JP2022512840A - 抗ヒトｐｄ－１抗体結晶およびその使用方法 - Google Patents

抗ヒトｐｄ－１抗体結晶およびその使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、結晶性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ここで、該ｍＡｂはペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体である）の製造方法であって、（１）（ａ）ｍＡｂ、（ｂ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ならびに（ｃ）カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリンおよび該生物活性ジベレリンの薬学的に許容される塩からなる群から選択される添加剤を含む溶液を混合して、結晶化溶液を形成させ、（２）結晶形成に十分な時間にわたって該結晶化溶液をインキュベートし、（３）所望により、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収することを含む製造方法を提供する。特定の実施形態においては、ＰＥＧはＰＥＧ ３３５０であり、添加剤はカフェインである。本発明はまた、本明細書に記載されている方法により製造される新規抗ヒトＰＤ－１ ｍＡｂ結晶に関する。幾つかの生化学的方法を用いる、再溶解された結晶性懸濁液の特徴づけは、再溶解ｍＡｂ結晶の生物物理学的特性が無傷抗体出発サンプルに合致することを示した。本発明の結晶および方法は精製、貯蔵、製剤化および薬物送達のような多種多様な薬学的用途に適している。【選択図】図５

Description

本発明は抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の結晶懸濁液の製造方法に関する。本発明は更に、本発明における製造方法により製造される抗体結晶、該結晶を含む医薬組成物およびその使用方法に関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は２０１８年１０月３１日付け出願のＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／７５３，６１５（その全体を本明細書に組み入れることとする）の利益を主張するものである。
電子的に提出された配列表に対する言及
本出願の配列表は、ファイル名「２４６３８ＷＯＰＣＴ－ＳＥＱＬＩＳＴ－１７ＯＣＴ２０ｌ９．ＴＸＴ」、作成日２０１９年１０月９日およびサイズ１０Ｋｂを有するＡＳＣＩＩ形式の配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出されたこの配列表は本明細書の一部であり、その全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
治療用抗体および診断用抗体は、バイオ医薬品業界で最も急速に成長している分野となっている。治療用物質としての抗体の成功のための重要な側面は、これらのタンパク質を発現させ、精製し、および特徴づけるための改善された方法の開発である。一般に、抗体治療用物質は大きく（典型的には１５０ｋＤａを超える）、本質的に複合的であり、触媒量ではなく化学量論量で投与される必要がある。したがって、製造および精製の規模は、以前は不可能と考えられていた製造レベルに達している。そのような大量の複合性分子のための安定製剤および送達戦略の開発も必要とされている。
抗体または抗原結合性フラグメントのような活性物質を高濃度で含む安定製剤の開発は、患者への皮下投与を意図した生物学的製剤にとって特に重要である。なぜなら、患者に送達される溶液の容量が著しく低減されるからである。皮下投与は多数の抗体の好ましい投与方法である。なぜなら、１つには、それは自己投与、または医療専門家（例えば、薬剤師、医師または看護師）による、より容易な投与を可能にしうるからである。治療用抗体は通常は凍結乾燥形態または溶液として製造される。凍結乾燥形態は長期安定性の向上を示しうるが、使用前に還元（再構成）を要するため、自己投与に理想的であるとは言えない。一方、安定液体製剤は開発がより困難であり、しばしば、使用前に冷蔵を要する。
プログラム死受容体－１（ＰＤ－１）系を標的とする免疫チェックポイント療法は複数のヒトがん（以下、がんは癌と称される）における臨床応答の画期的な改善をもたらしている（Ｂｒａｈｍｅｒら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２，３６６：２４５５－６５；Ｇａｒｏｎら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５，３７２：２０１８－２８；Ｈａｍｉｄら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３，３６９：１３４－４４；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｌａｎｃｅｔ ２０１４，３８４：１１０９－１７；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５，３７２：２５２１－３２；Ｒｏｂｅｒｔら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１５，３７２：３２０－３０；Ｔｏｐａｌｉａｎら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１２，３６６：２４４３－５４；Ｔｏｐａｌｉａｎら，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１４，３２：１０２０－３０；Ｗｏｌｃｈｏｋら，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３，３６９：１２２－３３）。Ｔ細胞上のＰＤ－１受容体と腫瘍および免疫浸潤細胞上のそのリガンド（すなわち、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２）との相互作用はＴ細胞媒介性免疫応答を調節し、ヒト腫瘍による免疫逃避において何らかの役割を果たしている可能性がある（Ｐａｒｄｏｌｌ ＤＭ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ ２０１２，１２：２５２－６４）。ＰＤ－１の、そのリガンドのいずれかへの結合は、Ｔ細胞への抑制性刺激の運搬をもたらす。ＰＤ－１系を標的とする免疫療法には、ＰＤ－１受容体に対するモノクローナル抗体［ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）（ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）），Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪおよびＯＰＤＩＶＯ（商標）（ニボルマブ（ｎｉｖｏｌｕｍａｂ）），Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ］、そしてまた、ＰＤ－Ｌ１リガンドに結合するもの［ＭＰＤＬ３２８０Ａ；ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（商標）（アテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ］が含まれる。どちらの治療アプローチも多数の癌型において抗腫瘍効果を示している。
抗ＰＤ－１抗体の改良された安定製剤、例えば、癌患者の治療における使用のためのものが必要とされている。好ましくは、そのような抗体製剤は投与前に再構成を要しない。また、そのような製剤は、典型的な溶液製剤を使用して容易に達成可能な濃度より高い濃度の抗体の投与を可能にし、好ましくは、皮下に簡便に送達されるのに十分に低い粘度で高濃度を支持する。
発明の概括
１つの態様においては、本発明は、結晶性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造方法であって、（ａ）（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含む緩衝水溶液（ここで、該抗ＰＤ－１ｍＡｂはペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体である）、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに（ｉｉｉ）カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、例えばジベレリンＡ３およびジベレリンの薬学的に許容される塩からなる群から選択される添加剤を混合して、結晶化溶液を形成させ［ここで、結晶化溶液は約６．０～約８．８のｐＨを有し、約２％～約４０％ ｗ／ｖ（重量／体積）のＰＥＧおよび約０．１％～約０．３０％ ｗ／ｖの添加剤を含む］、（ｂ）結晶形成に十分な時間にわたって該結晶化溶液をインキュベートし、（ｃ）所望により、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収することを含む製造方法に関する。
幾つかの実施形態においては、ｍＡｂはペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）である。更なる実施形態において、ｍＡｂは、ＰＤ－１に結合する能力および添加剤に結合する能力を保有するペンブロリズマブ変異体である。
特定の実施形態においては、添加剤はカフェインである。
幾つかの実施形態においては、結晶化溶液は約１％～約１０％のデキストラン硫酸ナトリウムを更に含む。
１つの態様においては、本発明は、本発明の方法により製造される単離された抗ＰＤ－１結晶に関する。
もう１つの態様においては、本発明は、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む単離された結晶であって、空間群Ｐ２２２１ ａ＝４３．８オングストローム ｂ＝１１３．９オングストローム ｃ＝１７５．０オングストローム，α＝β＝γ＝９０°により特徴づけられる結晶に関する。
もう１つの態様においては、本発明は、約１８２．１６、１８１．５４、１７９．９９、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、７６．８８および７６．０４ｐｐｍにおいてピークを示す固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む結晶性ペンブロリズマブに関する。
もう１つの態様においては、本発明は、約１８３．０７、１８２．１６、１８１．５４、１８０．５５、１７９．９９、１１０．７０、１１０．１５、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、１０１．４９、９９．７５、９８．５６、７６．８８、７６．０４、７４．９７、７４．４１、７３．５２、７２．６９、１３．８５、１３．２７、１２．２６および１１．１３ｐｐｍにおいてピークを示す固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む結晶性ペンブロリズマブに関する。
また、本発明は、本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶と薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。
１つの態様においては、本発明は、癌および／または感染症の治療を要する患者に本発明の結晶または組成物を投与することによる、癌および／または感染症の治療方法を提供する。特定の実施形態においては、静脈内注入により組成物を患者に投与する。別の実施形態においては、皮下注射により結晶を患者に投与する。
該特許または出願ファイルには、色付きで作成された少なくとも１つの図面を含む。色付き図面を含むこの特許または特許出願公開のカラーコピーは、要求および必要な料金の支払いに応じて、当局から提供される。
図１Ａ～１Ｃは、シルバー・ブレット・バイオ（Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｉｏ）結晶化試薬Ａ２の沈殿剤溶液および１２．５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ６．８）を使用して３０℃で蒸気拡散により得られたペムブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の顕微鏡写真を示す。実施例１を参照されたい。３０日後、ＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステムを使用して、倍率２００倍の顕微鏡写真を撮影した。図１Ａは、倍率２００倍で撮影された結晶の可視画像を示す。図１Ｂおよび１Ｃは、それぞれ、ＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステムのＵＶ－ＴＰＥＦおよびＳＨＧモードを使用して生成されたイメージを示す。ＳＨＧおよびＵＶ－ＴＰＥＦからのポジ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）イメージはタンパク質の結晶を示している。 図２Ａ～２Ｃは、実施例２に記載されているように、ドロップ蒸気拡散を使用して生成されたペンブロリズマブ結晶懸濁液中の結晶の、倍率２０倍で撮影された可視顕微鏡写真を示す。図２Ａは、０．２０％ カフェイン、１２％ ＰＥＧ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）を使用して形成された結晶を示す。図２Ｂは、０．２％ テオフィリン ＋ ０．２％ エタノールアミン ＋ １０％ ＰＥＧ３３５０を使用して形成された結晶を示す。図２Ｃは、０．２％ テオフィリン ＋ ０．２％ ２’デオキシグアノシン５－一リン酸ナトリウム塩水和物 ＋ １６％ ＰＥＧ３３５０を使用して形成された結晶を示す。 図３は、９．８％ ＰＥＧ ３３５０、４５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、０．２３％ カフェインと共にペンブロリズマブを３０℃で１８時間インキュベートすることを含む結晶化法（１０ｍＬのスケール）により得られた、倍率２００倍のペンブロリズマブ結晶の顕微鏡写真を示す。実施例５を参照されたい。 図４Ａ～４Ｆは、実施例６に記載されているとおり、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）溶液を使用して調製された結晶懸濁液のイメージを示す。イメージは、それぞれ、ＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステムの可視モード（図４Ａおよび４Ｄ）、ＵＶ－ＴＰＥＦモード（図４Ｂおよび４Ｅ）およびＳＨＧモード（図４Ｃおよび４Ｆ）を使用して特徴づけられた、２℃および５０℃で結晶化溶液をインキュベートした後に生じた結晶を示す。 図５は、実施例１０に記載されている方法を使用して製造されたペンブロリズマブ結晶の顕微鏡写真を示す。完全な構造特徴づけのために選択された結晶を示す。 図６Ａは、実施例１０に記載されている低塩／ＰＥＧ／カフェイン結晶形態におけるペンブロリズマブ／カフェイン複合体の画像表示を示す。タンパク質骨格がリボンとして示されており、タンパク質に結合したグリコシル、およびタンパク質に結合したカフェインの秩序だった分子が棒状物として描かれている。図６Ａのカラー版においては、タンパク質骨格は、以下のとおりに着色されたリボンとして示されている：オレンジＶＬ、マゼンタＣＬ、緑ＶＨ、シアンＣＨ１、黄色ＣＨ２、灰色ＣＨ３。図６Ｂは、結晶接触を媒介し秩序だっていることが判明したカフェイン分子の拡大図を示す。タンパク質骨格は、棒状物として示されているカフェイン分子を囲む側鎖を有するリボンとして表されている。カラー版においては、色の規則は図６Ａと同じである。 図７Ａ～７Ｃは、実施例１１に記載されている条件およびバッチ結晶化（１７５ｍＬのスケール）を使用するＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステムの可視モード（図７Ａ）、ＵＶ－ＴＰＥＦモード（図７Ｂ）およびＳＨＧモード（図７Ｃ）を使用して生成された結晶イメージを示す。 図８Ａは、２７Ｇ ＲＷおよび２９Ｇ ＴＷ ｘ １／２”針と共にＢＤ Ｈｙｐａｋ １ｍＬ ＰＦＳを使用した場合の、せん断速度（ｓ－１）に対する２００ｍｇ／ｍＬの結晶性ペンブロリズマブ懸濁液の粘度（ｃＰ）を示す。実施例１２を参照されたい。図８Ｂは、実施例１１に記載されているとおりに製造された２００（三角形）、１７５（正方形）および１５０（ひし形）ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブ結晶懸濁液の変位（ｍｍ）に対するシリンジ射出力（Ｎ）を示す。 図９は、種々の１ｍＬプラスチックシリンジおよびガラスシリンジ内の２００ｍｇ／ｍＬの結晶性ペンブロリズマブ懸濁液に関する、距離（ｍｍ）に対する必要射出力（Ｎ）を示す。実施例１２を参照されたい。該結晶懸濁液は、実施例１１に記載されている条件下で製造された。 図１０Ａは、実施例１１に記載されているとおりに調製されたペンブロリズマブ結晶懸濁液の固体１３Ｃ ＮＭＲ ＣＰ ＭＡＳを示す。図１０Ｂは図１０Ａのスペクトルの拡大スペクトル領域を示す。 図１１Ａおよび図１１Ｂはペンブロリズマブ－カフェイン結晶懸濁液（実線）およびカフェインのみの結晶（点線）の１３Ｃ（図１１Ａ）および１５Ｎ（図１１Ｂ）ＣＰ ＭＡＳスペクトルを示す。これらのスペクトルにおいては、２－１３Ｃおよび１，３－１５Ｎで同位体標識されたカフェインを使用した。
発明の詳細な説明
本発明は、ペンブロリズマブ抗体およびその変異体の結晶形態、これらの結晶の懸濁液ならびにこれらの懸濁液の医薬製剤を提供する。ハイスループット（ＨＴ）蒸気拡散スパースマトリックススクリーニング実験において、高度に精製されたペンブロリズマブモノクローナル抗体を使用した。種々の添加剤を使用して、３０℃および室温で新規結晶懸濁液を得た。本発明はまた、例えばバルク結晶化（バッチおよび透析）を使用する、該新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ）結晶懸濁液の高収率製造方法を提供し、ここで、ｍＡｂはペンブロリズマブまたはその変異体である。
１つの態様においては、結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂの製造方法であって、（ａ）（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含む緩衝水溶液、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに（ｉｉｉ）カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリンおよび生物活性ジベレリンの薬学的に許容される塩からなる群から選択される添加剤を混合して、結晶化溶液を形成させ［ここで、結晶化溶液は約６．０～約８．８のｐＨを有し、約５％～約４０％ ｗ／ｖ（重量／体積）のＰＥＧおよび約０．１０％～約０．３０％ ｗ／ｖの添加剤を含む］、（ｂ）結晶形成に十分な時間にわたって該結晶化溶液をインキュベートし、（ｃ）所望により、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収することを含む製造方法に関する。得られた結晶懸濁液は、回収後に０．５～２００ミクロンの粒子サイズを有する抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶、例えばペンブロリズマブ結晶を含む。特定の実施形態においては、該方法は、工程（ｂ）において形成された結晶を均質化（ホモジナイズ）する工程を更に含む。更に他の実施形態においては、結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを結晶化溶液から回収し、または結晶化溶液から少なくとも部分的に精製し、ついで、回収または精製された結晶が均質化する。得られた抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶、例えばペンブロリズマブ結晶は、約０．５～約５０ミクロンの粒子サイズを均質化後に有する。
本発明は更に、実施例１～１８に更に詳細に記載されているとおり、本発明の結晶性ペンブロリズマブ抗体の種々の製造方法を提供する。実施例１および２は、蒸気拡散に基づく方法を提供し、これは、結晶化条件を決定するためのスクリーニングに有用である。そのような方法は、例えば抗ＰＤ－１抗体の三次元構造を決定するための、Ｘ線回折研究における使用のための大きな結晶の生成にも適している。幾つかの実施形態においては、核形成のより良好な制御を可能にして、より大きな結晶の成長を可能にするために、デキストラン硫酸ナトリウムを結晶化溶液に添加する。
実施例５、１１および１５～１７は、大規模製造に適した結晶化方法、例えばバッチ結晶化およびバルク透析結晶化を示し、これらは治療用の結晶性ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体の商業的規模の製造に有用である。遠心分離を使用して本発明の結晶を回収する方法が例えば実施例１１、１４および１５に示されているが、中空繊維接線流濾過のような当技術分野で公知の濾過方法も、結晶を回収するために、例えば商業的規模で使用されうる。
特定の開示実施形態は抗体溶液と沈殿剤溶液との１：１および／または１：３の混合物を使用するが、（結晶が生じる）最終的な結晶化溶液における溶液成分のほぼ同じ濃度をもたらす開示方法の任意の改変は同等であろう。例えば、結晶化溶液の最終体積の５０％未満または５０％超を構成する沈殿剤溶液（本明細書中に定められているとおりにＰＥＧおよび添加剤を含む溶液）を使用する場合、沈殿剤溶液中の成分の濃度は比例的にそれぞれ増加または減少されうる。
本発明の結晶化方法はまた、そのような結晶が使用前に再溶解される場合にも、ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体抗体を精製するための方法を提供する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている及び当技術分野で公知の方法により、ペンブロリズマブ抗体を製造し、少なくとも部分的に精製する。ついで、例えばバッチ結晶化またはバルク透析により、抗体を結晶化する。ついで、例えば実施例５に記載されているとおりに（または濾過により）、結晶性抗体を回収し、洗浄し、バッファー、例えば１０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）、または精製抗体の使用目的に適した任意のバッファーに再溶解する。治療用には、適切な薬学的に許容されるバッファーおよび賦形剤を使用する。
本発明の結晶化方法はまた、そのような結晶が使用前に再溶解される場合にも、精製されたペンブロリズマブ抗体を保存する方法を提供する。１つの実施形態においては、本明細書に記載されている及び当技術分野で公知の方法により、ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体抗体を製造し、少なくとも部分的に精製する。ついで、例えばバッチ結晶化またはバルク透析により、抗体を結晶化する。得られた濃縮されたペンブロリズマブ結晶懸濁液を、出荷および世界各地の再製剤化場所に適した安定濃縮製剤として保存する。
本発明の結晶性ペンブロリズマブ抗体は、低粘度で高濃度で製剤化可能であることを含む、治療における使用のための幾つかの有利な特性を有する。この高濃度は、例えば皮下注射による、対象へのより効率的な投与を可能にしうる。本発明の結晶懸濁液は、最大３００～４００ｍｇ／ｍＬの医薬製剤を製造するために使用可能であり、より少ない注入体積でより高い用量の投与を可能にして、不快感を低減しうる。本発明の結晶懸濁液は、２７Ｇインスリンシリンジのような小口径針を使用する皮下注射により送達されうる。体積の減少、粘度の減少およびより小さな針の使用は全て、経皮投与時の患者の不快感を低減させうる。
本発明の結晶性ペンブロリズマブ抗体は他の有利な特性も有する。結晶性ペンブロリズマブ抗体の懸濁液は初めの溶液製剤と同等の安定性を示し、より長い貯蔵寿命を可能にしうる。また、本発明の結晶の懸濁液が室温で保存されうることは、医薬品の取り扱いおよびサプライチェーン管理において重要な利点をもたらしうる。
ペンブロリズマブの従来の結晶懸濁液は、高塩法を使用して製造されていた。ＷＯ ２０１６／１３７８５０を参照されたい。本発明の新規ペンブロリズマブ結晶は高塩の使用を必要とせず、このことは医薬製造プロセスに有利である。なぜなら、高レベルの塩は、皮下投与を意図した医薬製剤に適さないからである。
Ｉ．定義および略語
本明細書および添付の特許請求の範囲の全体において、以下の略語が適用される。
ＣＤＲ 相補性決定領域
ＣＨＯ チャイニーズハムスター卵巣
ＣＰ 交差分極（Ｃｒｏｓｓ ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ）
ＣＰＳ 複合陽性スコア
ＤＦＳ 無病生存期間
ＥＬＩＳＡ 酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＲ フレームワーク領域
ＧＲＡＳ 安全性認定
ＨＥＰＥＳ ヒドロキシエチル－ピペラジンエタン－スルホニウム酸バッファー
ＨＴ ハイスループット
ＩＥＸ イオン交換
ＩＨＣ 免疫組織化学または免疫組織化学的
ＩＰＴＧ イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド
ＩＶ 静脈内
ｍＡｂ モノクローナル抗体
ＭＡＳ マジック角回転
ＮＣＩ 米国国立癌研究所
ＮＭＲ 核磁気共鳴
ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水
ＰＤ 進行性疾患
ＰＤ－１ プログラム死１
ＰＤ－Ｌ１ プログラム細胞死１リガンド１
ＰＤ－Ｌ２ プログラム細胞死１リガンド２
ＰＥＧ ポリエチレングリコール
ＰＦＳ 無増悪生存期間
ＰＫ 薬物動態
ＰＲ 部分的応答
ＯＲ 全体的応答
ＯＳ 全生存期間
Ｑ２Ｗ ２週間に１用量
Ｑ３Ｗ ３週間に１用量
ＱＤ １日に１用量
ＲＥＣＩＳＴ 固形腫瘍における応答評価基準
ＲＰＬＣ 逆相液体クロマトグラフィー
ＲＰＭ １分当たりの回転数
ＳＣ 皮下
ＳＤ 安定している疾患または標準偏差（文脈に応じて）
ＳＨＧ 第二次高調波発生
ＳＯＮＩＣＣ キラル結晶の二次非線形イメージング
Ｔ／Ｃ 対照腫瘍体積に対する治療腫瘍体積の比
ＴＰＳ 腫瘍比例スコア
ＵＶ－ＴＰＥＦ 紫外線－二光子励起蛍光
ＶＨ 免疫グロブリン重鎖可変領域
ＶＫ 免疫グロブリンカッパ軽鎖可変領域
ｗ／ｖ 体積当たりの重量
本発明がより容易に理解されうるように、幾つかの科学技術用語を以下に具体的に定義する。本明細書中の他の箇所で特に定義されていない限り、本明細書中で用いる全ての他の科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。
本明細書の全体および添付の特許請求の範囲において用いる単数形の語は、文脈に明らかに矛盾しない限り、その対応複数対象物を含む。
「または」なる語は、示されている可能性の１つを文脈が明らかに定める場合を除き、示されている可能性の一方または両方を示す。幾つかの場合においては、一方または両方の可能性を強調するために「および／または」を用いた。
