CN115151242A - 包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中所述颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量为小于1.0重量％。

Description

包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液
背景技术
基于蛋白质和抗体作为活性成分的药物产品通常被配制成水性溶液或冻干物，其在使用和施用前需要重构。然而，蛋白质不稳定性在水性溶液中普遍存在，并且因此此类产品具有有限的保质期和/或需要开发复杂的冷链溶液。替代方法是提供冻干(即冷冻干燥)固体粉末形式的蛋白质药物，但冻干物在使用前需要在无菌条件下在水性介质中小心且准确地重构，因此通常不太方便患者和医疗保健提供者使用。如果水性介质的pH或温度欠佳，再水合所允许的时间太短或在溶解步骤期间小瓶被过于剧烈地摇动，则重构步骤本身可引发聚集。浪费的倾向也较高，因为在推荐的时间段内未能适当地溶解冻干的抗体产品通常需要丢弃样品。
即用型液体配制品由于易于制备来施用，所以是使用者通常优选的。作为水性配制品的替代物，已经描述了在非水性载体和媒介物中的蛋白质悬浮液。
例如，WO 2013/110621描述了蛋白质和多肽在半氟化烷烃中的配制。WO 2015/011199描述了悬浮在半氟化烷烃中的抗体，也是一种配制这些类型的化合物的手段。描述了在半氟化烷烃中配制蛋白质、多肽和抗体可对抗此类分子的降解或聚集。
然而，仍然需要提供蛋白质颗粒(即包含蛋白质和一种或多种赋形剂如稳定剂的颗粒)的非水性悬浮液配制品，其适合于储存并抵抗储存条件的变化，如储存温度升高的波动。此外，需要提供包含蛋白质/多肽和一种或多种赋形剂的蛋白质颗粒的悬浮液，所述悬浮液具有稳定的悬浮特征，如粒度和粒度稳定性，其允许悬浮液的注射以及随后的储存。
因此，本公开文本的目的是提供对于储存和注射来说可以是稳定的非水性蛋白质颗粒悬浮液配制品。另一个目的是提供一种用于制备所述非水性蛋白质颗粒悬浮液配制品的工艺或方法。基于以下对本发明、实施例和权利要求的描述，本发明的其他目的将变得清楚。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种制备包含蛋白质颗粒和非水性媒介物的悬浮液配制品的方法，所述方法包括以下步骤：a)提供包含蛋白质和稳定剂的水性溶液，b)从所述包含蛋白质和稳定剂的水性溶液中去除水以获得固体蛋白质颗粒，c)进一步干燥在步骤b)中获得的蛋白质颗粒以获得具有基于颗粒的总重量小于0.5wt％的残余水含量的蛋白质颗粒，和d)将步骤c)的蛋白质颗粒悬浮在非水性媒介物中；和任选地 e)均化悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化。
本发明还涉及包含通过本发明方法可获得的蛋白质颗粒的组合物。
在另外的方面，本发明涉及包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中所述颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量为小于0.5wt％。
在又另外的方面，本发明提供了如所述的悬浮液配制品用于治疗和/或诊断应用的用途。
附图说明
图1从左到右描绘了如下包含溶菌酶和蔗糖(相对比率50:50)的蛋白质颗粒在非水性媒介物中的悬浮液配制品的粒度分布：5a(F6H8；未干燥的颗粒)、5b(F6H8；真空干燥的颗粒)、6a(EO；未干燥的颗粒)、6b(EO；真空干燥的颗粒)，如表 1中所述。这些悬浮液配制品是通过在冰冷却的超声浴中均化来制备的。
图2从左到右描绘了如下包含模型单克隆抗体mAb和蔗糖(相对比率50:50；总固体含量(TSC)100mg/mL)的蛋白质颗粒在非水性媒介物中的悬浮液配制品的粒度分布：7a(F4H5；未干燥的颗粒)、7b(F4H5，真空干燥的颗粒)、8a(F6H8，未干燥的颗粒)、8b(F6H8，真空干燥的颗粒)、9a(油酸乙酯，未干燥的颗粒)、9b (油酸乙酯，真空干燥的颗粒)、10a(中链甘油三酯，未干燥的颗粒)、10b(中链甘油三酯，真空干燥的颗粒)。这些悬浮液配制品是通过在冰冷却的超声浴中来制备的。
图3从左到右描绘了包含模型单克隆抗体mAb和稳定剂蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布：11a(F6H8，未干燥的颗粒)、11b(F6H8，真空干燥的颗粒)、12a(MCT，未干燥的颗粒)、12b(MCT，真空干燥)。使用高剪切均化器均化悬浮液配制品。
图4从左到右描绘了包含贝伐单抗(beva)和稳定剂蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品(beva:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布：14a(F6H8，未干燥的颗粒)、 14b(F6H8，真空干燥的颗粒)、15a(EO，未干燥的颗粒)、15b(EO，真空干燥)。这些悬浮液配制品是在超声浴中均化来制备的。
图5从左到右描绘了悬浮液配制品的粒度分布：由未经真空干燥的蛋白质颗粒制备的在5℃下储存6个月后的悬浮液配制品8a(F6H8，mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)、由真空干燥的蛋白质颗粒制备的在5℃下储存6个月后的悬浮液配制品8b(F6H8， mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)、在25℃下储存6个月后的悬浮液配制品8a和在25℃下储存6个月后的悬浮液配制品8b。
图6A和图6B描绘了在40℃下储存0、1、3和6个月后包含模型mAb和蔗糖的蛋白质颗粒在作为液体媒介物的F4H5中的悬浮液配制品的粒度分布。图6A描绘了由未经真空干燥且含有约4.2wt％残余水含量的颗粒制备的悬浮液配制品7a(mAb:Suc 50:50； TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图6B描绘了包含约0.1wt％残余水含量的悬浮液配制品7b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。粒度分布在这些图中表示为 D5(●实心圆)、D10(○空心圆)、D50(▼实心三角形)、D90(△空心三角形) 和D95(■实心正方形)平均直径粒度值，其使用激光衍射测定。
图7A和图7B描绘了在40℃下储存0、1、3和6个月后包含模型mAb和蔗糖的蛋白质颗粒在作为液体媒介物的F6H8中的悬浮液配制品的粒度分布。图7A描绘了由未经真空干燥且含有约4.2wt％残余水含量的颗粒制备的悬浮液配制品8a(mAb:Suc 50:50； TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图7B描绘了仅包含约0.1wt％残余水含量的悬浮液配制品8b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/mL)的粒度分布。粒度分布在这些图中表示为D5(●实心圆)、D10(○空心圆)、D50(▼实心三角形)、D90(△空心三角形) 和D95(■实心正方形)平均直径粒度值，其使用激光衍射测定。
图8描绘了在5℃、25℃和40℃下储存6个月后，配制品8a(F6H8，mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml，未经真空干燥制备)的颗粒的XRD谱图(谱图A)，以及在5℃、 25℃和40℃下储存6个月后，配制品8b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/mL，经真空干燥制备)的蛋白质颗粒的XRD谱图(谱图B)。
图9A、图9B、图9C描绘了在40℃储存0、1、3、6和12个月后，用包含溶菌酶和海藻糖的喷雾干燥和真空干燥颗粒以及F6H8作为液体媒介物制备的配制品的粒度稳定性。图9A描绘了悬浮液配制品2(Lys:Tre 70:30；TSC＝300mg/ml)的粒度分布。图 9B描绘了悬浮液配制品3(含PS20的Lys:Tre 70:30配制品；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图9C描绘了悬浮液配制品4(Lys:Tre 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。粒度分布在这些图中表示为D5(●实心圆)、D10(○空心圆)、D50(▼实心三角形)、 D90(△空心三角形)和D95(■实心正方形)粒度值(平均直径)，其使用激光衍射测定。
图10描绘了在5℃、25℃和40℃下储存经12个月时间段的悬浮液配制品的再悬浮性，每组从左到右为配制品1a、1b、1c、1d(Lys:Tre 70:30；TSC＝100mg/ml，液体媒介物分别为F4H5、F6H8、EO、MCT)。再悬浮性使用立式摇床(在25rpm下立式旋转) 测定，并基于通过目视检查确定的再悬浮所需的时间(s)。
图11描绘了悬浮液配制品的再悬浮性，每组从左到右为配制品5a、5b、6a、6b(Lys:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml；5a(F6H8；未干燥的颗粒)、5b(F6H8；真空干燥的)、6a(EO；未干燥的颗粒)、6b(EO；真空干燥的)，如表1所述)。图 11A描绘了基于通过目视检查确定的基于立式旋转的再悬浮所需的时间的再悬浮性；图11B描绘了基于摇动方法(即再悬浮所需的摇动频率)的再悬浮性。图11B中以5Hz 描绘的水平线描述了普通人对该操作使用的频率。
图12描绘了在40℃下储存1个月、在40℃下储存3个月或在5℃、25℃和40℃下储存6 个月后，每组从左到右悬浮液配制品7a、7b、8a、8b、9b、10b(mAb:Suc 50:50； TSC＝100mg/ml)的再悬浮性。再悬浮性基于再悬浮所需的摇动频率。图B中以5Hz 描绘的水平线描述了普通人对该操作使用的频率。
图13A和图13B描绘了使用27G针头和1mL注射筒注射在40℃下储存经12个月时间段的包含含溶菌酶-海藻糖的颗粒的悬浮液配制品(溶菌酶海藻糖70:30；TSC＝100 mg/ml)，如表1中所述的配制品1a、1b、1c和1d以获得0.1ml/s体积流量所需的最大注射力(或滑动力)。图13A描绘了配制品1a(媒介物F4H5)、1b(媒介物F6H8) 的可注射性测试结果，并且图13B描绘了配制品1c(媒介物EO)；1d(媒介物MCT) 的可注射性测试结果。
图14描绘了在40℃下储存12个月后配制品2(上部曲线)和3(下部曲线)的滑动力曲线，如基于使用27G针头和1mL注射筒以0.1ml/s的体积流量注射所需的力。
图15描绘了使用27G针头和1mL注射筒注射在40℃下储存经6个月时间段的具有包含模型mAb-蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，如表1中所述的7a、7b(F4H5， mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)、以及8a、8b(F6H8，mAb:Suc 50:50；TSC＝100 mg/ml)以获得0.1ml/s体积流量所需的最大注射力(或滑动力)。图15A描绘了用未经过额外真空干燥步骤的蛋白质颗粒制备的配制品7a和8a的可注射性测试结果，所述颗粒含有约4.2wt％的残余水含量。图15B描绘了用喷雾干燥后经真空干燥的蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品7b和8b的可注射性结果，所述蛋白质颗粒具有相对于颗粒重量约0.1wt％的残余水含量。
图16描绘了在40℃下储存6个月后表1中所述的悬浮液配制品10b(上部曲线)和9b(下部曲线)的滑动力曲线，如基于使用27G针头和1mL注射筒以0.1ml/s的体积流量注射所需的力。
图17描绘了使用27G针头和1mL注射筒注射在40℃下储存3个月后(14a，14b)和6个月时间段的6个月后(14a，14b，15a，15b)的具有包含贝伐单抗-蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品14a、14b(F6H8，beva:Suc 50:50，TSC-100mg/mL)、和15a、15b (EO，beva:Suc 50:50，TSC-100mg/mL)以获得0.1ml/s体积流量所需的最大注射力 (或滑动力)。图中从左到右描绘了14a、14b//14a、14b、15a、15b的测量值。
具体实施方式
诸位发明人出人意料地发现，如果根据本发明的方法制备蛋白质颗粒，则包含蛋白质颗粒的组合物显示出高度有利的特性，所述蛋白质颗粒包含蛋白质和稳定剂，其中所述蛋白质颗粒悬浮在非水性媒介物中。
特别地，包含通过连续两个不同干燥步骤获得的蛋白质颗粒的组合物导致改进的化学和物理稳定性，这些与改进的粒度分布和易于再分散性组合允许改进的经由注射筒的注射施加。
因此，在第一方面，本发明涉及制备包含蛋白质颗粒和非水性媒介物的悬浮液配制品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含蛋白质和稳定剂的水性溶液，
b)从所述包含蛋白质和稳定剂的水性溶液中去除水以获得固体蛋白质颗粒，
c)进一步干燥在步骤b)中获得的蛋白质颗粒，以获得具有基于所述颗粒的总重量小于0.5wt％的残余水含量的蛋白质颗粒，以及
d)将步骤b)的蛋白质颗粒悬浮在非水性媒介物中；以及任选地
e)均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化；
其中蛋白质颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中非水性媒介物包含半氟化烷烃、中链甘油三酯(MCT)、乳酸乙酯、油酸乙酯或其混合物。
本发明的方法适合于生产具有改进的出人意料的特性的蛋白质颗粒悬浮液。所述方法本质上包括两个干燥步骤。第一步骤b)从包含蛋白质和稳定剂的水性溶液中去除水以获得蛋白质颗粒，以产生小于5wt％或小于3wt％的残余水含量，或产生3至5wt％的残余水含量。第二步骤将所得蛋白质颗粒的残余水含量降低至低于0.5wt％。所得蛋白质颗粒悬浮液的特征在于优异的化学和物理稳定性、易于再分散性和有利的粒度分布。通过所述方法获得的蛋白质颗粒悬浮液的粒度分布对于注射目的是理想的，避免针头或套管的堵塞。
