CN113710228A - 用于治疗眼部新生血管形成的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非水性眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含选自以下的抗VEGF蛋白：阿柏西普或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。所述组合物特别适用于治疗眼部新生血管形成。

Description

用于治疗眼部新生血管形成的组合物和方法
背景技术
新生血管形成可发生在许多眼睛疾病中，并且其流行病学影响显著。眼部新生血管形成已知来自眼睛的各个部分，包括角膜、虹膜、视网膜和脉络膜。
角膜新生血管形成的特征在于新血管从角膜缘侵入角膜。它是由维持角膜透明度的血管生成和抗血管生成因子之间的平衡破坏引起的。晚期阶段，向内生长的血管到达视轴，可能会永久性地威胁视力，并且在角膜移植患者中，可能会导致排斥反应。
全部都在标签外使用的若干种医学方法可用于治疗角膜新生血管。最近涉及单克隆抗VEGF抗体的研究已经显示出减少角膜新生血管形成的有希望的结果。尽管缺乏长期数据，但贝伐单抗或兰尼单抗的局部和/或结膜下施用已展现出良好的短期安全性和功效。针对角膜新生血管形成的抗VEGF疗法仍被认为是实验性的和标签外的，需要特别同意，并且保险可能会被拒绝。在角膜移植的情况下，角膜新生血管形成大大增加了移植排斥的风险，并最终增加经历角膜移植的患者失败的风险。
以下文件讨论了抗VEGF蛋白在治疗角膜新生血管形成中的用途。
US 7608261描述了抗VEGF蛋白的水溶液，注射后其可抑制损伤诱导的角膜新生血管形成。
WO 2007/149334描述了抗VEGF蛋白的水性眼用配制品的稳定性。
WO 2016/208989描述了以高稳定性(例如用于长期储存)为特征的抗VEGF蛋白的水溶液。
Park等人(Cornea.2015；34(10):1303-7)示出局部施用水性0.1％阿柏西普或0.1％贝伐单抗对兔角膜新生血管形成具有可比的抑制作用。
Sella等人(Exp Eye Res.2016；146:224-32)比较了在化学烧伤大鼠模型中局部施用高浓度水性阿柏西普和贝伐单抗配制品对角膜新生血管形成的抑制作用。
WO 2015/011199描述了组合物，所述组合物包含抗原结合蛋白和含有半氟化烷烃的液体媒介物。
发明内容
本发明属于眼科领域。特别地，本发明涉及用于治疗眼部新生血管形成，尤其是角膜新生血管形成的方法和组合物。
附图说明
图1：在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白阿柏西普对血管生长(血管生成)的抑制。Afli/F6H8＝以5mg/ml的蛋白质浓度悬浮在1-全氟己基辛烷(F6H8)中的阿柏西普蛋白粉末制剂；Afli＝在10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中的蛋白质浓度为5mg/ml的阿柏西普水溶液；F6H8＝媒介物(1-全氟己基辛烷)；磷酸盐＝对照(10mM水性磷酸钠缓冲液，pH 6.2)。
图2：在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白阿柏西普对淋巴管生长(淋巴管生成)的抑制。Afli/F6H8＝以5mg/ml的蛋白质浓度悬浮在1-全氟己基辛烷(F6H8)中的阿柏西普蛋白粉末制剂；Afli＝在10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中的蛋白质浓度为5mg/ml的阿柏西普水溶液；F6H8＝媒介物(1-全氟己基辛烷)；磷酸盐＝对照(10mM水性磷酸钠缓冲液，pH 6.2)。
图3：在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白贝伐单抗对血管生长(血管生成)的抑制。Be/F6H8＝以5mg/ml的蛋白质浓度悬浮在1-全氟己基辛烷(F6H8)中的贝伐单抗蛋白粉末制剂；贝伐单抗＝在10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中的蛋白质浓度为5mg/ml的贝伐单抗水溶液；F6H8＝媒介物(1-全氟己基辛烷)；磷酸盐＝对照(10mM水性磷酸钠缓冲液，pH 6.2)。
图4：在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白贝伐单抗对淋巴管生长(淋巴管生成)的抑制。Be/F6H8＝以5mg/ml的蛋白质浓度悬浮在1-全氟己基辛烷(F6H8)中的贝伐单抗蛋白粉末制剂；Afli＝在10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中的蛋白质浓度为5mg/ml的贝伐单抗水溶液；F6H8＝媒介物(1-全氟己基辛烷)；磷酸盐＝对照(10mM水性磷酸钠缓冲液，pH 6.2)。
具体实施方式
本发明基于诸位发明人的发现，即包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的粉末制剂的颗粒的眼用组合物适用于治疗眼部新生血管形成，其中所述颗粒包含抗VEGF蛋白。
这样，在第一方面，本发明涉及包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的颗粒的非水性眼用组合物，其中所述颗粒包含抗VEGF蛋白。优选地，所述颗粒是蛋白粉末制剂的颗粒。
特别地，本发明涉及包含悬浮在液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒的非水性眼用组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白并且其中所述液体媒介物包含半氟化烷烃。
在本发明的上下文中，VEGF是指血管内皮生长因子。血管内皮生长因子是细胞产生的一种信号蛋白，其刺激血管的形成(血管生成)。