「治療する」または「治療」は、正の治療効果を誘導するために本発明の組成物を患者に投与することを意味する。これらの用語は全ての疾患または障害の症状の完全排除を必ずしも示すものではない。癌または免疫病態を「治療する」は、免疫病態もしくは癌状態を有する患者、または癌もしくは病原性感染（例えば、ウイルス、細菌、真菌）を有すると診断された若しくはその素因を有する患者に本発明の結晶懸濁液または組成物を投与して、例えば癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、末梢器官への癌細胞浸潤率の低下または腫瘍転移もしくは腫瘍成長の速度の低下のような少なくとも１つの正の治療効果を得ることを意味する。「治療」は以下のものの１以上を含みうる：抗腫瘍免疫応答の誘導／増強、病原体、毒素および／または自己抗原に対する免疫応答の刺激、ウイルス感染に対する免疫応答の刺激、１以上の腫瘍マーカーの数値の減少、腫瘍細胞の成長または生存の抑制、１以上の癌性病変または腫瘍の排除またはそのサイズの縮小、１以上の腫瘍マーカーのレベルの低下、癌の重症度または持続期間の低減、類似した未治療患者の予想生存期間と比較した場合の患者の生存期間の延長。
「免疫病態」または「免疫障害」は、例えば、病的炎症、炎症性障害および自己免疫障害または疾患を含む。「免疫病態」はまた、感染（感染症）、持続感染、ならびに増殖状態、例えば癌、腫瘍および血管新生をも含み、例えば、免疫系による根絶に抵抗する感染、腫瘍および癌をも含む。「癌性状態」は、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生、および前癌性状態、例えば異形成を含む。
「炎症障害」は、病変が全体的または部分的に例えば免疫系の細胞の数の変化、遊走速度の変化または活性化の変化を引き起こす、障害または病的状態を意味する。免疫系の細胞には、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、単球またはマクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、ミクログリア、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、好中球、好酸球、マスト細胞、または免疫学に特異的に関連しているいずれかの他の細胞、例えばサイトカイン産生内皮または上皮細胞が含まれる。
癌における正の治療効果は幾つかの方法で測定されうる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ－１０Ｓ（２００９）を参照されたい）。例えば、腫瘍成長抑制に関しては、ＮＣＩ標準に従い、Ｔ／Ｃ≦４２％が抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ＜１０％は高い抗腫瘍活性レベルとみなされ、ここで、Ｔ／Ｃ（％）＝治療された腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００である。幾つかの実施形態においては、本発明の製剤の投与により達成される治療は無進行生存（ＰＦＳ）、無疾患生存（ＤＦＳ）または全生存（ＯＳ）のいずれかである。ＰＦＳは「腫瘍進行までの時間」とも称され、癌が成長（増殖）しない、治療中または治療後の時間の長さを示し、完全な応答または部分的な応答を患者が経験した時間の長さ、および安定な疾患を患者が経験した時間の長さを含む。ＤＦＳは、患者が無疾患状態のままである、治療中または治療後の時間の長さを意味する。ＯＳは、無処置または未治療の個体または患者と比較した場合の寿命の延長を意味する。本発明の製剤、治療方法および使用の実施形態は、全ての患者において正の治療効果を達成するのに有効でありうるとは限らないが、当技術分野で公知のいずれかの統計的検定、例えばスチューデントｔ検定、カイ２乗検定、マンおよびホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンケーレ－テルプストラ検定およびウィルコクソン検定により判定された場合に、統計的に有意な数の対象においては有効であるはずである。
「患者」（あるいは、本明細書においては「対象」または「個体」とも称される）は、本発明の製剤で治療されうる哺乳動物（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを意味する。「患者」なる語はまた、治療を要するウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ネコ、イヌおよび他の哺乳動物（これらに限定されるものではない）を含む家畜および飼育動物を含む非ヒト動物を含みうる。幾つかの実施形態においては、患者は成体患者である。他の実施形態においては、患者は小児患者である。「治療を要する」患者は、本発明の結晶懸濁液または組成物が治療すると意図される疾患または障害を有すると診断された、または有する疑いのある、またはその素因を有する個体、あるいは障害の予防が望まれる患者である。
「抗体」なる語は、所望の生物活性を示す、抗体の任意の形態を意味する。したがって、それは最も広い意味で用いられ、特に、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体およびキメラ抗体（これらに限定されるものではない）を含む。「親抗体」は、意図される使用のための抗体の修飾（例えば、ヒト治療用抗体としての使用のための抗体のヒト化）の前の、抗原への免疫系の暴露により得られる抗体である。
一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の、２つの同一ペアを含み、各ペアは１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識をもたらす約１００～１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各軽／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、無傷抗体は２つの結合部位を有する。重鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主にもたらす定常領域を定めうる。典型的には、ヒト軽鎖はカッパおよびラムダ軽鎖として分類される。更に、ヒト重鎖は、典型的には、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして、抗体のアイソタイプを定める。軽鎖および重鎖においては、可変領域および定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により連結されており、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域をも含む。全般的には、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．編，２ｎｄ ｅｄ．Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））を参照されたい。
典型的には、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインは、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）内に位置する、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは、通常、特定のエピトープへの結合が可能になるように、フレームワーク領域により整列されている。一般に、Ｎ末端からＣ末端方向に、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方はＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４を含む。各ドメインへのアミノ酸の帰属は、一般に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｋａｂａｔら；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；５ｔｈ ｅｄ．；ＮＩＨ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．９１－３２４２（１９９１）；Ｋａｂａｔ（１９７８）Ａｄｖ．Ｐｒｏｔ．Ｃｈｅｍ．３２：１－７５；Ｋａｂａｔら（１９７７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７またはＣｈｏｔｈｉａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３の定義に基づいている。
特定の標的タンパク質に「特異的に結合する」抗体は、他のタンパク質と比較してその標的への優先的結合を示す抗体であるが、この特異性は絶対的な結合特異性を要しない。抗体がその意図される標的に「特異的」だとみなされるのは、その結合が、例えば偽陽性のような望ましくない結果をもたらすことなく、サンプル中の標的タンパク質の存在を決定するものである場合である。本発明において有用な抗体またはその結合性フラグメントは、非標的タンパク質に対するアフィニティより少なくとも２倍大きな、好ましくは少なくとも１０倍大きな、より好ましくは少なくとも２０倍大きな、最も好ましくは少なくとも１００倍大きなアフィニティで標的タンパク質、すなわちヒトＰＤ－１に結合するであろう。本明細書中で用いる抗体が、与えられたアミノ酸配列、例えば成熟ヒトＰＤ－１のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると言えるのは、それが、その配列を含むポリペプチドには結合するが、その配列を欠くタンパク質には結合しない場合である。
「薬学的有効量」または「治療的有効量」なる語は、十分な治療用組成物または製剤が患者に導入されて疾患または病態を治療する量を意味する。このレベルは患者の特徴、例えば年齢、体重などに応じて変動しうると当業者に認識されている。本発明の結晶懸濁液または組成物に関して用いる「有効量」なる語は、治療することが意図される病態、例えば癌性状態または炎症障害を治療するのに十分な懸濁液または組成物の量を意味する。本発明の結晶または組成物の「有効量」なる語は、細胞、組織、系、動物またはヒトにおいて求められている応答を惹起するのに十分な量を意味する。１つの実施形態においては、有効量は、治療される疾患または状態の症状の改善のための「治療的有効量」である。活性化合物（すなわち、有効成分）を塩として投与する場合、有効成分の量に対する言及は該化合物の遊離酸または遊離塩基形態に関するものである。
「約」なる語は、物質または組成物の量（例えば、ｍＭまたはＭ）、製剤成分の百分率（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）、溶液／製剤のｐＨ、あるいは方法における工程を特徴づけるパラメータの値などを修飾している場合には、例えば、該物質または組成物の製造、特徴づけおよび／または使用に伴う典型的な測定、取り扱いおよびサンプリング操作により生じるうる数量における変動；これらの操作における偶発的エラーにより生じうる数量における変動；該組成物を製造または使用するために或いは該操作を行うために使用される成分の製造、起源または純度における差異により生じうる数量における変動などを意味する。ある実施形態においては、「約」は適切な単位の±０．１％、０．２、０．３、０．４、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０または５．０の変動を意味しうる。ある実施形態においては、「約」は±０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％または１０％の変動を意味しうる。ある実施形態においては、固体ＮＭＲの目的における「約」なる語は±０．１ｐｐｍを意味する。
「癌」、「癌性」または「悪性」なる語は、無制御な細胞増殖により典型的に特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を意味し又は示す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、白血病、芽腫および肉腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような癌の更に詳細な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、胃腸（管）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、メラノーマ（黒色腫）、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形性膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌が含まれる。
本発明の結晶性抗体懸濁液に関して用いた場合の「濃度」は、与えられた巨視的単位溶液体積中に存在する抗体（例えば、ペンブロリズマブ）の量を意味する。通常の溶液と比べて懸濁液は固有の不均一性を有するにもかかわらず、濃度なる語はその通常の意味で用いられる。結晶懸濁液中の抗体の濃度は、抗体が結晶形態でない同等サンプルの濃度に等しい。
本明細書中で用いる「抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶」または「結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂ」は、三次元で規則的に反復する格子構造内に整列した抗体を含有する結晶を意味する。これとは対照的に、ｍＡｂの固体、無定形形態（例えば、溶液中に溶解したｍＡｂを凍結乾燥することにより製造されたもの）は、結晶性抗体形態に典型的である屈折率および複屈折のような光学的特性を示さない。
「抗体溶液」は、本発明の結晶性抗体を生成させるために使用される、抗ヒトＰＤ－１抗体、例えばペンブロリズマブの溶液を意味する。「沈殿剤溶液」は、抗体が結晶成長する「結晶化溶液」を調製するために典型的には１：１の体積比で抗体溶液と混合される（すなわち、等しい体積の２つの溶液が混合される）第２の溶液を意味する。抗体および沈殿剤溶液の濃度は、本明細書においては便宜上、１：１の混合物に関して示されているが、該混合物を調製するために用いられる体積比は変更可能であり、したがって、該混合物を構成する溶液の濃度も変更可能である、と当業者は認識するであろう。そのような修飾は、それらが、本明細書に記載されている混合物と同じ結晶化条件（すなわち、同じ結晶化溶液）を生成する場合には、本発明の範囲内である。
透析に基づく結晶化法に関しては、「透析溶液（透析液）」は、本発明の結晶抗体の形成を導くためにペンブロリズマブの溶液（「抗体溶液」）が透析される溶液を意味する。「残余液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）」は透析後の抗体溶液を意味し、これは、回収される抗体の結晶を含みうる。抗体溶液／残余液は透析膜の一方の側に存在し、透析溶液は反対側に存在する。
「均質化（ホモジナイズ）」なる語は、機械的手段を使用して結晶粒子のサイズを減少させて、より均一であり均一に分布する、より小さな粒子を得ることを意味する。均質化は、任意の公知手段により、例えばホモジナイザーの使用により、または結晶粒子をシリンジのようなより小さな孔に強制的に通過させて（ベンチュリ効果）、粒子をより小さなサイズに分解することにより行われうる。
「ミクロン」および「マイクロメートル」なる語は本明細書において互換的に使用され、それぞれはメートルの１／１００００００を意味する。
「ＰＤ－Ｌ１」または「ＰＤ－Ｌ２」発現は、細胞表面における示されているＰＤ－Ｌタンパク質の、または細胞もしくは組織内の示されているＰＤ－Ｌ ｍＲＮＡの任意の検出可能なレベルの発現を意味する。ＰＤ－Ｌタンパク質発現は、腫瘍組織切片の免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイにおいて診断用ＰＤ－Ｌ抗体で、またはフローサイトメトリーにより検出されうる。あるいは、腫瘍細胞によるＰＤ－Ｌタンパク質発現は、所望のＰＤ－Ｌ標的、例えばＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２に特異的に結合する結合剤（例えば、抗体フラグメント、アフィボディなど）を使用して、ＰＥＴイメージングにより検出されうる。ＰＤ－Ｌ ｍＲＮＡ発現を検出し測定するための技術にはＲＴ－ＰＣＲおよびリアルタイム定量ＲＴ－ＰＣＲが含まれる。
腫瘍組織切片のＩＨＣアッセイにおいてＰＤ－Ｌ１タンパク質発現を定量するための幾つかのアプローチが記載されている。例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１（４９）：１７１７４－１７１７９（２００４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１－３３８５（２００６）；Ｇａｄｉｏｔ，Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ １１７：２１９２－２２０１（２０１１）；Ｔａｕｂｅ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ４：１２７ｒａ３７（２０１２）；およびＴｏｐｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．ら，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ Ｍｅｄ．３６６（２６）：２４４３－２４５４（２０１２）を参照されたい。
１つのアプローチは、ＰＤ－Ｌ１発現に関する陽性または陰性の単純な二成分（バイナリー）エンドポイントを用いるものであり、陽性結果は、細胞表面膜染色の組織学的証拠を示す腫瘍細胞の割合に関して定められる。腫瘍組織切片がＰＤ－Ｌ１発現に関して陽性とみなされるのは、全腫瘍細胞の少なくとも１％、好ましくは５％である場合である。
もう１つのアプローチにおいては、腫瘍組織切片におけるＰＤ－Ｌ１発現は、リンパ球を主に含む浸潤性免疫細胞および腫瘍細胞において定量される。膜染色を示す腫瘍細胞および浸潤性免疫細胞の割合は５％未満、５～９％、そしてついで１０％の増量で１００％までとして別々に定量される。幾つかの実施形態においては、腫瘍細胞におけるＰＤ－Ｌ１発現は、スコアが５％未満のスコアであれば陰性とみなされ、スコアが５％以上であれば陽性とみなされる。免疫浸潤物におけるＰＤ－Ｌ１発現は、補正（ａｄｊｕｓｔｅｄ）炎症スコア（ＡＩＳ）と称される半定量的測定値として示され、これは、膜染色細胞の百分率に浸潤物の強度を掛け算することにより決定され、これは、無し（０）、軽度（１のスコア、希少リンパ球）、中等度（２のスコア、リンパ組織球凝集物による腫瘍の病巣浸潤）または重度（３のスコア、びまん性浸潤）として評価される。ＡＩＳが５以上であれば、腫瘍組織切片は免疫浸潤物によるＰＤ－Ｌ１発現に関して陽性とみなされる。
診断用ＰＤ－Ｌ１抗体を使用するＩＨＣにより染色された腫瘍からの組織切片は、スコア化法を用いて組織切片の腫瘍細胞および浸潤免疫細胞の両方におけるＰＤ－Ｌ１発現を評価することによっても、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現に関してスコア化されうる。ＷＯ ２０１４／１６５４２２を参照されたい。１つのＰＤ－Ｌ１スコア化法は、染色に関して組織切片における各腫瘍巣を検査し、修飾Ｈスコア（ＭＨＳ）および修飾比率スコア（ＭＰＳ）の一方または両方を組織切片に割り当てることを含む。ＭＨＳを割り当てるために、被検腫瘍巣の全てにおける生存腫瘍細胞および染色単核炎症細胞の全てにわたって、以下の４つの別々の比率を推定する：（ａ）染色を有さない細胞（強度＝０）、（ｂ）弱い染色（強度＝１＋）、（ｃ）中等度の染色（強度＝２＋）、および（ｄ）強い染色（強度＝３＋）。細胞は、弱い、中等度または強い染色比率に含まれるためには、少なくとも部分的な膜染色を有する必要がある。ついで、合計が１００％である推定比率を、１×（弱い染色細胞のパーセント）＋２×（中等度の染色細胞のパーセント）＋３×（強い染色細胞のパーセント）の式に代入し、結果をＭＨＳとして組織切片に割り当てる。被検腫瘍巣の全てにおける生存腫瘍細胞および染色単核炎症細胞の全てにわたって、任意の強度の少なくとも部分的な膜染色を有する細胞の比率を推定することにより、ＭＰＳを割り当て、得られた比率をＭＰＳとして組織切片に割り当てる。幾つかの実施形態においては、ＭＨＳまたはＭＰＳが陽性である場合、腫瘍はＰＤ－Ｌ１発現に関して陽性として示される。
「ＣＰＳ」または「複合陽性スコア」は、患者の腫瘍サンプルからＰＤ－Ｌ１発現スコアを決定するためのアルゴリズムを意味する。ＣＰＳは、抗ＰＤ－１抗体の投与を含む治療方法（この場合、ＰＤ－Ｌ１を発現しない同じ患者集団と比較して、特定の患者集団において、より高い応答率とＰＤ－Ｌ１の発現が関連している）を含む特定の治療レジメンでの治療のための患者を選択するのに有用である。ＣＰＳは、腫瘍を有する患者の腫瘍組織における生存可能なＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞の数、生存可能なＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍細胞の数、および生存可能なＰＤ－Ｌ１陽性単核炎症細胞（ＭＩＣ）の数を決定すること、ならびに以下の式を用いてＣＰＳを計算することにより決定される。
（ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞数）＋（ＰＤ－Ｌ１陽性ＭＩＣ数）×１００％
（ＰＤ－Ｌ１陽性腫瘍細胞数）＋（ＰＤ－Ｌ１陰性腫瘍細胞）
ＴＰＳまたは「腫瘍比率スコア」は、細胞膜上でＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍細胞の比率である。ＴＰＳには、典型的には、ＰＤ－Ｌ１を任意の強度（弱、中等度または強）で発現する腫瘍細胞の比率が含まれ、これは、診断用抗ヒトＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂ、例えば抗体２０Ｃ３および抗体２２Ｃ３を使用する免疫組織化学的アッセイを用いて決定されうる（前掲）。部分的な膜染色を伴う細胞を含め、膜染色が存在する場合、細胞はＰＤ－Ｌ１を発現すると見なされる。
ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡ発現のレベルは、定量的ＲＴ－ＰＣＲにおいて頻繁に使用される１以上の参照遺伝子（例えば、ユビキチンＣ）のｍＲＮＡ発現レベルと比較されうる。
幾つかの実施形態においては、悪性細胞による及び／又は腫瘍内の浸潤性免疫細胞によるＰＤ－Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）のレベルは、適当な対照によるＰＤ－Ｌ１発現（タンパク質および／またはｍＲＮＡ）のレベルとの比較に基づいて、「過剰発現」または「上昇」していると判定される。例えば、対照ＰＤ－Ｌ１タンパク質またはｍＲＮＡ発現レベルは、同じタイプの非悪性細胞において、または釣り合わされた正常組織からの切片において定量されたレベルでありうる。幾つかの好ましい実施形態においては、腫瘍サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１発現は、サンプル中のＰＤ－Ｌ１タンパク質（および／またはＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡ）が対照の場合より少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％または５０％以上大きいならば、上昇していると判定される。
「ペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）」は、ＷＨＯ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．２，ｐ．１６１－１６２（２０１３）に記載されている構造を有するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である（Ｍｅｒｃｋ Ｓｈａｒｐ ＆ Ｄｏｈｍｅ Ｃｏｒｐ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ）。ペンブロリズマブの各軽鎖は、配列番号１、２および３に記載されているアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）と、配列番号４、５および６に記載されているアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲとを含む。ペンブロリズマブの可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ配列番号７および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含み、完全長の軽鎖および重鎖は、それぞれ配列番号９および配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含み、またはそれからなる。ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）に関する処方情報（Ｍｅｒｃｋ ＆ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ，ＮＪ ＵＳＡ；２０１４年初回米国承認、２０１７年９月改訂）に記載されているとおり、ペンブロリズマブは、切除不能または転移性メラノーマを有する患者の治療、完全切除後のリンパ節転移を伴うメラノーマを有する患者の補助薬物療法、ならびに再発性または転移性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、尿路上皮癌、胃癌、子宮頸癌、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）癌、食道癌、肝細胞、メルケル細胞癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌を有する或る患者の治療に関して、米国ＦＤＡにより承認されている。
本明細書中で用いる「ペンブロリズマブ変異体」は、ペンブロリズマブ抗体の誘導体であって、（１）抗原（すなわち、ヒトＰＤ－１）に結合し、その活性を抑制する（例えば、ＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２へのＰＤ－１の結合を遮断する）その生物活性を実質的に保有し、（２）本発明の方法における結晶化溶液中で使用される添加剤（ここで、添加剤はカフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、例えばジベレリンＡ３またはその薬学的に許容される塩である）に結合する能力を保有するものを意味する。本発明の実施形態においては、ペンブロリズマブ変異体は、軽鎖ＣＤＲの外部および重鎖ＣＤＲの外部に位置するアミノ酸位置に１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換を有する（例えば、変異位置はフレームワーク領域または定常領域に位置する）こと以外はペンブロリズマブのもの（それぞれ配列番号９および１０）と同一である軽鎖配列および重鎖配列を含む。更なる実施形態においては、ペンブロリズマブ変異体は、ペンブロリズマブ軽鎖ＣＤＲの外部および重鎖ＣＤＲの外部に、そして更に、カフェインに結合するペンブロリズマブ残基の外部、すなわち、ペンブロリズマブ重鎖のＴＹＲ４３６およびＡＳＮ４３４（配列番号１０の４３４位および４３６位）の外部に位置する１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換を有する。換言すれば、ペンブロリズマブおよびペンブロリズマブ変異体は同一ＣＤＲ配列を含むが、それらの完全長軽鎖および重鎖配列においてそれぞれ１０個以下の他の位置に保存的アミノ酸置換を有するため、互いに異なる。ペンブロリズマブ変異体は以下の特性に関してペンブロリズマブと実質的に同じである：ＰＤ－１への結合アフィニティ、ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２のそれぞれの結合を遮断する能力、ならびにカフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、例えばジベレリンＡ３、または該生物活性ジベレリンの薬学的に許容される塩から選択される添加剤に結合する能力。