因此，在优选的实施方案中，从包含蛋白质和稳定剂的水性溶液中去除水的步骤b) 是使用高效干燥方法进行的，优选使用干燥方法以导致蛋白质颗粒的残余水含量小于5wt％或小于3wt％，或导致蛋白质颗粒的残余水含量在3至5wt％的范围内或在1至3 wt％的范围内，合适的方法是本领域技术人员已知的。此类方法的例子包括冻干(即冷冻干燥)或喷雾干燥。
因此，在一个实施方案中，步骤b)包括喷雾干燥或冻干(或冷冻干燥)包含蛋白质和稳定剂的水性溶液以获得固体蛋白质颗粒。
第二干燥步骤可以用任何任选地其他合适的干燥方法进行，其允许将蛋白质颗粒的残余水含量(进一步)降低至基于颗粒总重量小于0.5wt％。优选的方法是真空干燥。
在一个实施方案中，悬浮液配制品可以通过步骤b)获得，所述步骤b)包括喷雾干燥包含蛋白质和稳定剂以及任选地另外的赋形剂(例如缓冲剂如组氨酸)的水性溶液以获得蛋白质颗粒。在另一个实施方案中，悬浮液配制品可以通过步骤b)获得，所述步骤b)包括冻干(即冷冻干燥)包含蛋白质和稳定剂以及任选地另外的赋形剂(例如缓冲剂如组氨酸)的水性溶液以获得蛋白质颗粒。
在步骤b)中，喷雾干燥可以使用例如但不限于旋风喷雾干燥器进行。所述方法中使用的喷雾干燥器的入口/出口温度应处于不影响蛋白质损失或降解的温度。在一个实施方案中，喷雾干燥加工温度不超过130℃。在另一个实施方案中，喷雾干燥方法不超过，即不超过130℃(入口温度)和不超过70℃(出口温度)。
在优选的实施方案中，上述步骤c)包括真空干燥步骤b)的颗粒。在所述步骤c)中，真空干燥可以在环境温度或略高于环境温度，例如15℃至40℃之间进行。在一些实施方案中，真空干燥可以在20℃至35℃、或22℃至35℃、或25℃-33℃、或27℃至32℃之间的温度下进行。真空干燥优选在减压(例如0.01至100mbar之间)下进行。在其他实施方案中，真空干燥可以在0.01至10mbar、0.01至1mbar或0.01mbar下进行。在一个实施方案中，从步骤b)获得的颗粒的步骤c)的真空干燥可以在15℃-40℃之间，在0.01-100mbar之间的压力下进行。步骤b)中的真空干燥的持续时间可以是至少6小时、或至少12小时或至少24小时。在一个实施方案中，步骤c)在15℃-40℃之间的温度下，在约0.01-100mbar的压力下进行至少24h的时间段。在替代实施方案中，真空干燥步骤c)可以进行不超过24小时。可以进行步骤c)以获得具有基于颗粒的总重量小于0.5wt％的残余水含量的蛋白质颗粒。
所述方法中使用的所有化合物可以是干燥的或无水的。这样得到的悬浮液配制品本质上不含水或基本上不含水。在本发明的一些实施方案中，悬浮液配制品的残余水含量基于配制品的总体积为小于0.5mg/ml(或小于0.05％(v/v))。
在步骤d)中，将蛋白质颗粒悬浮在包含半氟化烯烃、中链甘油三酯(MCT)、乳酸乙酯、油酸乙酯或其混合物的非水性液体媒介物中。
优选地，在步骤d)中，将蛋白质颗粒悬浮在包含半氟化烯烃的非水性液体媒介物中。半氟化烷烃基本上是无毒的，并且当局部或肠胃外施用时被各种类型的人和动物组织良好耐受。此外，它们是化学惰性的，并且通常与药物配制品中的活性和非活性成分相容。它们的典型密度范围为1.1至1.7g/cm3，并且其表面张力可以低至19mN/m。
半氟化烷烃是其中一些氢原子被氟原子替代的直链或支链烷烃。在一个实施方案中，本公开文本中描述和使用的半氟化烷烃(其可缩写为SFA)由一个直链非氟化烃段和一个直链全氟化烃段构成，优选全氟化烃段附接至非氟化烃段。
在一个实施方案中，半氟化烷烃具有化学式F(CF2)n(CH2)mH，其中n和m是分别定义全氟化烃段和非氟化烃段中的碳数的整数。在另外的实施方案中，一种或多种半氟化烷烃为式F(CF2)n(CH2)m的半氟化烷烃，其中n为选自4至6的整数且m为选自2至10的整数。在另外的实施方案中，一种或多种半氟化烷烃为式F(CF2)n(CH2)m的半氟化烷烃，其中n为选自4至6的整数且m为选自4至8的整数。
常用于半氟化烷烃的命名法将全氟化烃段指定为RF，将非氟化段指定为RH。可替代地，所述化合物可以分别称为FnHm和FnHm，其中F意指全氟化烃段，H意指非氟化段，并且n和m定义相应段的碳原子数量。例如，F3H3用于全氟丙基丙烷， F(CF2)3(CH2)3H。此外，这种命名法通常用于具有直链即非支链段的化合物。因此，除非另有指明，否则应假定F3H3意指1-全氟丙基丙烷，而不是2-全氟丙基丙烷、1-全氟异丙基丙烷或2-全氟异丙基丙烷。
RFRH类型的半氟化烷烃不溶于水但也有些两亲性，其亲脂性的增加与非氟化段的尺寸的增加相关。在本公开文本的上下文中使用的半氟化烷烃优选为液体半氟化烷烃。
在本公开文本的一个实施方案中，非水性媒介物可由一种或多种选自F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H2、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10的半氟化烷烃构成。或者非水性媒介物可由一种或多种选自F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8和F8H8 的半氟化烷烃构成，或者非水性媒介物可由一种或多种选自F4H5、F4H6、F4H8、F6H6 和F6H8的半氟化烷烃构成。这些半氟化烷烃的化学式可以分别表示为F(CF2)4(CH2)4H、 F(CF2)4(CH2)5H、F(CF2)4(CH2)6H、F(CF2)4(CH2)8H、F(CF2)6(CH2)2H、F(CF2)6(CH2)4H、 F(CF2)6(CH2)6H、F(CF2)6(CH2)8H和F(CF2)6(CH2)10H。在另一个实施方案中，非水性媒介物基本上由一种或多种选自F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6和F6H8的半氟化烷烃组成。
在一个实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品包含悬浮在包含F6H8或基本上由F6H8组成的非水性媒介物中的如本文定义的蛋白质颗粒。在另一个实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品包含悬浮在包含F4H5或基本上由F4H5组成的非水性媒介物中的如本文定义的蛋白质颗粒。在另一个实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品包含悬浮在选自F4H5和F6H8的非水性媒介物中的如本文定义的蛋白质颗粒。
任选地，配制品可以包含多于一种的半氟化烷烃。例如，为了实现特定的目标特性，如特定的密度或粘度，将SFA进行组合可能很有用。如果使用半氟化烷烃的混合物，优选的是，混合物包含F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8中的至少一种，或包含F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H2、F6H4、F6H6、F6H8、F6H10中的至少一种。在一个实施方案中，非水性媒介物可包含至少两个选自F4H4、F4H5、F4H6、 F4H8、F6H4、F6H6和F6H8的成员，或可包含至少两个选自F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、 F6H2、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10的成员。
如本文所用，包含半氟化烷烃的非水性媒介物包含至少一种或多种半氟化烷烃。所述媒介物可以任选地进一步包含其他媒介物或载体化合物、或赋形剂，如本文进一步描述的。在一个实施方案中，液体媒介物包含多于一种的半氟化烷烃。在另一个实施方案中，液体媒介物基本上由半氟化烷烃组成，或基本上由半氟化烷烃(如本文所定义的半氟化烷烃中的任一种)的混合物组成。在另一个实施方案中，悬浮液配制品包含由一种或多种半氟化烷烃和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂组成的非水性媒介物，所述赋形剂优选为在半氟化烷烃或半氟化烷烃混合物中可混溶或可溶的赋形剂。在一个实施方案中，非水性媒介物包含相对于液体媒介物的总重量至少70wt％、 75wt％、85wt％、90wt％、95wt％或至少99wt％的量的半氟化烷烃或半氟化烷烃的混合物。在另外的实施方案中，非水性媒介物基本上由100wt％的如上文定义的半氟化烷烃或半氟化烷烃的混合物组成。
在另一个实施方案中，所述方法可以包括步骤e)，均化悬浮液配制品。均化可以通过本领域已知的任何均化技术进行，例如使用高剪切均化器，或通过超声，任选地可以在冷却条件下(例如在冰冷却条件下，如约0℃)进行。
在优选的实施方案中，所述方法包括步骤e)并且均化使用超声处理进行。在另外的实施方案中，超声处理在低于环境温度下进行，优选地在冷却下进行，如在冰冷却下(在冰浴中)进行。
在另一个实施方案中，所述方法可包括选择具有所需或预定粒度的蛋白质颗粒的任选步骤，其中所述粒度由平均粒度直径定义。优选地，具有所需或预定粒度的蛋白质颗粒的所述选择可以在将蛋白质颗粒悬浮在非水性媒介物中之前进行。具有所需或预定粒度的蛋白质颗粒的选择可通过技术人员已知的任何方法进行；选择步骤可包括额外的研磨步骤以产生或增加具有所需或预定的较小粒度的颗粒的数量，和/或可包括将待悬浮的具有所需或预定粒度的颗粒分选出来(即通过挑选、筛分)的步骤。所需或预定的粒度由悬浮液配制品的应用或医学用途限定。例如，当用于注射目的如皮下、肌内或眼部注射时，预定粒度的特征可在于至少90％的颗粒的平均直径为1和15μm之间、或1和30μm之间、或1和50μm之间的分布，或者预定粒度的特征可在于平均直径小于50μm、小于30μm、小于15μm、1和15μm之间、1和30μm之间或1和50μm之间，各自通过激光衍射测定。在另外的实施方案中，水性溶液包含蛋白质和稳定剂，其中蛋白质与稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间。
所述方法适合于获得所有种类蛋白质的蛋白质颗粒悬浮液。所述蛋白质可以包括天然存在的和人工产生的蛋白质。在一些实施方案中，水性溶液中的蛋白质选自抗原结合多肽或蛋白、疫苗和酶。在一些实施方案中，所述蛋白质是抗体或其片段。
在一些实施方案中，所述蛋白质具有10至300kDa之间的分子量。
所述方法与悬浮液中的广泛稳定剂相容。稳定剂的例子包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、胺、表面活性剂、抗氧化剂、聚合物、盐或其组合。在一些实施方案中，稳定剂选自糖类、多元醇、氨基酸、胺、表面活性剂、抗氧化剂、聚合物、盐或其组合。在一些实施方案中，稳定剂是糖类，优选选自海藻糖和蔗糖的糖类。
所述方法的主要优点是悬浮液中蛋白质颗粒的尺寸分布相当均匀，并且颗粒小。在一个实施方案中，所述方法产生包含蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中如通过激光衍射所测定，至少90％的蛋白质颗粒具有1和30μm之间或1和50μm之间的平均直径。
悬浮液配制品中的蛋白质浓度可在步骤d)中适应合适的需要。在一些实施方案中，将蛋白质悬浮在足量的液体媒介物中，使得悬浮液配制品中的蛋白质浓度在2和350mg/ml之间、2和250mg/ml之间或2和125mg/ml之间。在一些实施方案中，悬浮液配制品的总固体含量在4和700mg/ml之间、7和500mg/ml之间或4和250mg/ml之间。
蛋白质颗粒可包括除蛋白质和稳定剂之外的其他化合物。在一些实施方案中，蛋白质颗粒或液体媒介物可另外包含表面活性剂。在优选的实施方案中，通过所述方法获得的悬浮液配制品不含表面活性剂。
在一个相关方面，本公开文本还可以涉及根据上述方法实施方案中的任一个可获得或获得的悬浮液配制品。
在另外的方面，本公开文本涉及包含悬浮在非水性媒介物中的两次干燥的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中所述颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量为小于0.5wt％。本文中，本公开文本涉及包含悬浮于非水性媒介物中的两次干燥的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中所述颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量已通过两个连续干燥步骤降低(从初始水性溶液)至基于所述颗粒的总重量的小于0.5wt％。
所述悬浮液配制品可以使用如上所述的方法获得。本文所述的悬浮液配制品的任何特定实施方案可以在上述方法中应用或实现。
在本发明的上下文中，“两次干燥的蛋白质颗粒”是指通过用两种不同的方法干燥蛋白质组合物而获得的固体蛋白质颗粒。优选的是，连续进行两种不同的干燥方法。优选地，通过以下方式获得两次干燥的颗粒：首先用高效干燥方法如喷雾干燥或冻干 (即冷冻干燥)干燥包含蛋白质和稳定剂的水性溶液以获得固体蛋白质颗粒，以及进行(连续)第二干燥步骤如真空干燥。在本文中，基于颗粒的总重量，第一干燥产生以3-5wt％范围内的残余水含量为特征的蛋白质颗粒，其中第二干燥步骤将残余水含量甚至进一步降低至小于0.5wt％。
本文所述的蛋白质或蛋白质颗粒的配制品以悬浮液的形式提供。悬浮液可以定义为一种分散体，即具有至少一个连续(或相干)相和至少一个分散在连续相中的不连续 (或内)相的体系。在悬浮液中，分散相基本上为固态。在本公开文本的一个实施方案中，蛋白质颗粒不溶于连续相，其中连续相由非水性液体媒介物构成，并且蛋白质颗粒在悬浮液配制品中作为分散相存在。在优选的实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品是液体悬浮液，至少在生理温度下，意指连续相是液体。通常，悬浮液在室温下也是液体。
如本文所使用和定义的非水性媒介物可以形成悬浮液配制品的连续相。非水性媒介物在室温下优选为液体。如本文所理解，关于媒介物或任何配制品组分的术语“非水性”是指基本上不含水的媒介物或配制品组分。在另一个实施方案中，非水性媒介物是液体，并且也不与水混溶。如本文所用的术语“媒介物”可以指基本上仅由形成悬浮液配制品的连续相的单一组分或化合物组成的媒介物，或者可以指包含两种或更多种组分或化合物的组合的媒介物，所述两种或更多种组分或化合物优选是可混溶的并且形成悬浮液配制品的单一连续相。
