BR112016001522B1

BR112016001522B1 - Composições de anticorpo estabilizado

Info

Publication number: BR112016001522B1
Application number: BR112016001522-3A
Authority: BR
Inventors: Bernhard Günther; Dieter Scherer; Anthony Pettigrew; Gesche Graf
Original assignee: Novaliq Gmbh
Priority date: 2013-07-23
Filing date: 2014-07-23
Publication date: 2019-10-01
Also published as: KR20160034307A; EP3024484B1; KR102272568B1; EP3024484A1; AU2014295052A1; US10273298B2; JP6503349B2; PL3024484T3; AU2014295052B2; CA2918419C; CA2918419A1; MX370207B; US11987623B2; CN105555311B; MX2016001018A; US20190256591A1; WO2015011199A1; CN105555311A; HK1224218A1; PT3024484T

Abstract

ï»¿----------------------- page 1----------------------- 1/1 resumo composiãães de anticorpo estabilizado a invenã§ã£o provãª composiã§ãµes novas de anticorpos com base em veãculos lãquidos selecionados de alcanos semifluorados. o uso desses veãculos provãª estabilidade aperfeiã§oada e vida de armazenagem de anticorpos e seus derivados. as composiã§ãµes sã£o ãºteis para administraã§ã£o tã³pica ou para injeã§ã£o parenteral.

Description

COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO ESTABILIZADO DESCRIÇÃO

CAMPO [0001] A presente invenção está no campo de composições de anticorpo, em particular composições que são úteis como formulações farmacêuticas para uso terapêutico ou diagnóstico.

ANTECEDENTES [0002] Terapias à base de anticorpo ficarem à frente nos últimos anos como opções eficazes de tratamento para inúmeras doenças como câncer ou doenças autoimunes, em combinação com muitos desenvolvimentos novos em tecnologias de produção e engenharia de anticorpo.

[0003] Um dos desafios principais associados à formulação e fornecimento de anticorpo é manter a estabilidade e forma do terapêutico de anticorpo, em particular para armazenagem de longo prazo e para transporte. Anticorpos, como outros tipos de terapêuticos à base de proteína, são suscetíveis a instabilidade física e química sob condições de tensão como alterações de temperatura de congelar-descongelar ou durante transporte, exposição à luz, solventes/químicos ou oxigênio, tensão de cisalhamento, e tensão de pH.

[0004] Os mesmos podem ser submetidos à desnaturação (por exemplo, perda de estrutura terciária e/ou secundária) ou interagem para formar agregados. Embora agregação de anticorpo possa ocorrer tanto no estado líquido como sólido, é especialmente problemático em formulações de líquido, especialmente em concentrações elevadas de anticorpo. Anticorpos são tipicamente terapeuticamente eficazes em doses relativamente elevadas. Concentrações elevadas de anticorpo, como minimizar volumes de dose e tornar a administração mais favorável ao paciente

2/37 (por exemplo, injeção subcutânea em vez de infusão intravenosa, número diminuído de injeções) são, portanto, genericamente desejáveis em formulações farmacêuticas.

[0005] A agregação, com efeito, pode levar à perda de terapêutica de anticorpo ativo, levando a dosagem ineficaz e não confiável. Mais significativamente, agregados também podem exibir toxicidade e desencadear respostas imunogênicas graves ou indesejáveis. Agregação resultando na precipitação de particulados grandes que impedem fluxo é indesejável para qualquer tipo de aplicação parenteral.

[0006] Modificação e degradação de anticorpo através de vias químicas como oxidação, desamidação, isomerização, formação de ligação de dissulfeto e outras reações de reticulação irreversíveis também podem ocorrer ao longo do tempo e levar à inativação do anticorpo, bem como desencadear agregação. Essas reações, juntamente com agregação, são frequentemente aceleradas em temperaturas elevadas; refrigeração é consequentemente quase sempre um pré-requisito. Em muitas dessas reações químicas, água também desempenha um papel significativo como um mediador ou como um intermediário reativo como na divagem hidrolítica de ligações de amida. A exclusão de água, como por liofilização, ou congelamento-secagem, para formar uma formulação de pó em estado solido pode ser desse modo uma medida eficaz para a preparação de uma formulação estável de um terapêutico de anticorpo.

[0007] Algumas das formulações de fragmentos/derivados de anticorpo ou anticorpo terapêutico comercializado são baseadas em formulações de pó liofilizado que necessita ser reconstituído em condições estéreis com meios aquoso pouco antes da administração por um médico treinado ou paramédico. Por exemplo, omalizumb

3/37 (por exemplo, Xolair®, comercializado por Genentech) é disponível como um pó liofilizado em um frasco de uso único.

[0008] A reconstituição do anticorpo liofilizado em meios aquosos estéreis como uma etapa extra antes da administração efetiva, entretanto, tem o risco de manipulação inadequada (por exemplo, agitação) ou dosagem, bem como contaminação. A própria etapa de reconstituição pode desencadear agregação se o pH ou temperatura do meio aquoso for inferior à ótima, o tempo permitido para reidratação for demasiadamente curto ou o frasco for demasiadamente agressivamente agitado durante a etapa de dissolução. A propensão para desperdício também é mais elevada, visto que a falha em dissolver adequadamente o produto de anticorpo liofilizado no período de tempo recomendado normalmente requer que a amostra seja descartada.

[0009] Deve ser observado que a própria etapa de processo de liofilização pode induzir agregação e/ou degradação. Excipientes de estabilização adicionais como sacarídeos ou poliois são frequentemente adicionados à composição de pré-liofilização, juntamente com outros

excipientes	como	agentes	de	volume. A	adição de outros
excipientes	também pode	ser	necessária	após liofilização
para suportar a	vida	de	armazenagem	mais longa	do
anticorpo,	adicionando	ao	número de	componentes	na
formulação	final.
[00010]	Formulações de líquido prontas para	uso

seriam genericamente preferidas pelos usuários, devido à facilidade de preparação para administração. Se estável, uma formulação de líquido também é atraente para o fabricante farmacêutico devido à evitação de liofilização, que é demorada, e cara tanto durante desenvolvimento de

4/37 droga como fabricação de rotina. Realmente, muitas formulações comercializadas de anticorpos ou derivados de anticorpo são soluções de base aquosa. Com formulações aquosas, o pH do meio pode ter um impacto significativo sobre a estabilidade do anticorpo em termos de promover ou reduzir a probabilidade de várias reações químicas de degradação. Consequentemente, um sistema de tamponamento otimizado é sempre exigido, juntamente com outros excipientes de formulação como limpadores de radical livre de antioxidante, tensoativos e outros aditivos antiagregação, ou preservativos para fornecer estabilização para o anticorpo e neutralizar os vários processos de degradação possíveis que podem ocorrer durante armazenagem em um ambiente aquoso ao longo do tempo.

[00011] Opções de formulação alternativas à liofilização e soluções aquosas são também conhecidas, como o uso de líquidos não aquosos como veículos carreadores. Por exemplo, WO2012/121754 descreve formulações de suspensão de concentração elevada, não aquosa compreendendo um veículo hidrofóbico como óleo de gergelim, e um agente redutor de viscosidade como oleato de etila, e um anticorpo anti-ΤΝΕα. Essas composições exigem adição de um agente redutor de viscosidade que é totalmente miscível no carreador, para tornar os carreadores de óleo mais favoráveis à injeção. Em geral, o uso parenteral de lipídeos e óleos pode causar dor e outros efeitos colaterais indesejáveis no local de injeção. Esses tipos de compostos também podem diminuir a liberação de agente terapêutico, e não são ideais se biodisponível imediato ou rápido for preferido.