「沈殿剤」は、濃縮溶液中のポリペプチド、例えば抗体の溶解度を減少させる化合物である。バッチ結晶化法においては、沈殿剤は「沈殿剤溶液」中に含まれることが可能であり、バルク透析法においては、沈殿剤は「透析溶液」中に含まれることが可能である。沈殿剤は、エネルギー的に不利な沈殿剤空乏層をポリペプチド分子の周囲に形成させることにより、結晶化を誘発する。この空乏層の相対量を最小にするために、該ポリペプチドは会合を生成し、最終的には結晶を形成する。この過程はＷｅｂｅｒ（１９９１）Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１：１において説明されている。種々の沈殿剤が当技術分野で公知である。本発明の方法においては、沈殿剤はポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ ３３５０）である。
沈殿剤に加えて、カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリンおよび該生物活性ジベレリンの薬学的に許容される塩から選択される、結晶化を促進する１以上の添加剤を、ポリペプチド沈殿剤溶液または結晶化溶液に加える。本発明の方法において有用な２つの添加剤であるカフェインおよびテオフィリンは、以下に示すとおりの構造的類似性を共有することが判明した。
Figure 2022512840000002
本明細書においては、ジベレリンＡ３（あるいは、ＧＡ３またはジベレリン酸）も本発明の方法の結晶化方法において有用な試薬であることが示されている。ジベレリン（ＧＡとしても公知）は、共通のジテルペノイド酸構造を共有し種々の発達過程を調節する、植物において見出されるホルモンのクラスである。「生物活性ジベレリン」は植物の発芽の種々の態様に関与し、以下の構造的特徴を共有する：１）Ｃ－３βのヒドロキシル基、２）Ｃ－６のカルボキシル基、および３）Ｃ－４とＣ－１０との間のラクトン（以下を参照されたい）。ジベレリンＡ１（ＧＡ１）、ジベレリンＡ３（ＧＡ３）、ジベレリンＡ４（ＧＡ４）およびジベレリンＡ７（ＧＡ７）またはそれらの薬学的に許容される塩を含む「生物活性ジベレリン」の類似した構造および機能に基づいて、いずれの生物活性ジベレリンまたはその薬学的に許容される塩も本発明の方法において有用であると予想される。
Figure 2022512840000003
沈殿剤に加えて、１以上の追加的な賦形剤がポリペプチド沈殿剤溶液または結晶化溶液に加えられうる。賦形剤には、溶液のｐＨ（したがってペプチド上の表面電荷）を調節するためのバッファー、例えばＴｒｉｓまたはＨＥＰＥＳ、ポリペプチドの溶解度を減少させるための塩、例えば塩化ナトリウム、塩化リチウムおよびクエン酸ナトリウムが含まれる。
「組織切片」は、組織サンプルの単一の部分または断片、例えば、正常組織または腫瘍のサンプルから切断された組織の薄片を意味する。
本明細書中で用いる「トリス」（２－アミノ－２－ヒドロキシメチルプロパン－１，３－ジオール）はＴＲＩＳ、トリス（Ｔｒｉｓ）塩基、トリズマ（Ｔｒｉｚｍａ）、トリスアミン（Ｔｒｉｓａｍｉｎｅ）、ＴＨＡＭ、トロメタミン（Ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、トロメタモール（Ｔｒｏｍｅｔａｍｏｌ）、トロメタン（Ｔｒｏｍｅｔｈａｎｅ）およびトリスアミノール（Ｔｒｉｓａｍｉｎｏｌ）と同義である。
「腫瘍」は、癌を有すると診断された又は癌を有する疑いのある対象に適用される場合には、任意のサイズの悪性または潜在的に悪性の新生物または組織塊を意味し、原発腫瘍または続発性新生物を含む。固形（充実性）腫瘍は、嚢胞または液体領域を通常は含有しない、組織の異常成長または塊を意味する。種々のタイプの固形腫瘍が、それらを形成する細胞のタイプにちなんで命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌腫およびリンパ腫が挙げられる。白血病（血液の癌）は、一般に、固形腫瘍を形成しない（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｅｒｍｓ）。
「腫瘍量」は「腫瘍負荷」とも称され、全身に分布する腫瘍物質の総量を意味する。腫瘍負荷は、リンパ節および骨髄を含む身体全体にわたる癌細胞の総数または腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍負荷は当技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば超音波、骨スキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）または磁気共鳴撮像（ＭＲＩ）スキャンを用いて体内において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。
「腫瘍サイズ」なる語は、腫瘍の長さおよび幅として測定されうる腫瘍の全サイズを意味する。腫瘍サイズは技術分野で公知の種々の方法により決定可能であり、例えば、被験者からの摘除に際して例えばカリパスを使用して、あるいはイメージング技術、例えば骨スキャン、超音波、ＣＴまたはＭＲＩスキャンを用いて体内において、腫瘍の寸法を測定することにより決定されうる。
「ヒト化抗体」は、非ヒト（例えば、マウス）抗体およびヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態を意味する。そのような抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的にはヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含んでいてもよい。アフィニティーを増加させるため、またはヒト化抗体の安定性を増強するため、または他の理由により、あるアミノ酸置換が含まれうるが、げっ歯類抗体のヒト化形態は、一般に、該親げっ歯類抗体の同一ＣＤＲ配列を含む。
本発明の組成物において有用な抗体は、改変されたエフェクター機能をもたらすための、修飾（または遮断）されたＦｃ領域を有する抗体をも含む。例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；ＷＯ２００３／０８６３１０；ＷＯ２００５／１２０５７１；ＷＯ２００６／００５７７０２；Ｐｒｅｓｔａ（２００６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．５８：６４０－６５６を参照されたい。そのような修飾は、免疫系の種々の反応を増強または抑制するために利用可能であり、診断および療法における可能な有益な効果を伴いうる。Ｆｃ領域の改変には、アミノ酸変化（置換、欠失および挿入）、グリコシル化または脱グリコシル化および複数のＦｃの付加が含まれる。Ｆｃに対する変化はまた、治療用抗体における抗体の半減期を改変することが可能であり、より長い半減期は、投与頻度の減少ならびにそれによる便利さの向上および資源の使用の減少を可能にする。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ．７３４－３５を参照されたい。
「超可変領域」なる語は、抗原結合をもたらし異抗体間で配列が可変性である、抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「相補性決定領域」もしくは「ＣＤＲ」［例えば、Ｋａｂａｔ番号付け系（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により決定された場合の、軽鎖可変ドメインにおける残基２４～３４（ＣＤＲＬ１）、５０～５６（ＣＤＲＬ２）および８９～９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける残基３１～３５（ＣＤＲＨ１）、５０～６５（ＣＤＲＨ２）および９５～１０２（ＣＤＲＨ３）］からのアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」［すなわち、軽鎖可変ドメインにおける残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）および９１～９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメインにおける２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）および９６～１０１（Ｈ３）（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７）］からのアミノ酸残基を含む。本明細書中で用いる「フレームワーク」または「ＦＲ」残基なる語は、ＣＤＲ残基として本明細書中で定義されている超可変領域残基以外の可変ドメイン残基を意味する。ＣＤＲおよびＦＲ残基は、Ｋａｂａｔの標準的な配列定義（Ｋａｂａｔら（１９８７）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．）に従い決定される。
「保存的に修飾された変異体」または「保存的置換」は、ポリペプチドの必須領域においてさえも、生じる分子の生物活性を変化させることなく一般に行われうる当業者に公知のアミノ酸の置換を意味する。そのような典型的な置換は、好ましくは、以下の表１に記載されているものに従い行われる。
Figure 2022512840000004
また、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一アミノ酸置換は生物活性を実質的に変化させない、と当業者は認識している。例えば、Ｗａｔｓｏｎら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４（４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。
本明細書および特許請求の範囲の全体において用いられている「から実質的になる」なる句、またはその変形表現、例えば「から実質的になり」は、挙げられている任意の要素または要素群の包含、および特定されている投与レジメン、方法または組成物の基本的または新規特性を実質的に変化させない、挙げられている要素と類似した又は異なる性質の他の要素の随意的包含（すなわち、包含されても包含されなくてもよいこと）を示す。非限定的な一例として、挙げられているアミノ酸配列から実質的になる結合性化合物は、該結合性化合物の特性に実質的に影響を及ぼさない、１以上のアミノ酸残基の置換を含む１以上のアミノ酸をも含みうる。
「含む」、または「含み」、「含んでいて」もしくは「含まれる」のような変形は、明確な言語または必然的暗示によって文脈に矛盾している場合を除き、本明細書および特許請求の範囲の全体において包括的な意味で用いられ、すなわち、本発明の実施形態のいずれかの実施または有用性を実質的に促進しうる更なる特徴の存在または付加を排除することなく、示されている特徴の存在を特定するために用いられる。
「単離された抗体」および「単離された抗体フラグメント」は精製状態を意味し、そのような文脈においては、示されている分子が、他の生物学的分子、例えば核酸、タンパク質、脂質、炭水化物、または細胞残渣および増殖培地のような他の物質を実質的に含有しないことを意味する。一般に、「単離（された）」なる語はそのような物質の完全な非存在を意図するものではなく、また、水、バッファーまたは塩の非存在を意図するものでもない。ただし、それらは、本明細書に記載されている結合性化合物の実験的または治療的使用を実質的に妨げる量で存在してはならない。
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「Ｍａｂ」は実質的に均一な抗体の集団を意味し、すなわち、該集団を構成する抗体分子は、僅かな量で存在しうる考えられうる自然突然変異以外は、アミノ酸配列において同一である。これとは対照的に、通常の（ポリクローナル）抗体調製物は、典型的には、異なるエピトープに対して特異的であることが多い可変ドメイン、特にＣＤＲ内に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含む。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという該抗体の特性を示しており、いずれかの特定の方法による該抗体の製造を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従い使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５により最初に記載されたハイブリドーマ法により製造可能であり、あるいは組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）により製造可能である。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８およびＭａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ２２２：５８１－５９７に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されうる。Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１も参照されたい。
「バッファー」なる語は、本発明の製剤の溶液ｐＨを許容範囲内に維持する物質を含み、あるいは本発明の凍結乾燥製剤に関しては、凍結乾燥前に、許容されうる溶液ｐＨをもたらす。
「医薬製剤」なる語は、有効成分が有効となることを可能にするような形態の製剤であって、該製剤が投与される対象に対して毒性である追加的成分を含有しない製剤を意味する。
「薬学的に許容される」は、使用される有効成分の有効量を与えるために対象に合理的に投与されうる、そしてヒトに投与された場合に、「安全であると一般にみなされている」、例えば、生理的に許容され、典型的にはアレルギーまたは類似の望ましくない反応（例えば、胃の異常など）を引き起こさない賦形剤（ビヒクル、添加剤）および組成物に関するものである。もう１つの実施形態においては、この用語は、動物における使用、より詳しくはヒトにおける使用に関して、連邦もしくは州政府の規制機関により承認された又は米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されている分子および組成物に関するものである。
本明細書中で用いる「室温」または「ＲＴ」は約１８～約２５℃（約６４～約７７°Ｆ）の範囲の温度を意味する。
「安定」製剤は、それに含まれるタンパク質が、貯蔵に際して、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を本質的に保持する製剤である。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当技術分野で利用可能であり、Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７－３０１，Ｖｉｎｃｅｎｔ Ｌｅｅ編，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）およびＪｏｎｅｓ，Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．１０：２９－９０（１９９３）に概説されている。安定性は、選択された温度で、選択された期間にわたって測定されうる。例えば、１つの実施形態においては、安定製剤は、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも１２ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。もう１つの実施形態においては、安定製剤は、冷蔵温度（２～８℃）で少なくとも１８ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。もう１つの実施形態においては、安定製剤は、室温（２３～２７℃）で少なくとも３ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。もう１つの実施形態においては、安定製剤は、室温（２３～２７℃）で少なくとも６ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。もう１つの実施形態においては、安定製剤は、室温（２３～２７℃）で少なくとも１２ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。もう１つの実施形態においては、安定製剤は、室温（２３～２７℃）で少なくとも１８ヶ月間、有意な変化が観察されない製剤である。
本明細書中で用いる「実質的に純粋」は、適切には、結晶性抗ＰＤ－１抗体、例えば結晶性ペンブロリズマブもしくはその変異体またはその塩（例えば、結晶性抗ＰＤ－１抗体または塩を与える反応混合物から単離された生成物）の少なくとも約６０重量（ｗｔ．）％、典型的には少なくとも約７０重量％、好ましくは少なくとも約８０重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％（例えば、約９０重量％～約９９重量％）、より一層好ましくは少なくとも約９５重量％（例えば、約９５重量％～約９９重量％、または約９８重量％～１００重量％）、最も好ましくは少なくとも約９９重量％（例えば、１００重量％）が結晶性抗ＰＤ－１抗体または塩からなることを意味する。結晶性抗ＰＤ－１抗体および塩の純度レベルは、標準的な分析方法、例えば薄層クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーおよび／または質量分析を使用して決定されうる。複数の分析方法を使用し、それらの方法が、決定された純度レベルにおける実験的に有意な差をもたらす場合には、最高レベルの純度をもたらす方法が優先される。純度１００％の結晶性抗ＰＤ－１抗体または塩は、標準的な分析方法で測定された場合に検出可能な不純物を含有しないものである。
ＩＩ．本発明の方法における使用のための抗ＰＤ－１抗体
抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶の製造方法および本発明の使用方法／治療方法においては、抗ヒトＰＤ－１抗体はペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体である。ペンブロリズマブのアミノ酸配列を表２に示す。
Figure 2022512840000005
本発明の結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは３つの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２およびＣＤＲＬ３）および３つの重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３）を含む。１つの実施形態においては、３つの軽鎖ＣＤＲは配列番号１、配列番号２および配列番号３であり、３つの重鎖ＣＤＲは配列番号４、配列番号５および配列番号６である。
特定の実施形態においては、本発明は、配列番号７または配列番号７の変異体を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号８または配列番号８の変異体を含む重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを提供する。幾つかの実施形態においては、変異体の軽鎖または重鎖可変領域配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸置換を有すること以外は参照配列と同一である。特定の実施形態においては、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換である。ペンブロリズマブ変異体における置換はフレームワーク領域（すなわち、ＣＤＲの外部）または定常領域に存在し、本発明の方法において使用される添加剤へのペンブロリズマブ変異体の結合を抑制して結晶化を抑制する残基の外部に存在する。
本発明の１つの実施形態においては、結晶性抗ヒトＰＤ－１抗体は、配列番号７を含む又はそれからなる軽鎖可変領域（ＶＬ）と、配列番号８を含む又はそれからなる重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。
もう１つの実施形態においては、本発明の結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは、前記のＶＬドメインまたはＶＨドメインに対して少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％または９０％の配列相同性を有するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含み、ＰＤ－１への特異的結合を示す。もう１つの実施形態においては、結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個以上のアミノ酸置換を有するＶＬドメインおよびＶＨドメインを含み、ＰＤ－１への特異的結合を示す。
前記の実施形態のいずれかにおいて、本発明の抗ＰＤ－１結晶は完全長抗ＰＤ－１抗体（例えば、ペンブロリズマブ）を含むことが可能であり、あるいは、（１）配列番号１、配列番号２および配列番号３の軽鎖ＣＤＲと配列番号４、配列番号５および配列番号６の重鎖ＣＤＲとを含む、（２）ヒトＰＤ－１に特異的に結合する、ならびに（３）本発明の方法で使用される添加剤に特異的に結合する短いトランケーションを含む抗原結合性フラグメントでありうる。特定の実施形態においては、抗ＰＤ－１抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のクラスの免疫グロブリンから選択される完全長抗ＰＤ－１抗体である。好ましくは、抗体はＩｇＧ抗体である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む、ＩｇＧの任意のアイソタイプが使用されうる。本明細書に記載されているＶＬ領域およびＶＨ領域に、異なる定常ドメインが付加されうる。例えば、本発明の抗体（またはフラグメント）の特定の意図される使用がエフェクター機能の改変を要する場合、ＩｇＧ１以外の重鎖定常ドメインが使用されうる。ＩｇＧ１抗体は、長い半減期、およびエフェクター機能、例えば補体活性化および抗体依存性細胞傷害性をもたらすが、そのような活性は抗体の全ての用途に望ましいわけではない。そのような場合、例えばＩｇＧ４定常ドメインが使用されうる。
本発明の実施形態においては、結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは、配列番号９に記載されているアミノ酸残基の配列を含む又はそれからなる軽鎖と、配列番号１０に記載されているアミノ酸残基の配列を含む又はそれからなる重鎖を含む抗ＰＤ－１抗体である。。本発明の幾つかの実施形態においては、本発明の結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは結晶性ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブバイオシミラーである。
更なる実施形態においては、結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂは、ペンブロリズマブ軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲの外部、そして更に、カフェインに結合するペンブロリズマブ残基の外部、すなわち、ペンブロリズマブ重鎖のＴＹＲ４３６およびＡＳＮ４３４（配列番号１０の４３４位および４３６位）の外部に位置する１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の保存的アミノ酸置換を有するペンブロリズマブ変異体である。
通常、本発明の結晶性ペンブロリズマブ変異体のアミノ酸配列変異体は、参照抗体のアミノ酸配列（例えば、重鎖、軽鎖、ＶＨまたはＶＬ）に対して少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５、９８または９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。本明細書においては、配列に関する同一性または相同性は、配列を整列（アライメント）させ、配列同一性の一部としていずれの保存的置換をも考慮せずに、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性の割合を得た後で抗ＰＤ－１残基と同一である候補配列におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。抗体配列へのＮ末端、Ｃ末端または内部の伸長、欠失もしくは挿入はいずれも、配列の同一性または相同性に影響を及ぼすと解釈されるものではない。
配列同一性は、２つの配列が最適にアライメントされた場合に２つのポリペプチドのアミノ酸が同等位置において同一である度合を意味する。配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定可能であり、この場合、該アルゴリズムのパラメーターは、それぞれの参照配列の長さ全体にわたってそれぞれの配列間で最大マッチを与えるように選択される。以下の参考文献は、配列分析にしばしば使用されるＢＬＡＳＴアルゴリズムに関するものである：ＢＬＡＳＴ ＡＬＧＯＲＩＴＨＭＳ：Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．ら，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら，（１９９６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．ら，（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６；Ｗｏｏｔｔｏｎ，Ｊ．Ｃ．ら，（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１７：１４９－１６３；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．Ｍ．ら，（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．１０：６７－７０；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＣＯＲＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．ら，“Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ”．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３４５－３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｒ．Ｍ．ら，“Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ”．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（１９７８）ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐｌ．３．“Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ（編），ｐｐ．３５３－３５８，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：５５５－５６５；Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ３：６６－７０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．ら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０－３００；ＡＬＩＧＮＭＥＮＴ ＳＴＡＴＩＳＴＩＣＳ：Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－２２６８；Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－５８７７；Ｄｅｍｂｏ，Ａ．ら，（１９９４）Ａｎｎ．Ｐｒｏｂ．２２：２０２２－２０３９；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．“Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”．Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓ．Ｓｕｈａｉ編），（１９９７）ｐｐ．１－１４，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