在一个实施方案中，悬浮液配制品包含悬浮于非水性媒介物中的根据本公开文本所定义的蛋白质颗粒，其中所述非水性媒介物包含半氟化烷烃、中链甘油三酯(MCT)、乳酸乙酯、油酸乙酯或其混合物。在另一个实施方案中，非水性媒介物选自半氟化烷烃、中链甘油三酯(MCT)、乳酸乙酯、油酸乙酯及其混合物。
在一个实施方案中，非水性媒介物包含一种或多种半氟化烷烃。
如本文所理解的，短语“基本上由……组成”(“essentially consists of”或“essentially consisting of”)和短语“由……组成”(“consists of”或“consistingof”)被认为是可互换的，并且意指除了所列出的那些之外，在组合物或配制品中不存在另外的组分。如果组合物或配制品中存在任何其他成分或组分，如材料固有的杂质，则这些可以仅以可忽略或痕量存在，并且对于所公开的组合物或配制品没有技术贡献、优点或功能。相比之下，如本文所用，术语“包含”(“comprises”或“comprising”)应以开放的意义来解释，其中可以存在除由所述术语开头的那些特征之外的其他特征，例如组合物组分。
此外，如本文所用，与诸如浓度或量等属性或值有关的术语“约”、“大体上”、“基本上”等包括确切属性或精确值，以及通常被认为落在与技术领域和所述属性或值的测量或测定方法相关的正常范围或接受的可变性内的任何属性或值。
在一个实施方案中，悬浮液配制品包含含有一种或多种半氟化烷烃的液体媒介物，其中半氟化烷烃以按配制品的总重量(wt％)计至少70wt％、85wt％、90wt％或至少95wt％的量存在。在另一个实施方案中，半氟化烷烃可以按配制品的重量计约85％至 99％的量存在。
如本文所理解的，术语“蛋白质颗粒”是指由蛋白质构成的固体颗粒，其基本上不溶于悬浮液配制品的非水性媒介物中，并且因此其特征为分散或悬浮在由媒介物形成的连续相中的颗粒。本文所定义的颗粒可由蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种另外的赋形剂构成，这些物质根据如本文进一步定义的制备颗粒的方法组合在一起以形成可分散或悬浮于液体非水性媒介物中的单位固相。
如本文所使用的，单数形式“一个/种”(“a”或“an”)或“所述”(“the”) 不排除多个/种，即，除了单数形式和含义之外，这些术语可以理解为还包括复数形式或多个/种，除非上下文另外明确地指示、要求或暗示。换言之，对本公开文本的单数特征或限制的提及可包括相应的复数特征或限制，反之亦然，除非明确地另外说明或通过作出引用的上下文清楚地相反地暗示。例如，如提及“一个/种”蛋白质颗粒的术语“一个/种”(“a”或“an”)或“所述”的使用将具有与“至少一个/种”或“一个/种或多个/种”蛋白质颗粒相同的含义，除非另外定义。
本文所用的术语“蛋白质”可与术语“多肽”互换。多肽也可称为蛋白质，反之亦然。通常，术语“多肽”仅指单个聚合物链，而表述“蛋白质”还可指通过非共价键彼此连接的两条或更多条多肽链。多肽和蛋白质通常代表通过肽键相互连接的氨基酸单元的聚合物。由于通常用于区分多肽和蛋白质的尺寸边界在某种程度上是任意的，因此在本公开文本的上下文中，对这些分子的两种表达不应理解为相互排斥。
在本公开文本的一个实施方案中，悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒包含具有3 至200kDA或10至200kDa之间的分子量的蛋白质。在另一个实施方案中，蛋白质具有 50至200kDa之间、或50至150kDa之间、或100至200kDa之间、或50至100kDa之间、或3至50kDa之间或3至25kDa之间的分子量。
在本公开文本的另外的实施方案中，悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒包含如下蛋白质，其为包含约25至200个氨基酸、优选包含约25至100个氨基酸、或更优选25 至50个氨基酸的多肽。
在一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含抗原结合多肽或蛋白。如在本公开本文的上下文中使用的，术语抗原结合多肽或蛋白是指处于单体或聚合物形式的全长和完整抗体(也称为免疫球蛋白)以及从全长抗体衍生的能够特异性结合抗原的任何片段、链、结构域或任何修饰。抗原结合多肽或蛋白可以属于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM免疫球蛋白同种型或类别中的任一种。在一个实施方案中，本文所用的蛋白质可以是免疫球蛋白G(IgG)抗体，即衍生自免疫球蛋白G或其五类中的任一类(例如IgG1、IgG2、 IgG3、IgG4)的抗体、抗体片段或包含衍生自免疫球蛋白G或其五类中的任一类(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的抗体片段的蛋白质。
在一个实施方案中，蛋白质颗粒可以包含酶，例如溶菌酶。溶菌酶是水解例如在肽聚糖中发现的糖苷键的糖苷水解酶。溶菌酶可以用作抗微生物剂，特别是针对革兰氏阳性细菌和其中肽聚糖在细菌细胞壁中具有显著特征的细菌。溶菌酶(c型)具有约 14.3kDa的分子量。在另一个实施方案中，酶可以是在有需要的受试者中缺乏或以低水平产生的酶。
在一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含蛋白质疫苗，如来自病原体如细菌或病毒的纯化或重组蛋白质性抗原。
在另一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含选自酶和抗原结合多肽或蛋白的蛋白质，如抗体或免疫球蛋白(例如免疫球蛋白G抗体，优选人或人源化IgG1)、或抗原结合抗体片段、或包含抗体片段的融合蛋白、或抗体-药物缀合物。在又另外的实施方案中，蛋白质选自溶菌酶和抗体或免疫球蛋白。
在特定实施方案中，蛋白质颗粒包含抗体。术语“抗体”可指全长抗体，以及衍生自全长抗体的能够特异性结合抗原的任何片段、链、结构域或任何修饰。
全长抗体是Y形糖蛋白，由具有Fc(可结晶片段)结构域和Fab(抗原结合片段) 结构域的一般结构构成。它们在结构上由两条重(H)链和两条轻(L)链多肽结构构成，所述重链和轻链多肽结构经由二硫键相互连接以形成Y形结构。每种类型的链都包含可变区(V)和恒定区(C)；所述重链包含一个可变链区(VH)和各种恒定区(例如CH1、CH2等)，并且所述轻链包含一个可变链区(VL)和一个恒定区(CL)。 V区可以进一步表征为进一步的子结构域/区，即包含更保守氨基酸残基的框架(FR) 区、以及高变(HV)区或互补决定区(CDR)，所述高变区或互补决定区由在氨基酸残基方面具有增加的变异性的区域构成。链的可变区决定了抗体的结合特异性，并形成了抗体的抗原结合Fab结构域。
本文所用的抗体片段可包括抗体的任何区、链、结构域，或其任何构建体或缀合物，可以与抗原相互作用并特异性结合，并且就结合能力而言可以是单价、二价或甚至多价。此类抗体片段可以通过本领域已知的方法产生，例如全长天然抗体的切开(例如通过蛋白水解)、蛋白质合成、基因工程/DNA重组方法、化学交联或其任何组合。抗体片段通常衍生自出现在全长抗体的可变V区中的各种结构域或区域的组合。在一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含抗体片段，例如其中抗体片段是抗原结合片段(Fab)、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体、微型抗体或双抗体。片段可以是单链可变片段(scFv)，如由通过接头连接的重链(VH)和轻链(VL)可变结构域构成的那些片段，或其复合多聚体/多价构建体，例如双抗体(二价二聚体)、三抗体(三价三聚体)或四抗体(四价四聚体)。多聚体抗体片段也可以是多特异性的，例如，双特异性双抗体可以由两个片段构成，每个片段对不同的抗原具有特异性。进一步优选的抗体片段包括单结构域抗体(daBs)，如包含能够特异性结合抗原的单个VH或VL结构域的那些。也在本公开文本范围内的抗体片段可包括scFv-CH二聚体构建体，如微型抗体。
在一个实施方案中，包含在根据本公开文本的颗粒中的蛋白质是单克隆抗体(mAb)。单克隆抗体是指从对抗原上的单个表位或结合位点具有特异性的同质抗体群体中获得的抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的抗体工程技术产生，如通过杂交瘤或重组DNA方法。在一个实施方案中，根据本公开文本的蛋白质颗粒包含重组单克隆抗体。在另外的实施方案中，本文所用的蛋白质可以选自嵌合、人源化或人单克隆抗体。例如，嵌合单克隆抗体是指杂合单克隆抗体，其包含从来自多于一种物种的抗体序列 (例如从鼠和人抗体序列)衍生的重链或轻链的结构域或区域。人源化单克隆抗体可指在结构上主要衍生自人抗体序列的、通常具有至少85％-95％人源序列贡献的抗体，而术语“人”是指仅衍生自人种系抗体序列的那些。在一个实施方案中，根据本公开文本的蛋白质是重组人源化或人单克隆抗体，优选免疫球蛋白G抗体或免疫球蛋白G1 抗体。
在另一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含融合蛋白。如本文定义的融合蛋白由以下构成：至少一种能够特异性结合抗原的抗体片段，其与至少一种其他生物活性蛋白或多肽或其片段融合。在一个实施方案中，如本文定义的蛋白质颗粒可以由Fc-融合蛋白构成，所述Fc-融合蛋白即由与至少另一种肽或肽片段共价连接的免疫球蛋白Fc结构域构成的蛋白质。
包含共价缀合或连接至药物分子(例如小分子药物或放射性标记的组分)的抗体或抗体片段的抗体-药物缀合物也在如本文所用的抗原结合多肽或蛋白的定义内。
在一个具体的实施方案中，所述蛋白选自贝伐单抗、阿柏西普和ziv-阿柏西普。阿柏西普(商品名，EYLEA)是携带VEGF受体(VEGF1和2)的胞外结构域的重组Fc- 融合多肽，用作诱饵受体以中和VEGF。阿柏西普可用于治疗患有新生血管(湿性) 年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)和糖尿病性视网膜病变(DR)的患者。贝伐单抗是一种重组人源化单克隆抗体，其通过抑制血管内皮生长因子A(VEGF-A)来阻断血管生成。贝伐单抗是一种全长IgG1κ同种型抗体，由两条相同的轻链和两条重链构成，总分子量为149 kDa。两条重链通过两个链间二硫键彼此共价偶联，这与人IgG1的结构一致。
如本文所定义，根据本公开文本的蛋白质颗粒包含蛋白质和稳定剂。本文提及的“稳定剂”可以是稳定蛋白质、蛋白质颗粒或悬浮液配制品本身的任何赋形剂或两种或更多种赋形剂的组合。稳定剂可在制造过程期间或在储存期间提供针对机械、物理、化学应力或其组合的保护作用。例如，稳定剂可用于防止蛋白质在喷雾干燥和暴露于极端温度如升高的温度期间的不稳定性。稳定剂的例子包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、胺、表面活性剂、抗氧化剂、聚合物、盐或其组合。
在一个实施方案中，稳定剂是糖类或糖。糖类或糖可以是单糖、二糖、三糖、或任选地寡糖或多糖。可用作稳定剂的糖类的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖、乳糖或环糊精。在一个优选的实施方案中，稳定剂选自海藻糖、蔗糖或其组合。在一个实施方案中，特征在于或用于制造蛋白质颗粒的糖类或糖是无定形的。
在另一个实施方案中，稳定剂是多元醇。多元醇的例子包括糖醇，如但不限于甘油、阿糖醇、赤藓糖醇、甘露醇、山梨醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇。在又另一个实施方案中，稳定剂是糖类、多元醇、聚山梨醇酯或其组合。
如本文所用，术语“赋形剂”是指可以以提供或调节所述配制品或组合物的特定特性或特征的量添加至药物配制品或组合物中的任何药学上可接受的药剂或药剂组合。赋形剂的例子包括表面活性剂、螯合剂、缓冲剂、pH调节剂(如无机盐或有机盐)、抗氧化剂或还原剂、填充剂、有机助溶剂、以及如上述的稳定剂。赋形剂可以在配制品中提供或具有多于一种功能。如本文所用的赋形剂优选地对于药物用途是可接受的，意指用作赋形剂的化合物或混合物是无毒的并且对于人类药物用途是可接受的。优选地，赋形剂适合于肠胃外、局部、皮肤病学或眼科用途。
表面活性剂的例子是非离子型表面活性剂和离子型表面活性剂。可用于本公开文本的上下文中的表面活性剂的例子包括但不限于聚山梨醇酯和泊洛沙姆。泊洛沙姆是聚氧乙烯和聚氧丙烯的三嵌段共聚物；例子包括泊洛沙姆P188。聚山梨醇酯是聚乙二醇化脱水山梨糖醇脂肪酸酯；可根据本公开文本使用的例子包括但不限于聚山梨醇酯20 (聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、聚山梨醇酯40(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯)、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯单硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80(聚氧乙烯单油酸酯)。在一个实施方案中，悬浮液配制品包含表面活性剂。在另外的实施方案中，悬浮液配制品不含表面活性剂。
可用于本公开文本的上下文中的螯合剂的例子是EDTA、柠檬酸盐。抗氧化剂的例子包括α-生育酚、丁羟甲苯、抗坏血酸、半胱氨酸、甲硫氨酸。无机盐的例子包括钙、镁、锌或钠盐，如碳酸盐(例如碳酸钙)、氢氧化物、磷酸盐、磷酸氢盐、乙酸盐或氯化物(例如NaCl)。氨基酸的例子包括精氨酸、组氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬酰胺等。聚合物的例子包括聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、多糖。
在一个实施方案中，配制品包括控制pH变化的缓冲剂，例如将pH控制在5.0至7.0范围内或约pH 6.0的缓冲液。缓冲剂的例子包括但不限于组氨酸、甘氨酸、乙酸盐、琥珀酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐、tris、谷氨酸盐和磷酸盐。