[00012] Compostos perfluorados também foram descritos como carreadores de líquido não aquosos possíveis de agentes biologicamente ativos como proteínas e

5/37 peptideos. Por exemplo, US6458376 descreve composições propostas para aplicações oftálmicas (como gotas de olho topicamente aplicadas) nas quais compostos de diagnóstico/terapêutico, incluindo oligopeptídeos e fatores de crescimento de proteína são suspensos em perfluorocarbonos ou óleos de silicone fluorados e na presença de pelo menos um tensoativos. Não há menção, entretanto, de tais composições compreendendo anticorpos ou fragmentos e derivados de anticorpo.

[00013] US6730328 descreve formulações termicamente estáveis nas quais veículos não reativos hidrofóbicos, não aquosos como óleo mineral, perfluorodecalin, metoxiflurano, perfluorotributil amina e tetradecano são usados para composições de suspensão compreendendo proteínas, compostos proteináceos e ácidos nucleicos. As formulações são propostas para métodos de administração parenteral, transdérmica, de mucosa, oral e enteral, bem como seu uso para administração e fornecimento contínuo de longo prazo através de um dispositivo implantável. Entretanto, nenhum exemplo específico de uma suspensão de um anticorpo ou fragmento de anticorpo ou derivado em tais veículos é revelado, nem há qualquer ensinamento com relação à estabilidade de tais composições em temperaturas elevadas além de um ponto de tempo de três meses. A compatibilidade efetiva de tecido desses tipos de composições não foi demonstrada também.

[00014] WO 2011/073134 revela soluções de ciclosporina, um polipeptídio cíclico com um peso molecular de 1202.31 em um alcano semiflucrado, opcionalmente na presença de um co-solvente como etanol. Embora suspensões e emulsões sejam mencionadas como alternativas opcionais, não há revelação específica de tal tipo de composição, ou qualquer composição compreendendo espécie proteinácea com

6/37 peso molecular elevado na faixa de kiloDalton como anticorpos ou fragmentos ou derivados de anticorpo.

[00015] Portanto, é um objetivo da presente invenção introduzir composições de anticorpo novas que superam quaisquer das limitações e desvantagens associadas a formulações atualmente conhecidas na técnica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [00016] Em um primeiro aspecto, a invenção provê uma composição nova de uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno, e um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RE é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 carbonos. O polipeptídio de ligação de antígeno ou proteína é incorporado na composição como para formar uma dispersão ou suspensão.

[00017] Em outro	aspecto,	a	proteína	ou
polipeptídio de ligação de	antígeno pode	ser	selecionada	de
um anticorpo monoclonal,	um	fragmento	de	anticorpo,	um

anticorpo policlonal, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo, ou um conjugado de drogaanticorpo.

[00018] Em um aspecto adicional, a invenção provê um método para o tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a etapa de administrar uma composição compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno, e um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RE é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 carbonos, e em que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é incorporada na composição de modo a formar uma

7/37 dispersão ou suspensão.

[00019] Ainda em outra modalidade, a invenção provê um método de estabilizar uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno, compreendendo a etapa de misturar a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 carbonos, para formar uma suspensão ou dispersão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [00020] Em um primeiro aspecto, a presente invenção provê composições compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 carbonos. Além disso, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é incorporada na composição como para formar uma dispersão ou uma suspensão; isto é, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é dispersa ou suspensa no veículo líquido.

[00021] Alcanos semiflucrados fornecem diversas vantagens a partir da perspectiva farmacêutica. São substancialmente não tóxicos e se verifica que são bem tolerados por vários tipos de tecido animal e humano quando administrado por via tópica ou parenteral. Além disso, são quimicamente inertes e são genericamente compatíveis com ingredientes ativos e inativos em formulações farmacêuticas. São também capazes de dissolver uma grande gama de compostos, como ingredientes ativos de molécula pequena e muitos excipientes farmaceuticamente aceitáveis comuns, provavelmente devido a sua anfifilicidade inerente.

8/37

Além disso, alcanos semiflucrados, ao atuar como veículos para compostos que não são solúveis ou pouco solúveis (como proteínas ou polipeptídios de ligação de antígeno), formam dispersões ou suspensões com propriedades farmacêuticas ou físicas muito úteis, isto é, com pouca ou nenhuma tendência a formar sedimentos não dispersáveis sólidos.

[00022] Foi descoberto pelos inventores que a presença de um alcano semifluorado como um veículo líquido em uma composição compreendendo polipeptídio ou proteína de ligação de antígeno tem um efeito de estabilização notável sobre esses componentes. Em particular, composições compreendendo alcano semifluorado como um veículo líquido são capazes de evitar substancialmente ou inibir sua agregação e reduzir degradação química durante um período de tempo substancial, em temperatura ambiente e mesmo em temperaturas mais elevadas como 40°C, sem perda de atividade biológica.

[00023] Verificou-se também que suspensões e dispersões de proteína de ligação de antígeno em alcanos semiflucrados apresentam um grau notável de estabilidade física. A ocorrência de flotação ou sedimentação ocorre lentamente, deixando tempo suficiente para a retirada de uma dose após agitação suave ou circulação do recipiente (por exemplo, um frasco) com a dispersão ou suspensão. As partículas de proteína de ligação de antígeno em alcano semifluorado parecem reter amplamente sua distribuição de tamanho de partícula original, e são prontamente redispersáveis; agregados pouco redispersáveis não parecem ser formados. De modo importante, isso provê um nível mais elevado de precisão de dosagem em termos de precisão e reprodutibilidade.

[00024] Em contraste, suspensões ou dispersões em outros veículos quimicamente inertes tendem a ser

9/37 instáveis, levando à formação de agregados densos e pouco redispersáveis; e tornando a dosagem precisa desafio, ou em alguns casos, impossível, como levando à obstrução de agulhas de calibre fino tipicamente usadas para injeções subcutâneas. Partículas de proteína agregadas também apresentam um risco elevado em direção a desencadear reações imunogênicas adversas.

[00025] Suspensões ou dispersões que são instáveis tendem a separar rapidamente por flotação da fase dispersa, ou por sua sedimentação, dependendo das densidades relativas da fase dispersa e da fase contínua. Tal comportamento é normalmente acompanhado por formação rápida de agregados densos e pouco redispersáveis. A flotação rápida ou sedimentação torna a dosagem precisa e reprodutível um desafio, se não impossível. Por exemplo, se uma suspensão oftálmica ou injetável assentar rapidamente após agitação, e se uma primeira dose a partir do recipiente cheio não for retirada imediatamente após agitação, uma dose que é retirada pode conter um número mais baixo que pretendido de partículas de droga (ou se o recipiente for seguro de cabeça para baixo, uma dose maior que pretendida será dispensada) . Posteriormente doses retiradas do mesmo recipiente também conterão uma dose de droga demasiadamente elevada ou demasiadamente baixa por volume. A agitação vigorosa de polipeptídios de ligação de antígeno e proteínas em tentativa para redispersar agregados pouco redispersáveis pode também desencadear adicionalmente sua agregação adicional e deterioração.

[00026] As principais vantagens da presente invenção são ocasionadas pela presença de um alcano semifluorado na composição, funcionando como um veículo líquido. As propriedades vantajosas de suspensões à base de alcano semifluorado resultam em características de

10/37 desempenho e qualidade farmacêutica superiores, e também aumentam a conveniência de uso para o paciente e/ou provedor de tratamento de saúde.

[00027] Alcanos semiflucrados são alcanos lineares ou ramificados cujos átomos de hidrogênio de alguns foram substituídos por flúor. Nos alcanos semiflucrados (SFAs) usados na presente invenção, um segmento de hidrocarboneto não fluorado linear e um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear estão presentes. Esses compostos seguem desse modo a fórmula geral F (CF₂) _n (CH₂) _mH. De acordo com a presente invenção, n é selecionado da faixa de 4 a 12, e m é selecionado da faixa de 4 a 8.