ＩＩＩ．結晶性抗体懸濁液の製造方法
１つの態様においては、本発明は、結晶性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造方法であって、（ａ）（ｉ）約５ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含む緩衝水溶液（ここで、該抗ＰＤ－１ ｍＡｂはペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体である）、（ｉｉ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに（ｉｉｉ）カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、およびジベレリンの薬学的に許容される塩からなる群から選択される添加剤を混合して、結晶化溶液を形成させ［ここで、結晶化溶液は約６．０～約８．８のｐＨを有し、約２％～約４０％ ｗ／ｖ（重量／体積）のＰＥＧおよび約０．１％～約０．３０％ ｗ／ｖの添加剤を含む］、（ｂ）結晶形成に十分な時間にわたって該結晶化溶液をインキュベートし、（ｃ）所望により、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収することを含む製造方法に関する。
本発明の特定の実施形態においては、該方法は、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収する工程を含む。該結晶を回収する方法は当業者に公知であり、遠心分離、デカンテーション、凍結乾燥および濾過、例えば中空繊維接線流濾過を含む。
幾つかの実施形態においては、該方法は、結晶化溶液から回収された後の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶を均質化（ホモジナイズ）する工程を更に含む。均質化の工程は、より小さな粒子サイズ（例えば、０．５～５０ミクロン）を有する抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶を与える。そのような、より小さな粒子結晶は、例えば高濃度医薬製剤において使用されうる。
幾つかの実施形態においては、該方法は、最初に結晶を結晶化溶液から回収することなく、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶を均質化する工程を更に含む。この方法においては、結晶化溶液は、結晶形成に十分な時間のインキュベーション後に、例えば最初に回収することなく、強制的にシリンジに通過させることにより、均質化されうる。より小さいサイズの抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶は、所望により、均質化後に回収されうる。
本発明の特定の実施形態においては、ｍＡｂを含む緩衝水溶液との混合の前に、ＰＥＧおよび添加剤を一緒に混合して、沈殿剤溶液を形成させる。ついで、ｍＡｂを含む緩衝水溶液と沈殿剤溶液とを一緒に混合して、結晶化溶液を形成させる。
本発明の代替的実施形態においては、ｍＡｂを含む緩衝水溶液中にＰＥＧを混合して、ＰＥＧ－ｍＡｂ溶液を形成させる。ついで、添加剤を固体または溶液のいずれかとしてＰＥＧ－ｍＡｂ溶液に加えて、結晶化溶液を形成させる。
他の実施形態においては、ｍＡｂを含む緩衝水溶液を添加剤と混合して、ｍＡｂおよび添加剤を含む緩衝水溶液を形成させる。ついでこの溶液を固体または溶液のいずれかとしてのＰＥＧと混合する。
前記実施形態のいずれかにおいては、添加剤はカフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、またはジベレリンの薬学的に許容される塩である。
１つの実施形態においては、添加剤はカフェインである。
もう１つの実施形態においては、添加剤はテオフィリンである。
更にもう１つの実施形態においては、添加剤は２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファートである。
もう１つの実施形態においては、添加剤は生物活性ジベレリンまたはその薬学的に許容される塩である。特定の実施形態においては、生物活性ジベレリンはジベレリンＡ１、ジベレリンＡ１の薬学的に許容される塩、ジベレリンＡ３、ジベレリンＡ３の薬学的に許容される塩、ジベレリンＡ４、ジベレリンＡ４の薬学的に許容される塩、ジベレリンＡ７またはジベレリンＡ７の薬学的に許容される塩である。
特定の実施形態においては、添加剤はジベレリンＡ３またはその薬学的に許容される塩である。幾つかの実施形態においては、添加剤はジベレリンＡ３である。他の実施形態においては、添加剤はジベレリンＡ３のナトリウム塩である。他の実施形態においては、添加剤はジベレリンＡ３のカリウム塩である。他の実施形態においては、添加剤はジベレリンＡ３のアンモニウム塩である。
最終的な結晶化溶液中の添加剤の量は約０．１０％～約０．３０％ ｗ／ｖである。他の実施形態においては、添加剤の量は約０．１５％～約０．３０％ ｗ／ｖ、約０．１７５％～約０．３０％ ｗ／ｖ、約０．２０％～約０．３０％ ｗ／ｖ、約０．２２５％～約０．３０％ ｗ／ｖ、約０．２５％～約０．３０％ ｗ／ｖ、約０．１０％～約０．２５％ ｗ／ｖ、約０．１０％～約０．２７５％ ｗ／ｖ、約０．１０％～約０．２５％ ｗ／ｖ、約０．１０％～約０．２２５％ ｗ／ｖ、または約０．１０％～約０．２０％ ｗ／ｖである。更なる実施形態においては、添加剤の量は約０．１０％ ｗ／ｖ、約０．１２５％ ｗ／ｖ、約０．１５％ ｗ／ｖ、約０．１７５％ ｗ／ｖ、約０．２０％ ｗ／ｖ、約０．２２５％ｗ／ｖ、約０．２５％ ｗ／ｖ、約０．２７５％ ｗ／ｖまたは約０．３０％ ｗ／ｖである。
１つの実施形態においては、添加剤はカフェインであり、これは最終的な結晶化溶液中に約０．１５％ ｗ／ｖ～約０．３０％ ｗ／ｖの量で存在する。
もう１つの実施形態においては、添加剤はテオフィリンであり、これは最終的な結晶化溶液中に約０．２５％ ｗ／ｖ～約０．３０％ ｗ／ｖの量で存在する。
前記実施形態のいずれかにおいては、結晶化溶液は約１％～約１０％ ｗ／ｖのデキストラン硫酸ナトリウムを更に含むことが可能であり、これは、核形成の速度を遅くし、より大きな結晶の成長を可能にする。ある場合には、例えば、Ｘ線結晶学のような特徴づけ研究における使用のために、より大きな結晶を製造することが望ましいかもしれない。更なる実施形態においては、結晶化溶液は約１％、約１．５％ ｗ／ｖ、約２％ ｗ／ｖ、約２．５％ ｗ／ｖ、約３％ ｗ／ｖ、約３．５％ ｗ／ｖ、約４％ ｗ／ｖ、約４．５％ ｗ／ｖ、約５％ ｗ／ｖ、約５．５％ ｗ／ｖ、約６％ ｗ／ｖ、約６．５％ ｗ／ｖ、約７％ ｗ／ｖ、約７．５％ ｗ／ｖ、約８％ ｗ／ｖ、約８．５％ｖ、約９％ ｗ／ｖ、約９．５％ ｗ／ｖまたは約１０％ ｗ／ｖのデキストラン硫酸ナトリウムを含む。代替的実施形態においては、結晶化溶液は約１％～約９％ ｗ／ｖ、約１％～約８％ ｗ／ｖ、約１％～約７％ ｗ／ｖ、約１％～約６％ｗ／ｖ、約１％～約５％ ｗ／ｖ、約１％～約４％ ｗ／ｖ、約１％～約３％ ｗ／ｖ、約１％～約２％ ｗ／ｖ、約２％～約１０％ ｗ／ｖ、約２％～約９％ ｗ／ｖ、約２％～約８％ ｗ／ｖ、約２％～約７％ ｗ／ｖ、約２％～約６％ ｗ／ｖ、約２％～約５％ ｗ／ｖ、約２％～約４％、約２％～約３％、約３％～約１０％、約３％～約９％、約３％～約８％ ｗ／ｖ、約３％～約７％ ｗ／ｖ、約３％～約６％ ｗ／ｖ、約３％～約５％ ｗ／ｖ、約３％～約４％ ｗ／ｖ、約４％～約１０％ ｗ／ｖ、約４％～約９％ ｗ／ｖ、約４％～約８％ ｗ／ｖ、約４％～約７％ ｗ／ｖ、約４％～約６％ ｗ／ｖ、約４％～約５％ ｗ／ｖ、約５％～約１０％ ｗ／ｖ、約５％～約９％ ｗ／ｖ、約５％～約８％ ｗ／ｖ、約５％～約７％ ｗ／ｖ、約５％～約６％ ｗ／ｖ、約６％～約１０％ ｗ／ｖ、約６％～約９％ ｗ／ｖ、約６％～約８％ ｗ／ｖ、約６％～約７％ ｗ／ｖ、約７％～約１０％ ｗ／ｖ、約７％～約９％ ｗ／ｖ、約７％～約８％ ｗ／ｖ、約８％～約１０％ ｗ／ｖ、約８％～約８％ ｗ／ｖ、または約９％～約１０％ ｗ／ｖのデキストラン硫酸ナトリウムを含む。
本発明の前記実施形態のいずれかにおいては、結晶化溶液は約２％～約４０％ ｗ／ｖのＰＥＧを含む。ＰＥＧの平均分子量は約２５００～約３５，０００である。特定の実施形態においては、ＰＥＧはＰＥＧ ３，３５０である。代替的実施形態においては、ＰＥＧはＰＥＧ ２，５００（すなわち、平均分子量２５００を有する）、ＰＥＧ ３，０００、ＰＥＧ ４，０００、ＰＥＧ ５，０００、ＰＥＧ ６，０００、ＰＥＧ ７，０００、ＰＥＧ ８，０００、ＰＥＧ ９，０００、ＰＥＧ １０，０００、ＰＥＧ １２，０００、ＰＥＧ １４０００、ＰＥＧ １５，０００、ＰＥＧ １６００、ＰＥＧ １８００、ＰＥＧ ２０，０００、ＰＥＧ ２２，０００、ＰＥＧ ２４，０００、ＰＥＧ ２５，０００、ＰＥＧ ２６，０００、ＰＥＧ ２８，０００、ＰＥＧ ３０，０００、ＰＥＧ ３２，０００、ＰＥＧ ３４，０００、またはＰＥＧ ３５，０００である。
結晶化溶液中のＰＥＧの量は約２％～約４０％ ｗ／ｖであるが、本発明の方法における異なる分子量のＰＥＧの使用はＰＥＧの量を変化させる、と当業者に認識されるであろう。幾つかの実施形態においては、ＰＥＧは約５％～約１５％ ｗ／ｖの量で結晶化溶液中に存在する。代替的実施形態においては、ＰＥＧは約１０％～約３０％ ｗ／ｖの量で結晶化溶液中に存在する。更なる実施形態においては、ＰＥＧは約５％～約３５％ ｗ／ｖ、約５％～約３０％ ｗ／ｖ、約５％～約２５％ ｗ／ｖ、約５％～約２５％ ｗ／ｖ、約５％～約１０％ ｗ／ｖ、約１０％～約４０％ ｗ／ｖ、約５％～約３５％ ｗ／ｖ、約１０％～約３０％ ｗ／ｖ、約１０％～約２５％ ｗ／ｖ、約１０％～約２０％ ｗ／ｖ、約１０％～約１５％ ｗ／ｖ、約１５％～約４０％ ｗ／ｖ、約１５％～約３５％ ｗ／ｖ、約１５％～約３０％ ｗ／ｖ、約１５％～約２５％ ｗ／ｖ、約１５％～約２０％ ｗ／ｖ、約２０％～約４０％ ｗ／ｖ、約２０％～約３５％ ｗ／ｖ、約２０％～約３０％ ｗ／ｖ、約２０％～約２５％ ｗ／ｖ、約２５％～約４０％ ｗ／ｖ、約２５％～約３５％ ｗ／ｖ、約２５ ％～約３０％ ｗ／ｖ、約３０％～約４０％ ｗ／ｖ、または約３０％～約３５％ ｗ／ｖの量で結晶化溶液中に存在する。
本発明の方法において、結晶化溶液は、（１）抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（すなわち、ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体）を含む緩衝水溶液、（２）ＰＥＧ、および（３）本明細書に記載されているる添加剤を一緒にすることにより調製され、ここで、結晶化溶液の成分は任意の順序で加えられうる。本発明の幾つかの実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂを含む緩衝水溶液は約６．０～約８．８のｐＨを有する。更なる実施形態においては、ｐＨは約６．０、約６．２、約６．４、約６．６、約６．８、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４、約８．６または約８．８である。更なる実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂを含む緩衝水溶液のｐＨは約５．０～約６．０である。追加的実施形態においては、ｐＨは約６．８～約８．４である。
更に詳細な実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂを含む緩衝水溶液のｐＨは約６．２～約８．８、約６．２～約８．６、約６．２～約８．４、約６．２～約８．２、約６．２～約８．０、約６．２～約７．８、約６．２～約７．６、約６．２～約７．４、約６．２～約７．２、約６．２～約７．０、約６．２～約６．８、約６．２～約６．８、約６．２～約６．６、約６．２～約６．４、約６．４～約８．８、約６．４～約８．６、約６．４～約８．４、約６．４～約８．２、約６．４～約８．０、約６．４～約７．８、約６．４～約７．６、約６．４～約７．４、約６．４～約７．２、約６．４～約７．０、約６．４～約６．８、約６．４～約６．６、約６．６～約８．８、約６．６～約８．６、約６．６～約８．４、約６．６～約８．２、約６．６～約８．０、約６．６～約７．８、約６．６～約７．６、約６．６～約７．４、約６．６～約７．２、約６．６～約７．０、約６．６～約６．８、約６．８～約８．８、約６．８～約８．６、約６．８～約８．４、約６．８～約８．２、約６．８～約８．０、約６．８～約７．８、約６．８～約７．６、約６．８～約７．４、約６．８～約７．２、約６．８～約７．０、約７．０～約８．８、約７．０～約８．６、約７．０～約８．４、約７．０～約８．２、約７．０～約８．０、約７．０～約７．８、約７．０～約７．６、約７．０～約７．４、約７．０～約７．２、約７．２～約８．８、約７．２～約８．６、約７．２～約８．４、約７．２～約８．２、約７．２～約８．０、約７．２～約７．８、約７．２～約７．６、約７．２～約７．４、約７．４～約８．８、約７．４～約８．６、約７．４～約８．４、約７．４～約８．２、約７．４～約８．０、約７．４～約７．８、約７．４～約７．６、約７．６～約８．８、約７．６～約８．６、約７．６～約８．４、約７．６～約８．２、約７．６～約８．０、約７．６～約７．８、約７．８～約８．８、約７．８～約８．６、約７．８～約８．４、約７．８～約８．２、または約７．８～約８．０である。
本発明における方法のいずれかの特定の実施形態においては、ｍＡｂを含む緩衝水溶液は約５．０～約６．０のｐＨのヒスチジンバッファーを更に含む。特定の実施形態においては、ｍＡｂを含む緩衝水溶液はｐＨ５．４の２０ｍＭ ヒスチジンバッファーを更に含む。
本発明の方法の特定の実施形態においては、結晶化溶液のｐＨおよび溶液中に存在するＰＥＧの量は、
ａ）結晶化溶液のｐＨは約６．０であり、ＰＥＧの量は約２％～約４％ ｗ／ｖである；
ｂ）結晶化溶液のｐＨは約６．４であり、ＰＥＧの量は約２％～約６％ ｗ／ｖである；
ｃ）結晶化溶液のｐＨは約６．８～８．４であり、ＰＥＧの量は約６％～約１２％ ｗ／ｖである；および
ｄ）結晶化溶液のｐＨは約８．８であり、ＰＥＧの量は約１０％～約１２％ ｗ／ｖである
からなる群から選択される。前記方法の特定の実施形態においては、ＰＥＧはＰＥＧ ３３５０である。
本発明の方法の幾つかの実施形態においては、結晶化溶液中の抗ＰＤ－１ ｍＡｂの溶液濃度は約５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬである。更なる実施形態においては、結晶化溶液中の抗ＰＤ－１ ｍＡｂの溶液濃度は約５ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～約１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約１５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬ、または約４０ｍｇ／ｍＬ～約４５ｍｇ／ｍＬである。
本発明の方法のいずれかの特定の実施形態においては、結晶化溶液は約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを更に含む。幾つかの実施形態においては、結晶化溶液は約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、約６０ｍＭ、約６５ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約８５ｍＭ、約９０ｍＭ、約９５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、約２００ｍＭ、約２１０ｍＭ、約２２０ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２３０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２４５ｍＭ、または約２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを更に含む。
本発明の方法の他の実施形態においては、結晶化溶液は、前記で特定されている量のいずれかのＴｒｉｓ（トリス）バッファー（すなわち、ＨＥＰＥＳバッファーの代わりに）を更に含む。代替的実施形態においては、結晶化溶液はＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＭＯＢＳまたはＴＡＰＳＯバッファーを更に含む。
（１）抗ＰＤ－１ ｍＡｂを含む緩衝水溶液、（２）ＰＥＧおよび（３）添加剤を混合した後、結晶化溶液を、結晶形成に十分な長さの時間にわたり、約２℃～約３７℃の温度でインキュベートする。特定の実施形態においては、結晶化溶液のインキュベーション温度は約１８℃～約２５℃である。更に他の実施形態においては、結晶化溶液のインキュベーション温度は約２℃～約３５℃、約２℃～約３０℃、約２℃～約２５℃、約２℃～約２０℃、約２℃～約１５℃、約２℃～約１０℃、約５℃～約３７℃、約５℃～約３５℃、約５℃～約３０℃、約５℃～約２５℃、約５℃～約２０℃、約５℃～約１５℃、約５℃～約１０℃、約１０℃～約３７℃、約１０℃～約３５℃、約１０℃～約３０℃、約１０℃～約２５℃、約１０℃～約２０℃、約１０℃～約１５℃、約１５℃～約３７℃、約１５℃～約３５℃、約１５℃～約３０℃、約１５℃～約２５℃、約１５℃～約２０℃、約２０℃～約３７℃、約２０℃～約３５℃、約２０℃～約３０℃、約２０℃～約２５℃、約２５℃～約３７℃、約２５℃～約３５℃、約２５℃～約３０℃、約３０℃～約３７℃、または約３０℃～約３５℃である。
更なる実施形態においては、結晶化溶液を約５０℃に加熱し（この場合、それは溶液中に残存する）、ついで冷却する（この場合、それは、約３７℃以下の温度に冷却されて初めて結晶化する）。
更に詳細な実施形態においては、結晶化溶液を約５０℃に加熱し、ついで約１８℃～約２５℃の温度に冷却し、または約２５℃以下の温度に冷却する。
追加的実施形態においては、結晶化溶液は約５０℃に加熱し、ついで約４℃の温度に冷却する。
本発明の方法の特定の実施形態においては、インキュベーション温度を約４℃から約１０～４０℃まで増加させる。
本発明における方法のいずれかにおいては、結晶化溶液を、結晶形成に十分な時間にわたってインキュベートする。結晶形成は、例えば、目視検査により、またはＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングの使用により検出されうる。特定の実施形態においては、結晶化溶液を約１５分以上インキュベートする。幾つかの実施形態においては、結晶化溶液を約２時間以上インキュベートする。幾つかの実施形態においては、結晶化溶液を一晩インキュベートする。幾つかの実施形態においては、結晶化溶液を１８時間以上インキュベートする。特定の実施形態においては、結晶化溶液を約３０分以上、約１時間以上、約３時間以上、約４時間以上、約５時間以上、約６時間以上、約７時間以上、約８時間以上、約９時間以上、約１０時間以上、約１１時間以上、約１２時間以上、約１３時間以上、約１４時間以上、約１５時間以上、約１６時間以上、約１７時間以上、約２０時間以上、または約２４時間以上インキュベートする。追加的実施形態においては、結晶化溶液を約２日間、３日間、４日間、５日間、１週間、１０日間、２週間、１５日間、３週間またはそれ以上インキュベートする。
本明細書に記載されている方法のいずれかの特定の実施形態においては、結晶化溶液を、インキュベーション中に回転させ、または攪拌する。
タンパク質結晶化の種々の方法が公知である。Ｇｉｅｇｅら（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ５０：３３９；ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９９０）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８９：１。そのような技術には、ハンギングドロップ蒸気拡散（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ（１９７６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：６３００）、シッティングドロップ蒸気拡散、マイクロバッチおよび透析が含まれる。
ハンギングドロップ蒸気拡散およびシッティングドロップ蒸気拡散は共に、精製タンパク質、バッファーおよび沈殿剤を含有する液滴が、類似バッファーおよび沈殿剤をより高濃度で含有する、より大きなリザーバーと平衡化することを伴う。最初は、タンパク質溶液の液滴は、結晶化に不十分な濃度の沈殿剤を含有するが、水が液滴から蒸発し、レザーバーに移るにつれて、沈殿剤濃度は、結晶化に最適なレベルまで増加する。該系は平衡状態にあるため、これらの最適条件は、結晶化が完了するまで維持される。ハンギングドロップ法は系内のタンパク質溶液の液滴の垂直配向においてシッティングドロップ法とは異なる。
マイクロバッチ法においては、ポリペプチドを沈殿剤と混合して過飽和にし、容器を密封し、結晶が出現するまで放置する。
透析法においては、沈殿剤を含有する溶液と接触した透析膜の一方の側にポリペプチドを保持させる。膜を越えた平衡化は沈殿剤濃度を増加させ、それにより、ポリペプチドは過飽和レベルに達する。
実施例において更に詳細に記載されているとおり、これらの技術の幾つかは、本発明のペンブロリズマブ結晶を製造するために使用された。
本明細書に記載されている方法のいずれかの特定の実施形態においては、結晶化溶液を蒸気拡散またはバッチ結晶化により製造する。
本明細書に記載されている結晶性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体の製造方法のいずれかの特定の実施形態においては、該方法は、インキュベーション工程の前または途中に、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの結晶を結晶化溶液に播種する工程を更に含む。
抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶は、その物理的特性、例えば結晶サイズ、形状、表面形態、総表面積および多孔性を調べ又は特徴づけるために、種々の方法により分析されうる。そのような分析技術には、例えば、電子線回折および固体核磁気共鳴（ｓｓＮＭＲ）、光学顕微鏡検査、透過型電子顕微鏡検査、走査電子顕微鏡検査、原子間力顕微鏡検査および種々の光散乱技術が含まれる。また、本発明の結晶における抗ＰＤ－１ ｍＡｂの生物活性および／または生物物理学的特性は、所望の分析技術に適したバッファー中に抗体結晶を「再溶解」または可溶化することにより分析されうる。例えば、可溶化された抗ＰＤ－１ ｍＡｂは、ＥＬＩＳＡ、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ ＰＡＧＥおよび動的光散乱の１以上により分析されうる。
ＩＶ．抗ＰＤ－１結晶性抗体懸濁液および組成物
１つの態様においては、本発明は、本発明の任意の方法、すなわち、本明細書に記載されている抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶の任意の製造方法により形成された単離された結晶を提供する。
本発明はまた、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む単離された結晶であって、空間群Ｐ２２２１ ａ＝４３．８オングストローム ｂ＝１１３．９オングストローム ｃ＝１７５．０オングストローム，α＝β＝γ＝９０°により特徴づけられる結晶に関する。
１つの実施形態においては、本発明は、ポリペプチドを含むペンブロリズマブ結晶を提供し、ここで、該ポリペプチドは、表７の構造座標により示される骨格原子上に重ね合わされた場合に約２．０オングストローム未満の保存された残基骨格原子の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標により特徴づけられる。
幾つかの実施形態においては、本発明のペンブロリズマブ結晶またはペンブロリズマブ変異体結晶は、回収後、約０．５～２００ミクロンの粒子サイズを有する。特定の実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶、例えばペンブロリズマブ結晶を結晶化後に均質化して、約０．５～約５０ミクロンの均質化後粒子サイズを得る。
１つの実施形態においては、本発明は、約１８２．１６、１８１．５４、１７９．９９、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、７６．８８および７６．０４ｐｐｍにおいてピークを示す固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む結晶性ペンブロリズマブに関する。もう１つの態様においては、約１８３．０７、１８２．１６、１８１．５４、１８０．５５、１７９．９９、１１０．７０、１１０．１５、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、１０１．４９、９９．７５、９８．５６、７６．８８、７６．０４、７４．９７、７４．４１、７３．５２、７２．６９、１３．８５、１３．２７、１２．２６および１１．１３ｐｐｍにおいてピークを示す固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む結晶性ペンブロリズマブを提供する。もう１つの実施形態においては、結晶性ペンブロリズマブは、図１０Ａに示されている固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる。
もう１つの態様においては、本発明は、本発明の新規抗ＰＤ－１結晶（すなわち、新規ペンブロリズマブ結晶またはペンブロリズマブ変異体結晶）と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。医薬組成物を製造するためには、本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶またはそのような結晶から可溶化された抗ＰＤ－１ ｍＡｂを少なくとも１つの医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）を参照されたい。本発明の医薬組成物において使用される抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶は、該抗体の生物活性および安定性が所望の範囲内で維持される限り、いずれかの特定の回折特性を有することは要求されない。
幾つかの実施形態においては、結晶化の途中または後で結晶化液に賦形剤を直接加える。他の実施形態においては、まず、結晶を該液体から回収し、安定化溶液中の懸濁により洗浄し、該安定化溶液から回収し、ついで、賦形剤を含む液体溶液中に懸濁させる。該液体の組成物は任意の薬学的に許容される媒体であることが可能であり、例えば水溶液および油中水型混合物を含みうる。