VEGF是指具有多个成员的生长因子家族。在哺乳动物中，所述家族包括VEGF-A至VEGF-D。在本发明的上下文中，术语VEGF是指VEGF家族的任何家族成员。
在本发明的上下文中，术语抗VEGF蛋白是指中和VEGF活性的蛋白。在一些实施方案中，所述抗VEGF蛋白是结合VEGF抗原的抗原结合多肽或蛋白质。多肽和蛋白质通常代表通过肽键相互连接的氨基酸单元的聚合物。由于通常用于区分多肽和蛋白质的大小边界在某种程度上是任意的，因此在本发明的上下文中，对这些分子的两种表达不应理解为相互排斥：多肽也可以称为蛋白质，反之亦然。通常，术语“多肽”仅指单个聚合物链，而表述“蛋白质”还可指通过非共价键彼此连接的两条或更多条多肽链。
更具体地，并且如在本发明的上下文中使用的，抗原结合多肽或蛋白是指处于其单体或聚合物形式的全长和完整抗体(也称为免疫球蛋白)以及从全长抗体衍生的能够特异性结合抗原的任何片段、链、结构域或任何修饰。抗原结合多肽或蛋白可以属于IgG、IgA、IgD、IgE或IgM免疫球蛋白同种型或类别中的任一种。包含能够特异性结合抗原的抗体片段的融合蛋白以及抗体-药物缀合物也在如本文所用的抗原结合多肽或蛋白的定义内。
全长抗体是Y形糖蛋白，由具有Fc(可结晶片段)结构域和Fab(抗原结合片段)结构域的一般结构构成。它们在结构上由两条重(H)链和两条轻(L)链多肽结构构成，所述重链和轻链经由二硫键相互连接以形成Y形结构。每种类型的链都包含一个可变区(V)和一个恒定区(C)；所述重链包含一个可变链区(VH)和各种恒定区(例如CH1、CH2等)，并且所述轻链包含一个可变链区(VL)和一个恒定区(CL)。V区可以进一步表征为进一步的子结构域/区，即包含更保守氨基酸残基的框架(FR)区、以及高变(HV)区或互补决定区(CDR)，所述高变区或互补决定区由在氨基酸残基方面具有增加的变异性的区域构成。链的可变区决定了抗体的结合特异性，并形成了抗体的抗原结合Fab结构域。
如本文所用，抗VEGF蛋白包括但不限于抗VEGF抗体和相关分子。在本发明的优选实施方案中，所述组合物包含抗VEGF蛋白，其中所述抗VEGF蛋白选自单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、包含抗体片段的融合蛋白、抗体-药物缀合物、或其任何组合。
在本发明的特别优选的实施方案中，所述组合物包含选自单克隆抗体(mAb)的抗VEGF蛋白。单克隆抗体是指从对抗原上的单个表位或结合位点具有特异性的同质抗体群中获得的抗体。单克隆抗体可以使用本领域已知的抗体工程技术产生，如通过杂交瘤或重组DNA方法。
结合VEGF抗原的抗体片段也在抗VEGF蛋白的范围内。本发明的抗体片段包括抗体的任何区、链、结构域，或其任何构建体或缀合物，可以与VEGF抗原相互作用并特异性结合，并且就结合能力而言可以是单价、二价或甚至多价。此类抗体片段可以通过本领域已知的方法产生，例如全长天然抗体的切开(例如通过蛋白水解)、蛋白质合成、基因工程/DNA重组方法、化学交联或其任何组合。抗体片段通常源自出现在全长抗体的可变V区中的各种结构域或区域的组合。
优选地，本发明的抗VEGF蛋白选自贝伐单抗(安维汀(Avastin))、阿柏西普(VEGFTrap-Eye；
Figure BDA0003287633540000041
)和ziv-阿柏西普(VEGF Trap；
Figure BDA0003287633540000042
)。
阿柏西普
阿柏西普(商品名，EYLEA)是一种抗VEGF蛋白，即携带VEGF受体的胞外结构域的Fc融合多肽，用作诱饵受体以中和VEGF。阿柏西普用于治疗患有新生血管(湿性)年龄相关性黄斑变性(AMD)、视网膜静脉阻塞(RVO)后黄斑水肿、糖尿病性黄斑水肿(DME)和糖尿病性视网膜病变(DR)的患者。阿柏西普(也称为VEGFR1 R2-FcAC1(a))的氨基酸序列以及编码其的核酸序列在例如WO 2012/097019中列出。
阿柏西普的蛋白质序列(SEQ ID NO:1)是：
SDTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG
ziv-阿柏西普
Ziv-阿柏西普含有与阿柏西普相同的蛋白质(活性药物)，但特别被配制用于作为静脉输注液注射。Ziv-阿柏西普并非旨在用于眼科用途，因为ziv-阿柏西普制剂的摩尔渗透压浓度显著高于玻璃体内阿柏西普注射的摩尔渗透压浓度。然而，玻璃体内ziv-阿柏西普已成功用于多种眼部病症，具有可接受的安全性。
贝伐单抗
贝伐单抗是一种重组人源化单克隆抗体，其通过抑制血管内皮生长因子A(VEGF-A)来阻断血管生成。贝伐单抗是一种全长IgG1κ同种型抗体，由两条相同的轻链(214个氨基酸残基；SEQ ID NO:2)和两条重链(453个残基；SEQ ID NO:3)构成，总分子量为149kDa。两条重链通过两个链间二硫键彼此共价偶联，这与人IgG1的结构一致。
“贝伐单抗轻链”的蛋白质序列(SEQ ID NO:2)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
“贝伐单抗重链”的蛋白质序列(SEQ ID NO:3)是：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFTFSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
如本文所理解的，抗VEGF抗体可以是嵌合的、人源化的或人的。例如，嵌合单克隆抗体是指杂合单克隆抗体，其包含从来自多于一种物种的抗体序列(例如从鼠和人抗体序列)衍生的重链或轻链的结构域或区域。人源化单克隆抗体是指在结构上主要源自人抗体序列的、通常具有至少85％-95％人源序列贡献的那些，而术语人是指仅源自人种系抗体序列的那些。在优选实施方案中，所述组合物由选自单克隆抗体的抗原结合多肽或蛋白构成，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