[00028] Uma nomenclatura que é frequentemente usada para alcanos semiflucrados designa um segmento de hidrocarboneto perfluorado como RE e um segmento não fluorado como RH. Alternativamente, os compostos podem ser mencionados como FnHm e FnHm, respectivamente, em que F significa um segmento de hidrocarboneto perfluorado, H significa um segmento não fluorado, e n e m definem o número de átomos de carbono do segmento respectivo. Por exemplo, F3H3 é usado para perfluoropropil propano, F (CF₂) 3 (CH₂) 3H. Além disso, esse tipo de nomenclatura é normalmente usado para compostos tendo segmentos lineares. Portanto, a menos que de outro modo indicado, deve ser presumido que F3H3 ignifica 1-perfluoropropil propano, em vez de 2-perfluopropil propano, 1-perfluoroisopropil propano ou 2-perfluoroisopropil propano.

[00029] Alcanos semiflucrados preferidos incluem, em particular, os compostos F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8, e F6H10. São particularmente preferidos para realizar a invenção F4H5, F4H6, F6H6 e F6H8. Em outra modalidade particularmente preferida, a composição da

11/37 invenção compreende F6H8.

[00030] Opcionalmente, a composição pode compreender mais de um SFA. Pode ser útil para combinar SFAs, por exemplo, para obter uma propriedade alvo específica como certa densidade ou viscosidade, se uma mistura de SFAs for usada, é adicionalmente preferido que a mistura compreenda pelo menos um de F4H5, F4H6, F6H4, F6H6, F6H8, e F6H10, em particular um de F4H5, F4H6, F6H6 e F6H8 . Em outra modalidade, a mistura compreende pelo menos dois

membros	selecionados entre	F4H5, F4H6,	F6H4,	F6H6, F6H8 e
F6H10, e	em particular pelo	menos dois	membros	selecionados
de F4H5,	F6H6 e F6H8.
	[00031] SFAs	líquidos	são	química e
fisiologicamente inertes,	incolores	e estáveis. Suas

densidades típicas variam de 1,1 a 1,7 g/cm³, e sua tensão superficial pode ser tão baixa quanto 19 mN/m. SFAs do tipo RFRH são insolúveis em água porém também de certo modo anfifílicos, com lipofilicidade crescente correlacionando com um tamanho crescente do segmento não flucrado.

[00032] SFAs líquidos do tipo RFRH estão sendo usados comercialmente para desdobrar e reaplicar uma retina, para tamponado de longa duração como substituto de humor vítreo (H. Meinert e outros, European Journal of Ophthalmology, vol. 10(3), pág. 189-197, 2000), e como soluções de lavagem para óleo de silicone residual após cirurgia vítreo-retinal. Experimentalmente, também foram usados como substitutos de sangue (H. Meinert e outros, Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology, vol. 21(5), pág. 583-95, 1993). Essas aplicações estabeleceram SFAs como compostos fisiologicamente bem tolerados. Por outro lado, SFAs não foram usados como excipientes em produtos de droga aprovados atualmente.

12/37 [00033] A composição da invenção compreende uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno. Polipeptídios e proteínas em geral representam polímeros de unidades de aminoácido que são ligadas entre si por ligações de peptídeo. Uma vez que os limites de tamanho que são frequentemente usados para diferenciar entre polipeptídios e proteínas são de certo modo arbitrários, as duas expressões para essas moléculas não devem - no contexto da presente invenção - ser entendidos como mutuamente exclusivos: um polipeptídio pode ser também mencionado como uma proteína e vice versa. Tipicamente, o termo polipeptídio somente se refere a uma cadeia de polímero única, ao passo que a expressão proteína também pode se referir a duas ou mais cadeias de polipeptídio que são ligadas entre si por ligações não covalentes.

[00034] Mais especificamente, e como usado no contexto da presente invenção, proteínas ou polipeptídios de ligação de antígeno se refere a anticorpos inteiros e de comprimento total (também conhecidos como imunoglobulinas) em seu monômero, ou formas poliméricas e quaisquer fragmentos, cadeias, domínios ou quaisquer modificações derivadas de um anticorpo de comprimento total capaz de ligação específica a um antígeno. As proteínas ou polipeptídios de ligação de antígeno podem pertencem a quaisquer das classes ou isotipos de imunoglubilina IgG, IgA, IgD, IgE ou IgM. Proteínas de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo capaz de especificamente se ligar a um antígeno e conjugados de droga-anticorpo estão também compreendidas na definição de proteínas ou polipeptídios de ligação de antígeno como usado aqui.

[00035] Um anticorpo de comprimento total é uma glicoproteína no formato de Y compreendendo uma estrutura geral com um domínio Fc (fragmento cristalizável) e um

13/37 domínio Fab (fragmento de ligação de antígeno). Esses são estruturalmente compostos a partir de duas cadeias pesadas (H) e duas estruturas de polipeptídio de cadeia leve (L) interligadas através de ligações de dissulfeto para formar a estrutura no formato de Y. cada tipo de cadeia compreende uma região variável (V) e uma região constante (c) ; a cadeia pesada compreende uma região de cadeia variável (V_H) e várias regiões constantes (por exemplo, C_H1, C_H2, etc.) e a cadeia leve compreende uma região de cadeia variável (V_L) e uma região constante (C_L) . as regiões V podem ser adicionalmente caracterizadas em regiões/subdomínios adicionais, isto é, regiões de estrutura (FR) compreendendo resíduos de aminoácido mais conservados e as regiões de determinação de complementaridade (CDR) ou hipervariáveis (HV) que compreendem regiões de variabilidade aumentada em termos de resíduos de aminoácido. As regiões variáveis das

cadeias	determinam	a	especificidade e de	ligação	do
anticorpo	e formam	os	domínios Fab de ligação	de antígeno
de um anticorpo.
	[00036]	Em	uma modalidade preferida	da
invenção,	as composições compreendem uma	proteína	ou

polipeptídio de ligação de antígeno, em que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é selecionado de um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo, um conjugado de droga-anticorpo ou qualquer combinação dos mesmos.

[00037] Em uma modalidade particularmente preferida da invenção, as composições compreendem uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno selecionada de um anticorpo monoclonal (mAb). Um anticorpo monoclonal se refere a um anticorpo obtido de uma população homogênea de anticorpos que são específicos em direção a um epítopo

14/37 único ou local de ligação em um antigeno. Anticorpos monoclonais podem ser produzidos utilizando técnicas de engenharia de anticorpo conhecidas na arte, como via métodos de DNA recombinante ou hibridoma.

[00038] Também compreendidos no escopo de proteínas e polipeptídios de ligação de antigeno, e anticorpos monoclonais são fragmentos de anticorpo. Como definido aqui, fragmentos de anticorpo incluem qualquer região, cadeia, domínio de um anticorpo, ou quaisquer construções ou conjugados do mesmo que podem interagir e ligar especificamente a um antigeno e podem ser monovalentes, bivalentes ou mesmo multivalentes com relação à capacidade de ligação. Tais fragmentos de anticorpo podem ser produzidos de métodos conhecidos na técnica, por exemplo, dissecção (por exemplo, por proteólise) de um anticorpo nativo de comprimento total, a partir de sínese de proteína, processos recombinantes de DNA/engenharia genética, reticulação química ou qualquer combinação dos mesmos. Fragmentos de anticorpo são comumente derivados da combinação de vários domínios ou regiões apresentadas em região V variável de um anticorpo de comprimento total.

[00039] Em uma modalidade da invenção, as composições compreendem uma proteína ou polipeptídio de ligação de antigeno selecionada de um fragmento de anticorpo, em que o fragmento de anticorpo é uma ligação de antigeno de fragmento (Fab), um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, um minicorpo ou um diacorpo.

[00040] Fragmentos de anticorpo particularmente preferidos são domínios de ligação de antigeno de fragmento (Fab, também mencionado como Fab') ou dímeros de Fab compreendendo dois fragmentos de Fab ligados por uma ligação de dissulfeto. Os exemplos de Fabs são abciximab,

15/37 certolizumab, digifab e ranibizumab. Um Fab preferido é certolizumab (também conhecido como certolizumab pegol), que é um fragmento Fab' de anticorpo humanizado recombinante conjugado com polietileno glicol. Certolizumab tem uma massa molecular de 91 kDa e é dirigido contra fator de necrose de tumor alfa (TNFa).