在一个实施方案中，蛋白质颗粒可包含蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种其他赋形剂。在所述实施方案中，稳定剂不同于所述一种或多种其他赋形剂。在一个实施方案中，蛋白质颗粒可进一步包含以下或由以下组成：蛋白质和稳定剂、缓冲剂。在一个所述实施方案中，缓冲剂可以是组氨酸。在另一个实施方案中，蛋白质颗粒可进一步包含以下或可由以下组成：蛋白质和稳定剂、缓冲剂(例如组氨酸)和表面活性剂 (例如聚山梨醇酯)。在其他实施方案中，蛋白质颗粒可基本上由蛋白质和稳定剂以及任选地一种或多种其他赋形剂组成。
基于重量，蛋白质颗粒中蛋白质与稳定剂的相对比率可以在1:1至7:3的范围内。在其他实施方案中，蛋白质与稳定剂的相对重量比可为约50:50、55:45、60:40、 65:35、70:30；或者可以在55:45至70:30、60:40至70:30或6 5:35至70:30的范围内。在一个具体的实施方案中，蛋白质颗粒包含抗体或酶，并且稳定剂是糖类(例如海藻糖或蔗糖)，其中蛋白质颗粒中这些的相对重量比在1:1至7:3之间。
根据本公开本文，悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于颗粒的总重量为小于0.5wt％。如本文所理解，术语“水含量”或“残余水含量”是指组合物(例如蛋白质颗粒)中存在的水的量，或如在组合物的加工或制造(可包括去除水的步骤)之后组合物中剩余的水的量。
在一个实施方案中，悬浮颗粒的残余水含量基于颗粒的总重量为小于0.5wt.％。在另外的实施方案中，悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于蛋白质颗粒的总重量可以为等于或小于2.0、1.0、0.8、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05wt％。在又另外的实施方案中，如本文定义的悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于颗粒的总重量可以在0.05 至0.5wt％、或0.05至0.2wt％、0.1-0.5wt％、0.1-0.2wt％的范围内。
悬浮液形式的配制品(包括蛋白质颗粒悬浮液或分散体)需要在物理上是稳定的，以便适用于治疗应用。在储存或静置一段时间后，分散的颗粒相可以与悬浮液的液体连续相分离，如通过颗粒的漂浮或沉降。悬浮液的物理稳定性可以例如通过沉降/漂浮的速率或颗粒再分散的容易度来确定。
为了给药准确性和再现性，尤其是对于可能影响注射容易性的可注射或肠胃外悬浮液，悬浮液配制品中的颗粒优选应保持一致的粒度分布并且是易于可再分散的。此外，悬浮液配制品应保持均匀分散，并且漂浮或沉降应仅缓慢发生。如本文所用，可与术语“可再悬浮的”等互换使用的术语“可再分散的”是指悬浮液在沉降或相分离后基本上重新形成或恢复到其初始或预期悬浮液特征的能力。
不太合适且不太稳定的悬浮液配制品往往难以可再分散，由此可能形成的蛋白质颗粒的凝聚物或饼不容易再分散，其中分散颗粒的相分离迅速发生，并且其中粒度分布例如由于颗粒聚集的发生而在一段时间内变化。致密且难以可再分散的蛋白质颗粒凝聚物的形成可使得精确给药具有挑战性，或在一些情况下，如果凝聚物的尺寸可导致通常用于例如皮下注射的细规格针头堵塞，则可使得精确给药不可能。
已经出乎意料地发现，当蛋白质颗粒具有至少小于0.5wt％或在如上定义的范围内的水含量时，可以实现包含分散在非水性液体媒介物如半氟化烷烃中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品的物理稳定性的进一步改进。如本文所述，已经发现，例如可通过包括喷雾干燥步骤、随后是真空干燥的后续步骤的方法获得的这些悬浮液配制品提供了这样的悬浮液，与从仅通过喷雾干燥制备的蛋白质颗粒(通常具有3至5wt％范围内的残余水含量)制备的悬浮液相比，还可在延长的时间段内具有改进的特征，如再分散性、物理稳定性、以及可注射性(injectability)和/或可注入性(syringeability)。
特别地，发现当最初制备时悬浮液的分散特性优于由相同的但包含较高残余水含量的蛋白质颗粒制备的悬浮液。还发现，如例如通过粒度生长和再分散性以及可注射性 /可注入性测定的所述悬浮液的物理稳定性(参见实施例)即使在高达40℃的升高的 (应力水平)温度下，也可以在延长的储存(例如长达4、6或12个月)内维持。
因此，这些悬浮液配制品可用作治疗性蛋白质和多肽的配制和递送媒介物和/或用作所述蛋白质和多肽的储存或运输介质。
可替代地，也可以测定悬浮液配制品本身的水含量。优选地，悬浮液配制品的总残余水含量基于配制品的总体积可以为小于1.0mg/ml、或小于0.5mg/ml。在一个实施方案中，悬浮液配制品的总残余水含量基于配制品的总体积可以为小于1.0、0.9、0.8、 0.7、0.6、0.5、0.4、0.35、0.3、0.25、0.2、0.15、0.1、0.05mg/ml。在其他实施方案中，悬浮液形式的总残余水含量基于配制品的总体积可以在0.05mg/ml至1.0mg/ml、或0.005mg/ml至0.5mg/ml的范围内。还优选地，悬浮液配制品的总残余水含量基于配制品的总体积可以为小于0.1％(v/v)、或小于0.05％(v/v)。在一个实施方案中，悬浮液配制品的总残余水含量基于配制品的总体积可以为小于0.1％、0.09％、0.08％、 0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％(v/v)。在其他实施方案中，悬浮液形式的总残余水含量基于配制品的总体积可以在0.001％(v/v)至0.1％(v/v)、或0.001％(v/v)至0.01％(v/v)的范围内。
在优选的实施方案中，基于配制品的总体积，悬浮液配制品的总固体含量高达30mg/ml，并且悬浮液配制品的总残余水含量小于0.15mg/ml(小于0.015％(v/v))或小于0.03mg/ml(小于0.003％(v/v))。在进一步优选的实施方案中，基于配制品的总体积，悬浮液配制品的总固体含量高达50mg/ml，并且悬浮液配制品的总残余水含量小于0.25mg/ml(小于0.025％(v/v))或小于0.05mg/ml(小于0.005％(v/v))。在再进一步优选的实施方案中，基于配制品的总体积，悬浮液配制品的总固体含量高达100mg/ml，并且悬浮液配制品的总残余水含量小于0.5mg/ml(小于0.05％(v/v)) 或小于0.1mg/ml(小于0.01％(v/v))，在再进一步优选的实施方案中，基于配制品的总体积，悬浮液配制品的总固体含量高达300mg/ml，并且悬浮液配制品的总残余水含量小于1.5mg/ml(小于0.15％(v/v))或小于0.3mg/ml(小于0.03％(v/v))，悬浮液配制品、蛋白质颗粒或配制品的其他组分的残余水含量可通过本领域已知的常规技术和分析方法测定，例如通过卡尔·费歇尔(Karl Fischer)分析、干燥失重或热重分析。
根据本公开文本的悬浮液配制品中的蛋白质浓度可以为2和350mg/ml之间、或25和 350mg/ml之间。在其他实施方案中，蛋白质的浓度可以高达280mg/ml、高达210mg/ml、高达140mg/mL、高达70mg/mL或高达350mg/ml。在另外的实施方案中，悬浮液配制品中蛋白质的浓度可以在2至280mg/ml、5至280mg/ml、25至280mg/mL；25至210 mg/mL、25至140mg/mL、70至210mg/mL、70至280mg/mL、140至280mg/mL或210 至280mg/mL、5至50mg/ml之间。
在另外的实施方案中，悬浮液配制品可以具有7和500mg/ml之间、或50和500mg/ml之间的总固体含量(TSC)。如本文所理解的，总固体含量可以指在去除配制品的液相后保留的固体量(质量/体积)。在其他实施方案中，悬浮液配制品的总固体含量可高达500mg/ml。在另外的实施方案中，悬浮液配制品的总固体含量可以为高达400 mg/mL、350mg/mL、300mg/ml、200mg/ml或100mg/l。在又另外的实施方案中，总固体含量可以在7至450mg/ml、25至450mg/ml、50至400mg/mL、50至300mg/mL、 100至300mg/mL、100至200mg/mL之间或在200至300mg/ml之间。
在一个实施方案中，根据本文所述的其他实施方案中的任一个或实施方案的组合的悬浮液配制品可包含相对于配制品的总固体含量(TSC)的50％至70％的蛋白质。在其他实施方案中，相对于悬浮液配制品的总固体含量，蛋白质的量可以是约50％、55％、 60％、65％或70％。在另一个实施方案中，相对于悬浮液配制品的总固体含量，蛋白质的量可以在50％至60％、55％至65％或60％至70％之间。
根据本公开文本的蛋白质颗粒优选具有小于30μm或小于50μm的平均直径，如通过激光衍射测定的。在另外的实施方案中，蛋白质颗粒的平均直径可以小于20μm、 15μm、10μm或小于5μm，如使用激光衍射测定的。任选地，可以使用激光衍射测定悬浮液配制品粒度所依赖的粒度分布基础可以是体积，或换言之，“平均直径”可以指体积平均直径。在任选的实施方案中，蛋白质颗粒可具有小于50μm、小于30μm、小于20μm、15μm、10μm或小于5μm的体积平均直径。
在另外的实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品可以由蛋白质颗粒构成，其中至少90％的蛋白质颗粒具有1至30μm之间、或1至50μm之间的平均直径，如通过激光衍射测定的。任选地，通过激光衍射测定悬浮液配制品粒度所依赖的粒度分布基础可以是体积，或换言之，“平均直径”可以指体积平均直径。任选地，悬浮液配制品的至少90％的蛋白质颗粒可具有小于50μm、小于30μm、小于20μm、小于15μm、小于10μm或小于5μm的体积平均直径。
在一个实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品可以由基本上由蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种赋形剂组成的蛋白质颗粒构成。在另外的实施方案中，悬浮液配制品可基本上由悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒组成，其中所述蛋白质颗粒由蛋白质和稳定剂以及任选地一种或多种赋形剂组成。
在一个实施方案中，悬浮液配制品可以进一步包含一种或多种赋形剂，如以上定义的，例如表面活性剂，如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20。在另一个实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品不包含或不含表面活性剂和/或防腐剂。防腐剂可以是作为抗微生物剂添加的任何赋形剂，以防止配制品中的微生物污染和生长。防腐剂的例子是苯扎氯铵、1,3-丁二醇；苯酚、苯甲醇。
在另外的实施方案中，本公开文本涉及包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，所述非水性媒介物包含半氟化烷烃或基本上由半氟化烷烃组成，其中：蛋白质颗粒中蛋白质与稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间，相对于蛋白质颗粒的总重量，蛋白质颗粒的残余水含量小于0.5wt％；优选小于0.3wt％；并且其中配制品的总固体含量不超过约300mg/ml。
在所述实施方案中，半氟化烷烃优选选自F4H5或F6H8。在一个实施方案中，所述配制品的总固体含量为300mg/ml。在替代实施方案中，配制品的总固体含量不超过约100mg/ml。在所述实施方案的另外的方面，配制品的残余水含量基于配制品的总重量可以为小于0.4wt％、或小于0.25wt％。根据这些实施方案中任一个的蛋白质颗粒优选为喷雾干燥的蛋白质颗粒；更优选为喷雾干燥和真空干燥的蛋白质颗粒。
在另一个实施方案中，悬浮液配制品可以由悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒构成，其中非水性媒介物基本上由选自F4H5或F6H8(或其混合物)的半氟化烷烃和任选地一种或多种赋形剂组成，优选地其中所述一种或多种赋形剂在F4H5或F6H8中溶解或可溶；其中蛋白质颗粒是包含蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种另外的赋形剂 (例如缓冲剂，如组氨酸)的经喷雾干燥(和真空干燥)的颗粒；其中所述蛋白质是单克隆抗体，或选自溶菌酶、免疫球蛋白、阿柏西普、ziv-阿柏西普或贝伐单抗；并且其中所述稳定剂是糖类(优选选自蔗糖和海藻糖)和/或多元醇；其中蛋白质颗粒中蛋白质与稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间；其中配制品的总固体含量不超过约 300mg/mL，并且其中相对于蛋白质颗粒的总重量，蛋白质颗粒的残余水含量小于0.5 wt％，优选小于0.3wt％。
根据本公开文本的悬浮液配制品可以通过注射或肠胃外施用来施用。在一个实施方案中，可将悬浮液抽入(抽吸)到注射筒中并通过细规格针头(例如27G或23G针头) 注射。在一个实施方案中，悬浮液配制品可以以小于35N(牛顿)的注射滑动力注射。在另外的实施方案中，配制品可以以小于15N的滑动力注射。在又另外的实施方案中，配制品的注射滑动力可以小于25N、20N、15N或小于10N；或在1至10N之间、或在5至15N之间。优选地，悬浮液配制品的注射滑动力在至少长达12个月的储存期内基本上不发生变化。在另外的实施方案中，在40℃下储存悬浮液配制品至少长达1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后，施用悬浮液配制品所需的注射滑动力可以小于35N、25N、20N、15N或小于10N；在1至35N之间、或在5至35N之间。
在一个具体的实施方案中，悬浮液配制品包含非水性媒介物，所述非水性媒介物包含以下或基本上由以下组成：半氟化烷烃，优选F4H5或F6H8，其中注射滑动力小于 15N、或小于10N、或在1至15N之间、或在5至15N之间。优选地，悬浮液配制品的注射滑动力在至少长达12个月的储存期内基本上不发生变化。在另外的实施方案中，在40℃下储存至少长达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月后，所述配制品可以具有小于15N或小于14、13、12、11或10N；或在1至15N之间的注射滑动力。