所述液体媒介物包含半氟化烷烃。从制药的角度来看，半氟化烷烃具有许多优点。它们基本上是无毒的，并且当局部或肠胃外施用时被各种类型的人和动物组织良好耐受。此外，它们是化学惰性的，并且通常与药物配制品中的活性和非活性成分相容。半氟化烷烃在充当不溶性或难溶性化合物(如抗原结合蛋白或多肽)的媒介物时，会形成具有非常有用的物理或药物特性(即几乎没有形成固体的不可分散沉积物的倾向)的分散体或悬浮液。
半氟化烷烃是直链或支链烷烃，其中一些氢原子已被氟替代。在用于本发明的半氟化烷烃(SFA)中，存在一个直链非氟化烃段和一个直链全氟化烃段。这些化合物因此遵循通式F(CF2)n(CH2)mH。根据本发明，n选自3至12的范围，并且m选自3至12的范围，优选n选自4至8的范围，并且m选自4至10的范围。
常用于半氟化烷烃的命名法将全氟化烃段指定为RF，将非氟化段指定为RH。可替代地，所述化合物可以分别称为FnHm和FnHm，其中F意指全氟化烃段，H意指非氟化段，并且n和m定义相应段的碳原子数量。例如，F3H3用于全氟丙基丙烷，F(CF2)3(CH2)3H。此外，这种命名法通常用于具有直链段的化合物。因此，除非另有指明，否则应假定F3H3意指1-全氟丙基丙烷，而不是2-全氟丙基丙烷、1-全氟异丙基丙烷或2-全氟异丙基丙烷。
优选的半氟化烷烃特别包括化合物F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10。特别优选用于实施本发明的是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8。在另一个特别优选的实施方案中，本发明的组合物包含F6H8。
任选地，所述组合物可包含多于一种SFA。例如，为了实现特定的目标特性，如特定的密度或粘度，将SFA进行组合可能很有用。如果使用SFA的混合物，则进一步优选的是所述混合物包含F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一种，并且特别是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8中的一种。在另一个实施方案中，所述混合物包含至少两种选自F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10的成员，并且特别是至少两种选自F4H5、F6H6和F6H8的成员。
液体SFA在化学和生理上是惰性的，无色且稳定。它们的典型密度范围为1.1至1.7g/cm3，并且其表面张力可以低至19mN/m。RFRH类型的SFA不溶于水但也有些两亲性，其亲脂性的增加与非氟化段的大小的增加相关。
组合物包含液体媒介物，其中半氟化烷烃按重量计以组合物的至少85％(wt％)的浓度存在，优选地半氟化烷烃按重量计以组合物的约85％至99％的浓度存在。
诸位发明人已经发现，在包含抗VEGF蛋白的组合物中，半氟化烷烃在液体媒介物中的存在或特别作为液体媒介物的存在对抗VEGF蛋白具有明显的稳定作用。特别地，包含半氟化烷烃作为液体媒介物的组合物能够在相当长的一段时间内，在室温下甚至在更高的温度如40℃下基本上防止或抑制所述组合物的聚集并减少化学降解，而不会损失生物活性.此外，已经发现包含一种抗VEGF蛋白和一种含有半氟化烷烃的液体媒介物的组合物在局部应用于眼睛表面时显示出抗新生血管形成活性。
还已发现半氟化烷烃中的抗VEGF蛋白质分散体和悬浮液展现出明显程度的物理稳定性。漂浮或沉降的发生缓慢，这样在轻轻摇动或旋动装有分散体或悬浮液的容器(例如小瓶)后，留出足够的时间抽取剂量。半氟化烷烃中的抗VEGF蛋白颗粒显现在很大程度上保留了其原始粒度分布，并且易于再分散；再分散性差的聚集体显现没有形成。重要的是，这在精确性和再现性方面提供了更高水平的给药准确性。
相比之下，其他化学惰性媒介物中的悬浮液或分散体往往不稳定，导致形成致密且再分散性差的聚集体，并且使精确给药具有挑战性，或者在一些情况下使精确给药不可能，如导致通常用于皮下注射的细号针头堵塞。聚集的蛋白质颗粒也存在触发不良免疫原性反应的高风险。
术语蛋白粉末制剂是指粉末形式的蛋白质组合物，优选它是至少包含如上文定义的抗VEGF蛋白的干固体颗粒的形式。蛋白粉末制剂的颗粒可以通过冻干或喷雾干燥包含抗VEGF蛋白的水溶液来获得。
在特定方面，本发明因此涉及一种眼用组合物，其包含悬浮在液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，所述液体媒介物包含式RFRH的半氟化烷烃，其中RF是具有4至8个碳原子的直链全氟化烃段，并且其中RH是具有4至10个碳的直链烷基。此外，所述蛋白粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白。将包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂的颗粒掺入眼用组合物中以在液体媒介物中形成悬浮液。
术语包含半氟化烷烃的液体媒介物是指包含至少一种半氟化烷烃的液体组合物。所述液体媒介物可包含另外的化合物。优选地，所述液体媒介物包含一种或多种半氟化烷烃。更优选地，所述液体媒介物由至少一种半氟化烷烃或半氟化烷烃的混合物组成。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种眼用组合物，其包含悬浮在液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，其中所述液体媒介物由式F(CF2)n(CH2)mH的半氟化烷烃或半氟化烷烃的混合物组成，其中n是4至8的整数且m是4至10的整数，并且其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白。在特定实施方案中，所述液体媒介物由式F(CF2)n(CH2)mH的半氟化烷烃组成，其中n是4至8的整数且m是4至10的整数。在优选实施方案中，所述半氟化烷烃或所述半氟化烷烃的混合物选自F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一种，并且特别是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8中的一种。在具体实施方案中，所述液体媒介物由F6H8组成。