[00041] Ainda em outra modalidade da invenção, as composições podem compreender um fragmento variável de cadeia única (scFv) como aqueles compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada (V_H) e leve (v_L) unidos por um ligador ou uma construção multivalente/multimérica complexada do mesmo, por exemplo, diacorpos (dímero bivalente), triacorpos (trímero trivalente), ou tetracorpos (tetrâmero tetravalente). Fragmentos de anticorpo multimérico também podem ser multiespecíficos, por exemplo, um diacorpo biespecífico pode compreender dois fragmentos cada com especificidade para um antígeno diferente. Fragmentos de anticorpo preferidos adicionais incluem anticorpos de domínio único (daBs) como aqueles compreendendo um domínio V_H ou V_L único capazes de ligação específica a um antígeno. Fragmentos de anticorpo também compreendidos no escopo da invenção incluem construções de dímero scFv-Ch, isto é, um minicorpo.

[00042] De acordo com uma modalidade adicional, a composição compreende uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com uma massa molecular selecionada de pelo menos 10 KDa, pelo menos 15 KDa, pelo menos 35 KDa, pelo menos 50 KDa, pelo menos 70 KDa, ou pelo menos 90 KDa. Também preferido é uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com uma massa molecular de pelo menos 100 KDa, como 100-150 KDa, ou mesmo mais elevada que 150 KDa. São particularmente preferidos polipeptídios ou proteínas de ligação de antígeno com uma massa molecular na faixa de 70

16/37 kDa a 160 kDa.

[00043] Em uma modalidade adicional da invenção, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno pode ser selecionada de uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo. Um fragmento de anticorpo pode ser fundido com outra proteína bioativa ou fragmento de polipeptídio, por exemplo, uma toxina de polipeptídio, enzima, citocina, proteína de membrana, etc. Os exemplos de uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo incluem etanercept e atacicept. Etanercept é uma proteína humana recombinante com uma massa molecular de 150 kDa, compreendendo a porção de ligação de ligando de 75 kDa de receptor de fator de necrose de tumor (TNFR) fundido com a porção Fc de IgGl.

[00044] Em outra modalidade da invenção, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno pode ser selecionada de um conjugado de droga-anticorpo, em que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é covalentemente ligada, por exemplo, através de um ligador ou quimicamente reticulando com uma droga de molécula pequena ou um componente radio rotulado como radionuclides. Os exemplos de conjugados de droga-anticorpo incluem gemtuzumab ozogamicina, brentuximab vedotin, tiuxetan ibritumomab rotulado- ⁹⁰Y, tositumomab rotulado ¹³¹I, arcitumomab rotulado ^99mTC. Como usado aqui, o termo conjugado de droga-anticorpo pode também se referir a uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno que é substancialmente modificado quimicamente, por exemplo, por PEGuilação (por exemplo, certolizumab pegol, um fragmento Fab' PEGuilado de um anticorpo monoclonal de inibidor TNF humanizado) ou lipidação.

[00045] Como entendido aqui, proteínas e polipeptídios de ligação de antígeno podem ser quiméricos,

17/37 humanizados ou humanos. Anticorpos monoclonais quiméricos, por exemplo, se referem a anticorpos monoclonais híbridos compreendendo domínios ou regiões das cadeias pesada ou leve derivadas das sequências de anticorpo de mais de uma espécie, por exemplo, de sequências de anticorpo humanas e de murinho. Anticorpos monoclonais humanizados se referem àqueles que são predominantemente estruturalmente derivados de sequências de anticorpo humanas, genericamente com uma contribuição de pelo menos 85-95% de sequências derivadas de humanos, ao passo que o termo humano se refere àquelas que são derivadas unicamente de sequências de anticorpo de linha germinal humano. Em uma modalidade preferida, as composições compreendem uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno selecionada de um anticorpo monoclonal, em que o anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

[00046] Em outra modalidade, a composição pode compreender um anticorpo policlonal, ou uma mistura heterogênea de anticorpos capazes de reconhecer mais de um epítopo de um antígeno.

[00047] Em uma modalidade preferida, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é um composto de diagnóstico ou terapêutico ou vacina. Como usado aqui, um composto terapêutico é um composto que é útil para evitar uma doença ou condição, aliviar quaisquer sintomas de uma doença ou condição, melhorar qualquer doença ou condição, retardar o avanço de uma doença ou condição ou similar. Um composto de diagnóstico é útil para determinar o estado de um organismo, ou para diagnosticar uma doença, condição, sintoma ou fenótipo de paciente. O composto terapêutico deve ser administrado ao paciente, ao passo que o agente de diagnóstico pode ser usado in vivo ou in vitro, dependendo do caso específico. Para evitar dúvida, o composto de

18/37 diagnóstico ou terapêutico é incorporado na composição da invenção é uma quantidade terapêutica ou diagnosticamente eficaz.

[00048] Em uma modalidade particularmente preferida, as composições da invenção compreendem um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo que é terapeuticamente eficaz ou que pode ser administrado para o tratamento de uma doença ou condição, como uma doença autoimune ou condição inflamatória, um distúrbio neurológico, ou câncer. Anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo exemplares para o tratamento de câncer incluem alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, ipilimumab, ibritumomab, nimotuzumab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositumomab, e trastuzumab. Anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo exemplares para o tratamento de condições inflamatórias ou autoimunes incluem adalimumab, alemtuzumab, belimumab, briakinumab, canakinumab, eculizumab, epratuzumab, efalizumab, golimumab, infliximab, mepolizumab, natalizumab, ofatumumab, ocrelizumab, otelixizumab, omalizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab, ustekinumab, e vedolizumab. Exemplos adicionais de anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpo que podem ser administrados para tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição incluem basiliximab, daclizumab, denosumab, eculizumab, palivizumab e motavizumab.

[00049] Composições de dispersão ou suspensão de acordo com a invenção podem em particular compreender um agente de terapia de câncer selecionado de uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno como anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento

19/37 de anticorpo, um conjugado de droga -anticorpo, ou qualquer combinação do mesmo e um veiculo liquido compreendendo um alcano semifluorado da fórmula RFRH em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono. Proteínas ou polipeptídios de ligação de antígeno que atuam como inibidores de angiogênese ou que são capazes de inibir proliferação de célula de tumor (agente anti-proliferativo) são particularmente relevantes. 0 fragmento de anticorpo pode ser um fragmento de ligação de antígeno (Fab), um fragmento variável de cadeia única (scFv), um anticorpo de domínio único, um minicorpo ou um diacorpo.

[00050] Por exemplo, uma composição de acordo com a invenção pode compreender bevacizumab e um veículo líquido, em que o veículo líquido compreende um alcano semifluorado da fórmula RFRH, em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono; e em que bevacizumab é incorporado na composição na forma de uma dispersão ou suspensão. Fragmentos de ligação de antígeno de bevacizumab são também considerados. Bevacizumab (nome comercial Avastin®) é um anticorpo de murino humanizado que almeja VEGF-A (fator de crescimento endotelial vascular A) e que atua como inibidor de angiogênese. Composições da invenção compreendendo bevacizumab podem ser usadas para o tratamento ou prevenção de doenças e condições como canceres colorretal, pulmão, mama, renal ou cérebro (glioblastoma), bem como condições dos olhos como degeneração macular relacionada à idade (AMD) .