固体形態の結晶の医薬組成物は、例えば、窒素、空気または不活性ガスの気流を該結晶上に通過させることにより、空気乾燥、真空乾燥または凍結乾燥により、結晶と所望の賦形剤とを含む液体懸濁液を乾燥させることにより製造されうる。最終産物中の水分含有率は典型的には１０重量％未満、７重量％未満、５重量％未満または３重量％未満である。
液体懸濁液中または乾燥固体中のペンブロリズマブ結晶から可溶化されたペンブロリズマブを含む医薬組成物は、所望の量の該結晶を薬学的に許容される溶解バッファーに加え、結晶が溶解するまで４℃でインキュベートすることにより製造されうる。１つの実施形態においては、溶解バッファーは１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）、０．０２％ ポリソルベート８０（ｗ／ｖ）および４％以下のスクロース（ｗ／ｖ）を含む。１つの実施形態においては、生じた組成物中の粒状物を投与前に例えば遠心分離または濾過により除去する。
特定の実施形態においては、医薬組成物は結晶懸濁液であり、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの濃度は約５～４００ｍｇ／ｍＬである。追加的実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの濃度は７５ｍｇ／ｍＬ以上、１００ｍｇ／ｍＬ以上、１２５ｍｇ／ｍＬ以上、１５０ｍｇ／ｍＬ以上、１７５ｍｇ／ｍＬ以上、２００ｍｇ／ｍＬ以上、２２５ｍｇ／ｍＬ以上、２５０ｍｇ／ｍＬ以上、２７５ｍｇ／ｍＬ以上、３００ｍｇ／ｍＬ以上、３２５ｍｇ／ｍＬ以上または３５０ｍｇ／ｍＬ以上である。
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約５ｍＭ～約５０ｍＭのバッファーを更に含む。幾つかの実施形態においては、バッファーの量は約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭまたは約５０ｍＭである。
特定の実施形態においては、本発明の医薬組成物は約０．０１％～約０．１０％ ｗ／ｖの非イオン性界面活性剤を更に含む。幾つかの実施形態においては、非イオン性界面活性剤の量は約０．０１％～約０．０５％ ｗ／ｖ、約０．０１％～約０．０４％ ｗ／ｖ、０．０２％～約０．０５％ ｗ／ｖまたは０．０２％～約０．０４％ ｗ／ｖである。更なる実施形態においては、本発明の医薬組成物はいかなる界面活性剤も含まない。
Ｖ．使用方法
１つの態様においては、本発明は、（１）本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶、すなわち、本明細書に記載されている製造方法により製造されたペンブロリズマブの結晶もしくはペンブロリズマブ変異体の結晶、または（２）本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶と薬学的に許容される担体とを含む組成物の有効量を患者（対象）に投与することを含む、癌の治療を要する患者における癌の治療方法に関する。本発明の幾つかの実施形態においては、ペンブロリズマブ結晶を、患者への投与の前に、溶液に溶解する（例えば、水性製剤として製剤化する）。この方法の特定の実施形態においては、組成物を静脈内投与により対象に投与する。他の実施形態においては、組成物を皮下投与により対象に投与する。
本発明における治療方法の幾つかの実施形態においては、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの投与量は２００ｍｇであり、これを約３週間ごとに患者に投与する。代替的実施形態においては、結晶性ｍＡｂの投与量は４００ｍｇであり、これを約６週間ごとに患者に投与する。
本発明の幾つかの実施形態においては、ペンブロリズマブ結晶、ペンブロリズマブ変異体結晶、またはペンブロリズマブ結晶もしくはペンブロリズマブ変異体結晶を含む組成物を、３週間に１回、１２週間以上にわたって患者に投与する。他の実施形態においては、本発明の結晶または組成物を、３週間に１回、１５週間以上、１８週間以上、２１週間以上、２４週間以上、２７週間以上、３０週間、３３週間以上、３６週間以上、３９週間以上、４２週間以上、４５週間以上、４８週間以上、５１週間以上、５４週間以上、５７週間以上、６０週間以上、６３週間以上、６６週間以上、６９週間以上、７２週間以上、７５週間以上、７８週間以上、８１週間以上、８４週間以上、８７週間以上または９０週間以上にわたって患者に投与する。
本発明の他の実施形態においては、ペンブロリズマブ結晶、ペンブロリズマブ変異体結晶、またはペンブロリズマブ結晶もしくはペンブロリズマブ変異体結晶を含む組成物を、６週間に１回、１２週間以上にわたって患者に投与する。他の実施形態においては、本発明の結晶または組成物を、６週間に１回、１８週間以上、２４週間以上、３０週間以上、３６週間以上、４２週間以上、４８週間以上、５４週間以上、６０週間以上、６６週間以上、７２週間以上、７８週間以上、８４週間以上、９０週間以上、９６週間以上、１０２週間以上、１０８週間以上、１１４週間以上、１２０週間以上、１２６週間以上または１３２週間以上にわたって患者に投与する。
第１の実施形態（実施形態Ｅ１）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含む。
第２の実施形態（実施形態Ｅ２）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における黒色腫（メラノーマ）の治療方法を含む。
実施形態Ｅ２の下位実施形態においては、黒色腫は切除不能または転移性である。
実施形態Ｅ２のもう１つの下位実施形態においては、黒色腫はアジュバント黒色腫である。特定の実施形態においては、黒色腫は、切除されたステージＩＩＩ黒色腫である。
第３の実施形態（実施形態Ｅ３）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療方法を含む。
実施形態Ｅ３の下位実施形態においては、ＮＳＣＬＣは扁平上皮性である。代替的実施形態においては、ＮＳＣＬＣは非扁平上皮性である。
実施形態Ｅ３の下位実施形態においては、該方法は、カルボプラチン－パクリタキセルまたはナブ－パクリタキセルを患者に投与することを更に含む。
実施形態Ｅ３の下位実施形態（実施形態Ｅ３－Ａ）においては、患者は、高いＰＤ－Ｌ１発現を伴う腫瘍［（腫瘍比率スコア（ＴＰＳ）≧５０％）］を有し、以前に白金含有化学療法で治療されていない。
実施形態Ｅ３のもう１つの下位実施形態（実施形態Ｅ３－Ｂ）においては、患者は、ＰＤ－Ｌ１発現を伴う腫瘍（ＴＰＳ≧１％）を有し、以前に白金含有化学療法で治療されていた。実施形態Ｅ３－Ｂの特定の実施形態においては、患者は、白金含有化学療法を受けた際または受けた後に疾患進行を示した。
実施形態Ｅ３の特定の実施形態においては、患者は、ＰＤ－Ｌ１発現を伴う腫瘍（ＴＰＳ≧１％）を有し、以前に白金含有化学療法で治療されていない。
実施形態Ｅ３の特定の実施形態（実施形態Ｅ３－ＡおよびＥ３－Ｂを含む）においては、ＰＤ－Ｌ１ ＴＰＳをＦＤＡ承認試験により決定する。
実施形態Ｅ３の特定の実施形態（実施形態Ｅ３－ＡおよびＥ３－Ｂを含む）においては、患者の腫瘍はＥＧＦＲまたはＡＬＫゲノム異常を有さない。
実施形態Ｅ３の特定の実施形態（実施形態Ｅ３－ＡおよびＥ３－Ｂを含む）においては、患者の腫瘍はＥＧＦＲまたはＡＬＫゲノム異常を有し、該抗ＰＤ－１抗体またはその抗原結合性フラグメントの投与を受ける前に、ＥＧＦＲまたはＡＬＫ異常の治療を受けた際または受けた後に疾患進行を示した。。
第４の実施形態（実施形態Ｅ４）においては、本発明は、（１）本発明のペンブロリズマブ結晶を患者に投与すること、ならびに（２）ペメトレキセドおよびカルボプラチンを患者に投与することを含む、ヒト患者における転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療方法を含む。実施形態Ｅ４の下位実施形態においては、患者は、ペメトレキセドおよびカルボプラチンと組合された本発明のペンブロリズマブ結晶での併用治療レジメンを開始する前に、以前に抗癌治療剤で治療されていない。
実施形態Ｅ３およびＥ４（その下位実施形態を含む）の特定の実施形態においては、患者は非扁平上皮非小細胞肺癌を有する。
実施形態Ｅ４の下位実施形態においては、ペメトレキセドを５００ｍｇ／ｍ２の量で患者に投与する。
実施形態Ｅ４の下位実施形態においては、ペメトレキセドを２１日ごとに静脈内注入により患者に投与する。特定の実施形態においては、注入時間は約１０分である。
実施形態Ｅ４の下位実施形態（実施形態Ｅ４－Ａ）においては、本発明は、１日１回、約４００μｇ～約１０００μｇの葉酸を患者に投与することを更に含み、該投与は患者へのペメトレキセドの投与の約７日前から開始し、患者へのペメトレキセドの最終用量の投与の約２１日後まで継続する。特定の実施形態においては、葉酸を経口投与する。
実施形態Ｅ４およびＥ４－Ａの下位実施形態（実施形態Ｅ４－Ｂ）においては、本発明は、ペメトレキセドの最初の投与の約１週間前およびペメトレキセドの投与の約３サイクルごと（すなわち、約９週間ごと）に約１ｍｇのビタミンＢ１２を患者に投与することを更に含む。特定の実施形態においては、ビタミンＢ１２を筋肉内投与する。
実施形態Ｅ４、Ｅ４－ＡおよびＥ４－Ｂの下位実施形態（実施形態Ｅ４－Ｃ）においては、本発明は、ペメトレキセド投与の前日、当日および翌日に約４ｍｇのデキサメタゾンを患者に１日２回投与することを更に含む。特定の実施形態においては、デキサメタゾンを経口投与する。
第５の実施形態（実施形態Ｅ５）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における再発性または転移性頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）の治療方法を含む。
実施形態Ｅ５の特定の下位実施形態においては、患者は以前に白金含有化学療法で治療されておらず、患者の腫瘍はＰＤ－Ｌ１を発現する（複合陽性スコア（ＣＰＳ）≧２０）。
実施形態Ｅ５の特定の下位実施形態においては、患者は再発性または転移性ＨＮＳＣＣを有する。
実施形態Ｅ５の下位実施形態においては、患者は以前に白金含有化学療法で治療されていた。特定の実施形態においては、患者は白金含有化学療法の際または後に疾患進行を示した。
第６の実施形態（実施形態Ｅ６）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における難治性古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の治療方法を含む。
第７の実施形態（実施形態Ｅ７）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）の治療方法を含み、該患者はｃＨＬに対する３つ以上（３ ｏｒ ｍｏｒｅ ｌｉｎｅｓ）の療法の後で再発している。
実施形態Ｅ６およびＥ７の下位実施形態においては、患者は成人患者である。
実施形態Ｅ６およびＥ７の代替的下位実施形態においては、患者は小児患者である。
第８の実施形態（実施形態Ｅ８）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における局所進行性または転移性尿路上皮癌の治療方法を含む。
実施形態Ｅ８の下位実施形態においては、患者はシスプラチン含有化学療法に適格でない。
実施形態Ｅ８の下位実施形態においては、患者は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍を有する。幾つかの実施形態においては、ＰＤ－Ｌ１発現レベルはＣＰＳ＞１０により特徴づけられる。
実施形態Ｅ８の下位実施形態においては、患者は白金含有化学療法の途中もしくは後または白金含有化学療法でのネオアジュバントもしくはアジュバント治療の１２ヶ月以内に疾患進行を示す。
第９の実施形態（実施形態Ｅ９）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における切除不能または転移性のマイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損固形腫瘍の治療方法を含む。
実施形態Ｅ９の下位実施形態においては、患者は事前の抗癌治療の後で疾患進行を示した。
第１０の実施形態（実施形態Ｅ１０）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における切除不能または転移性のマイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）またはミスマッチ修復欠損結腸直腸癌の治療方法を含む。
実施形態Ｅ１０の下位実施形態においては、患者はフルオロピリミジン、オキサリプラチンおよびイリノテカンでの事前の治療の後に疾患進行を示した。
第１１の実施形態（実施形態Ｅ１１）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における再発性局所進行性または転移性胃癌の治療方法を含む。
第１２の実施形態（実施形態Ｅ１２）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における再発性局所進行性または転移性胃食道接合部腺癌の治療方法を含む。
実施形態Ｅ１１およびＥ１２の下位実施形態においては、患者の腫瘍はＰＤ－Ｌ１を発現する［複合陽性スコア（ＣＰＳ）≧１］。
実施形態Ｅ１１およびＥ１２の下位実施形態においては、患者は、フルオロピリミジンおよび白金含有化学療法を含む２つ以上の事前の療法の際または後に疾患進行を示す。
実施形態Ｅ１１およびＥ１２の下位実施形態においては、患者は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ標的化療法を含む２つ以上の事前の療法の際または後に疾患進行を示す。
第１３の実施形態（実施形態Ｅ１３）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における子宮頸癌の治療方法を含む。
実施形態Ｅ１３の下位実施形態においては、患者は再発性または転移性子宮頸癌を有する。
実施形態Ｅ１３の更なる下位実施形態においては、患者は化学療法の際または後に疾患進行を示した。
実施形態Ｅ１３のもう１つの下位実施形態においては、患者は、ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍を有する［ＣＰＳ＞１］。
第１４の実施形態（実施形態Ｅ１４）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、患者は、黒色腫（メラノーマ）、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、リンパ腫、腎癌、中皮腫、卵巣癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、メルケル細胞癌および唾液腺癌（ｓａｌｉｖａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）からなる群から選択される癌を有する。
第１５の実施形態（実施形態Ｅ１５）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、患者は小細胞肺癌を有する。
実施形態Ｅ１５の下位実施形態においては、患者は転移性ＳＣＬＣを有する。特定の下位実施形態においては、患者は、白金に基づく化学療法および少なくとも１つの他の事前の療法で以前に治療されており、白金に基づく化学療法の際または後に疾患進行を示した。特定の下位実施形態においては、患者は、白金に基づく化学療法および少なくとも１つの他の事前の療法の際または後に疾患進行を示した。
第１６の実施形態（実施形態Ｅ１６）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における非ホジキンリンパ腫の治療方法を含む。
実施形態Ｅ１６の下位実施形態においては、非ホジキンリンパ腫は縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。幾つかの実施形態においては、非ホジキンリンパ腫は、難治性である原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）である。他の実施形態においては、患者はＰＭＢＣＬを有し、２つ以上の事前の療法の後に再発した。
第１７の実施形態（実施形態Ｅ１７）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における乳癌の治療方法を含む。
実施形態Ｅ１７の下位実施形態においては、乳癌はトリプルネガティブ（三重陰性）乳癌である。
実施形態Ｅ１７の下位実施形態においては、乳癌はＥＲ＋／ＨＥＲ２－ 乳癌である。
第１８の実施形態（実施形態Ｅ１８）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における鼻咽頭癌の治療方法を含む。
第１９の実施形態（実施形態Ｅ１９）においては、本発明は、患者に本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を投与することを含む、ヒト患者における甲状腺癌の治療方法を含む。
第２０の実施形態（実施形態Ｅ２０）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における唾液腺癌の治療方法を含む。
第２１の実施形態（実施形態Ｅ２１）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者におけるメルケル細胞癌（ＭＣＣ）の治療方法を含む。下位実施形態においては、ＭＣＣは再発性局所進行性または転移性である。
第２２の実施形態（実施形態Ｅ２２）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、癌は、黒色腫（メラノーマ）、非小細胞肺癌、再発性または難治性古典的ホジキンリンパ腫、頭頸部扁平上皮癌、子宮頸癌、尿路上皮癌、食道癌、胃癌、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫および肝細胞癌からなる群から選択される。
第２３の実施形態（実施形態Ｅ２３）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、癌はヘム悪性腫瘍である。
実施形態Ｅ２３の下位実施形態においては、ヘム悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ＥＢＶ陽性ＤＬＢＣＬ、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄性細胞白血病１タンパク質（ＭＣＬ－１）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）からなる群から選択される。
第２４の実施形態（実施形態Ｅ２４）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、患者は、高い突然変異負荷（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ）を伴う腫瘍を有する。
第２６の実施形態（実施形態Ｅ２６）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における肝細胞癌の治療方法を含む。実施形態Ｅ２６の下位実施形態においては、患者は以前にソラフェニブで治療されていた。
第２７の実施形態（実施形態Ｅ２７）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における腎癌の治療方法を含む。実施形態Ｅ２７の下位実施形態においては、腎癌は明細胞腎細胞癌である。
第２８の実施形態（実施形態Ｅ２８）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における食道癌の治療方法を含む。実施形態Ｅ２８の下位実施形態においては、食道癌は食道の再発性局所進行性または転移性扁平上皮癌である。もう１つの下位実施形態においては、患者は１つ以上の全身療法の後に疾患進行を示した。もう１つの下位実施形態においては、患者の腫瘍はＰＤ－Ｌ１を発現する［複合陽性スコア（ＣＰＳ）＞１０］。
第２９の実施形態（実施形態Ｅ２９）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における卵巣癌の治療方法を含む。
第３０の実施形態（実施形態Ｅ３０）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における結腸直腸癌の治療方法を含む。
第３１の実施形態（実施形態Ｅ３１）においては、本発明は、本発明のペンブロリズマブ結晶の有効量を患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法を含み、ここで、癌は、黒色腫（メラノーマ）、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、乳癌、胃腸癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、腎癌、中皮腫、卵巣癌、食道癌、肛門癌、胆道癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、甲状腺癌、唾液腺癌、前立腺癌（例えば、ホルモン抵抗性前立腺腺癌）、膵臓癌、結腸癌、食道癌、肝癌、甲状腺癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌神経膠芽細胞腫、神経膠腫および他の新生物悪性腫瘍からなる群から選択される。
本明細書に記載されている本発明の方法のいずれかにおいては、「本発明のペンブロリズマブ結晶」または「本発明の抗ＰＤ－１結晶性ｍＡｂ」は本発明の任意のペンブロリズマブ結晶もしくはペンブロリズマブ変異体結晶（すなわち、本明細書に記載されている結晶、または本明細書に記載されている方法により製造される結晶）、または「本発明の方法における使用のための抗ＰＤ－１抗体」と題する本明細書における発明の詳細な説明の第ＩＩ節もしくは「抗ＰＤ－１結晶性抗体懸濁液および組成物」と題する第ＩＶ節に記載されている、本発明のペンブロリズマブ結晶もしくはペンブロリズマブ変異体結晶を含む組成物でありうる。
生検または外科的材料における腫瘍浸潤性リンパ球の存在に関して無病生存および全生存の改善を示す悪性腫瘍、例えば黒色腫、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌、胃／食道癌、乳癌、膵臓癌および卵巣癌が、本明細書に記載されている方法および治療に含まれる。そのような癌の亜型はＴリンパ球による免疫制御に感受性であることが公知である。また、本明細書に記載されている抗体を使用して増殖抑制されうる難治性または再発性悪性腫瘍が含まれる。
幾つかの実施形態においては、卵巣癌、腎臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、肝臓癌、胃癌、食道癌および黒色腫を含む、被検組織サンプルにおけるＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の発現の上昇により特徴づけられる癌を有する対象に、本発明の組成物を投与する。本発明の組成物による治療から利益を受けうる追加的な癌には、例えばカポジ肉腫、肝臓癌、鼻咽頭癌、リンパ腫、子宮頸癌、外陰癌、肛門癌、陰茎癌および口腔癌の原因に関連していることが公知であるヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスクラスＡ、ＢおよびＣ、エプスタインバーウイルス、ヒトパピローマウイルスのようなウイルスによる持続感染に関連した癌が含まれる。
追加的な態様は、感染もしくは感染症を有する患者、それを有する疑いのある患者またはそれを有するリスクのある患者を治療するための、本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶または医薬組成物の使用方法を含む。したがって、本発明は、本発明の抗ＰＤ－１結晶性ｍＡｂまたは本発明の抗ＰＤ－１結晶性ｍＡｂを含む組成物の有効量を対象に投与することを含む、哺乳動物対象における慢性感染の治療方法を提供する。この方法の幾つかの特定の実施形態においては、該組成物を静脈内投与により対象に投与する。他の実施形態においては、該組成物を皮下投与により対象に投与する。
この態様においては、本発明の組成物は、病原体、毒素および自己抗原に対する免疫応答を刺激するために、単独で、またはワクチンと組合せて使用されうる。本発明の組成物は、ヒト免疫不全ウイルス、肝炎ウイルスクラスＡ、ＢおよびＣ、エプスタインバーウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトパピローマウイルスおよびヘルペスウイルス（これらに限定されるものではない）を含む、ヒトに対して感染性であるウイルスに対する免疫応答を刺激するために使用されうる。アンタゴニスト抗ＰＤ－１抗体または抗体フラグメントを含む本発明の組成物は、細菌または真菌寄生生物および他の病原体による感染に対する免疫応答を刺激するために使用されうる。Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎およびＨＩＶによるウイルス感染は、慢性ウイルス感染と見なされるものの１つである。
本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶および組成物は１以上の「追加的な治療用物質」と組合せて患者に投与されうる。追加的な治療用物質は生物療法剤（ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＶＥＧＦ受容体、他の増殖因子受容体、ＣＤ２０、ＣＤ４０、ＣＤ－４０Ｌ、ＯＸ－４０、４－ＩＢＢおよびＩＣＯＳに対する抗体を含むが、これらに限定されるものではない）、増殖抑制物質、免疫原性物質［例えば、弱毒化癌細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸でパルスされた樹状細胞のような抗原提示細胞、免疫刺激性サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮα２、ＧＭ－ＣＳＦ）、および免疫刺激性サイトカイン、例えばＧＭ－ＣＳＦ（これに限定されるものではない）をコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞］でありうる。
前記のとおり、本発明の方法の幾つかの実施形態においては、該方法は、追加的な治療用物質を投与することを更に含む。特定の実施形態においては、追加的な治療用物質は抗ＬＡＧ３抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗ＧＩＴＲ抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗ＴＩＧＩＴ抗体またはその抗原結合性フラグメント、抗ＣＤ２７抗体またはその抗原結合性フラグメントである。１つの実施形態においては、追加的な治療用物質は、ＩＬ－１２を発現するニューカッスル病ウイルスベクターである。もう１つの実施形態においては、追加的な治療用物質はジナシクリブ（ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）である。更に他の実施形態においては、追加的な治療用物質はＳＴＩＮＧアゴニストである。更に他の実施形態においては、追加的な治療用物質はＰＡＲＰインヒビターである。更に他の実施形態においては、追加的な治療用物質はムリ（ｍｕｌｉ）－チロシンキナーゼインヒビターである。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はＭＥＫインヒビターである。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はＣＸＣＲ２アンタゴニストである。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はナバリキシン（ｎａｖａｒｉｘｉｎ）である。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はオラルパリブ（ｏｌａｒｐａｒｉｂ）である。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はセルメチニブ（ｓｅｌｕｍｅｔｉｎｉｂ）である。追加的な実施形態においては、追加的な治療用物質はアキシチニブ（ａｘｉｔｉｎｉｂ）である。