所述抗VEGF蛋白可以是如上文定义的任何合适的抗VEGF蛋白。优选地，所述抗VEGF蛋白是结合VEGF的融合蛋白。在一个实施方案中，所述抗VEGF蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。在一个实施方案中，所述抗VEGF蛋白由与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列组成。在另外的实施方案中，所述抗VEGF蛋白包含与SEQ IDNO.1具有100％序列同一性的序列。在另外的实施方案中，所述抗VEGF蛋白由与SEQ IDNO.1具有100％序列同一性的序列组成。在优选实施方案中，所述抗VEGF蛋白是阿柏西普或ziv-阿柏西普。
在另外的实施方案中，所述抗VEGF蛋白是结合VEGF的抗体。在一个实施方案中，所述抗VEGF蛋白包含与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的序列。在另外的实施方案中，所述抗VEGF蛋白包含与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的蛋白质序列。在特定实施方案中，所述抗VEGF蛋白包含至少两种多肽，其中每种多肽由与SEQ ID NO:2具有至少90％序列同一性的序列或与SEQ ID NO:3具有至少90％序列同一性的序列组成。在一些实施方案中，所述抗VEGF蛋白由包含与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的序列的多肽组成。在另外的实施方案中，所述抗VEGF蛋白由多肽组成，所述多肽由与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3具有100％序列同一性的序列组成。在特定实施方案中，所述抗VEGF蛋白是贝伐单抗(安维汀)。
在本发明的一些实施方案中，抗VEGF蛋白在本发明的眼用悬浮液中的浓度高达约60mg/ml。在一些实施方案中，抗VEGF蛋白在眼用悬浮液中的浓度在约1至60mg/ml之间，优选在约1至25mg/ml之间，更可能在约1至10mg/ml之间，甚至更优选地，所述抗VEGF蛋白的浓度为约5mg/ml。在特定实施方案中，抗VEGF蛋白在悬浮液中的浓度为60mg/ml、50mg/ml、40mg/ml、30mg/ml、20mg/ml、15mg/ml、10mg/ml、7.5mg/ml、5mg/ml、4mg/ml、3mg/ml、2.5mg/ml、2mg/ml或1mg/ml。
包含悬浮在液体媒介物中的颗粒的眼用组合物可包含任何合适量的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。诸位发明人发现所述组合物优选包含约高达35％重量(wt％)的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。这样，在一个实施方案中，所述组合物包含按重量计高达约35％(wt％)的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计在0.1％与16％(wt5)之间的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。在优选实施方案中，所述组合物包含按重量计在0.5％与8％(wt％)之间的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。在一些实施方案中，所述组合物包含按重量计约0.1％、0.25％、0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、7.5％、8.0％、9.0％、10.0％、15.0％、17.5％、20.0％、25％、30％、3或35.0％(wt％)的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。在优选实施方案中，所述组合物包含按重量计1.0％至4.0％，优选约1.2％或3.8％(wt％)的包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂。
如前所指出，可以通过冻干和/或喷雾干燥获得包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂的颗粒。在一些实施方案中，所述包含抗VEGF蛋白的蛋白粉末制剂的颗粒是通过喷雾干燥或冻干包含抗VEGF蛋白的水溶液获得的。所述水溶液还可包含蛋白质稳定剂。可替代地或另外，所述水溶液可包含缓冲剂。
合适的蛋白质稳定剂和缓冲剂是技术人员已知的。优选地，所述一种或多种蛋白质稳定剂选自多元醇、糖(即蔗糖或海藻糖)、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸。
所述缓冲剂可以是任何药理学上可接受的缓冲剂。优选的缓冲剂是磷酸钠。
在一些实施方案中，所述蛋白粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白和一种或多种选自多元醇、糖(即蔗糖或海藻糖)、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸的蛋白质稳定剂。
在本发明的优选实施方案中，所述蛋白粉末制剂的颗粒是通过冻干包含抗VEGF蛋白、一种或多种如上文定义的蛋白质稳定剂和缓冲剂的水溶液获得的。在本发明的另外的优选实施方案中，所述蛋白粉末制剂的颗粒是通过喷雾干燥包含抗VEGF蛋白、一种或多种如上文定义的蛋白质稳定剂和缓冲剂的水溶液获得的。优选地，所述水溶液具有生理学和药理学上可接受的pH。更优选地，所述溶液具有眼科可接受的pH。
因此，在一些实施方案中，本发明涉及一种眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白、一种或多种蛋白质稳定剂和任选的缓冲剂。