[00051] Composições adicionais podem compreender os anticorpos conhecidos sob o nome pipeline

20/37 como Fsn0503 e Fsnl006. Fsnl006 é um anticorpo específico dual que pode se ligar a EGFR humano (receptor de fator de crescimento de epiderme) ligandos anfiregulin e HB-EGF (fator de crescimento epidérmico de ligação de heparina), e que podem atuar para inibir proliferação de células. Fsnl006 é um isotipo de kappa/IgGl humanizado. Foi demonstrado que Fsnl006 funciona independentemente do status de mutação de K-ras da célula, e, portanto, tem vantagens significativas em relação a propriedades de alvejar EGFR atuais como cetuximab. Fsn0503 também é um anticorpo kappa/IgGl humanizado que alveja e inibe a atividade proteolítica de Cathepsin S humano. Fsn0503 pode ser usado no tratamento de câncer, e outras doenças relacionadas a angiogênese, em particular doenças onde remodelagem mediada por Cathepsin S da matriz extracelular está envolvido.

[00052] Ainda em uma modalidade preferida adicional, composições de dispersão ou suspensão de acordo com a invenção podem compreender um inibidor de TNF selecionado de uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno como um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo, um conjugado de droga-anticorpo, ou qualquer combinação dos mesmos, e um veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado da fórmula RFRH em que RE é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono. Inibidores de TNF exemplares são infliximab, etanercerpt e certolizumab e seus biossimilares. Composições da invenção podem compreender esses inibidores de TNF e um veículo líquido, em que o veículo líquido consiste em alcano semifluorado selecionado entre F4H5,

21/37

FRH6, F4H8, F6H4, F6H6, F6H8 e F6H10. Em particular, essas composições podem ser usadas na terapia de doenças autoimunes que afetam o sistema gastrointestinal como doença de Crohn, colite ulcerativa, ou condições que afetam as articulações e pele como artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante, e psoriase de placa.

[00053] Ainda em outra modalidade, as composições da invenção compreendem uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno em uma concentração preferivelmente de pelo menos 0,5 mg/mL, como 0,5-10 mg/ml. Em modalidades preferidas adicionais, a concentração é pelo menos 1 mg/mL, pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/mL, pelo menos 25 mg/mL ou pelo menos 35 mg/mL.

[00054] Em um aspecto adicional, a presente invenção apresenta um método de estabilizar uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno, compreendendo a etapa de misturar a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com um veículo líquido compreendendo um alcano semiflucrado. O alcano semiflucrado é da fórmula RFRH, em que RE é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono. De acordo com o método, a etapa de misturar a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com o veículo líquido é realizada de modo a formar uma suspensão ou uma dispersão. Tal método de estabilizar uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno pode ser útil para a preparação de uma composição para uso como um remédio, como no tratamento, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou condição em um paciente necessitando do mesmo. Opcionalmente, tal método de estabilização pode ser também usado para a preparação, fabricação ou sínese de uma proteína ou polipeptídio de

22/37 ligação de antigeno.

[00055] Como usado aqui, o termo estabilidade é definido como a manutenção da integridade química ou física e/ou bioatividade da proteína ou polipeptídio de ligação de antigeno durante um período de tempo. A estabilização de uma proteína ou polipeptídio de ligação de antigeno inclui a prevenção ou retardo de degradação ou deterioração da proteína ou polipeptídio de ligação de antigeno a partir de sua forma biológica e/ou terapeuticamente ativa para uma forma inativa. Instabilidade pode se originar de eventos como agregação, desnaturação, fragmentação, ou modificações químicas como oxidação, reticulação, desamidação e reações com outros componentes apresentados na composição compreendendo a proteína ou polipeptídio de ligação de antigeno.

[00056] A estabilidade do polipeptídio ou proteína de ligação de antigeno na composição pode ser caracterizada utilizando métodos conhecidos na arte, incluindo, porém não limitado a, medição de atividade biológica como atividade de ligação de antigeno com técnicas de imunoensaio como ELISA, ou outras técnicas de determinar pureza ou alterações físicas/químicas para o polipeptídio ou proteína de ligação de antigeno como cromatografia de exclusão de tamanho, eletroforese de gel capilar, dicroísmo circular, ou espectrometria de massa. A estabilidade é determinada por comparação de medições obtidas através desses tipos de métodos de caracterização em um ponto de tempo inicial, como no momento de formulação ou preparação da composição (isto é, conforme o caso possa ser, a suspensão ou dispersão), e aqueles obtidos em um ponto em tempo posterior, isto é, após armazenagem em um dado ambiente ou condição.

[00057] Foi descoberto pelos inventores que uma

23/37 proteína de ligação de antígeno em um veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado permanece estável a 25°C por pelo menos 6 meses. Mais notavelmente, a proteína de ligação de antígeno era comparavelmente estável quando armazenada em uma temperatura de 4 0°C durante o mesmo período de tempo. Isto é, a composição compreendendo a proteína de ligação de antígeno reteve eficazmente atividade de ligação de antígeno igual ou similar a sua atividade de ligação de antígeno inicial.

[00058] Em uma modalidade preferida, as composições da invenção retêm pelo menos 85% ou pelo menos 90% como 90-95% ou mesmo mais que 95% de sua atividade de ligação de antígeno inicial durante armazenagem de 3 meses a 25°C, ou em temperatura ambiente, ou em uma temperatura entre temperatura ambiente e 40°C. em outra modalidade preferida, as composições da invenção retêm pelo menos 85% ou pelo menos 90% como 90-95%, ou mesmo mais que 95% de sua atividade de ligação de antígeno inicial, durante armazenagem de 6 meses a 25°C, ou em temperatura ambiente (RT) ou em uma temperatura entre RT e 40°C. Ainda em outra modalidade, as composições da invenção retêm pelo menos 85% de sua atividade de ligação de antígeno inicial, durante armazenagem de 6 meses entre RT e 4 0°C e uma umidade relativa entre 50-75%. Em outras modalidades, o período de tempo de armazenagem pode ser 4-6 semanas, 6-12 semanas ou

3-6 meses ou	6-12 meses. Em modalidades	adicionais, a
umidade (RH)	durante armazenagem pode	ser	pelo menos	40%,
ou pelo menos	50%	ou pelo	menos 65% ou	pelo	menos 75%.
[00059]	Como	mencionado,	a	proteína	ou
polipeptídio	de	ligação	de antígeno	é	incorporada	na

composição como para formar uma dispersão ou suspensão. Em outras palavras, a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é dispersa ou suspensa no veículo líquido

24/37 compreendendo um alcano semifluorado. 0 fato de se uma suspensão é formada após dispersar a proteína de ligação de antígeno no carreador liquido depende, por exemplo, da natureza da proteína de ligação de antígeno, sua concentração no carreador, e os SFA(s) selecionado(s).

[00060] Como utilizado aqui, uma suspensão pode ser definida como um tipo de dispersão, isto é, um sistema tendo pelo menos uma fase contínua (ou coerente) e pelo menos uma fase descontínua (ou interna) que é dispersa na fase contínua. Em uma suspensão, a fase dispersa está no estado sólido. As suspensões úteis para pôr em prática a invenção são líquidas, pelo menos em temperatura fisiológica, o que significa que a fase contínua é um líquido. Tipicamente, as suspensões são também líquidas tem temperatura ambiente. Além de suspensões, o termo dispersões é entendido como incluindo sistemas coloidais nos quais um polipeptídio e proteína de ligação de antígeno é finamente disperso na fase líquida. Em algumas modalidades, o polipeptídio ou proteína de ligação de antígeno é também pelo menos parcialmente solvatado.

[00061] Uma dispersão ou suspensão estabilizada de uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é preparada através de um método compreendendo a etapa de misturar a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com um veículo líquido que compreende um alcano semifluorado. A estabilidade da suspensão ou dispersão resultante pode ser caracterizada pela medição de vários atributos físicos incluindo, porém não limitado a, por exemplo, a capacidade de redispersão das partículas suspensas, distribuição de tamanho de partícula e crescimento de tamanho de partícula ao longo do tempo, utilizando tais métodos como aqueles conhecidos na técnica.