追加的な治療用物質のための適切な投与経路には、例えば非経口送達、例えば筋肉内、皮下、および髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内が含まれうる。薬物は、種々の通常の方法で、例えば腹腔内、非経口、動脈内または静脈内注射により投与されうる。
追加的な治療用物質の投与量の選択は、該物質の血清または組織代謝回転速度、症状の程度、該物質の免疫原性、および治療される個体における標的細胞、組織または器官の接近可能性を含む幾つかの要因に左右される。追加的な治療用物質の投与量は、許容レベルの副作用をもたらす量であるべきである。したがって、各追加的治療用物質（例えば、生物療法または化学療法剤）の用量および投与頻度は、部分的には、個々の治療用物質、治療される癌の重症度、および患者の特性に左右される。抗体、サイトカインおよび小分子の適切な用量を選択する際の指針が利用可能である。例えば、以下のものを参照されたい：Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６）Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂ．Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１－６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６－１９７３；Ｓｌａｍｏｎら（２００１）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３－７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３－６１９；Ｇｈｏｓｈら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４－３２；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４－１６０２；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００３（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５７ｔｈ Ｅｄ）；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｍｐａｎｙ；ＩＳＢＮ：１５６３６３４４５７；第５７版（２００２年１１月）。適切な投与レジメンの決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野で知られている若しくは疑われている又は治療に影響を及ぼすと予想されるパラメータまたは因子を用いて、臨床家によりなされることが可能であり、例えば、患者の臨床履歴（例えば、過去の治療）、治療される癌の型および病期、ならびに該組合せ療法における治療用物質の１以上に対する応答のバイオマーカーに左右される。
追加的な治療用物質のための薬学的に許容される担体または賦形剤の選択を容易にするための種々の参考文献が利用可能である。例えば、以下のものを参照されたい：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８４）；Ｈａｒｄｍａｎら（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ．。
幾つかの実施形態においては、追加的な治療用物質は連続注入により、または例えば１日間、週１～７回、１週間、２週間、３週間、毎月、隔月などの間隔の投与により投与される。好ましい投与プロトコルは、有意な望ましくない副作用を回避する最大用量または投与頻度を含むものである。合計週用量は、一般に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ体重以上である。例えば、Ｙａｎｇら（２００３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７－４３４；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２－１６９８；Ｌｉｕら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１－４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３－１４４を参照されたい。小分子治療用物質、例えばペプチド模倣物、天然物または有機化合物の望ましい用量はモル／ｋｇベースの抗体またはポリペプチドの場合とほぼ同じである。
ある実施形態においては、投与は、治療経過にわたって、追加的治療用物質の１．０、３．０および１０ｍｇ／ｋｇの漸増用量を対象に投与することを含む。製剤は再構成液体製剤でありうる。あるいは、それは、未だ凍結乾燥されていない液体製剤でありうる。時間経過は変動可能であり、所望の効果が得られる限り継続されうる。ある実施形態においては、用量の漸増は約１０ｍｇ／ｋｇの用量まで継続される。ある実施形態においては、対象は、黒色腫または他の形態の固形腫瘍の組織学的または細胞学的診断を有し、ある場合においては、対象は測定不可能な疾患を有しうる。ある実施形態においては、対象は他の化学療法剤で治療されているが、他の実施形態においては、対象は治療を受けていない。
ある実施形態においては、投薬レジメンは、患者内の用量増加を伴って、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの用量を投与することを含む。ある実施形態においては、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇの用量を３週間ごと又は２週間ごとの間隔で投与する。更なる追加的な実施形態においては、黒色腫患者または他の固形腫瘍を有する患者に３週間隔で３ｍｇ／ｋｇの用量を投与する。これらの実施形態においては、患者は切除不能な疾患を有するべきであるが、患者は過去に手術を受けていてもよい。
ある実施形態においては、本明細書に記載されている医薬製剤のいずれかの３０分間のＩＶ注入を対象に投与する。漸増用量の或る実施形態においては、投与間隔は第１投与と第２投与との間で約２８日（±１日）ある。ある実施形態においては、第２投与と第３回投与との間の間隔は約１４日（±２日）である。ある実施形態においては、投与間隔は第２投与の後の投与に関しては約１４日（±２日）である。
皮下投与は、シリンジを使用して、あるいは他の注射装置（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ－ｅａｓｅ（登録商標）装置）、インジェクターペン；または無針装置（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒおよびＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（登録商標））を使用して行われうる。
本発明の実施形態はまた、（ｉ）（ａ）治療（例えば、人体の治療）、（ｂ）医薬、（ｃ）抗腫瘍免疫応答の誘導または増強、（ｄ）患者における１以上の腫瘍マーカーの数の減少、（ｅ）腫瘍または血液癌の成長の阻止または遅延、（ｆ）ＰＤ－１関連疾患の進行の阻止または遅延、（ｇ）進行癌の阻止または遅延、（ｈ）ＰＤ－１関連疾患の安定化、（ｉ）腫瘍細胞の成長または生存の抑制、（ｊ）１以上の癌性病変または腫瘍のサイズの縮小または排除、（ｋ）ＰＤ－１関連疾患の進行、開始または重症度の低減、（ｌ）癌のようなＰＤ－１関連疾患の臨床症状の重症度または持続期間の低減、（ｍ）類似未治療患者の予想生存期間と比較した場合の患者の生存期間の延長、ｎ）癌性状態または他のＰＤ－１関連疾患の完全または部分的な寛解の誘導、（ｏ）癌の治療、あるいは（ｐ）感染または感染症の治療における使用のための、（ｉｉ）前記（ａ）～（ｐ）のための医薬または組成物としての使用のための、あるいは（ｉｉｉ）前記（ａ）～（ｐ）のための医薬の製造における使用のための、本発明の抗ＰＤ－１ ｍＡｂ結晶（例えば、結晶性ペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体）または本明細書に記載されている結晶もしくは本明細書に記載されている方法により製造される結晶を含む製剤の１以上を含む。
本明細書中に言及されている全ての刊行物を、本発明に関連して使用されうる方法論および材料を記載および開示する目的で、参照により本明細書に組み入れることとする。
添付の図面を参照して本発明の種々の実施形態が本明細書に記載されているが、本発明はそれらの厳密な実施形態に限定されず、それらにおいては種々の変更および修飾が、添付の特許請求の範囲において定義されている本発明の範囲または精神から逸脱することなく、当業者により施されうる、と理解されるべきである。
実施例１
ペンブロリズマブのハイスループット結晶化スクリーニング
アミノ酸、ペプチド、有機塩および酸ならびに生物学的に活性な小分子を含む多数の小分子試薬を、ペンブロリズマブの結晶化を促進するそれらの能力に関してスクリーニングした（Ｈａｍｐｔｏｎ ＲｅｓｅａｒｃｈのＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔ Ｂｉｏスクリーン（カタログ番号ＨＲ２－０８８））。１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ ５．６）中にペンブロリズマブ（４４ｍｇ／ｍＬ）を含む溶液を、０．２μｌのペンブロリズマブおよび０．２μｌのスクリーニング溶液を使用して、１５３６個のユニーク結晶化プレート（マイクロバッチアンダーオイル）内でスクリーニングした（Ｌｕｆｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４２：１７０－１７９（２００３））。該スクリーニング溶液は以下の３つの主要範疇に分類されうる：（１）塩、バッファー（８種のバッファーと組合された３つの濃度の３６種の塩）；（２）ＰＥＧ、塩、バッファー（３６種の塩および８種のバッファーと組合された２つの濃度の８種のＰＥＧ）；および（３）ＰＥＧ、Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｓ Ｂｉｏ試薬。Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｓ Ｂｉｏスクリーンは単一のディープウェルブロック（Ｇｒｅｉｎｅｒ ７８０２６１）ハイスループットフォーマットにおける９６種の溶液から構成される。各試薬は０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳナトリウム（ｐＨ６．８）バッファー中の小分子または高分子消化物の混合物であった。各溶液は２～２０種の小分子を含有していた。Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｓ Ｂｉｏスクリーンを、沈殿剤としての１５％ ＰＥＧ ３３５０、０．０２Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）中で１：１０希釈した。実験は４℃、２０～２２℃および３０℃のそれぞれで行った。プレートウェルを経時的な結晶形成に関して顕微鏡的にモニターした。
１か月後、ペンブロリズマブの結晶化を誘発する幾つかの分子を特定した。ＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステム（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して結晶を可視化した。キラル結晶の二次非線形イメージング（Ｓｅｃｏｎｄ Ｏｒｄｅｒ Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ Ｃｈｉｒａｌ Ｃｒｙｓｔａｌｓ）（ＳＯＮＩＣＣ）は、タンパク質結晶を可視化するためのイメージング技術であり、これはタンパク質結晶を見出し、特定する。２つの技術、すなわち、結晶化度を調べる二次高調波発生（Ｓｅｃｏｎｄ Ｈａｒｍｏｎｉｃ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）（ＳＨＧ）と、タンパク質性サンプルに特異的である紫外線２光子励起蛍光（Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｔｗｏ－Ｐｈｏｔｏｎ Ｅｘｃｉｔｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（ＵＶ－ＴＰＥＦ）とを一緒に組合せて、タンパク質結晶をポジティブに特定する。結晶は真っ黒の背景に対しては白く見え、暗い環境においてさえも結晶の特定を可能にする。ＳＯＮＩＣＣは、１μｍ未満の少なくとも１つの寸法を有するものとして定められる極めて小さな結晶または微結晶をも検出しうる。
３０℃で特定された分子の１つであるリン酸二水素アンモニウムは、従前に開発された高塩法に適した結晶化剤としても特定された。ＷＯ２０１６／１３７８５０を参照されたい。また、従前の高塩法で使用された分子とは異なる混合物としての新規結晶化剤を特定した。結晶の生成に有用であった混合物、および結晶化スクリーニングが結晶に関して陽性であった温度を、以下の表３に示す。
Figure 2022512840000006
更なる研究のために、４つの分子、すなわち、カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファートおよびジベレリンＡ３を特定した。４℃では、このスクリーニングにおいて試験された分子のいずれにおいても、結晶は観察されなかった。結晶化添加剤としてＳｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｒ Ｂｉｏ Ａ２を使用して形成された結晶のイメージを図１に示す。
実施例２
ドロップ蒸気拡散を使用した結晶化剤の確認
実施例１で特定された結晶化剤を確認するために、シッティングドロップ蒸気拡散イオン実験［９６ウェル－３ドロップ・スイスシ（Ｓｗｉｓｓｃｉ）・プレート］を行った。４４ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブを含む抗体溶液を１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．６）中で調製した。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）と、１２～１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０と、カクテル溶液（総容量０．６μＬ）当たり１つの添加剤とを含む幾つかの異なるカクテル溶液を調製した。ドロップ比は以下のとおりに変動した：ドロップ１：０．４μｌ カクテル ＋ ０．２μＬ ペンブロリズマブ、ドロップ２：０．３μｌカクテル ＋ ０．３μＬ ペンブロリズマブ、およびドロップ３：０．２μｌカクテル ＋ ０．４μＬ ペンブロリズマブ。実験は２３℃で行った。経時的な結晶形成に関してプレートウェルを顕微鏡的にモニターした。
結果は、１２～１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ３３５０および５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）の存在下、０．１～０．１８％のカフェインのみがペンブロリズマブの結晶化を助けることを証明した。また、０．１５％ カフェインｗ／ｖおよび０．１５％ ｗ／ｖ ジベレリンＡ３は、一緒に混合された場合も単独の場合も、１２～１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）の存在下、ペンブロリズマブ結晶を生成するのに有効であった。テオフィリンは０．１５％ ｗ／ｖにおいては結晶を生成しなかったが、１２～１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）の存在下、０．２５％および０．３０％ ｗ／ｖの、より高い濃度においては、ペンブロリズマブを結晶化するのに有効であった。他のシルバー・ブレット（Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔ）剤と組合された０．１５％ ｗ／ｖテオフィリンは、０．２％ ｗ／ｖ ２’デオキシグアノシン５’－一リン酸ナトリウム塩水和物、０．２％ エタノールアミン、０．２％ ＩＰＴＧ、０．２％ チアミンピロリン酸、０．２％ コリン塩基溶液と混合された場合に結晶を生成した。図２を参照されたい。５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーおよび１２～１５％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ３３５０は単独では結晶を全く生成しなかった。
実施例３
ペンブロリズマブのバッチ結晶化
１０～５０ミクロンの均一な粒子サイズ分布を有するペンブロリズマブの結晶懸濁液を生成するための最適なマイクロバッチ結晶化条件を決定するために、実験を設計した。
１０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．６）中のペンブロリズマブストック溶液を濃縮器内で濃縮して、４４ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度を得た。該濃縮溶液をヒスチジンバッファー中で２０ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブへと希釈した。１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｃ７７３１－２５０Ｇ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）に加え、カフェインが溶解し溶液が生成されるまで、得られた混合物を４０℃に加熱することにより、２．５％ ｗ／ｖ カフェイン溶液を調製した。
１０ｍＭ トリス（ｐＨ８．０）中の０．２％ カフェインを２０ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブ溶液（５０ｍＭ ヒスチジンバッファー，ｐＨ５．４）にカクテル１６％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳと共に加え、ｐＨを０．１間隔で６．８～７．４で変化させた。１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ内で総体積を２００μＬとし、１：１、１：２および１：３のペンブロリズマブ：カクテル比で、バッチ結晶化を準備した。チューブを回転プラットフォーム上または攪拌プレート上のいずれかに配置した。４℃の初期バッチプレート（これは結晶を生成せず、大部分が沈殿した）を除き、全ての実験は室温で行った。
室温で行った実験では、結晶は初日のうちに形成し、１８時間にわたって形成し続けた。バッチプレート上でのイメージングのために、少容量の結晶化溶液を抽出した。１０～５０ミクロンの単針結晶を得るための最良の観察された条件は、１５ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブ、０．２０％ カフェイン、１４％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよびｐＨ７．３で室温で１８時間であった。
実施例４
バッチ結晶化スケールアップ実験（１ｍＬスケール）－静的法と回転法との比較
３３３μｌの１９．４ｍｇ／ｍｌ ペンブロリズマブ、０．１７５％ カフェイン、５０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．５）（Ａ部）を６６６μＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０（Ｂ部）と１．５ｍＬエッペンドルフチューブ内で混合することにより、２つの１ｍＬバッチ結晶化実験を準備した。Ａ部溶液の調製：４４ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブの溶液を５０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．５）で２０ｍｇ／ｍＬに希釈した。１．４ｍＬの該希薄溶液に１０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．５）中の１１２μｌの２．５％ カフェインを加えた。Ａ部の最終組成は１９．４ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブ、７％ カフェイン、５０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．５）であった。Ｂ部溶液の調製：オプティマトリックス（Ｏｐｔｉｍａｔｒｉｘ）メーカー液体処理系を使用して、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、１０．１８％ ＰＥＧ３３５０溶液を調製した。
一方のチューブを静的条件下でインキュベートし、もう一方のチューブをＬａｂｎｅｔ Ｍｉｎｉ ＬａｂＲｏｌｌｅｒ Ｈ５５００上に３０℃で１８時間配置した。該実験の２００倍での顕微鏡検査は静的条件下で結晶のクラスターを示したが、回転サンプルでは針状結晶（１０～３０ミクロン）の均一懸濁液が観察された。このことは、回転が、静的インキュベーションと比較して好ましい工程であったことを示している。
実施例５
カフェイン／ＰＥＧ ３３５０方法を使用したペンブロリズマブのバッチ結晶化（１０ｍＬスケールバッチ）
ペンブロリズマブの４４ｍｇ／ｍＬ ストック溶液を２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）で３．３３ｍＬの総体積まで希釈することにより、ペンブロリズマブの２０ｍｇ／ｍＬ 溶液を調製した。この溶液に、６．６６ｍＬの１３％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）および２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の１．０ｍＬの２．５％ カフェインを加えた。得られた溶液の最終組成は６．７ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブ、９．８％ ＰＥＧ ３３５０、４５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）、６．６ｍＭ ヒスチジン、０．２３％ カフェインであった。溶液をＬａｂｎｅｔ Ｍｉｎｉ ＬａｂＲｏｌｌｅｒ Ｈ５５００回転機上に２４ＲＰＭ、３０℃で配置した。溶液は最初は透明であったが、１８時間後に濁りが観察された。濁った懸濁液を顕微鏡検査し、２００倍での顕微鏡検査により微小針状結晶の形成を確認した。得られた結晶の顕微鏡写真を図３に示す。
未結晶化ペンブロリズマブおよび過剰のカフェインを懸濁液から除去し、結晶化収率を測定するために、得られた結晶懸濁液の更なる処理を行った。
結晶懸濁液の１ｍＬアリコートを微量遠心管内で３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬの１３％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）に再懸濁させ、上清を洗浄１とラベル付けした。懸濁液を微量遠心管内で３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬの１３％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．７）に再懸濁させ、上清を洗浄２とラベル付けした。懸濁液を微量遠心管内で３，０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬの冷２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）に再溶解させた。ペレットは５分以内に溶解した。
タンパク質濃度を、１．４の吸光係数を用いるナノドロップ分光光度計を使用して決定した。母液タンパク質濃度は７８ｍｇ／ｍＬ（カフェインによる歪み）であった；洗浄１：２４ｍｇ／ｍＬ（カフェインによる歪み）；洗浄２：３．８７ｍｇ／ｍｍＬ ｌ（カフェインによる歪み）；および最終再溶解結晶：６．２ｍｇ／ｍｌ（２８０：２６０ｎｍ比は０．５２；これは出発ペンブロリズマブ溶液の場合と同じである）。タンパク質の測定に基づけば、全収率は９４％であった。
実施例６
温度範囲０～５０℃の結晶化能スクリーニング
滅菌非発熱性水溶液を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の４４ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブの溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。
１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａ；ロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ；Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）に加えることにより、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。カフェインが溶解するまで混合物を６０℃に加熱した。得られた溶液を使用前に室温まで冷却した。
２．５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（１Ｍ溶液、ｐＨ７．４；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）（ｐＨ７．４）および１０．２ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０を３７．３ｍＬの注射用滅菌水に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の溶液を調製した。得られた溶液を０．２ミクロン濾過した。
２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の３３μＬのペンブロリズマブ溶液（４４ｍｇ／ｍＬ）に６６μｌの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）溶液を室温で加えた。得られた溶液に１０μｌの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。１．４５ｍｇのペンブロリズマブ、６ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）、６．１％ ＰＥＧ ３３５０、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．２３％ カフェイン（ｐＨ７．２で測定）の混合物（溶液中）を２℃（ウェットアイス）または５０℃（水浴）で１８時間インキュベートした。２℃のサンプルにおいて、結晶が顕微鏡で観察された。５０℃のサンプルは１８時間透明であり、室温に冷却したら１時間以内に結晶化した。
添付のＳＯＮＩＣＣ（商標）分析に示されている１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）溶液中の両方のサンプルの１／１６希釈物において、ＳＯＮＩＣＣ（商標）分析を行った。どちらの実験も、タンパク質キラル結晶に合致して、陽性のＵＶおよびＳＨＧイメージングを示した。図４を参照されたい。