在优选实施方案中，所述蛋白质稳定剂选自多元醇、糖(即蔗糖或海藻糖)、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸。
在特定实施方案中，所述蛋白质稳定剂选自蔗糖、海藻糖和聚山梨醇酯。在优选实施方案中，所述蛋白质稳定剂是海藻糖。
所述颗粒在根据本发明的眼用组合物中的总浓度高达400mg/ml。优选地，所述颗粒在所述眼用组合物中的浓度在约10至400mg/ml之间，优选在约10至200mg/ml之间，更优选在10至100mg/ml之间，甚至更优选在约10至60mg/ml之间。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及如上文定义的组合物，其中包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的组合物的总固体含量在约10至400mg/ml之间，优选在约10至200mg/ml之间，更优选在10至100mg/ml之间，甚至更优选在约10至60mg/ml之间。
本发明进一步涉及如上文定义的组合物，其中通过激光衍射测量，90％的悬浮的蛋白粉末制剂颗粒的尺寸在1至100μm之间，优选在1至50μm之间，更优选在1至30μm之间，甚至更优选在1至20μm之间。
本发明的特定性质是，如上文定义的组合物中的抗VEGF蛋白在储存期间保持其活性，尤其是在一段长时间内且甚至在升高的温度下保持其活性。诸位发明人发现，如上文定义的组合物能够在不添加防腐剂的情况下稳定抗VEGF蛋白。这样，在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的组合物，其中所述组合物不含防腐剂。
在特定实施方案中，本发明涉及如上文定义的组合物，其中当在2℃-8℃下储存长达3个月时，悬浮液中所包含的抗VEGF蛋白保持其90％的活性，或者其中当在25℃和60％的湿度下储存长达3个月时，悬浮液中所包含的抗VEGF蛋白保持其90％的活性。(参见实施例2(c)稳定性)
在另外的实施方案中，本发明涉及如上文定义的组合物，其中当在2℃-8℃下储存长达3个月时，90％的悬浮(含抗VEGF蛋白)颗粒保持其初始粒度，或者其中当在25℃和60％的湿度下储存长达3个月时，90％的悬浮(含抗VEGF蛋白)颗粒保持其初始粒度。
在优选实施方案中，所述眼用组合物包含悬浮在媒介物中的蛋白粉末制剂的含抗VEGF颗粒，所述媒介物包含F6H8、蛋白质稳定剂和缓冲剂。
在另外的优选实施方案中，所述眼用组合物包含悬浮在媒介物中的蛋白粉末制剂的含阿柏西普颗粒，所述媒介物包含F6H8、蔗糖和缓冲剂，其中阿柏西普在所述组合物中的浓度为约5mg/ml。
在另外的优选实施方案中，所述眼用组合物包含悬浮在媒介物中的蛋白粉末制剂的含贝伐单抗颗粒，所述媒介物包含F6H8、海藻糖和缓冲剂，其中贝伐单抗在所述组合物中的浓度为约5mg/ml。
本发明的组合物特别适用于医学用途，特别是眼科用途。这样，在一个实施方案中，本发明涉及用作药物的如上文定义的在所有实施方案中的眼用组合物。在另外的实施方案中，本发明涉及用于制造药物的如上文定义的在所有实施方案中的眼用组合物。
诸位发明人出人意料地发现，如上文定义的在所有实施方案中的组合物，即包含蛋白粉末制剂(包含抗VEGF蛋白)的颗粒在包含SFA的液体媒介物中的悬浮液的组合物在治疗眼部新生血管形成方面与包含所述抗VEGF蛋白的水性组合物(溶液)一样有效。
这样，在特定方面，本发明涉及一种眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，所述眼用组合物用于治疗和/或预防眼部新生血管形成的方法中，其中所述蛋白粉末制剂包含抗VEGF蛋白。在特定实施方案中，本发明涉及一种眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，所述眼用组合物用于制造治疗和/或预防眼部新生血管形成的药物，其中所述蛋白粉末制剂包含抗VEGF蛋白。
在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于治疗和/或预防眼部新生血管形成的方法中。本发明还涉及如上文定义的组合物在治疗和/或预防眼部新生血管形成的方法中的用途。
诸位发明人发现，如上文定义的在所有实施方案中的组合物显示出与包含相同抗VEGF蛋白的水性组合物可比或更好的血管生长抑制。因此，在特定实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于抑制血管和/或淋巴管生长的方法中。在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于制造用于抑制血管和/或淋巴管生长的方法中的药物。
在本发明的特定实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于同时抑制血管和淋巴管生长的方法中。在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于制造用于同时抑制血管和淋巴管生长的方法中的药物。
根据本发明的组合物适用于治疗任何类型的眼部新生血管形成，并且特别适用于治疗和/或预防角膜新生血管形成，特别适用于治疗、预防和/或控制角膜血管生成和/或角膜淋巴管生成。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于治疗和/或预防角膜新生血管形成的方法中。在另外的实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的方法，其用于制造用于治疗和/或预防或角膜新生血管形成的药物。
在特定实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物，其用于预防和/或治疗角膜血管生成和/或角膜淋巴管生成的方法中。在另外的实施方案中，本发明涉及所述组合物在制造药物的方法中的用途，所述药物用于预防和/或治疗角膜血管生成和/或角膜淋巴管生成的方法中。