[00062] Em uma modalidade específica, a

25/37 composição compreende somente a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um ou mais SFAs, isto é, a composição consiste na proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um ou mais SFAs como definido acima. Em outra modalidade preferida, a composição compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um ou mais SFAs é eficazmente ou substancialmente livre de água, isto é, a composição não compreende água, exceto talvez por quantidades residuais de água introduzida através de outros componentes líquidos ou sólidos ou a própria proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno. Em outros casos, as composições de dispersão ou suspensão compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado pode ser isenta de água.

[00063] Em contraste com algumas outras suspensões ou dispersões conhecidas na técnica anterior, as formulações da invenção não exigem tensoativo, ou somente pequenas quantidades de tensoativo para sua estabilização física. Essa é uma vantagem significativa visto que tensoativos têm um potencial substancial para irritação e toxicidade local, especialmente quando administrados por injeção intramuscular ou subcutânea ou por instilação no olho. De acordo com uma das modalidades preferidas, as composições da invenção são substancialmente isentas de tensoativo. Em uma modalidade adicional, a quantidade total de tensoativo ou tensoativos, se mais de um tensoativo for incorporado, não é maior que aproximadamente 10% e peso, em particular não maior que aproximadamente 5% em peso, ou preferivelmente não maior que aproximadamente 2% em peso, respectivamente. Em modalidades preferidas adicionais, a quantidade não é maior que aproximadamente 1% em peso ou não maior que aproximadamente 0,5% em peso,

26/37 respectivamente. Nesse contexto, os SFAs como descrito aqui, embora possuam algumas propriedades anfifílicas devido a sua estrutura química que inclui grupos de alquila fluorada e não fluorada (ou alquileno) caracterizados por graus diferentes de lipofilicidade, não são entendidos como estando compreendidos no escopo de tensoativos.

[00064] Os tensoativos que são ausentes ou somente presentes em quantidades pequenas incluem tensoativos não iônicos, catiônicos, aniônicos e zwiteriônicos como comumente usados como excipientes em vários tipos de composições farmacêuticas, por exemplo, como agentes umectantes, emulsionantes, agentes de dispersão, solubilizadores e similares. Os exemplos de tensoativos que são considerados potencialmente úteis incluem tyloxapol, poloxâmeros como Pluronic F68LF ou Lutrol F68, Pluronic L-G2LF e Pluronic L62D, polisorbatos como polisorbato 20 e polisorbato 80, derivados de óleo de rícino de polioxietileno, ésteres de sorbitano, estearatos de polioxil, lecitinas, fosfolipídios purificados ou sintéticos e misturas de dois ou mais dos mesmos.

[00065] As composições da invenção podem compreender opcionalmente um líquido orgânico não fluorado, por exemplo para modificar as propriedades do veículo líquido, como a viscosidade, tal outro líquido pode ser um óleo selecionado de óleos de glicerídeo, ceras líquidas, e parafina líquida, ou um solvente orgânico apresentando um alto grau de biocompatiblidade, ou uma mistura de mais de um excipiente líquido.

[00066] Exemplos de excipientes oleosos potencialmente úteis que podem ser usados em combinação com um ou mais SFA's incluem óleos de triglicerídeo (isto é, óleo de soja, azeite, óleo de gergelim, óleo de semente de algodão, óleo de rícino, óleo de amêndoa doze), óleo

27/37 mineral (isto é, petrolato e parafina liquida), triglicerideos de cadeia média (MCT), ácidos graxos oleosos, miristato de isopropila, álcoois graxos oleosos, ésteres de sorbitol e ácidos graxos, ésteres de sacarose oleoso, ou qualquer outra substância oleosa que seja fisiologicamente tolerada pelo olho.

[00067] Exemplos de solventes orgânicos potencialmente úteis incluem glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e etanol. A concentração do co-solvente deve ser preferivelmente baixa em relação àquela de SFA ou mistura de SFA. Se um solvente orgânico como etanol for usado, é recomendável manter o mesmo abaixo de um nivel de aproximadamente 5% em peso. Mais preferivelmente, o teor de etanol é de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 2% em peso e mais preferivelmente não maior que aproximadamente 1% em peso.

[00068] A composição pode evidentemente compreender excipientes farmacêuticos adicionais como necessários ou úteis. Excipientes potencialmente úteis incluem ácidos, bases, antioxidantes, estabilizadores, sinergistas, agentes de coloração, agentes espessantes, e se exigido em um caso especifico - um preservativo. Em geral, entretanto, a invenção provê um meio de formular composições não aquosas que são microbiologicamente estáveis. Isso se deve ao fato de que SFAs não são normalmente propensos à contaminação microbiana. Consequentemente, é possível formular composições isentas de preservativo a serem cheias em recipientes de multiuso. Composições isentas de preservativo são mais bem toleradas por muitos pacientes e permitem custos inferiores de artigos finais.

[00069] As suspensões líquidas da invenção podem ser preparadas por métodos convencionais. Em

28/37 principio, as partículas sólidas compreendendo o ingrediente ativo podem ser dispersas no veículo líquido compreendendo o SFA. Alternativamente, as partículas podem ser precipitadas no local por adicionar uma solução tipicamente orgânica - do ingrediente ativo (e opcionalmente um ou mais excipientes sólidos) em condições controladas ao veículo baseado em SFA.

[00070] As partículas sólidas podem ser preparadas por liofilização ou secagem por pulverização de uma solução das partículas ou proteínas de ligação de antígeno. A solução pode ser aquosa ou não aquosa e pode compreender ainda excipientes farmacêuticas como pode ser útil ou exigido.

[00071] O tamanho de partícula da fase dispersa pode ser também ajustado antes ou após as partículas serem combinadas com o veículo líquido. Em uma das modalidades preferidas, partículas do ingrediente ativo são fornecidas que já têm o tamanho de partícula apropriadamente selecionado. Pós tendo tal tamanho de partícula selecionado podem ser obtidos diretamente a partir da síntese do composto respectivo por engenharia de cristal, ou após síntese por métodos de moagem ou trituração convencionais utilizando equipamento padrão como um moinho de bolas, moinho de martelo, moinho de rolos, moinho coloidal, moinho de jato, ou similares. Se o tamanho de partícula deve ser reduzido após preparação de uma suspensão, ultrassonicação bem como vários tipos de homogeneizadores podem ser usados, como moinhos coloides ou homogeneizadores de pressão elevada.

[00072] A presente invenção também provê um método de tratar, evitar ou diagnosticar uma doença ou condição em um paciente necessitando do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao paciente uma

29/37 composição, de preferência na forma de uma suspensão ou dispersão, compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno e um veículo líquido, em que o veículo líquido compreende um alcano semifluorado. As propriedades físicas superiores das suspensões de acordo com a invenção tornam essas composições particularmente úteis para administração tópica ao olho de um paciente, ao ouvido, nariz ou pulmão, ou por via parenteral por injeção. Por exemplo, as composições da invenção podem ser administradas ao olho de um paciente ou aplicação tópica ou injeção. Modos de injeção preferidos incluem injeção dérmica, subcutânea, intramuscular e locorregional. São mais preferidas as vias de administração subcutânea e intramuscular.

EXEMPLOS

Exemplo 1 [00073] A estabilidade de um anticorpo monoclonal anti-ECSR (regulador de quimiotaxia específico de célula endotelial) (clone id 13G11 1A31 A7, um anticorpo IgG/k de murino expresso a partir de células de hibridoma que se ligam ao marcador endotelial ECSCR) em F6H8 a 25°C e a 40°C foi estudada durante um período de 6 meses.

[00074] Amostras de 0,25 mg liofilizadas do anticorpo monoclonal anti-ECSR (originalmente armazenadas a -80°C em tampão PBS) foram reconstituídas até uma concentração de 1 mg/mL em F6H8. As amostras reconstituídas foram armazenadas em frascos de vidro frisado a 25°C/60% RH e a 40°C/75% RH. As atividades de ligação dessas amostras foram determinadas após 3 meses e 6 meses de armazenagem.