在另一个实施方案中，悬浮液配制品包含非水性媒介物，所述非水性媒介物包含以下或基本上由以下组成：油酸乙酯或乳酸乙酯，其中注射滑动力小于20N。优选地，所述悬浮液配制品的注射滑动力在至少长达12个月的储存期内基本上不发生变化。在另外的实施方案中，在40℃下储存至少长达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或 12个月后，所述配制品可以具有小于20N、或在5至20N之间的注射滑动力。
如本文所理解的，注射滑动力是指通过针头和注射筒注射配制品所需的最大力。在以上这些实施方案中的任一个中，注射滑动力可适用于实现0.1mL/s的流速和用1mL 注射筒和27G针头(内径约210μm)注射，其类型对应于或类似于本文示例的注射筒和针头。
根据本公开文本的悬浮液配制品优选具有5至40mPa s的粘度，如通过旋转粘度计在25℃下测量的。在一些实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品可具有10至30、 10至25、10至20、15至30、15至25或15至30mPa s的粘度，如通过旋转粘度计在25℃下测量的。在其他实施方案中，悬浮液配制品可具有约10、15、20、25、30mPa s；或小于40、35、30、25、20、15、10mPa s的粘度，如通过旋转粘度计在25℃下测量的。
根据本公开文本的悬浮液配制品的颗粒在沉降或漂浮后可以再分散，如通过旋转(例如使用立式旋转器)、用手摇动或通过以高达15Hz的频率摇动。在一个实施方案中，如本文所述的悬浮液配制品可以通过以高达5Hz、或10Hz或2至15Hz、2至10 Hz、2至5Hz、5至15Hz、5至10Hz之间的频率摇动来再分散。可以使用本领域中的设备进行摇动，如本文所述的用于悬浮液的再分散的设备。
在一个实施方案中，悬浮液配制品在室温下储存至少1个月后可以是可再分散的。在另外的实施方案中，悬浮液配制品在至少1、3、6或12个月内可以是可再分散的。如本文所用，可与术语“可再悬浮的”互换使用的术语“可再分散的”是指悬浮液在沉降或相分离之后(例如在储存期期间)基本上重新形成或恢复到其初始或预期悬浮液特征的能力。在另外的实施方案中，根据本公开文本的配制品在高达40℃下储存至少1、3、6或12个月后可以是可再分散的。
在另一个实施方案中，悬浮液配制品可以在小于1000s内再分散或再悬浮，并保留其原始粒度分布的至少70％、80％或90％。优选地，悬浮液配制品可以在小于1000s 内再分散或再悬浮，并保留其原始d90粒度分布的至少70％、80％或90％。时间段是指沉降的或相分离的悬浮液再分散所需的时间，如通过如本文所述的机械或物理手段 (例如用手摇动，或使用摇床)进行再分散。在其他实施方案中，根据本公开文本的悬浮液配制品的再悬浮可以在小于800或900秒内，或在2至800秒、或2至900秒、或2 至1000秒的时间段内进行。在又另外的实施方案中，悬浮液配制品包含非水性媒介物，其中所述非水性媒介物是半氟化烷烃，并且其中悬浮液配制品在小于50s内是可再分散的并且保留其原始粒度分布的至少70％、80％或至少90％。在另外的实施方案中，所述悬浮液配制品在小于20s、或小于30s内；或在2至50s内、2至30s内、或在2至20 s内可以是可再分散的。在又另外的实施方案中，所述配制品在30s内以5Hz的频率，或在30s内通过手动摇动可以是可再分散的，以保留其原始粒度分布的至少70％、或 80％、或90％。在又另外的实施方案中，悬浮液配制品包含非水性媒介物，其中所述非水性媒介物是中链甘油三酯(MCT)、油酸乙酯或乳酸乙酯，并且其中配制品可在少于1000秒(s)内再分散以保留其原始粒度分布的至少70％、80％、或90％。在一个更具体的实施方案中，非水性媒介物可以是MCT，其中悬浮液配制品在小于800s 或小于900s内；或在200至1000s、200至900s、200至800s、300至1000s、300至900 s、或300-800s内是可再分散的。
在一个实施方案中，蛋白质颗粒是喷雾干燥或冻干的蛋白质颗粒。本文所用的术语“喷雾干燥的”是指使用喷雾干燥方法制备的蛋白质颗粒，所述喷雾干燥方法包括喷雾干燥包含蛋白质和稳定剂以及任选地一种或多种其他赋形剂的水性溶液。术语“冻干的”是指通过冻干即冷冻干燥包含蛋白质和稳定剂以及任选地一种或多种其他赋形剂的水性溶液而制备的蛋白质颗粒。在优选的实施方案中，悬浮在如本文所述的非水性媒介物中的蛋白质颗粒是喷雾干燥的蛋白质颗粒。在另外的实施方案中，悬浮在如本文所述的非水性媒介物中的蛋白质颗粒是喷雾干燥的且经额外干燥的蛋白质颗粒，即从喷雾干燥获得的蛋白质颗粒随后经受额外的干燥步骤，如额外的真空干燥步骤。在又另一实施方案中，蛋白质颗粒可以是冻干的且经额外干燥的蛋白质颗粒，即从冻干获得的蛋白质颗粒随后经受额外的干燥步骤，如额外的真空干燥步骤。如本文所理解的，术语真空干燥是指经受真空干燥过程的蛋白质颗粒，其与冻干的区别在于真空干燥不在如在冻干领域中进行的低温条件下进行。
冷冻干燥(冻干)是用于从蛋白质颗粒中去除水的典型且通常优选的方法，因为喷雾干燥过程需要将蛋白质颗粒暴露于升高的温度，并且因此可能与蛋白质或蛋白质活性的损失相关。然而，观察到使用喷雾干燥并结合真空干燥步骤(在约环境温度或更高温度(例如在15℃-40℃的范围内)下并且不在如冻干中的水升华条件下进行)制备的根据本公开文本的蛋白质颗粒不仅提供了具有适合于通过注射施用的均匀粒度分布的蛋白质颗粒在非水性媒介物中的物理稳定的悬浮液，而且其中还保留了蛋白质活性(参见实施例2)。
在另外的方面，本公开文本涉及如本文所述的悬浮液配制品用于治疗和/或诊断应用的用途。悬浮液配制品可用于治疗有需要的受试者的例如影响皮肤、眼、耳、鼻或肺的疾病或病症。如本文所理解的，“受试者”可以指人类受试者，并且还可以与术语“患者”同义使用。所述受试者或患者可能患有或诊断患有疾病或病症，并且需要对所述疾病或病症或所述病症或疾病的症状进行治疗或改善、改进、控制、进展控制、预防发生等。任选地，受试者也可以是兽医学受试者。
在一个实施方案中，悬浮液配制品可用于治疗眼科疾病或病症，例如影响受试者的一只或两只眼睛。可以将如本文所述的悬浮液配制品局部施用(例如施用至组织或器官表面)或可以通过注射施用。可以将配制品肠胃外施用，例如通过注射，例如皮下或肌内注射。在一个实施方案中，可以将配制品通过注射施用到眼睛(眼部注射)或眼睛组织。适用于本公开文本的上下文中的眼部注射方法可包括玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内(intra-cameral)、视网膜下、眼球筋膜囊下(sub-tenon) 或眼周注射。
在本公开文本的上下文中还提供了本文任何一个实施方案中所述的悬浮液配制品的用途，用于制造或制备用于所述用途的药物或药品。类似地，如上文所述的实施方案中的任一个或组合中所述的治疗用途可以以治疗有需要的受试者的方法为特征，所述方法包括向所述受试者施用悬浮液配制品。
在又另外的方面，本公开文本可涉及试剂盒，所述试剂盒包含如本文定义的悬浮液配制品和适于容纳所述配制品的容器，以及任选地分配装置。
分配装置的例子可以是适于局部施用悬浮液配制品的分配装置，或适于通过注射施用到例如受试者的皮肤、眼、耳、鼻、肺的分配装置。分配装置的例子包括例如适合或适于注射配制品的针头，或适于将悬浮液配制品分配到眼睛的滴眼管。在一个实施方案中，适于容纳悬浮液配制品的容器也可适于蛋白质颗粒的再悬浮。容器可以适合或适于机械搅动，如通过旋转或摇动，例如通过手(手动)或摇动装置，如摇床或旋转器。根据本文任一实施方案的容器还可适于以高达15Hz的频率摇动。如本文所述的容器也可被适配或填充以提供足够顶部空间来允许再悬浮配制品。在一些实施方案中，容器还可适于通过注射或通过局部施用来施用配制品。在一个实施方案中，容器和任选地分配装置适于局部施用或肠胃外注射。
在一个实施方案中，试剂盒可以是包含注射筒的预填充注射筒(其可用作适于容纳配制品的容器)和任选地用于注射的针头。在又另外的实施方案中，注射筒和分配装置可适于眼部注射，优选用于玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内、视网膜下、眼球筋膜囊下或眼周注射。试剂盒还可以进一步包括使用容器或分配装置和施用悬浮液配制品的说明书，并且可以以有形或可读的形式提供，如说明书小册子或包装标签或插入物。
以下编号的项的列表是本发明中包括的实施方案：
1.一种包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其中所述颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量为小于1.0wt％。
2.根据项1所述的悬浮液配制品，其包含喷雾干燥或冻干的蛋白质颗粒。
3.根据项2所述的悬浮液配制品，其包含喷雾干燥和真空干燥的蛋白质颗粒。
4.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物在室温下是液体和/或与水不混溶。
5.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物包含半氟化烷烃、中链甘油三酯(MCT)、乳酸乙酯、油酸乙酯或其混合物。
6.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物包含一种或多种半氟化烷烃。
7.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物由一种或多种半氟化烷烃和任选地一种或多种药学上可接受的赋形剂组成。
8.根据项6或7中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述一种或多种半氟化烷烃是式 F(CF2)n(CH2)m的半氟化烷烃，其中n是选自4至6的整数并且m是选自4至8的整数。
9.根据项8所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物包含以下或由以下组成：一种或多种选自F4H4、F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8的半氟化烷烃。
10.根据项1至9中任一项所述的悬浮液配制品，其中非水性媒介物是选自F4H5、F6H8、油酸乙酯和中链甘油三酯的媒介物，或是选自F4H5和F6H8的媒介物。
11.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量为小于0.5wt％。
12.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量在0.05至1.0wt％的范围内。
13.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中悬浮的蛋白质颗粒的残余水含量基于所述颗粒的总重量在0.05至0.5wt％之间。
14.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中悬浮液配制品的总残留水含量基于所述配制品的总体积为小于1.0mg/ml、或小于0.5mg/ml。
15.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中蛋白质与稳定剂的相对重量比在 1:1至7:3的范围内。
16.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂选自糖类、多元醇、氨基酸、胺、表面活性剂、抗氧化剂、聚合物、盐或其组合。
17.根据项16所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂选自糖类、多元醇、氨基酸、胺、二醇和无机盐。
18.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂是糖类、多元醇、聚山梨醇酯或其组合。
19.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂是糖类，优选选自海藻糖和蔗糖的糖类。
20.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质具有10至300kDa之间的分子量。
21.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质选自抗原结合多肽或蛋白、疫苗和酶。
22.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质选自抗体(优选单克隆抗体或免疫球蛋白(例如IgG))、抗体片段、包含抗体片段的融合蛋白、抗体-药物缀合物和酶。
23.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质是嵌合、人源化或人单克隆抗体。
24.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质选自溶菌酶和抗体 (例如阿柏西普、ziv-阿柏西普或贝伐单抗)。
25.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质选自阿柏西普、ziv- 阿柏西普和贝伐单抗。
26.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质浓度在5和350mg/ml 之间。
27.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述配制品的总固体含量(TSC) 在10-500mg/ml之间。
28.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中蛋白质相对于所述配制品的总固体含量(TSC)的百分比在50％-70％之间。
29.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中通过激光衍射测定，所述蛋白质颗粒具有小于30μm的平均直径。
30.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中通过激光衍射测定，至少90％的蛋白质颗粒具有1和30μm之间的平均直径。