実施例７
ｐＨ範囲の結晶性研究
この研究は、どのｐＨ範囲が結晶の生成に有効であるかを決定するために溶液のｐＨを調べるように設計した。
Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ Ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ（商標）液体処理装置を使用し、各ウェルの最終体積が６６μｌとなるように、各行に５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを、各列に１～１２％ ＰＥＧ３３５０を使用して、ｐＨ６．０～８．８のグリッドを９６ウェルマイクロバッチプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ ＨＲ２６７）内に分配した。２０Ｍ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中にペンブロリズマブ（４４ｍｇ／ｍＬ）を含む３３μｌの溶液を各ウェルに室温で加え、ついで１０μｌの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。１．４５ｍｇのペンブロリズマブ、６ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）、０．２３％ カフェインプレート成分を７回の吸引および分注工程により混合した。混合物（溶液中）を２２℃で１８時間インキュベートし、ＳＯＮＩＣＣ（商標）分析を用いて結晶形成を確認した。
結晶はｐＨ６．０～８．８の全ｐＨ範囲にわたって観察された。６．０～６．４の、より低いｐＨ範囲では、より高いｐＨより少ない結晶が観察され、結晶と沈殿物との混合が観察された。サイズおよび品質に基づく最良の結晶はｐＨ６．７～８．０で観察された。ｐＨ８．０を超えた場合には、より高い割合のＰＥＧを使用した場合にのみ、結晶が観察された。ＳＯＮＩＣＣイメージングを用いて、結晶化度を確認した。表４を参照されたい。
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実施例８
種々の分子量のＰＥＧを使用した結晶性のスクリーニング
滅菌非発熱性水溶液を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の４４ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブの溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。
１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａ；ロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ；Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）に加え、溶液になるまで６０℃に加熱することにより、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。使用前に溶液を室温に冷却した。
２．５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（１Ｍ溶液、ｐＨ７．４；Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）（ｐＨ７．４）および１０．２ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０を３７．３ｍＬの注射用滅菌水に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の溶液を調製した。得られた溶液を０．２ミクロンで濾過した。
Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ Ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒ（商標）液体処理装置を使用して、１～１２％ ＰＥＧ ２００、４００、３０００、３３５０、８０００、１０，０００および２０，０００ならびに５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）の直線勾配を各カラムにおいて変化させ、９６ウェルマイクロバッチプレート（Ｈａｍｐｔｏｎ ＨＲ２６７）内に分注し、各ウェル内の最終体積を６６μｌとした。２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の３３μｌのペンブロリズマブ（４４ｍｇ／ｍＬ）を室温で加え、ついで１０μｌの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。プレート成分を７回の吸引および分注工程により混合した。混合物（溶液中）を２２℃で１８時間インキュベートした。
ＰＥＧ ２００およびＰＥＧ ４００の行を除く全ての行において、結晶が顕微鏡で観察された。Ｗｈａｔｍａｎ Ｆａｓｔ Ｆｒａｍｅ ４スライドウェルプレート内のアリコートを使用して、ＳＯＮＩＣＣ（商標）分析を行った。３，０００～２０，０００の分子量を有するＰＥＧ分子を含む全てのウェルが、タンパク質キラル結晶と合致して、陽性のＵＶおよびＳＨＧイメージングを示した。表５を参照されたい。
Figure 2022512840000008
実施例９
モノクローナル抗体の結晶化スクリーニング
この研究は、ペンブロリズマブを結晶化するのに有用であった前記のＰＥＧ／カフェイン条件が、他のモノクローナル抗体の結晶化にも有効であるかどうかを判断するために行った。
０．２μｌのモノクローナル抗体（１０～４０ｍｇ／ｍＬ）および０．２μｌの沈殿化溶液（Ｓｉｌｖｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｓ Ｂｉｏスクリーンを含む商業的に入手可能なスクリーン）を使用して、Ｌｕｆｔら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４２（２００３） １７０－１７９））に記載されているマイクロ・バッチ・アンダー・オイル（ｍｉｃｒｏ ｂａｔｃｈ－ｕｎｄｅｒ－ｏｉｌ）法を用いて、１５３６ユニーク結晶化プレートにおいて、幾つかのヒト組換えモノクローナル抗体（１０～４０ｍｇ／ｍＬ）をスクリーニングした。４℃、室温および３０℃で結晶化スクリーニングを行った。１か月後、ペンブロリズマブの場合を除いて、試験された温度のいずれにおいても、抗ＰＤ－１抗体ニボルマブを含むスクリーニングされたモノクローナル抗体は０．１６～０．２％ カフェイン、１２～１５％ ＰＥＧ ３３５０、０．０５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）の条件下で結晶化しなかった。ｍＡｂ標的およびＩｇＧ型の一覧を表６に示す。
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実施例１０
Ｘ線回折分析に適したペンブロリズマブ結晶の製造
添加剤スクリーン（８μｌ）の１０％をリザーバー溶液に添加するシッティングドロップ蒸気拡散プレートにおいて、１２％ ＰＥＧ ３３５０、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、０．２％ カフェイン（７２μｌ）の基本条件を用いて、９６個のユニークな添加剤（ＨＲ２－１３８）からなるＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ添加剤スクリーンを準備した。クリスタルグリフォン（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｙｐｈｏｎ）（Ａｒｔ Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して、リザーバー溶液を混合し、個々のドロップウェル１～３の０．４、０．３および０．２μｌを３ウェルＩｎｔｅｌｌｉプレート９６に分注した。ペンブロリズマブ（２０ｍｇ／ｍＬ）を個々のドロップウェルの３滴にそれぞれ０．２、０．３および０．４μｌで加え、それにより、各補完リザーバー溶液に対する、２：１、１：１および１：２の、リザーバーとペンブロリズマブとの液滴（ドロップ）比を得た。該プレートを１４℃でインキュベートした。１日後、ウェルの多数において結晶が生じ、添加剤としてデキストラン硫酸ナトリウムを含むウェル（Ｈａｍｐｔｏｎ添加剤スクリーンからの条件Ｅ３）は、その他の添加剤より厚い針状結晶を生成した。
データ収集の前に、結晶を室温で回収し、２０％ エチレングリコールで増強された沈殿剤カクテルから構成される凍結防止剤溶液に移した。この凍結防止剤溶液に約２０秒間浸した後、クライオループ（ｃｒｙｏ－ｌｏｏｐ）を使用して結晶を取り出し、液体窒素中で凍結した。ついで、窒素冷却ストリームを備えた、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ａｒｇｏｎｎｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）におけるＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＰＳ）におけるＳＥＲ－ＣＡＴビームラインのゴニオメーター上に凍結結晶をマウントした。Ｒａｙｏｎｉｘ ＭＸ３００ＨＳ検出器を使用して、Ｘ線回折結果を収集した。以下の条件を用いて製造されたペンブロリズマブ結晶の完全な特徴づけを行った：１２％ ＰＥＧ ３３５０、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、０．２％ カフェイン、３％ デキストラン硫酸ナトリウム、２０ｍｇ／ｍｌ ペンブロリズマブ、１：１の比［０．３μＬのペンブロリズマブ／０．３μｌの１２％ ＰＥＧ ３３５０、０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、０．２％ カフェイン、３％ デキストラン硫酸ナトリウム］。ａｕｔｏＰＲＯＣプログラム（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ）を使用して、データを統合し、スケーリングした。該プログラムは、統合のためにＸＤＳを、空間群の確認のためにＰＯＩＮＴＬＥＳＳを、スケーリングのためにＡＩＭＬＥＳＳを、異方性解析および振幅への変換のためにＳＴＡＲＡＮＩＳＯを使用するように設定された。結晶の顕微鏡写真を図５に示す。
ＰＥＧ／カフェイン結晶の特性およびデータ収集統計を以下に示す。
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ＭＡＴＴＨＥＷＳプログラムを使用したパッキング分析は、非対称単位が抗体の半分を含有し、残りの半分が結晶２回対称性の適用により生成されることを示した。検索モデルとしてＰＤＢエントリ５ＤＫ３を使用する分子置換パッケージＭＯＬＲＥＰを使用して、結晶構造を解析した。抗体の一部を固定座標として配置したまま、各剛体部分を連続的に検索することにより、検索を行った。該部分は以下の順序で配置された：ＶＬおよびＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３。Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇパッケージの一部としてプログラムａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用して、精密化を行った。抗体の図解を図６Ａに示す。カフェインと結晶内のその環境との相互作用を示す拡大図を図６Ｂに示す。
ペンブロリズマブ結晶に関する完全な構造情報および特徴づけを表７に示す。
解像限界：０．８１～２．２２オングストローム
反射数：３３，８５０（７６．３％）
試験セットにおける反射数：１，６３５（４．８３％）
非Ｈタンパク質原子の数：４，９７０
溶媒原子の数：３９５
Ｒ因子：０．２０２
Ｒフリー：０．２５５
ＲＭＳＤ結合長：０．０１０オングストローム
ＲＭＳＤ結合角：１．１４°
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該結晶は、前記の高塩法を用いて製造されたペンブロリズマブ結晶と比較して異なる四次構造を有する。ＷＯ２０１６／１３７８５０を参照されたい。ペンブロリズマブ結晶において見出されるカフェイン結合部位は、従前の高塩法を用いて成長させた結晶から決定されたペンブロリズマブ抗体構造と比較して新規である。
実施例１１
バッチ結晶化方法（１７５ｍＬスケール）
滅菌非発熱性水溶液を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中のペンブロリズマブの４２．７ｍｇ／ｍＬ 溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。２０ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）および８１．６ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０を２９８．４ｍＬの注射用滅菌水（Ｈｏｓｐｉｒａ ＲＩ－４４６９）に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０（５０％ 溶液Ｒｉｇａｋｕ商品番号１０８０５８）、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（１Ｍ溶液、ｐＨ７．４ Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）、ｐＨ７．０溶液（４００ｍＬ）を調製した。得られた溶液を０．２ミクロンで濾過し、室温で保存した。
１．２５ｇのカフェインを５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）に加えることにより２．５％ カフェイン（Ｓｉｇｍａロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）、２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。カフェインが溶解するまで、溶液を６０℃に加熱した。溶液を使用前に室温まで冷却させた。
５０ｍＬ ポリプロピレン遠心管（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ（商標）Ｓｔｅｒｉｌｅカタログ番号０５－５３９－８）に、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を含む２６．４ｍＬの溶液と共に、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の１３．３２ｍＬのペンブロリズマブ（４２．７ｍｇ／ｍＬ）溶液を室温で加えた。ついで、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を含む４ｍＬの溶液を加えた。この過程を合計４本の５０ｍＬ遠心管で繰り返した。
該管（溶液中）をＬａｂｎｅｔ回転機（カタログ番号Ｈ５６００）上に配置し、室温で回転させた。視認可能な濁りが１５分後に観察された。バッチの回転を室温で２時間続けた。１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０溶液中の１：１０希釈でＷｈａｔｍａｎ Ｆａｓｔ Ｆｒａｍｅ ４スライドウェルプレートにおいて分析された各管に関するＦｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ ＳＯＮＩＣＣ（商標）分析により、結晶化度を検証した。ＳＯＮＩＣＣ（商標）イメージングシステムを使用した代表的な分析を図７に示す。
５０ｍＬ管をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ遠心分離機で２３００ＲＰＭ、室温で１０分間遠心分離した。得られた母液をデカントした。各５０ｍＬ円錐管内の得られたペレットを４０ｍＬの１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよびｐＨ７．０バッファーに再懸濁させた。この過程を繰り返した。得られたペレットをＳＯＮＩＣＣ（商標）分析により結晶化度に関して検査した。冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の溶解、重量：体積、１００ｍｇ懸濁液：１ｍＬ ＰＢＳ測定により、ペンブロリズマブ濃度を測定した。ナノドロップＵＶ分光計を使用した場合の、１０ｍＬのＰＢＳ溶液中の得られた１９．５ｍｇに関する測定Ａ２８０読み取り値は１９５ｍｇ／ｍＬの最終濃度（９．４ｍＬ）であり、全収率は８４％であった。１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよびｐＨ７．０バッファーを使用して、１７５および１５０ｍｇ／ｍＬ懸濁液を調製するために、更なる希釈を行った。
この実験は、該結晶化方法がスケーラブル（規模変更可能）であり、再現性を有していて、室温で２時間以内に高収率で結晶懸濁液を与えることを示している。結果はまた、ペンブロリズマブ結晶懸濁液が高濃度に濃縮されうることを示している。
実施例１２
ペンブロリズマブ結晶懸濁液の特徴づけ
実施例１１において調製されたペンブロリズマブ結晶懸濁液を、以下に記載されているとおりに、粒子サイズ、動的粘度および注射可能性を測定することにより、特徴づけした。
粒子サイズ分析
平均粒子サイズを測定するために、Ｈｏｒｉｂａ ＬＡ－９６０を使用した。Ｈｏｒｉｂａ ＬＡ－９６０は、最新のサイジング技術と、１０ナノメートルから５ミリメートルまでの懸濁液サンプルの測定を可能にする精密化とを兼ね備えている。レーザー回折における中心的な理論は、粒子は、その粒子のサイズにより決定される角度で光を散乱させるというものである。より大きな粒子は小さな角度で散乱し、より小さな粒子は広角度で散乱する。粒子のコレクションは、粒子サイズ分布の結果に変換されうる強度および角度により定められる散乱光のパターンを生成する。サンプルを１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０バッファーで１：１０希釈した。平均粒子サイズは４．４ミクロンであった。
動的粘度測定
Ｒｈｅｏｓｅｎｓｅ ｍ－ＶＲＯＣ装置は、ハーゲン・ポアズイユの式を用いて、圧力降下から粘度を導き出す。動的粘度を測定するために、せん断掃引を１，５００～９５，０００（１／秒）で行った。２００ｍｇ／ｍＬの製剤の粘度を測定し、１／２”針と共に２７ゲージの通常の壁（ＲＷ）または２９ゲージの薄壁（ＴＷ）のいずれかを有するＢＤ Ｈｙｐａｋ １ｍｌ予充填シリンジを使用して、種々のせん断速度に対してプロットした。粘度対せん断速度のデータを図８Ａに示す。２００ｍｇ／ｍＬの結晶懸濁液サンプルの場合、室温での粘度は約２０００秒－１のせん断速度で２６ｃＰであった。せん断速度を更に８０，０００秒－１および１８００００秒－１に増加させると、それに伴う粘度低下が観察された。粘度は１８ｃＰから１２ｃＰに低下し、これはモノクローナル抗体のような高濃度注射製品に関して許容範囲内である。この結晶懸濁液製剤における予想外のせん断薄化挙動は、シリンジまたは自動注入装置のような装置からの医薬品の注入を容易にするために利用されうる。
注射可能性の測定
予備的な射出力の実施可能性試験を、種々の１ｍＬプラスチックおよびガラスシリンジならびに針において、２００ｍｇ／ｍＬ 結晶性ペンブロリズマブ懸濁液に関して行った。表８を参照されたい。
Figure 2022512840000313
シリンジ射出力は、シリンジの内容物を一定速度で分注するために必要な力である。この力は、しばしば、引張／圧縮試験機（つまり、ＩＮＳＴＲＯＮ）を使用して測定される。１２０ｍｍ／分（１７５ｍｇ／ｍＬおよび２００ｍｇ／ｍＬ）または２２５ｍｍ／分（１５０ｍｇ／ｍＬ）の注入速度で、２００、１７５および１５０ｍｇ／ｍＬにおける、１ｍＬポリカーボネートシリンジに充填されたペンブロリズマブ結晶懸濁液を測定するために、引張／圧縮試験機（ＩＮＳＴＲＯＮ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を使用した。３つの異なる濃度におけるペンブロリズマブ懸濁液の射出力を図８Ｂに示し、ガラスシリンジに充填されたサンプルに関する射出力を図９に示す。
結果が示すところによると、摺動降伏応力（ｂｒｅａｋ－ｌｏｏｓｅ ｆｏｒｃｅ）および摺動平衡応力（ｇｌｉｄｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）は２００ｍｇ／ｍＬ懸濁液ではより高かったが（それぞれ７．０８Ｎおよび４．５２～５．１２Ｎ）、より低い濃度（１７５および１５０ｍｇ／ｍＬ）のサンプルはより低い摺動降伏応力および摺動平衡応力（それぞれ３．９６Ｎおよび３．５７～３．９７Ｎ）を示した。図８Ｂを参照されたい。射出力はシリンジバレルの材質（プラスチックまたはガラス）、注入速度、針サイズ（２７または２９Ｇ）および針の太さ（薄壁または通常の壁）によって異なった。射出力は、ガラスシリンジ（＞１２Ｎ）と比較して、プラスチックシリンジ（＜８．５Ｎ）ではより低かった。図８Ｂを参照されたい。
２００ｍｇ／ｍＬの懸濁液の場合、より高い注入速度はより高い射出力を要した。表８および図９を参照されたい。例えば、ＢＤ Ｈｙｐａｋ １ｍＬガラスシリンジにおいては、１３３．８６ｍｍ／分の注入速度では射出力は１２．１ Ｎであったが、３００ｍｍ／分の注入速度では１６．２Ｎであった。観察された注射力（６．３６～１８．４１Ｎ）はペンブロリズマブの２００ｍｇ／ｍＬ 結晶懸濁液の皮下注射に関する許容範囲内であった。全体として、これらのデータは、ペンブロリズマブの２００ｍｇ／ｍＬ 結晶懸濁液の注射には、ポリカーボネートプラスチックまたはガラス製のシリンジ、薄壁または通常の壁の２７または２９Ｇステンレス鋼の針が、皮下注射に許容可能な射出力で、注入速度１３３．８６～３００ｍｍ／分で使用されうることを示唆している。
実施例１３
高速イオン交換クロマトグラフィー分析
材料
滅菌非発熱性水溶液を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中のペンブロリズマブの４４ｍｇ／ｍＬ溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。
２．５ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ （Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）（ｐＨ７．４）および１０．２ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０（５０％溶液；Ｒｉｇａｋｕ商品番号１０８０５８）を３７．３ｍＬの注射用滅菌水（Ｈｏｓｐｉｒａ ＲＩ－４４６９）に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）の溶液を調製した。得られた溶液を０．２ミクロンで濾過した。
１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａ；ロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ；Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）に加えることにより、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。カフェインが溶解するまで、溶液を６０℃に加熱した。溶液を使用前に室温に冷却した。
バッチ結晶化方法（１ｍＬ）
２０Ｍ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の３３３μＬのペンブロリズマブ（４４ｍｇ／ｍＬ）に６６６μｌの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を室温で加えた。得られた溶液に１００μｌの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。該混合物（溶液中）を室温でＬａｂｎｅｔ回転機上に配置した。視認可能な濁りが１５分後に観察された。バッチを室温で２時間回転させ続けた。顕微鏡検査に基づいて結晶を観察した。
結晶懸濁液を微量遠心管内で３０００ＲＰＭで室温で３分間遠心分離した。母液をピペットで除去した。ペレットを１ｍＬの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよびｐＨ７．２に再懸濁させ、微量遠心管内で３０００ＲＰＭで室温で３分間遠心分離した。洗浄液をピペットで除去した。ペレットを１ｍＬのＰＢＳに４℃で８分間再溶解し、微量遠心管内で３０００ＲＰＭで室温で３分間遠心分離した。
ＨＰ－ＩＥＸ方法
非結晶化材料と比較して結晶性ペンブロリズマブの電荷プロファイルを評価するために、高速イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰ－ＩＥＸ）を用いた。Ｄｉｏｎｅｘ ＰｒｏＰａｃ ＷＣＸ－１０カラムおよび２８０ｎｍのＵＶ検出器を使用して、イオン交換ＨＰＬＣ法を行った。サンプルを精製水中で希釈し、分析のために８０μｇを注入した。以下の移動相の勾配を使用して、種々の電荷変異体を溶出した：移動相Ａ：２４ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）、４％ アセトニトリル（ｖ／ｖ）；移動相Ｂ：２０ｍＭ リン酸、９５ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ８）、４％ アセトニトリル（ｖ／ｖ）。ペンブロリズマブ出発物質および溶解ペンブロリズマブ結晶に関する種々の電荷変異体および未分解ペンブロリズマブを表す主ピークの面積率（％）を表９に示す。結果は、結晶懸濁液中のペンブロリズマブの電荷変異体の割合（％）が水溶液中の出発物質に類似していたことを示している。
Figure 2022512840000314
実施例１４
ペンブロリズマブ競合結合ＥＬＩＳＡ
バイオアッセイ分析のための結晶懸濁液の調製
２０Ｍ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の３３３μＬのペンブロリズマブ（４４ｍｇ／ｍＬ）に６６６μｌの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）を室温で加えた。得られた溶液に１００μｌの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。該混合物（溶液中）を３０℃で１ヶ月間インキュベートした。顕微鏡での目視検査に基づいて結晶を観察した。
結晶懸濁液を微量遠心管内で３０００ＲＰＭで室温で３分間遠心分離した。母液をピペットで除去した。ペレットを１ｍＬの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）に再懸濁させ、微量遠心管内で３０００ＲＰＭで室温で３分間遠心分離した。洗浄液をピペットで除去した。ペレットを１ｍＬのＰＢＳに４℃で８分間再溶解し、微量遠心管内で３０００ＲＰＭで４℃で３分間遠心分離した。ナノドロップ２８０ｎｍの読取り値に基づいて、６．０６１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度が決定された（総体積１ｍＬ）。後記のとおり、サンプルをバイオアッセイ分析に使用した。
競合結合ＥＬＩＳＡ