[00075] Para servir como um primeiro controle, outras amostras do anticorpo liofilizado foram armazenadas na forma liofilizada a -80°C. Essas foram reconstituídas em PBS somente antes da análise. Um segundo controle consistiu

30/37 em amostras do anticorpo em PBS que nunca foram liofilizadas, porém mantidas sob refrigeração a 4°C.

[00076] As atividades de ligação das amostras de anticorpo para o antígeno ECSR foram determinadas por ELISA utilizando o seguinte protocolo:

[00077] Uma placa Elisa de fundo plano Nunc MaxiSorp™ foi preparada por revestir com antígeno ECSR e um antígeno negativo não relacionado. Os antígenos foram diluídos em um tampão de revestimento a uma concentração de 1 gg/mL e incubados com as placas durante a noite a 4°C. as placas foram então bloqueadas com 200 gL de solução de bloqueio a 3% e incubadas em RT em um agitador por 1-2 horas, seguido por três lavagens com solução de PBS-Tween 20 e secas. As amostras de anticorpo foram diluídas a 1 gg/mL em PBS. 100 ng ou 10 ng de cada amostra diluída foram adicionados a uma cavidade revestida com o antígeno ECSR e uma cavidade revestida com o antígeno de controle negativo. A placa foi incubada em RT por 1 h em um agitador, a seguir lavada com PBS-Tween 20 e seca. As alíquotas de anticorpo foram sondadas com conjugado de anticorpo secundário IgGHRP de cabra-anti-camundongo (Biorad, Catálogo no. 1706516) em uma diluição de 1:5000 em PBS. As placas foram incubadas por 1 h em RT em um agitador, seguido por três lavagens com solução de PBS-Tween 20 e secas. A placa foi incubada a 37°C por 10 min. com 100 gL de TMB (3, 3'_r 5, 5'-tetrametil benzidina), seguido pela adição de 50 gL/cavidade de 1 M HC1. A absorvência foi medida a 450 nm com um espectrofotômetro.

[00078] A comparação com as atividades de ligação determinadas no ponto de tempo inicial de reconstituição e as amostras de controle mostra que a atividade de ligação (determinada a partir da média de três

31/37 amostras) do anticorpo em F6H8 armazenado a 25°C ou mesmo na temperatura mais elevada de 40°C é mantida após armazenagem durante um período de 6 meses (figura 1) . A atividade de ligação é comparável com aquela observada para amostras de anticorpo monoclonal anti-ECSR liofilizadas a 80 °C (controle 1, figura 1) e para uma amostra nunca liofilizada armazenada a 4°C em PBS (controle 2, figura 1).

Exemplo 2 [00079] A estabilidade de bevacizumab, Fsnl006 e Fsn0503 foi estudada a 25°C, 50°C e 70°C durante um período de 4 semanas.

[00080] Protocolo de liofilização: soluções de estoque de cada dos anticorpos listados acima foram obtidas: Fsnl006 e Fsn0503 como soluções em PBS, bevacizumab (nome comercial Avastin®) em seu tampão de armazenagem comercial. Um equivalente de 80 mg de bevacizumab foi transferido para >7000 MWCO de tubagem de diálise e dialisado por 72 horas contra 3 x 2L volumes de PBS. As soluções de anticorpo foram diluídas a 0,5 mg/ml em PBS e 500 μΐ de cada solução foram formadas em alíquotas em frascos do tipo farmacêutico de vidro âmbar de 5 ml individuais para liofilização. A liofilização foi feita durante um ciclo de 48 horas.

[00081] Ressuspensão dos anticorpos liofilizados: os anticorpos liofilizados foram suspensos em F4H5, F6H8, 50% vol. F4H5 em F6H8, PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KC1, 10 mM Na₂HPO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, pH = 7,4) em uma concentração de 0,5 mg/mL com vórtice cuidadoso. A resuspensão dos anticorpos liofilizados em PBS forma soluções, enquanto as suspensões foram formadas com os alcanos semiflucrados. As suspensões resultantes e soluções foram armazenadas em frascos de vidro âmbar a 25°C e 50°C por 4 semanas (28 dias) . Após o dia 24, as amostras a 50°C

32/37 foram submetidas a condições de 70°C.

[00082] As atividades de ligação das amostras de anticorpo foram determinadas por teste de ELISA em t = 0 (imediatamente após resuspensão) , t = 2 semanas e t = 4 semanas. Como controle, amostras de anticorpos liofilizados que nunca foram resuspensas (armazenadas a -80°C) e soluções dos anticorpos em PBS que nunca foram liofilizadas (armazenadas a 4°C) foram usadas.

[00083] Protocolo de ELISA: para o teste de ELISA de cada anticorpo, uma placa de 96 cavidades Nunc Maxisorp foi revestida com o antígeno alvo por adicionar 100 ng/cavidade do antígeno apropriado em 100 μΐ 0.2 M tampão de carbonato, pH 9,5 e incubada por 1 hora a 37°C. após lavagem com PBS contendo 0,1% tween 20 (PBS-T) , a placa foi bloqueada por adicionar 200 μΐ de leite em pó a 4% em PBS e incubando em temperatura ambiente por 2 horas em um agitador. Após lavagem adicional, as amostras de anticorpo foram aplicadas. 1 ml de xO.5 PBS foi adicionado a cada frasco não aquoso. O anticorpo foi extraído na solução por balanço suave por 5 minutos. 1 μΐ da camada aquosa foi então transferido para um frasco contendo 999 μΐ PBS (para fornecer um valor nominal de 50 ng/cavidade). 100 μΐ de cada frasco de amostra foram então revestidos em 6 réplicas de 100 μΐ. as placas foram incubadas durante a noite a 4°C. após lavagem, o anticorpo secundário foi aplicado (conjugado de HRP cabra-anti-humano) em uma diluição de 1:60.000 em PBS; 100 μΐ foram adicionados a cada cavidade e a placa foi incubada por 1 hora em temperatura ambiente com agitação. As placas foram então lavadas com 3 volumes de PBS-T seguido por 2 volumes de PBS. 100 μΐ de solução TMB foram então aplicados e a placa incubada por 10 minutos a 37°C. A reação foi parada pela

33/37 adição de 50 μΐ 1M HC1. A absorvência em λ = 450 nm foi lida para cada cavidade.

Tabela 1 Atividade de Bevacizumab (OD médio ± 2SD a 450 nm)

25°C
semana	F4H5	F6H8	50% vol. F4H5 em F6H8	PBS
0	3.15±0.19	3.26±0.11	3.12±0.12	3.04±0.03
2	3.23±0.05	2.34±0.09	3.05±0.10	2.12±0.07
4	2.16±0.36	2.23±0.46	2.03±0.56	0.30±0.54

50°C (70°C últimos	5 dias)
semana	F4H5	F6H8	50% F4H5 F6H8	vol. em	PBS
0	3.16±0.01	3.26±0.11	3.14±0.05	3.00±0.05
2	3.27±0.09	3.19±0.10	3.05±0.19	3.16±0.08
4	1.63±0.62	1.69±0.34	1.64±0.54	0.05±0.003

Tabela 2 Atividade de Fsnl006 (OD médio ± 2SD a

450 nm)

25°C
semana	F4H5	F6H8	50% vol. F4H5 em F6H8	PBS
0	2.57±0.20	2.47±0.94	2.12±0.21	2.63±0.21
2	3.27±0.13	3.32±0.15	3.26±0.10	2.99±0.10
4	2.54±0.30	2.43±0.45	2.45±0.38	0.62±1.26

34/37

50°C	(70°C últimos 5 dias)
semana	F4H5	F6H8	50% vol. F4H5 em F6H8	PBS
0	2.56±0.27	2.47±0.94	2.26±0.20	2.56±0.24
2	3.32±0.04	3.28±0.04	2.81±0.04	2.79±0.13
4	2.01±0.40	1.97±0.24	1.80±0.91	0.05±0.01

Tabela 3 Atividade de FsmO5O3 (OD médio ± 2SD a

450 nm)