31.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中在40℃储存长达12个月后，注射滑动力小于35N，优选小于25N。
32.根据项31所述的悬浮液配制品，其中所述非水性媒介物包含以下或由以下组成：半氟化烷烃，优选F4H5或F6H8，并且其中在40℃储存长达12个月后，所述注射滑动力小于15N，优选小于15N。
33.根据项31或32中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述注射滑动力是针对0.1ml/s的流速以及使用1-mL注射筒和27G针头的注射。
34.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中通过旋转粘度测定法在25℃下测量，所述配制品的粘度在5和40mPa·s之间。
35.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质颗粒由蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种赋形剂组成。
36.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品由悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒组成，并且其中所述蛋白质颗粒由蛋白质和稳定剂以及任选地一种或多种赋形剂组成。
37.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述配制品进一步包含一种或多种赋形剂，例如表面活性剂(例如聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)。
38.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品不包含或不含表面活性剂和/或防腐剂。
39.根据前述项中任一项所述的悬浮液配制品，其中：
-所述非水性媒介物包含以下或由以下组成：优选选自F4H5或F6H8的半氟化烷烃，
-蛋白质颗粒中所述蛋白质与稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间，
-相对于所述蛋白质颗粒的总重量，所述蛋白质颗粒的残余水含量小于0.5wt％；优选小于0.3wt％；以及
其中所述配制品的总固体含量不超过约300mg/ml。
40.根据项39所述的悬浮液配制品，其中所述配制品的总固体含量为300mg/ml。
41.根据项39所述的悬浮液配制品，其中所述配制品的总固体含量不超过约100mg/ml。
42.根据项39至41中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述配制品的残留水含量基于所述配制品的总重量为小于0.4wt％，优选小于0.25wt％。
43.根据项39至42中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质颗粒为喷雾干燥的蛋白质颗粒，更优选喷雾干燥和真空干燥的蛋白质颗粒。
44.根据项39至43中任一项所述的悬浮液配制品，其中：
-所述非水性媒介物由选自F4H5或F6H8的半氟化烷烃和任选地一种或多种赋形剂组成；
-所述蛋白质颗粒是包含蛋白质、稳定剂和任选地一种或多种其他赋形剂的喷雾干燥颗粒；其中所述蛋白质是单克隆抗体，或选自溶菌酶、免疫球蛋白、阿柏西普、 ziv-阿柏西普或贝伐单抗；并且其中所述稳定剂是优选选自蔗糖和海藻糖的糖类；
-蛋白质颗粒中所述蛋白质与稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间，
-相对于所述蛋白质颗粒的总重量，所述蛋白质颗粒的残余水含量小于0.5wt％，优选小于0.3wt％，并且其中
-所述配制品的总固体含量不超过约300mg/ml。
45.根据项1-44中任一项所述的悬浮液配制品，其用作药品。
46.根据项45所述的用于所述用途的悬浮液配制品，其中所述用途包括治疗有需要的受试者的影响皮肤、眼、耳、鼻或肺的疾病或病症。
47.根据项46所述的用于所述用途的悬浮液配制品，其中所述用途包括治疗眼科疾病或病症。
48.根据项45至47中任一项所述的用于所述用途的悬浮液配制品，其中将所述配制品局部施用或通过注射施用。
49.根据项45至48中任一项所述的用于所述用途的悬浮液配制品，其中将所述配制品通过注射(例如皮下或肌内注射)施用；或通过注射施用到眼睛(眼部注射)，优选玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内、视网膜下、眼球筋膜囊下或眼周注射。
50.根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品在制造用于治疗受试者或患者的疾病或病症的药物中的用途。
51.根据项50所述的用途，其中所述药物用于治疗受试者中影响皮肤、眼、耳、鼻或肺的疾病或病症。
52.根据项51所述的用途，其中所述药物用于治疗眼科疾病或病症。
53.根据项50至52中任一项所述的用途，其中所述药物是局部施用的药物，或是被配制成用于注射或适于注射的药物。
54.根据项50至53中任一项所述的用途，其中将所述药物通过注射(例如皮下或肌内注射)施用；或通过注射施用到眼睛(眼部注射)，优选玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内、视网膜下、眼球筋膜囊下或眼周注射。
55.一种治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用根据项1至44 中任一项所述的悬浮液配制品。
56.根据项55所述的方法，其中所述疾病或病症是影响所述受试者的皮肤、眼、耳、鼻或肺的疾病或病症。
57.根据项55或56所述的方法，其中所述疾病或病症是眼科疾病或病症。
58.根据项55至57中任一项所述的方法，其中将所述悬浮液配制品局部施用或通过注射施用。
59.根据项55至58中任一项所述的方法，其中将所述悬浮液配制品通过注射(例如皮下或肌内注射)施用；或通过注射施用到眼睛(眼部注射)，优选玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内、视网膜下、眼球筋膜囊下或眼周注射。
60.根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品，其通过包括以下步骤的方法获得或可获得：
a)喷雾干燥或冻干包含所述蛋白质和所述稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒，
b)干燥在步骤a)中获得的蛋白质颗粒以获得基于所述颗粒的重量小于1.0wt％、或小于0.5wt％的残余水含量，以及
c)将步骤b)的蛋白质颗粒悬浮在所述非水性媒介物中
d)以及任选地，均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化。
61.根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品，其通过包括以下步骤的方法获得或可获得：
a)喷雾干燥或冻干包含所述蛋白质和所述稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒，
b)真空干燥在步骤a)中获得的蛋白质颗粒，以及
c)将步骤b)的蛋白质颗粒悬浮在所述非水性媒介物中；
d)以及任选地，均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化。
62.根据项60或61所述的方法可获得的悬浮液配制品，所述方法包括在步骤a)中，喷雾干燥包含所述蛋白质和稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒。
63.根据项60至62中任一项所述可获得的悬浮液配制品，其中所述蛋白质与所述稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间。
64.根据项60至63中任一项所述的方法可获得的悬浮液配制品，其中步骤a)中的喷雾干燥是使用旋风喷雾干燥器进行的。
65.根据项60至64中任一项所述可获得的悬浮液配制品，其中步骤b)干燥是真空干燥，优选地其中所述真空干燥在15℃-40℃之间的温度下，在0.01-100mbar之间的压力下进行。
66.根据项60至65中任一项所述可获得的悬浮液配制品，其中步骤b)进行至少12小时、或至少24小时。
67.根据项60至66中任一项所述可获得的悬浮液配制品，其中进行步骤b)真空干燥以获得具有基于所述颗粒的重量小于1.0wt％或小于0.5wt％的残余水含量的颗粒。
68.一种用于制造根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)喷雾干燥或冻干包含所述蛋白质和所述稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒，
b)干燥在步骤a)中获得的蛋白质颗粒以获得包含基于所述颗粒的重量小于1.0wt％、或小于0.5wt％的残余水含量的颗粒，以及
c)将步骤b)的蛋白质颗粒悬浮在所述非水性媒介物中；以及任选地
d)均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化。
69.一种用于制造根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)喷雾干燥或冻干包含所述蛋白质和所述稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒，
b)真空干燥在步骤a)中获得的蛋白质颗粒，以及
c)将步骤b)的蛋白质颗粒悬浮在所述非水性媒介物中；以及任选地
d)均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化。
70.根据项68或69中任一项所述的方法，其包括在(步骤a)中，喷雾干燥包含所述蛋白质和稳定剂的水性溶液以获得蛋白质颗粒。
71.根据项68至70中任一项所述的方法，其中所述蛋白质与所述稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间。
72.根据项68至71中任一项所述的方法，其中步骤b)干燥是真空干燥，优选在 15℃-40℃之间的温度下在0.01-100mbar之间的压力下进行的真空干燥。
73.根据项68至72中任一项所述的方法，其中步骤b)进行至少12小时、或至少24小时。
74.根据项68至73中任一项所述的方法，其中进行步骤b)真空干燥以获得具有基于所述颗粒的重量小于1.0wt％或小于0.5wt％的残余水含量的颗粒。
75.一种试剂盒，其包含根据项1-44中任一项所述的悬浮液配制品和适于容纳所述配制品的容器，以及任选地分配装置。
76.根据项75所述的试剂盒，其中适于容纳所述配制品的容器是预填充注射筒，或其中所述试剂盒进一步包含注射筒和任选地分配装置，所述分配装置优选为适于注射所述配制品的针头。
77.根据项76所述的试剂盒，其中所述注射筒和分配装置适于眼部注射，优选用于玻璃体内、脉络膜上、近巩膜、结膜下、前房内、视网膜下、眼球筋膜囊下或眼周注射。
78.一种施用设备，其包含根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品。
79.根据项78所述的施用设备，其中所述施用设备适于局部施用或通过注射施用所述悬浮液配制品。
80.根据项78或79所述的施用设备，其中所述施用设备包括注射筒和任选地针头。
81.根据项78至80所述的施用设备，其中所述施用设备适于皮下施用根据项1至44中任一项所述的悬浮液配制品。
82.根据项68至74所述的方法，其进一步包括选择具有预定粒度的蛋白质颗粒以悬浮在所述非水性媒介物中的步骤。
83.根据项82所述的方法，其中所述预定粒度的特征在于至少90％的颗粒的平均直径为1和15μm之间、1和30μm之间、或1和50μm之间的分布，或者特征在于平均直径小于50μm、小于30μm、小于15μm、1和15μm之间、1和30μm之间或1和 50μm之间，各自通过激光衍射测定。
以下实施例用于说明本发明，然而不应理解为限制本发明的范围。
实施例
实施例1–悬浮液配制品的制备
材料-通过将纯溶菌酶(lys)(Ovobest，Neuenkirchen-Voerden，德国)溶解在 pH6.0的10mM组氨酸缓冲液中来制备溶菌酶本体溶液。使用在25mM组氨酸和1.6 mM甘氨酸缓冲液pH 6.0中56mg/ml的IgG1型模型单克隆抗体(mAb)。mAb在CHO 细胞中产生并具有1.49ml g-1cm-1的ε280nm。贝伐单抗(Beva)(市售产品Avastin) 的样品从当地药房获得。使用海藻糖(Tre)(Hayashibara Co.Ltd，冈山(Okayama)，日本)、蔗糖(Suc)、L-组氨酸、L-组氨酸-单盐酸盐一水合物(Sigma-Aldrich，圣路易斯(St.Louis)，美国)和聚山梨酯20(PS20)(Merck KGaA，达姆施塔特(Darmstadt)，德国)在用ELGA Purelab系统(ELGALabWater，策勒(Celle)，德国)制备的高度纯化水中制备配制品。全氟丁基戊烷(F4H5)和全氟己基辛烷(F6H8)由Novaliq GmbH (海德尔堡(Heidelberg)，德国)提供。此外，还测试了作为悬浮媒介物的中链甘油三酯(MCT)(Miglyol 812，Caesar&Loretz GmbH，希尔登(Hilden)，德国) 和油酸乙酯(EO)(Sigma-Aldrich，圣路易斯，美国)。
分析方法-
UV-Vis-用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，沃尔瑟姆(Waltham)，美国)在280nm下测量蛋白质浓度。
扫描电子显微术(SEM)-使用FEI Helios G3 UC(Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，美国)在位于铝柱上的自粘碳带上研究粉末。将悬浮研磨的粉末(在F6H8中) 直接移液到碳带上并在VTS-2真空干燥器(Memmert，施瓦巴赫(Schwabach)，德国)中在10mbar下干燥24小时。