本发明还涉及如上文定义的在所有实施方案中的组合物在如上文定义的治疗或预防眼部新生血管形成的方法中的用途。在这种用途中，优选将所述组合物应用于眼睛或眼部组织。更优选地，将如上文定义的组合物局部应用于眼睛或眼部组织。
这样，所述组合物和应用特别适用于可能受新生血管形成影响的受试者或患者。此类受试者包括即将或已经接受眼科手术，特别是角膜手术，尤其是角膜移植的患者。
本发明还涉及一种治疗和/或预防眼部新生血管形成的方法，其包括将如上文定义的在所有实施方案中的组合物施用于受试者的眼睛或眼部组织。在特定实施方案中，所述方法是治疗和/或预防角膜新生血管形成的方法，尤其是治疗或预防角膜血管生成和/或角膜淋巴管生成的方法。
本发明还涉及一种抑制血管和/或淋巴管生长的方法，其包括将如上文定义的在所有实施方案中的组合物施用于受试者的眼睛或眼部组织。
在本发明的任一方法中，优选将本文定义的组合物局部应用于受试者的眼睛或眼部组织。
所述受试者优选是脊椎动物，更优选是哺乳动物。在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的在所有实施方案中的方法，其中所述受试者是哺乳动物。在特定实施方案中，所述受试者是人。
在一些实施方案中，本发明涉及如上文定义的方法，其中所述受试者有受眼部新生血管形成影响的风险或受眼部新生血管形成影响。在特定实施方案中，所述受试者已经接受或将要接受眼科手术，特别是角膜手术。在具体实施方案中，所述受试者将要接受或已经接受角膜移植手术。
在另外的方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含如上文定义的在所有实施方案中的眼用组合物和适于施用于眼睛的容器。在优选实施方案中，所述容器适于局部应用。
优选地，所述试剂盒还包括使用说明书。
本发明还特别涉及以下编号项目：
1.一种非水性眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的颗粒，其中所述颗粒包含抗VEGF蛋白。
2.根据项目1所述的非水性眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，其中所述粉末制剂的颗粒包含抗VEGF蛋白。
3.根据项目1或2所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白包含与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。
4.根据项目1至3所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白选自阿柏西普和ziv-阿柏西普。
5.根据项目1或2所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白包含与SEQ ID NO:2和SEQID NO:3具有至少90％序列同一性的序列。
6.根据项目1、2或5所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白是贝伐单抗。
7.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述颗粒是通过喷雾干燥或冻干抗VEGF蛋白水溶液获得的。
8.根据项目7所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白在所述抗VEGF蛋白水溶液中的浓度在约1至60mg/ml之间，优选在约1至25mg/ml之间，更优选在约1至10mg/ml之间，甚至更优选地，所述抗VEGF蛋白的浓度为约5mg/ml。
9.根据项目6或7所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白水溶液包含一种或多种选自多元醇、糖(即蔗糖或海藻糖)、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸的蛋白质稳定剂。
10.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含悬浮在所述液体媒介物中的一种或多种选自多元醇、糖(即蔗糖或海藻糖)、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸的蛋白质稳定剂。
11.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含选自蔗糖、海藻糖和聚山梨醇酯的蛋白质稳定剂。
12.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白在所述组合物中的浓度在约1至60mg/ml之间，优选在约1至25mg/ml之间，更优选在约1至10mg/ml之间，甚至更优选地，所述抗VEGF蛋白的浓度为约5mg/ml。
13.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述组合物的总固体含量在约10至400mg/ml之间，优选在约10至200mg/ml之间，更优选在10至100mg/ml之间，甚至更优选在约10至60mg/ml之间。
14.根据任一前述项所述的组合物，其中通过激光衍射测量，90％的悬浮的蛋白粉末制剂颗粒的尺寸在1至100μm之间，优选在1至50μm之间，更优选在1至30μm之间，甚至更优选在1至20μm之间。
15.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述半氟化烷烃具有式F(CF2)n(CH2)mH，其中n是4至8的整数且m是4至10的整数。
16.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述半氟化烷烃选自F4H4、F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8、F8H8。
17.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述半氟化烷烃选自1-全氟丁基戊烷(F4H5)和1-全氟己基辛烷(F6H8)，优选地所述半氟化烷烃是1-全氟己基辛烷(F6H8)。