25°C
semana	F4H5	F6H8	50% vol. F4H5 em F6H8	PBS
0	3.07±0.10	3.06±0.08	2.98±0.22	3.11±0.16
2	3.22±0.23	3.22±0.09	3.20±0.08	2.01±1.23
4	2.70±0.19	2.43±0.19	2.87±0.24	0.72±1.98

50°C	(70°C últimos 5 dias)
semana	F4H5	F6H8	50% vol. F4H5 em F6H8	PBS
0	3.09±0.08	3.06±0.08	3.07±0.08	3.11±0.07
2	3.26±0.10	3.22±0.12	3.18±0.14	3.10±0.21
4	2.64±0.22	2.19±0.18	2.73±0.19	0.65±1.91

[00084] A atividade de bevacizumab, Fsnl006 e Fsn0503 armazenados como suspensões em F4H5, F6H8 e 50% vol. F4H5 em F6H8 foi substancialmente consistente durante um período de 4 semanas tanto em 25°C como em 50°C, incluindo o aumento até uma temperatura de armazenagem de

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0°C para a amostra de 50°C durante os cinco últimos dias do período. Em contraste a atividade de ligação demonstrada pelas soluções desses anticorpos em tampão de PBS deteriorou significativamente até o término do período de quatro semanas independente de temperatura de armazenagem.

Exemplo 3 [00085] A atividade de ligação de bevacizumab, Fsnl006 e Fsn0503 armazenados em SFA e tampão de PBS em temperaturas entre 50°C e 80°C foi examinada.

[00086] Os anticorpos liofilizados bevacizumab, Fsnl006 e Fsn0503 (como preparado acima no exemplo 2) foram resuspensos em F4H5, F6H8 e PBS em uma concentração de 0,5 mg/ml com vórtice cuidadoso. A resuspensão desses anticorpos liofilizados em PBS fornece soluções, enquanto suspensões foram formadas com os SFAs.

[00087] As amostras de solução/suspensão foram mantidas em temperaturas de 50°C, 55°C, 60°C, 65°C, 70°C, 75°C e 80°C respetivamente por um período de 2 h e então resfriadas a 10 °C antes de extração de tampão de PBS e ensaio de atividade utilizando o método ELISA como descrito acima no exemplo 2. Cada experimento foi realizado em triplicata. As amostras aquecidas a 40°C foram usadas como controle.

[00088] Verificou-se que as suspensões de bevacizumab (figura 2), Fsnl006 (figura 3) e Fsn0503 (figura 4) em F4H5 e F6H8 demonstraram estabilidade significativa para desnaturação térmica em comparação com as amostras em tampão aquoso. A atividade de ligação permaneceu relativamente constante entre 50°C e 80°C para os anticorpos formulados nesses alcanos semiflucrados. Em contraste, a atividade desses anticorpos armazenados em tampão PBS aquoso deteriorou acentuadamente em temperaturas acima de 60°C.

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Exemplo 4 [00089] estabilidade de uma composição compreendendo uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno selecionada de infliximab (um anticorpo monoclonal quimérico com regiões variáveis de murino e constante humana, e uma massa molecular de 149 kDa), a proteína de fusão etanercept (uma proteína humana recombinante com uma massa molecular de 150 kDa compreendendo a porção de ligação de ligando de TNFR de 75 kDa (receptor de fator de necrose de tumor) fundida com a porção Fc de IgGl), e certolizumab (um fragmento de anticorpo com uma massa molecular de 91 kDa, compreendendo um Fab' recombinante conjugado com um polietileno glicol de 40 kDa aproximadamente) ou biossimilares do mesmo e um veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado da fórmula RFHR em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo de alquila linear com 4 a 8 carbonos (por exemplo, F4H5 e F6H8) é estudado e comparado com formulações em meios diferentes.

[00090]

O anticorpo é liofilizado e ressuspenso em um alcano semifluorado. Suspensões/soluções comparativas são também preparadas em outros meios. Os seguintes testes de estabilidade são realizados nessas formulações:

[00091] . estabilidade de armazenagem em condições de ICH (25 e 40°C).

[00092] . estabilidade de temperatura fora de condições de ICH, isto é, desnaturação térmica.

[00093] Esses são realizados em analogia aos métodos descritos nos exemplos 1-3. Métodos analíticos adequados para ensaiar a estabilidade desses polipeptídios de ligação de antígeno são realizados. Os ensaios para monitorar a atividade e potência do anticorpo, bem como

37/37 monitorar níveis de agregação por todo o curso dos experimentos de estabilidade listados acima incluem técnicas como ELISA em similaridade com o protocolo como descrito acima nos exemplos 1-3.

[00094] Os métodos analíticos são realizados com amostras obtidas diretamente a partir das suspensões de anticorpo ou dependendo da técnica analítica, em amostras que são extrações de tampão aquoso.

[00095] Espera-se que as composições compreendendo o polipeptídio de ligação de antígeno ou proteínas apresente estabilidade aperfeiçoada e uma propensão diminuída para a formação de agregado.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada por compreender uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno selecionado dentre um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo, um conjugado de fármacoanticorpo ou qualquer combinação destes, e um veículo líquido, em que o veículo líquido compreende um alcano semifluorado da fórmula

RFRH em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono; e em que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é incorporada na composição de modo a formar uma dispersão ou suspensão.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o fragmento de anticorpo é um fragmento de ligação de antígeno (Fab), um fragmento variável de cadeia única (scFv) , um anticorpo de domínio único, um minicorpo ou um diacorpo.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o anticorpo monoclonal é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno tem uma massa molecular de pelo menos 90 kDa.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o alcano semifluorado é selecionado dentre F4H5, F4H6, F4H8, F6H4, F6H6 e F6H8.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das

Petição 870190046001, de 16/05/2019, pág. 9/13

2/3 reivindicações 1 a 5, caracterizada por ser efetivamente isenta de água.
7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que a composição retém pelo menos 85% de sua atividade de ligação de antígeno inicial durante armazenagem de 6 meses em uma temperatura entre temperatura ambiente e 40°C.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno está em uma concentração de pelo menos 0,5 mg/mL.
9. Uso de uma composição, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser na fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou para o tratamento de uma doença autoimune ou condições inflamatórias.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para administração parenteral por injeção subcutânea, dérmica, intramuscular ou locorregional.
11. Método de estabilizar uma proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno, selecionado dentre um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, um fragmento de anticorpo, uma proteína de fusão compreendendo um fragmento de anticorpo, um conjugado de fármaco-anticorpo ou qualquer combinação destes, caracterizado por compreender a etapa de misturar a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno com um veículo líquido compreendendo um alcano semifluorado de fórmula

RFRH em que RF é um segmento de hidrocarboneto perfluorado linear com 4 a 12 átomos de carbono, e em que RH é um grupo alquila linear com 4 a 8 átomos de carbono,

Petição 870190046001, de 16/05/2019, pág. 10/13

3/3 de modo a formar uma suspensão ou uma dispersão.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno retém pelo menos 85% de atividade de ligação de antígeno inicial durante armazenagem de 6 meses em uma temperatura entre temperatura ambiente e 40°C.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12, caracterizado por compreender uma etapa inicial de preparação da proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno por liofilização ou secagem por pulverização.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo selecionado dentre alemtuzumab, bevacizumab, cetuximab, gemtuzumab, ipilimumab, ibritumomab, nimotuzumab, ofatumumab, panitumumab, rituximab, tositumomab e trastuzumab.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo selecionado dentre adalimumab, alemtuzumab, belimumab, briakinumab, canakinumab, eculizumab, epratuzumab, efalizumab, golimumab, infliximab, mepolizumab, natalizumab, ofatumumab, ocrelizumab, otelixizumab, omalizumab, reslizumab, rituximab, teplizumab, tocilizumab, ustekinumab e vedolizumab.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína ou polipeptídio de ligação de antígeno é um inibidor de angiogênese, um agente anti-proliferativo ou um inibidor de TNF.