激光衍射-使用Horiba(Horyiba，京都(Kyoto)，日本)的激光衍射粒度分析仪 LA-960，在作为分散介质的含有1％Span 80的异辛烷中分析粒度分布。为了研究初始分散品质，在分散介质中不进行额外的分散步骤。在额外的分散步骤后，使用具有 MS 72探头(30s20％强度)的超声均化器Bandelin Sonoplus(BANDELIN electronic GmbH&Co.KG，柏林，德国)分析储存后的粒度。进行额外的步骤，以区分凝聚的颗粒和已经烧结在一起的颗粒。
光学显微术-使用具有VH-Z100R透镜的Keyence数字显微镜VHX 500F(KeyenceCorporation，大阪(Osaka)，日本)以200x放大倍数进行光学显微术。为了分析，将悬浮液配制品分散在MCT中至5mg/ml的浓度。然后将所得悬浮液配制品转移到载玻片上并随后进行研究。
悬浮液配制品制备
喷雾干燥-制备总固体含量为7.5％(m/V)的用于喷雾干燥的进料溶液，其含有不同蛋白质与稳定剂比率的海藻糖或蔗糖和任选地表面活性剂(例如聚山梨醇酯20)。制备基于溶菌酶(lys)、模型单克隆抗体(mAb)和贝伐单抗(beva)的蛋白质颗粒。所述蛋白质与稳定剂的比率基于质量比来描述。所有溶液均是在pH 6.0的10mM组氨酸缓冲液中制备的。
使用配备有高效旋风器的Büchi B290(Büchi AG，弗拉维尔(Flawil)，瑞士)根据制造商的建议(例如喷嘴直径0.7mm，干燥空气流速35m3/h，雾化空气流速414L/h) 进行喷雾干燥，保持出口温度在70℃。
将从喷雾干燥获得的含蛋白质颗粒转移到10R 1型玻璃小瓶(MGlas AG，Muennerstadt，德国)中，并附接冻干塞(Helvoet Pharma，蒂尔堡(Tilburg)，荷兰)。使用Christ 2-6D(Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH，奥斯特罗德(Osterode)，德国)在32℃、0.1mBar下进行额外的干燥步骤，即真空干燥，持续24h。
在氮气环境下处理含蛋白质颗粒以防止吸湿性粉末吸水。
由喷雾干燥和真空干燥的含蛋白质配制品制备悬浮液配制品。在2R(Schott AG，美因茨(Mainz)，德国)(Beva)、6R(mAb)或20R(Lys)(MGlas AG，Muennerstadt，德国)1型玻璃小瓶中，通过向计算量的经喷雾干燥的含蛋白质颗粒中添加相应的媒介物，制备不同浓度的悬浮液配制品。然后使用高剪切均化器Ultraturrax T10 (IKA-Werke GmbH&Co.KG，施陶芬(Staufen)，德国)(sh；2min/20 000rpm) 或在冰冷却的VWR超声清洁器(VWR，拉德诺(Radnor)，美国)(us；20min，在5、10和15min后用手另外摇动)均化悬浮液。
悬浮液配制品的浓度基于悬浮液配制品的总固体含量(TSC)。
使用配备有顶部空间模块的Karl-Fischer-Titrator Aqua 40.00(AnalytikJena AG；耶拿(Jena)，德国)在100℃的室温度下分析含蛋白质颗粒或悬浮液配制品的残留水量。
根据这些一般方法描述的示例性悬浮液配制品1a-15b描述于表1中。在表1中，描述了每种配制品的蛋白质与稳定剂的比率，以及测定的颗粒的残余水含量和悬浮液配制品的水含量。
表1
Figure RE-GDA0003830102750000231
Figure RE-GDA0003830102750000241
1含有0.1％聚山梨醇酯20；2含有0.5％聚山梨醇酯20；3us＝超声均化，sh＝高剪切均化
悬浮液制备后的颗粒再分散
获得初始的均匀悬浮液配制品对于制备可注射悬浮液配制品是非常重要的。可以使用合适的分散技术如高剪切均化器、悬浮研磨或超声技术均化悬浮液配制品。使用用冰冷却的超声浴或者可替代地使用高剪切均化器制备本文的悬浮液配制品。
观察到对于在喷雾干燥后用额外的干燥步骤制备的悬浮液配制品，悬浮液在分散性方面的品质更高。
使用超声浴均化方法制备用额外干燥的含蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品，发现其易于可分散在F4H5、F6H8、EO和MCT中(配制品编号1a-d)。对于分散在作为液体媒介物的F6H8中的较高浓度的配制品(2；300mg/ml)，含有PS20(聚山梨醇酯20) 的配制品(3)，以及具有较高海藻糖含量的配制品(4)，类似地观察到这一点。
就在悬浮液配制品的制备后观察到，用经受额外的干燥步骤(例如通过真空干燥)的蛋白质颗粒制备的悬浮液在更均匀的粒度分布以及总体更小的粒度方面对初始分散品质具有影响。
如图1(配制品5a、5b、6a和6b)、图2(配制品7a、7b、8a、8b、9a、9b、10a和 10b)和图3(配制品11a、11b、12a、12b)和图4(14a、14b、15a、15b)所绘，由在没有额外的真空干燥步骤的情况下制备且具有残余水分含量≥3％的示例性蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品，与使用真空干燥并具有低残余水含量(例如小于0.5wt％) 的蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品相反，参见表1，发现前者具有较差的初始分散品质(例如不太均匀的粒度分布、总体较大的中值(d50)粒径值)，无论使用超声浴还是高剪切均化器来均化悬浮液都如此。激光衍射结果还通过光学显微术得到进一步证实。
实施例2-稳定性研究
将根据实施例1制备的悬浮液配制品装入N13-2玻璃小瓶(Beva9a-10b；0.4ml)(Macherey-Nagel，杜伦(Düren)，德国)、2R玻璃小瓶(Lys 1a-5d、11a-11d； mAb:Suc 6a-7d；1ml)或Terumo Plajex(mAb：Tre 8a-8d；1ml)(Terumo，东京 (Tokyo)，日本)可预填充注射筒中。使用附接有Terumo Agani 30G(Terumo，东京，日本)针头(内径≈160μm)的B.BraunInjekt(B.Braun AG，梅尔松根(Melsungen)，德国)注射筒手工进行填充，以确保初始可注射性。使用13或20mm特氟隆(Teflon) 涂覆的注射塞封闭小瓶，然后使用10R帽(Westpharma，埃克斯顿(Exton)，美国) 手动加盖。
粒度稳定性
例如对于有待通过注射施用于受试者的配制品，悬浮液配制品的粒度随时间的增加可导致针头堵塞的可能性增加，并且还可导致释放动力学改变。
在悬浮液配制品中研究粒度稳定性，所述悬浮液配制品包含溶菌酶和模型mAb并具有蔗糖或海藻糖作为稳定剂，并根据实施例1中所述的一般方法制备并在5℃-8℃、 25℃和40℃下储存。
悬浮在F4H5和F6H8中的模型mAb/蔗糖颗粒
观察到，包含悬浮在F6H8中的模型mAb和蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品在冷条件(5℃-8℃)下和在25℃的室温条件下储存和老化6个月导致所有测试配制品的粒度分布方面没有显著变化。图5从左到右描绘了悬浮液配制品的粒度分布：由未经真空干燥的蛋白质颗粒制备的在5℃下储存6个月后的悬浮液配制品8a(mAb:Suc 50:50； TSC＝100mg/ml)、由真空干燥的蛋白质颗粒制备的在5℃下储存6个月后的悬浮液配制品8b(mAb:Suc50:50；TSC＝100mg/ml)、在25℃下储存6个月后的悬浮液配制品8a和在25℃下储存6个月后的悬浮液配制品8b。
然而，出乎意料地，观察到在40℃的较高温度应力条件下，当储存长达6个月时，含有通过喷雾干燥和额外的真空干燥制备且具有小于1.0wt％残余水含量的模型mAb 蛋白质颗粒的悬浮液配制品的粒度未发生任何显著增加或变化。相比之下，观察到在颗粒制备期间未经受真空干燥步骤的含有mAb颗粒的悬浮液配制品在40℃下储存6个月时粒度急剧增加。
图6A和图6B描绘了在40℃下储存0、1、3和6个月后包含模型mAb和蔗糖的蛋白质颗粒在作为液体媒介物的F4H5中的悬浮液配制品的粒度分布。
图6A描绘了由未经真空干燥且含有约4.2wt％残余水含量的颗粒制备的悬浮液配制品7a(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图6B描绘了包含约0.1wt％残余水含量的悬浮液配制品7b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。
图7A和图7B描绘了在40℃下储存0、1、3和6个月后包含模型mAb和蔗糖的蛋白质颗粒在作为液体媒介物的F6H8中的悬浮液配制品的粒度分布。
图7A描绘了由未经真空干燥且含有约4.2wt％残余水含量的颗粒制备的悬浮液配制品8a(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图7B描绘了仅包含约0.1wt％残余水含量的悬浮液配制品8b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/mL)的粒度分布。粒度分布D5(●)、D10(○)、D50(▼)、D90(△)和D95(■)值。
对于包含使用如实施例1中所述的喷雾干燥和真空干燥方法制备的并且具有较低残余水含量的蛋白质颗粒的两种配制品(其中F4H5或F6H8用作液体媒介物)在40℃下储存经6个月时间段观察到一致的粒度分布(图6B、图7B)，而相比之下，当方法中没有实施额外的干燥步骤时，使用蛋白质颗粒制备的配制品和具有较高残余水含量的配制品的粒度分布在6个月时显著改变(图6A、图7A)。
配制品样品的SEM分析揭示针状结构的形成，表明结晶效应是测量的粒度增加的根本原因。显示结晶蔗糖的峰的配制品8a(F6H8，mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml) 的XRD分析进一步证实了这个假设(图8，谱图A)。在25℃下储存6个月后也观察到 8a颗粒的XRD谱图中的结晶度，但在5℃下储存6个月后未观察到。另一方面，发现由干燥的含蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品(配制品8b)即使在40℃下储存6个月后仍保持无定形状态(图8，谱图B)。
稳定剂如蔗糖的重结晶不仅对粒度稳定性方面有负面影响，而且对蛋白质稳定性方面也有负面影响，因为所述稳定剂的结晶度可能影响其稳定蛋白质的功能。如上所述制备的并且具有相对于蛋白质颗粒的重量小于1.0wt％(例如约0.1wt％或更少)的降低的水含量的蛋白质颗粒在液体非水性媒介物(如F4H5或F6H8)中的配制品以及储存因此在潜在的不利储存情况(如失去冷链或温度控制)下可能是有利的。
对于由储存在可预填充的COP注射筒中的经喷雾和真空干燥的含mAb颗粒制备的悬浮液配制品，没有发现粒度的变化。
F6H8中的溶菌酶/海藻糖
还研究了悬浮在F6H8中的溶菌酶/海藻糖颗粒的粒度稳定性。图9A、图9B、图9C 描绘了在40℃储存0、1、3、6和12个月后，用悬浮在作为液体媒介物的F6H8中的包含不同比率的溶菌酶和海藻糖的喷雾干燥和真空干燥颗粒制备的配制品的粒度稳定性。图9A描绘了悬浮液配制品2(Lys:Tre 70:30；TSC＝300mg/ml)的粒度分布。图 9B描绘了悬浮液配制品3(含PS20的Lys:Tre 70:30配制品；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。图9C描绘了悬浮液配制品4(Lys:Tre 50:50；TSC＝100mg/ml)的粒度分布。
如这些图中所示，还观察到，对于包含溶菌酶和作为稳定剂的海藻糖的蛋白质颗粒，并且在不同浓度下，这些配制品即使在40℃下储存12个月后粒度也没有差异。通过光学显微术和SEM进一步证实了这些结果。用SEM拍摄的照片进一步显示，在40℃下储存12个月期间，没有发生颗粒形态的变化或单个颗粒的烧结。
再悬浮性
使用两种不同的方法测试根据实施例1制备的一些悬浮液的再悬浮性，其也可称为再分散性。
悬浮液配制品的再悬浮性是其物理稳定性的另一量度。欧洲药典(Ph.Eur.)定义了悬浮液的通用标准，其中悬浮液需要为通过温和的手动摇动是可再分散的。特别地，悬浮液配制品的再悬浮不应花费太长时间，以使医务人员或甚至患者自己易于施用。如果预期将悬浮液配制品作为试剂盒或施用装置如可预填充注射筒形式提供，则再悬浮性的物理属性甚至更显著，因为可用于再悬浮配制品的顶部空间体积通常减小。不稳定的悬浮液配制品是不能完全再悬浮或再分散到其原始特征的悬浮液配制品。例如在以下情况下悬浮液是不稳定的：颗粒聚集体形成，所述颗粒聚集体包括视觉上可观察到的聚集体(如在储存配制品的容器中的漂浮物、沉淀物或沉积物)并且在静置或储存时可随时间形成，不能完全再分散。
使用SU1100立式旋转器(Sunlab，Mannheim，德国)以25rpm的旋转速度进行再悬浮性的第一个测试(旋转方法)。测量达到视觉再悬浮的时间。15min后终止实验。使用Retsch摆式研磨机MM 400(Retsch GmbH，哈恩(Haan)，德国)进行第二种方法(摇动方法)。为此目的，将含有悬浮液配制品的小瓶固定并以恒定频率摇动30s。如果没有可见的再悬浮，则以高2.5Hz的频率重复此步骤(起始频率：5Hz；最大频率：30Hz)。
结果
溶菌酶/海藻糖悬浮液
使用立式摇床(以25rpm立式旋转)测试在5℃、25℃和40℃下储存的包含蛋白质颗粒的悬浮液配制品1a、1b、1c和1d的再悬浮性，所述蛋白质颗粒包含溶菌酶和海藻糖颗粒。如图10所绘，发现包含F4H5或F6H8作为悬浮媒介物的含蛋白质悬浮液配制品在若干秒后容易再悬浮，即使样品在40℃下储存12个月也如此。基于EO或MCT媒介物的悬浮液需要若干分钟的较长再悬浮时间。此外，与半氟化烷烃相反，观察到EO 和MCT悬浮液在储存后具有低得多的沉降体积并形成更致密的饼。
还发现对含有在媒介物F6H8中的较高浓度蛋白质颗粒(2)；Lys:Tre 70:30；总固体含量(TSC)300mg/ml)、聚山梨醇酯20(3；Lys:Tre 70:30；总固体含量(TSC) 100mg/ml；0.1％聚山梨醇酯20)或更高的稳定剂浓度(4；Lys:Tre 50:50；100mg/ml) 的配制品进行的再悬浮测试是容易可再分散的，即在小于1分钟内可再分散。
溶菌酶/蔗糖悬浮液
还使用立式旋转方法或手动摇动方法研究了含有溶菌酶和蔗糖颗粒的悬浮液配制品在5℃、25℃和40℃下储存经12个月时间段后的再悬浮性。