18.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述半氟化烷烃按重量计以所述组合物的至少85％(wt％)的浓度存在，优选地所述半氟化烷烃按重量计以所述组合物的约85％至99％的浓度存在。
19.根据任一前述项目所述的组合物，其中所述组合物不含防腐剂。
20.根据任一前述项目所述的组合物，其中当将所述组合物在2℃-8℃下储存长达3个月时，在悬浮颗粒中包含的抗VEGF蛋白保持其90％的活性，或者其中当将所述组合物在25℃和60％的湿度下储存长达3个月时，在悬浮颗粒中包含的抗VEGF蛋白保持其90％的活性。
21.根据任一前述项目所述的组合物，其中当将所述组合物在2℃-8℃下储存长达3个月时，90％的悬浮颗粒保持其初始粒度，或者其中当将所述组合物在25℃和60％的湿度下储存长达3个月时，90％的悬浮颗粒保持其初始粒度。
22.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒悬浮在包含F6H8、蔗糖和缓冲剂的媒介物中，并且其中所述组合物包含5mg/ml阿柏西普。
23.根据前述项目中任一项所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒悬浮在包含F6H8、海藻糖和缓冲剂的媒介物中，并且其中所述组合物包含5mg/ml贝伐单抗。
24.根据任一前述项目所述的组合物，其用作药物。
25.在预防和/或治疗眼部新生血管形成中的根据项目24所述的用于所述用途的组合物。
26.在抑制血管和/或淋巴管生长中的根据24至25所述的用于所述用途的组合物。
27.在同时抑制血管和淋巴管生长中的根据24至26所述的用于所述用途的组合物。
28.在预防和/或治疗角膜新生血管形成和/或角膜血管生成中的根据项目24至27所述的用于所述用途的组合物。
29.在预防和/或治疗角膜血管生成和/或角膜淋巴管生成中的根据项目24至28所述的用于所述用途的组合物。
30.根据项目24至29所述的用于所述用途的组合物，其中将所述组合物局部施用于眼睛或眼部组织。
31.根据24至30所述的用于所述用途的组合物，其中将所述组合物施用于经历角膜移植的受试者。
32.一种试剂盒，其包含根据项目1至23中任一项所定义的眼用组合物、用于容纳所述组合物的容器，所述容器适于施用于眼睛或眼部组织。
33.根据项目32所述的试剂盒，其中所述容器被施用用于局部施用。
34.一种治疗眼部新生血管形成的方法，其包括将根据项目1至23中任一项所述的组合物施用于眼睛或眼部组织。
35.根据项目34中任一项所述的方法，其中所述方法有效抑制血管和/或淋巴管生长。
36.根据项目1至23中任一项所定义的组合物用于制造用于治疗眼部新生血管形成的药物的用途。
37.一种制备根据项目1至23中任一项所定义的含有抗VEGF蛋白的稳定非水性眼用组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使包含抗VEGF蛋白和任选的蛋白质稳定剂和/或缓冲剂的水溶液经受喷雾干燥或冻干以形成蛋白粉末制剂的颗粒
(b)将所述蛋白粉末制剂的颗粒悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中以形成所述含有抗VEGF蛋白的组合物。
实施例
实施例1：眼用组合物的制备
从阿柏西普(Zaltrap；Sanofi Genezyme；包含25mg/ml阿柏西普和另外的作为蛋白质稳定剂的蔗糖)和贝伐单抗(安维汀；Roche；包含25mg/ml贝伐单抗和另外的作为蛋白质稳定剂的海藻糖)的水性商业蛋白质原料起始，本发明的眼用悬浮液按以下步骤制备：
(a)将水性商业蛋白质原料稀释至所需浓度，
(b)制备(a)的经稀释水性蛋白质原料的蛋白粉末(即通过喷雾干燥或冻干)和
(c)通过将蛋白粉末制剂(b)悬浮在包含半氟化烷烃(即F6H8)的液体媒介物中来制备眼用组合物
ad a)将浓缩的阿柏西普(25mg/ml)和贝伐单抗(25mg/ml)蛋白水溶液用5mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)稀释，以获得4％-5％(w/v)的总固体含量。
ad b)包含抗VEGF蛋白(阿柏西普、贝伐单抗)的蛋白粉末制剂是例如通过喷雾干燥制备的。在本文中，喷雾干燥使用配备有高效旋风分离器的Büchi B290在以下条件下进行：喷嘴直径0.7mm，干燥空气流速35m3/h，雾化空气流速414L/h。获得包含阿柏西普或贝伐单抗的蛋白粉末制剂。
ad c)通过以下方式制备含SFA眼用组合物：通过涡旋将适当量的蛋白粉末制剂(即约50mg的含有阿柏西普的或约15mg的含有贝伐单抗的蛋白粉末制剂)悬浮在F6H8中，随后在充满冰水的超声浴中进行20min声处理和间歇涡旋(每5min)，以接收悬浮在F6H8中的5mg/ml阿柏西普(还包含作为蛋白质稳定剂的蔗糖和缓冲盐)和悬浮在F6H8中的5mg/ml贝伐单抗(还包含作为蛋白质稳定剂的海藻糖和缓冲盐)。
作为参考材料，阿柏西普和贝伐单抗的眼用水溶液是通过将25mg/ml水性商业蛋白质原料在无菌10mM磷酸钠缓冲液(pH 6.2)中稀释至阿柏西普和贝伐单抗所需的最终蛋白质浓度5mg/ml来制备的。
实施例2：眼用组合物的分析
(a)对阿柏西普和贝伐单抗的水性商业蛋白质原料(RM)以及阿柏西普和贝伐单抗的重构蛋白粉末制剂进行重构水基蛋白粉末制剂SEC-MALS(尺寸排阻色谱-多角度光散射)和ELISA，以确保制造过程没有改变蛋白质。在本文中，阿柏西普和贝伐单抗的重构蛋白粉末制剂(REP)是通过将所述抗VEGF蛋白从基于SFA的非水性眼用悬浮液中提取到水中而获得的。在提取程序中，添加等体积的水，然后轻轻摇动双相样品，直到有机(半氟化烷烃)相变得清澈且所有抗VEGF蛋白已移入水相。然后将该水层(REP)转移到新的小瓶中，并通过SEC-MALS分析蛋白质碎裂/聚集，并通过ELISA分析蛋白质活性。蛋白质聚集和碎裂
蛋白质聚集和碎裂可以通过首先分离级分然后测定它们的分子量(即SEC-MALS分析)来检测。