ペンブロリズマブ競合結合ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレート上に固定化されたＰＤ－１／Ｆｃへの結合に関してＰＤ－Ｌ１（ＰＤ－１リガンド）と競合するペンブロリズマブの能力を評価する。前記方法により製造された結晶化ペンブロリズマブ懸濁液（「試験サンプル」）の効力を試験するための参照物質として未結晶化ペンブロリズマブのサンプル（「参照」）を使用した。４．５μｇ／ｍＬの参照サンプルおよび試験サンプルをＰＢＳ（ｐＨ６．５）、１％ ＢＳＡ中で２倍系列希釈し、等体積の６００ｎｇ／ｍＬ ｒｈＰＤ－Ｌ１／Ｆｃキメラ（「ＰＤ－Ｌ１」，Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号１５６－Ｂ７），Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）と混合し、ついでＥＬＩＳＡプレートに移した。アッセイ成分の最終濃度は２．２５μｇ／ｍＬ（参照サンプルおよび試験サンプル）および３００ｎｇ／ｍＬ（ＰＤ－Ｌ１）であった。ＰＤ－１／Ｆｃに結合したＰＤ－Ｌ１のレベルを、ビオチン化抗ＰＤ－Ｌ１（Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号ＢＡＦ１５６））により、ついでペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンおよび化学発光基質により検出した。マイクロプレートリーダーを使用して発光を測定し、得られた阻害応答曲線を４－ＰＬ曲線フィッティングソフトウェア（ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ）で分析した。
このアッセイから得られたＩＣ５０値は、ＰＤ－１／ＦｃへのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害するペンブロリズマブの能力の測定値である。結晶サンプルの生物学的効力はペンブロリズマブ参照物質に対する相対的効力（％）として表される。同じサンプルの複数の重複実験（Ｎ＝３）からの相対的効力の幾何平均が幾何標準偏差（％ＧＳＤ）および９５％信頼区間と共に示されている。結果は、溶解結晶サンプルが、参照（未結晶化）ペンブロリズマブと比較して９５％の相対的効力を有していたことを示している。表１０を参照されたい。
Figure 2022512840000315
実施例１５
ラボバッチ結晶化方法－非クリーンルーム条件
滅菌非発熱性水溶液を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中のペンブロリズマブ（バッチ番号Ｗ１５－ＭＫ３４７５Ｐ－０８１）の４２．７ｍｇ／ｍＬ溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。
２０ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）（ｐＨ７．４）および８１．６ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０を２９８．４ｍＬの滅菌水に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０（５０％溶液Ｒｉｇａｋｕ商品番号１０８０５８５０）ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）（４００ｍＬ）の溶液を調製した。得られた溶液を０．２ミクロンで濾過し、室温で保存した。
１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）に加えることにより、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。得られた溶液を、カフェインが溶解するまで、６０℃に加熱した。溶液を使用前に室温に冷却した。
結晶化溶液（４３．７２ｍＬスケール）の４ｍＬ管を準備した。２０Ｍ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の１３．３２ｍＬのペンブロリズマブ（４２．７ｍｇ／ｍＬ）に２６．４ｍＬの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を室温で加えた。得られた溶液に５０ｍＬ管において４ｍＬの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。該混合物（溶液中）をＬａｂｎｅｔ回転機上に室温で配置した。視認可能な濁りが１５分後に観察された。バッチを室温で更に２時間回転させた。ＳＯＮＩＣＣ分析を行い、結晶化度を確認した。
５０ｍＬ円錐管を、それぞれの５０ｍＬ円錐管に関して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ遠心分離機で２６００ＲＰＭ、室温で１０分間遠心分離した。上清をデカントした。各５０ｍＬ円錐管内のペレットを４０ｍＬの１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に再懸濁させた。遠心分離、デカントおよび再懸濁の過程を繰り返した。最後の遠心分離工程では、ボトルをＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ遠心分離機で３５００ＲＰＭ、室温で２０分間遠心分離した。上清をデカントした。重量：体積、１：１０、Ａ２８０の読取り値により測定されたタンパク質濃度は２１６ｍｇ／ｍＬであった。最終体積９．７ｍＬ（収率９２％）。Ｈｏｒｉｂａ粒子サイズ分析装置を使用して測定された粒子サイズ分析は１．３ミクロンの平均粒子サイズであった。
実施例１６
バッチ結晶化（４３．７２ｍＬスケール）－クリーンルーム条件
１．２５ｇのカフェイン（Ｓｉｇｍａロット番号ＳＬＢＫ４８０４Ｖ）を５０ｍＬの２０ｍＭ ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ Ｈ－８０００）（ｐＨ５．４）に加えることにより、２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジン（ｐＨ５．４）の溶液を調製した。該混合物を、カフェインが溶解するまで、６０℃に加熱した。溶液を室温に冷却し、使用前に滅菌濾過した。
２０ｍＬの１Ｍ ＨＥＰＥＳ（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＨＲ２－９４１－２７）（ｐＨ７．４）および８１．６ｍＬの５０％ ＰＥＧ ３３５０（Ｒｉｇａｋｕ商品番号１０８０５８）を２９８．４ｍＬの滅菌水に加えることにより、１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）の溶液（４００ｍＬ）を調製した。得られた溶液を０．２ミクロンで濾過し、室温で保存した。
滅菌非発熱性水を使用して、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）中の４２．７ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブの溶液（０．２ミクロン濾過）を調製した。
２０Ｍ ヒスチジンバッファー（４×５０ｍＬ管）（ｐＨ５．４）中の無菌の濾過された１３．３２ｍＬのペンブロリズマブ（４２．７ｍｇ／ｍＬ）に２６．４ｍＬの１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）を室温で加えた。この溶液にクリーンルーム内の５０ｍＬ無菌円錐管において４ｍＬの２．５％ カフェイン、２０ｍＭ ヒスチジンバッファー（ｐＨ５．４）を加えた。混合後、４×５０ｍＬ円錐管内の結晶化溶液の成分の濃度は６ｍＭ ヒスチジン、６％ ＰＥＧ ３３５０、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．２３％ カフェイン（ｐＨ６．８）中でペンブロリズマブ２．２８ｇであった。
混合物（溶液中）をＬａｂｎｅｔ回転機上に室温で配置した。視認可能な濁りが１５分後に観察された。４×５０ｍＬの無菌円錐管を室温で２時間回転させた。２時間後にＳＯＮＩＣＣ（商標）分析を行い、結晶化度を確認した。
４×５０ｍＬ無菌円錐管を、それぞれの５０ｍＬ円錐管に関して、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ遠心分離機で２６００ ＲＰＭ、室温で１０分間遠心分離した。上清をデカントした。それぞれの５０ｍＬ円錐管に関して、ペレットを４０ｍＬの１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に再懸濁させた。この過程を繰り返した。最後の遠心分離工程では、円錐管をＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ Ｘ－１５Ｒ遠心分離機で３５００ＲＰＭ、室温で２０分間遠心分離した。上清をデカント除去した。重量：体積 １：１０ Ａ２８０により測定されたタンパク質濃度は２３１ｍｇ／ｍＬであった。サンプルを０．８ｍＬの１０％ ＰＥＧ ３３５０、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）に希釈した。重量：体積 １：１０ Ａ２８０により測定されたタンパク質濃度は最終濃度２００．３ｍｇ／ｍＬであった。最終体積は８．４ｍＬ（収率７４％）であった。ＲＰＬＣ法を用いて測定されたタンパク質濃度は１９２．５ｍｇ／ｍＬ（１．２ｍＭ）であり、カフェイン濃度は０．５ｍｇ／ｍＬ（２．５ｍＭ）であった。Ｈｏｒｉｂａ粒子サイズ分析装置を使用して測定された平均粒子サイズは１．３ミクロンであった。
実施例１７
バッチ透析結晶化方法
４００μｌの４４ｍｇ／ｍＬ ペンブロリズマブ（ロット番号Ｗ１２１２３４７５Ｐ－１７Ｃ）ストック溶液をＳｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ（商標）ＣＥ（セルロースエステル）照射ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒ（分子量カットオフ：１０，０００ 直径５ｍｍ、サンプル体積５００μｌ）内に配置した。バッグを、１０ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％ ＰＥＧ ３３５０、１００ｍＭ カフェインを含有する１５ｍＬ平底管内に配置し、それをマグネチックスターラーにより室温で撹拌した。
３時間後に僅かな濁りが観察され、１８時間後に濁り有意に増加した。アリコートをＳＯＮＩＣＣ分析により特徴づけし、結晶形成を確認した。得られた懸濁液を微量遠心管内で３０００ＲＰＭで３分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．８）、１０％ ＰＥＧ ３３５０で洗浄し、微量遠心管内で３０００ＲＰＭで３分間再遠心分離した。得られたペレットを１０ｍＬの通常のＰＢＳに溶解した（室温で５分間）。得られた測定Ａ２８０読取り値は１．６ｍｇ／ｍＬ（合計１６ｍｇのタンパク質）であった。全収率は９１％であった（１７．６ｍｇの出発全ｍＡｂ含量）。この実験は、透析を用いる結晶化方法が、室温で１８時間以内に高収率で結晶性ペンブロリズマブ懸濁液を生成させうることを示している。
実施例１８
ペンブロリズマブ結晶製剤の薬物動態研究
ペンブロリズマブ結晶製剤に関する雄Ｗｉｓｔａｒ ＨｅｎラットにおけるＰＫ比較可能性研究を行った。全群のペンブロリズマブの用量は５０ｍｇ／ｋｇであった。液体ＩＶ製剤（７％ スクロース、０．０２％ ポリソルベート８０、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ５．５（群１））および液体ＳＣ製剤（７％ スクロース、０．０２％ ポリソルベート８０、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ５．５、１０ｍＭ メチオニン（群２））における２０ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブをバイオアベイラビリティ対照群の基礎として含めた（群１および２のそれぞれに関してＮ＝３）。
実施例１６に記載されているとおりにペンブロリズマブ結晶懸濁液を調製し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．０）および１０．１８％ ＰＥＧ ３３５０と共に２０ｍｇ／ｍＬ（群３、Ｎ＝４）、４０ｍｇ／ｍＬ（群４、Ｎ＝４）および１００ｍｇ／ｍＬ（群５、Ｎ＝４）のペンブロリズマブを含むペンブロリズマブ結晶製剤に使用し、表１１に記載されている濃度で皮下投与した。各群の正確な投与量を確保するために、重量／密度測定（１ｇ／ｍＬ）を行って、表１１に記載されている各群のＢＤ Ｈｙｐａｋ ２．２５ｍＬ予充填シリンジに正確に充填した。
Figure 2022512840000316
示されている重量の結晶懸濁液を、無菌１０ｍＬ容積式ピペッターを使用して、秤量されたＢＤ Ｈｙｐａｋ（商標）２．２５ｍＬ予充填可能ガラスシリンジに各群で加えた。通気手段を使用して、各充填シリンジ内の懸濁液の液面にプランジャーキャップを移動させた。各群に合計６本のシリンジを準備した。
潜在的なカフェイン効果に関する対照実験のために、ペンブロリズマブ－カフェイン非含有製剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、１０％ ＰＥＧ ３３５０、群６）およびペンブロリズマブ－ＰＥＧ非含有製剤（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８、カフェイン、群７）を試験に含めた。
投与後、血液を採取し、投与後０．５、３、６、２４、４８、７２、９６、１６８、２１６、３３６、４０８および５０４時間の時点で０．３ｍＬの全血から血清を調製した。血清中のペンブロリズマブをＭＳＤ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）イムノアッセイで測定した。Ｐｈｏｅｎｉｘ ＰＫソフトウェア６４．６．３を使用して、ＰＫパラメータを計算した。液体製剤ＩＶ群からのＡＵＣに基づいて、バイオアベイラビリティ（Ｆ）を計算した（Ｆ＝ＳＣのＡＵＣ／ＩＶのＡＵＣ ＊ １００％）。研究の全体にわたって注射部位をモニターした。
結果は、２０ｍｇ／ｍＬのペンブロリズマブの被検ＳＣ液体製剤が、２０ｍｇ／ｍＬの結晶性製剤に類似したバイオアベイラビリティをもたらすことを示した。表１２を参照されたい。結果はまた、最大濃度（Ｃｍａｘ）、曝露（曲線下面積、ＡＵＣ）およびバイオアベイラビリティ（Ｆ）が濃度依存的に増加することも示した。つまり、濃度が高いほど、Ｃｍａｘ、ＡＵＣおよびＦも高くなる。血清中の最大濃度までの時間（Ｔｍａｘ）は、結晶製剤の最高濃度においては、より低い濃度の場合より短かかった。このことは結晶製剤の最高濃度における速い吸収速度（Ｋａ）を示唆している。
Figure 2022512840000317
実施例１９
ペンブロリズマブ結晶懸濁液の固体ＮＭＲ特徴づけ
固体ＮＭＲスペクトルを、４．０ｍｍ Ｈ／Ｆ／Ｘマジック角スピニング（ＭＡＳ）プローブを備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ＨＤ ４００ＭＨｚ分光計、および４．０ｍｍ Ｈ／Ｃ／Ｎ ＭＡＳプローブを備えたＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ ＩＩＩ ５００ＭＨｚ分光計で取得する。プローブを、４００ＭＨｚ分光計での１３Ｃ（炭素１３）実験では二重共鳴Ｃ／Ｈに、そして５００ＭＨｚ分光計での１３Ｃ（炭素１３）および１５Ｎ（窒素１５）実験では三重共鳴Ｃ／Ｎ／Ｈに調整する。全ての実験のＭＡＳ周波数は１２ｋＨｚである。サンプル温度を、４００ＭＨｚ分光計では１０℃に、そして５００ＭＨｚ分光計では２１℃に制御する。４００ＭＨｚ分光計では、１ミリ秒のＣＰ接触時間および２秒のリサイクル遅延で、取得中の９０．９ｋＨｚ １Ｈ双極デカップリングで、１３Ｃ交差分極（ＣＰ）ＭＡＳスペクトルを収集する。５００ＭＨｚ分光計では、１ミリ秒のＣＰ接触時間および２秒のリサイクル遅延で、取得中の７１．４ｋＨｚ １Ｈ双極デカップリングで、１３Ｃ ＣＰ ＭＡＳスペクトルを収集する。５００ＭＨｚ分光計では、２．５ミリ秒のＣＰ接触時間および２秒のリサイクル遅延で、取得中の７１．４ｋＨｚ １Ｈ双極デカップリングで、１５Ｎ ＣＰ ＭＡＳスペクトルを収集する。１３Ｃ化学シフトは１７６．４５ｐｐｍにおけるグリシン（α型）のカルボニル炭素の１３Ｃシグナルを基準としている。固体ＮＭＲの目的においては、「約」なる語は±０．１ｐｐｍを意味する。
前記の固体１３Ｃ ４００ＭＨｚ ＮＭＲ装置および手順を用いて、ペンブロリズマブ－カフェイン結晶を測定した。具体的には、実施例１１に記載されている方法を用いて、結晶化ペンブロリズマブを製造した。ペンブロリズマブ－カフェイン結晶の１３Ｃ（炭素１３）ＣＰ ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルを得た。全スペクトルおよび幾つかの拡大領域を、それぞれ図１０Ａおよび図１０Ｂに示す。ペンブロリズマブ－カフェイン結晶の特性ピークは約１８３．０７、１８２．１６、１８１．５４、１８０．５５、１７９，９９、１１０．７０、１１０．１５、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、１０１．４９、９９．７５、９８．５６、７６．８８、７６．０４、７４．９７、７４．４１、７３．５２、７２．６９、１３．８５、１３．２７、１２．２６および１１．１３ｐｐｍにおいて観察される。
２－１３Ｃおよび１，３－１５Ｎで同位体標識されたカフェインを使用して製造されたペンブロリズマブ－カフェイン結晶を、前記の固体１３Ｃおよび１５Ｎ ５００ＭＨｚ ＮＭＲ装置および手順を用いて測定した。ペンブロリズマブ－カフェイン結晶の１３Ｃ（炭素１３）および１５Ｎ（窒素１５）ＣＰ ＭＡＳ ＮＭＲスペクトルを得た。分離された１３Ｃおよび１５Ｎカフェインピークを示す拡大スペクトル領域を、それぞれ図１１Ａおよび図１１Ｂに示す。ペンブロリズマブ－カフェイン結晶とカフェインのみの結晶との間の１３Ｃおよび１５Ｎカフェインピークの特性化学シフト差異が、それぞれ約１．６９および０．９２ｐｐｍで観察される。

Claims (51)

  1. 結晶性抗ＰＤ－１モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の製造方法であって、
    ａ）ｉ．約５ｍｇ／ｍＬ～約８０ｍｇ／ｍＬのｍＡｂを含む緩衝水溶液（ここで、該抗ＰＤ－１ｍＡｂはペンブロリズマブまたはペンブロリズマブ変異体である）、
    ｉｉ．ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ならびに
    ｉｉｉ．カフェイン、テオフィリン、２’デオキシグアノシン－５’－モノホスファート、生物活性ジベレリン、および該生物活性ジベレリンの薬学的に許容される塩からなる群から選択される添加剤
    を混合して、結晶化溶液を形成させ［ここで、結晶化溶液は約６．０～約８．８のｐＨを有し、約２％～約４０％ ｗ／ｖ（重量／体積）のＰＥＧおよび約０．１％～約０．３０％ ｗ／ｖの添加剤を含む］、
    ｂ）結晶形成に十分な時間にわたって該結晶化溶液をインキュベートし、
    ｃ）所望により、該溶液から結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを回収することを含む製造方法。
  2. ｍＡｂを含む緩衝水溶液が約５．０～約６．０のｐＨのヒスチジンバッファーを更に含む、請求項１記載の製造方法。
  3. ＰＥＧおよび添加剤を一緒に混合して沈殿剤溶液を形成させた後、ｍＡｂを含む緩衝水溶液と混合する、請求項１または２記載の製造方法。
  4. ｍＡｂを含む緩衝水溶液をＰＥＧと混合した後、添加剤と混合する、請求項１または２記載の製造方法。
  5. ｍＡｂを含む緩衝水溶液を添加剤と混合した後、ＰＥＧと混合する、請求項１または２記載の製造方法。
  6. 添加剤がジベレリンＡ３またはその薬学的に許容される塩である、請求項１記載の製造方法、
  7. 添加剤が約０．１５％～約０．３０％ ｗ／ｖのカフェインまたは約０．２５～約０．３０％ ｗ／ｖのテオフィリンである、請求項１記載の製造方法。
  8. 添加剤がカフェインであり、結晶化溶液が約１％～約１０％ ｗ／ｖのデキストラン硫酸ナトリウムを更に含む、請求項１記載の製造方法。
  9. デキストラン硫酸ナトリウムの量が約５％ ｗ／ｖである、請求項８記載の製造方法。
  10. ＰＥＧが約５％～約１５％ ｗ／ｖの量で結晶化溶液中に存在する、請求項１～９のいずれか１項記載の製造方法。
  11. ＰＥＧが約１０％～約３０％ ｗ／ｖの量で結晶化溶液中に存在する、請求項１～９のいずれか１項記載の製造方法。
  12. ＰＥＧの分子量が約２，５００～約３５，０００である、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  13. ＰＥＧがＰＥＧ ３３５０である、請求項１２記載の製造方法。
  14. 結晶化溶液のｐＨおよび結晶化溶液中に存在するＰＥＧの量が、
    ａ）結晶化溶液のｐＨは約６．０であり、ＰＥＧの量は２～４％ ｗ／ｖである；
    ｂ）結晶化溶液のｐＨは約６．４であり、ＰＥＧの量は２～６％ ｗ／ｖである；
    ｃ）結晶化溶液のｐＨは約６．８～８．４であり、ＰＥＧの量は６～１２％ ｗ／ｖである；および
    ｄ）結晶化溶液のｐＨは約８．８であり、ＰＥＧの量は１０～１２％ ｗ／ｖである
    からなる群から選択される、請求項１３記載の製造方法。
  15. 結晶化溶液を約２℃～約３７℃のインキュベーション温度でインキュベートする、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  16. 結晶化溶液を約１８℃～約２５℃のインキュベーション温度でインキュベートする、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  17. 結晶化溶液を約５０℃に加熱し、ついで約３７℃以下の温度に冷却する、請求項１～１４のいずれか１項記載の製造方法。
  18. 結晶化溶液を約１８℃～約２５℃の温度に冷却する、請求項１７記載の製造方法。
  19. 結晶化溶液を約４℃の温度に冷却する、請求項１７記載の製造方法。
  20. インキュベーション温度を約４℃から約１０～４０℃まで増加させる、請求項１７記載の方法。
  21. 結晶化溶液を約１５分間以上インキュベートする、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  22. 結晶化溶液を約２時間以上インキュベートする、請求項２１記載の製造方法。
  23. 結晶化溶液をインキュベーション中に回転させ、または攪拌する、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  24. 結晶化溶液中の抗ＰＤ－１ ｍＡｂの溶液濃度が約５ｍｇ／ｍＬ～約５０ｍｇ／ｍＬである、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  25. 結晶化溶液を蒸気拡散、バッチ結晶化または透析により製造する、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  26. 結晶化溶液が約２５ｍＭ～約２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを更に含む、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  27. 結晶化溶液が約５０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファーを含む、請求項２６記載の製造方法。
  28. ｍＡｂがペンブロリズマブである、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  29. 抗ＰＤ－１ ｍＡｂの結晶を結晶化溶液に播種する工程を更に含む、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  30. 結晶性抗ＰＤ－１ ｍＡｂを均質化する工程を更に含む、前記請求項のいずれか１項記載の製造方法。
  31. 前記請求項のいずれか１項記載の製造方法により形成される単離された結晶。
  32. カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む単離された結晶であって、空間群Ｐ２２２１ ａ＝４３．８オングストローム ｂ＝１１３．９オングストローム ｃ＝１７５．０オングストローム，α＝β＝γ＝９０°により特徴づけられる結晶。
  33. 該結晶がポリペプチドを含み、該ポリペプチドが、表７の構造座標により示される骨格原子上に重ね合わされた場合に約２．０オングストローム未満の保存された残基骨格原子の平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を含む構造座標により特徴づけられる、請求項３２記載の結晶。
  34. 結晶の粒子サイズが約０．５～５０ミクロンである、請求項３１～３３のいずれか１項記載の結晶。
  35. 約１８２．１６、１８１．５４、１７９．９９、１０９．３６、１０８．２３、１０３．５８、７６．８８および７６．０４ｐｐｍにおいてピークを示す固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、カフェインと複合体形成したペンブロリズマブを含む結晶性ペンブロリズマブ。
  36. 約１８３．０７、１８０．５５、１１０．７０、１１０．１５、１０１．４９、９９．７５、９８．５６、７４．９７、７４．４１、７３．５２、７２．６９、１３．８５、１３．２７、１２．２６および１１．１３ｐｐｍにおいてピークを更に示す、請求項３５記載の結晶性ペンブロリズマブ。
  37. 図１０Ａに示されている固体ＮＭＲ １３Ｃスペクトルにより特徴づけられる、請求項３５～３６のいずれか１項記載の結晶性ペンブロリズマブ。
  38. 請求項３１～３４のいずれか１項記載の結晶または請求項３５～３７のいずれか１項記載の結晶性ペンブロリズマブと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
  39. 組成物が結晶懸濁液であり、抗ＰＤ－１ ｍＡｂの濃度が５～４００ｍｇ／ｍＬである、請求項３８記載の組成物。
  40. 抗ＰＤ－１ ｍＡｂの濃度が＞７５ｍｇ／ｍｌである、請求項３８記載の組成物。
  41. 約５ｍＭ～約２０ｍＭ バッファーを更に含む、請求項３５～４０のいずれか１項記載の組成物。
  42. 約０．０１％～約０．１０％ ｗ／ｖ 非イオン性界面活性剤を更に含む、請求項３３～３９のいずれか１項記載の組成物。
  43. 第２の活性医薬成分（ＡＰＩ）を更に含む、請求項３３～４０のいずれか１項記載の組成物。
  44. 第２のＡＰＩが小分子または生物学的物質である、請求項４３記載の組成物。
  45. 請求項３１～３４のいずれか１項記載の結晶、請求項３５～３７のいずれか１項記載の結晶性ペンブロリズマブまたは請求項３８～４４のいずれか１項記載の組成物を、それを要するヒト患者に投与することを含む、ヒト患者における癌の治療方法。
  46. 結晶または組成物を患者に静脈内または皮下投与する、請求項４５記載の方法。
  47. 癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、ホジキンリンパ腫、頭頸部癌、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、尿路上皮癌、胃癌、食道癌、腎癌、子宮内膜癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌および子宮頸癌からなる群から選択される、請求項４５または４６記載の方法。
  48. 癌がマイクロサテライト不安定性高またはミスマッチ修復欠損固形腫瘍または結腸直腸癌である、請求項４５または４６記載の方法。
  49. 患者の腫瘍が、高い腫瘍負荷を有する、請求項４５または４６記載の方法。
  50. 抗ＰＤ－１ ｍＡｂの投与量が２００ｍｇであり、これを約３週間ごとに患者に投与する、請求項４５～４８のいずれか１項記載の方法。
  51. 結晶性ｍＡｂの投与量が４００ｍｇであり、これを約６週間ごとに患者に投与する、請求項４５～４８のいずれか１項記載の方法。
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