类似于对于溶菌酶/海藻糖颗粒观察到的，观察到与媒介物为EO的悬浮液相比，在F6H8中的Lys:Suc 50:50颗粒(TSC＝100gm/ml)(配制品5a、5b、6a和6b)通常使用立式旋转更快地再悬浮(图11，图A)。对于在较低温度下储存的基于EO的配制品观察到可接受的再分散时间，而对于基于F6H8的配制品，再悬浮性在所有各种储存温度下基本上始终保持快速。
使用用于测试再分散的摇动方法(其模拟用手摇动)，还测试了这些配制品的再悬浮所需的频率(图11，图B)。在F6H8中的溶菌酶悬浮液在5Hz的频率下是容易可再分散的，该频率是普通人用于该操作的频率。EO配制品需要高达15Hz的较高频率。
模型mAb/蔗糖悬浮液
还对在5℃、25℃和40℃下老化经6个月时间段的如表1中所述的悬浮液配制品7a、7b、8a、8b、9b、10b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)进行再悬浮测试。
观察到(图12)与例如上述溶菌酶/蔗糖颗粒相比，含有在没有额外干燥步骤的情况下制备的含mAb颗粒(mAb:蔗糖50:50)的悬浮液(配制品7a、8a)不容易再悬浮，并且还观察到颗粒支架的形成。然而，相比之下，用具有低残余水含量的mAb:蔗糖颗粒制备的悬浮液配制品(配制品7b、8b)使用摇动方法是容易可再分散的。值得注意的是，这些配制品在较高温度即40℃下长时间储存后也是可再分散的。
可注入性(Syringeability)和可注射性(Injectability)
测试根据实施例1制备的悬浮液的可注入性，或其中配制品可以被抽入并填充到注射筒的体积中的总体容易性。手动测试可注入性。将23G针头(Terumo)附接到1mlB.Braun Inject F一次性注射筒(B.Braun AG，梅尔松根，德国)。然后通过将柱塞移动到注射筒末端来测试悬浮液配制品的可注入性。测量可去除体积。
可注射性对于预期使用注射筒和针头施用的悬浮液配制品也是重要的参数，这是由于有形成颗粒凝聚物导致针头堵塞的潜在风险。这可影响通过注射施用的配制品的适用性，以及准确给药。使用质构分析仪XT plus(Stable Micro Systems，戈德尔明(Godalming)，英国)进行不同注射系统的注射筒滑动力测量。将储存在小瓶中的悬浮液配制品吸入1ml B.Braun Inject F一次性注射筒(B.Braun AG，梅尔松根，德国)中，然后附接27G Terumo Agani针头(Terumo，东京，日本)。为了测定注射所需的滑动力，设定柱塞速度以获得0.1ml/s的体积流量。为了研究初始分散品质，手动测试可注射性(27G针头)。27G针头的内径为大约210μm。
结果
当根据实施例1制备的经喷雾干燥和真空干燥的含蛋白质颗粒用于制备悬浮液时，通常发现利用超声浴或高剪切均化器制备的悬浮液是可注射的。相反，使用未经过额外真空干燥步骤的含蛋白质颗粒在一些测试配制品中由于不完全悬浮而导致针头堵塞。
例如，在40℃下储存经6个月时间段后，对表2中所述的悬浮液配制品7a、7b、8a、8b(mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)进行可注入性测试。观察到使用23G针头不可能将悬浮液7a和8a吸入注射筒中。当将含有mAb颗粒的悬浮液7b和8b吸入注射筒时，没有发生困难。即使在以30Hz的频率破坏颗粒支架后，仍观察到悬浮液配制品7a和 8a的颗粒粘附在小瓶壁上并且分散性差。如下表2所示，主要为空气(由可去除体积确定)被吸入注射筒中：
表2
Figure RE-GDA0003830102750000281
因此，显现包括干燥蛋白质颗粒(即通过真空干燥)的额外加工步骤可对用于注射的稳定性和适用性具有有利影响。
溶菌酶/海藻糖悬浮液
还根据上述方案测试在40℃下储存经12个月时间段的如表1中所述的包含含溶菌酶 -海藻糖颗粒(溶菌酶海藻糖70:30；TSC＝100mg/ml)的悬浮液配制品即配制品1a、1b、1c和1d的可注射性。对于所有测试的媒介物(即F4H5、F6H8、EO或MCT)中的配制品，即使在40℃下储存一年后，也没有观察到滑动力的显著变化，并且没有观察到针头堵塞。
对于TSC＝300mg/ml和TSC＝100mg/ml的溶菌酶-海藻糖悬浮液配制品(Lys:Tre70:30；即配制品2和还含有聚山梨醇酯20的配制品3)获得了类似的结果。图14描绘了配制品2和3在40℃下储存12个月后的滑动力曲线。
对于F6H8中的Lys:Tre 50:50配制品(配制品4，TSC＝100mg/mL)也获得了类似的结果。
模型mAB/蔗糖悬浮液
根据上述方案测试在40℃下储存经6个月时间段的如表1中所述的具有包含模型mAb-蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品7a、7b(F4H5，mAb:Suc 50:50；TSC＝100 mg/ml)和8a、8b(F6H8，mAb:Suc 50:50；TSC＝100mg/ml)的可注射性。图15描绘了在40℃下储存经6个月时间段中注射这些配制品所需的最大注射力。用未经过额外真空干燥步骤的蛋白质颗粒制备的配制品7a和8a，即如图15A中所描绘的含有约4.2 wt％残余水含量的颗粒，随着在40℃下储存经6个月时间段的进展，观察到所需的力的施加增加。相比之下，用蛋白质颗粒制备的悬浮液配制品7b和8b的可注射性结果显现在6个月时间段内保持一致，所述蛋白质颗粒在喷雾干燥后被真空干燥，并且具有相对于颗粒重量约0.1wt％的残余水含量(图15，B)。
对于用媒介物MCT(10b，mAb:Suc 50:50，TSC＝100mg/mL)和EO(9b，mAb:Suc 50:50，TSC＝100mg/mL)制备的mAb-蔗糖悬浮液配制品获得类似的结果。图16描绘了配制品9b和10b在40℃下储存6个月后的滑动力曲线。
贝伐单抗/蔗糖悬浮液
根据上述方案测试在40℃下储存经6个月时间段的如表1中所述的具有包含贝伐单抗-蔗糖的蛋白质颗粒的悬浮液配制品14a、14b(F6H8，beva:Suc 50:50；TSC＝100 mg/mL)和15a、15b(EO，beva:Suc 50:50；TSC＝100mg/mL)的可注射性。如图 17所示，发现在F6H8和EO中储存6个月后，含有贝伐单抗的悬浮液配制品是可注射的，没有任何针头堵塞或扰动。
蛋白质活性测试
ELISA用于评价配制品16中贝伐单抗的活性。贝伐单抗参与与VEGF的结合，所述结合与抑制血管生成相关。测试基于夹心型ELISA，其使用包被有重组人VEGF-A的微量滴定板。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG单克隆抗体(与抗体Fc区结合) 用于量化结合的贝伐单抗。使用来自ImmunoGuide(安卡拉(Ankara)，土耳其)的市售试剂盒，根据制造商的说明书，使用水性市售蛋白质原料和重构的蛋白质悬浮液配制品进行ELISA测定。
蛋白质悬浮液配制品是由喷雾干燥且随后真空干燥的蛋白质颗粒制备的。ELISA分析显示原料和重构的蛋白质悬浮液配制品之间的结合活性没有显著差异。蛋白质颗粒制备、随后的干燥以及随后的悬浮液制备的过程不影响抗VEGF蛋白贝伐单抗的活性。
表3贝伐单抗悬浮液16的测试
Figure RE-GDA0003830102750000291
Figure RE-GDA0003830102750000301

Claims (34)

1.一种用于制造包含蛋白质颗粒和非水性媒介物的悬浮液配制品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)提供包含蛋白质和稳定剂的水性溶液，
b)从所述水性溶液中去除水以获得固体蛋白质颗粒，
c)进一步干燥在步骤b)中获得的蛋白质颗粒，以获得包含基于所述颗粒的重量小于0.5wt％的残余水含量的蛋白质颗粒，以及
d)将步骤c)的蛋白质颗粒悬浮在包含半氟化烷烃的非水性媒介物中；以及任选地
e)均化所述悬浮液配制品，优选地通过高剪切均化、研磨或超声处理来均化，
其中所述蛋白质颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中所述非水性媒介物包含半氟化烷烃。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的水是通过喷雾干燥或冻干所述组合物去除的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中步骤b)中的水是通过喷雾干燥去除的。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤c)干燥步骤使用真空干燥进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中步骤c)干燥是在15℃-40℃之间的温度、0.01-100mbar之间的压力下进行的真空干燥。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤c)进行至少12小时、或至少24小时。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其包括步骤e)通过超声处理使所述悬浮液配制品均化。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述均化在冰浴中通过超声处理进行。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述蛋白质与所述稳定剂的相对重量比在1:1至7:3之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中将步骤d)中的蛋白质颗粒再悬浮在选自F4H5和F6H8的半氟化烷烃中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述稳定剂选自糖类、多元醇、氨基酸、胺、表面活性剂、抗氧化剂、聚合物、盐或其组合。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述稳定剂是糖类，优选选自海藻糖和蔗糖的糖类。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白质具有10至300kDa之间的分子量。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质选自抗原结合多肽或蛋白、疫苗和酶。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中在步骤d)或任选地步骤e)后，如通过激光衍射所测定的，至少90％的所述蛋白质颗粒具有1和30μm之间的平均直径。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述悬浮液配制品中的蛋白质浓度在2和350mg/ml之间。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述悬浮液配制品的总固体含量在7和500mg/ml之间。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述悬浮液配制品不含表面活性剂。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述悬浮液配制品的残余水含量基于所述配制品的总体积为小于1.0mg/ml。
20.一种包含悬浮在非水性媒介物中的蛋白质颗粒的悬浮液配制品，其可通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得，其中所述蛋白质颗粒包含蛋白质和稳定剂，并且其中所述非水性媒介物包含半氟化烷烃。
21.一种悬浮液配制品，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的非水性液体媒介物中的两次干燥的包含蛋白质和稳定剂的蛋白质颗粒；其中所述蛋白质颗粒的残余水含量小于0.5wt％；并且其中至少90％的所述蛋白质颗粒具有通过激光衍射测定的1和30μm之间的平均直径。
22.根据权利要求21所述的悬浮液配制品，其中所述两次干燥的蛋白质颗粒是经喷雾干燥和真空干燥或冻干和真空干燥的。
23.根据权利要求21或22所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂是糖类、多元醇、聚山梨醇酯或其组合。
24.根据权利要求23所述的悬浮液配制品，其中所述稳定剂是糖类，优选选自海藻糖和蔗糖的糖类。
25.根据权利要求21至24中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质具有10至300kDa之间的分子量。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质选自抗原结合多肽或蛋白、疫苗和酶。
27.根据权利要求21至26中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述蛋白质与所述稳定剂的相对重量比在1:1至7:3的范围内。
28.根据权利要求21至27中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述半氟化烷烃选自F4H5和F6H8。
29.根据权利要求21至28中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品中的蛋白质浓度在2和350mg/ml之间。
30.根据权利要求21至29中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品的总固体含量在7和500mg/ml之间。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品不含表面活性剂。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的悬浮液配制品，其中所述悬浮液配制品的残余水含量基于所述配制品的总体积为小于1.0mg/ml。
33.一种试剂盒，其包含根据权利要求20至32中任一项所述的悬浮液配制品和适于容纳所述配制品的容器，以及任选地分配装置。
34.一种包含根据权利要求20至32中任一项所述的悬浮液配制品的施用设备，其中所述施用设备适于局部施用或通过注射施用所述悬浮液配制品。
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