SEC-MALS分析揭示，阿柏西普和贝伐单抗的水性商业蛋白质原料(RM)和重构蛋白粉末制剂(REP)的色谱图重叠得非常好，并且没有显示聚集或碎裂种类的增加。
(b)蛋白质活性
使用ELISA评价两种蛋白质的关于结合VEGF从而抑制血管生成的活性。测试基于夹心型ELISA，其使用包被有重组人VEGF-A的微量滴定板。然后辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗人IgG单克隆抗体(与抗体Fc区结合)用于量化结合的阿柏西普或贝伐单抗。两种测定均使用来自ImmunoGuide的商业试剂盒，根据制造商的说明，使用水性商业蛋白质原料(RM)和重构蛋白粉末制剂(REP)进行。
相应的ELISA分析也显示阿柏西普和贝伐单抗二者在RM和REP之间结合活性没有显著差异，因此，粉末生产过程以及随后的眼用悬浮液的制备均不影响两种抗VEGF蛋白(阿柏西普、贝伐单抗)的活性。
(c)稳定性
制备在F6H8中的阿柏西普和贝伐单抗蛋白粉末制剂的眼用悬浮液的样品，并放置三个月以测试稳定性。在每个时间点：初始、一个月和3个月测试两个重复。为了分析稳定性样品，如上所述，将抗VEGF蛋白从基于半氟化烷烃的眼用悬浮液中提取到水性环境中。
该稳定性研究揭示，在F6H8中的阿柏西普(表1)和贝伐单抗(表2)蛋白粉末制剂的眼用悬浮液在2℃-8℃和25℃/60％RH下储存时在测定、活性和聚集方面是稳定的。
表1阿柏西普的稳定性研究结果
Figure BDA0003287633540000191
表2贝伐单抗的稳定性研究结果
Figure BDA0003287633540000192
实施例3：缝合诱导的炎性角膜新生血管形成测定
将动物(BALB/c小鼠)通过肌内注射氯胺酮(8mg/kg)和甲苯噻嗪(0.1mL/kg)麻醉，随后在基质内置入三根11-0尼龙缝合线，其中两处基质侵入各自延伸超过角膜圆周的120°。外侧缝合线置入点选择在角膜缘附近，而内侧缝合线置入点选择在离角膜缘等距的角膜中心附近，以获得标准化的血管生成反应。在实验期间缝合线留在原处。
在外科手术之后，将小鼠用3μl对照(缓冲液)、包含悬浮在F6H8或空白中的贝伐单抗和阿柏西普蛋白粉末制剂的眼用组合物处理14天，每天三次(每个样品10只小鼠)。
测试的眼用抗VEGF蛋白组合物包括：
Figure BDA0003287633540000193
Figure BDA0003287633540000201
在处理时期结束时，处死动物，并分析它们的角膜是否存在血管和淋巴管。
实施例4：血管生成和淋巴管生成的形态学测定
切除动物角膜，在PBS中冲洗并在丙酮中固定30min。在PBS中进行三次另外的洗涤步骤并用PBS中的2％BSA封闭2h后，将角膜在4℃下用兔抗小鼠LYVE-1染色过夜。在第二天，将组织洗涤、封闭并用FITC缀合的大鼠抗CD31(Acris Antibodies GmbH，希登豪森，德国)抗体在4℃下染色过夜。在第三天的最后一次洗涤和封闭步骤后，使用山羊抗兔Cy3缀合的二抗。用针对CD31/FITC的FITC缀合的正常大鼠IgG2A并用针对LYVE-1的正常兔IgG(均来自Santa Cruz Biotechnology，圣克鲁兹，加利福尼亚州，美国)确保同种型对照。
用荧光显微镜(BX51，Olympus Optical Co.，汉堡，德国)分析双重染色的整个载片，并用12位单色CCD相机(F-View II，Soft Imaging System，Münster，德国)拍摄数字灰度值图片，分辨率为1376×1023像素。对于FITC染色的血管，使用HQ-FITC选择性滤光片组(激发器：HQ 480/40；发射器：HQ 527/30；AHF Analysentechnik AG，蒂宾根，德国)。对于Cy3染色的淋巴管，使用U-MWG2镜单元(激发滤光片：510-550nm；发射滤光片：590nm；二色镜：570nm；Olympus，汉堡，德国)。每张整个载片照片都由9张以100×放大率拍摄的照片组配而成。血管生长或淋巴管生长的抑制描绘于图1至4中。
实施例5：早期效果
六至八周龄的雌性BALB/c小鼠用于缝合诱导的炎性新生血管形成模型。将三根11-0尼龙缝合线置于右眼的基质内，其中两处基质侵入各自延伸超过角膜圆周的120度。外侧缝合线置入点选择在角膜缘附近，而内侧缝合线点置于离角膜缘等距的角膜中心附近，以获得标准化的血管生成反应。小鼠分为2组(n＝10)：悬浮在半氟化烷烃中的阿柏西普(Afli/F6H8)；溶解于磷酸盐中的阿柏西普(Afli)。就缝合后，每天滴三次。局部施用后第五天和第十天，收获角膜并用LYVE-1和CD31染色，以量化角膜血管和淋巴管生成的形态测量。图5示出用包含悬浮在F6H8中的阿柏西普蛋白粉末制剂的眼用组合物(Afli/F6H8)处理后，血管和淋巴管二者的生长受到抑制的早期效果(5天、10天)。此效果与水性阿柏西普配制品(Afli)是可比的。
实施例6：低剂量应用
除了处理方案之外，程序类似于实施例5。每天仅滴一次(3μl)，并且局部应用后5天收获角膜。图6示出，在减少剂量的情况下也能实现抑制血管和淋巴管生长的效果。在本文中，当与水性阿柏西普配制品(Afli)相比时，用包含悬浮在F6H8中的阿柏西普蛋白粉末制剂的眼用组合物(Afli/F6H8)进行处理显示出可比的效果。
实施例7：对炎症细胞的作用
六至八周龄的雌性BALB/c小鼠用于缝合诱导的炎性新生血管形成模型。将三根11-0尼龙缝合线置于右眼的基质内，其中两处基质侵入各自延伸超过角膜圆周的120度。外侧缝合线置入点选择在角膜缘附近，而内侧缝合线点置于离角膜缘等距的角膜中心附近，以获得标准化的血管生成反应。小鼠分为2组(n＝10)：悬浮在半氟化烷烃中的阿柏西普(Afli/F6H8)；溶解于磷酸盐中的阿柏西普(Afli)。就缝合后，每天滴三次。局部施用后三天，收获角膜并用LYVE-1和CD45染色以量化CD45+细胞和LYVE-1巨噬细胞。图7示出3天后，在早期，诸如CD45+细胞和LYVE-1巨噬细胞等炎症细胞的浸润。显现出，与水性阿柏西普配制品(Afli)相比，包含悬浮在F6H8中的阿柏西普蛋白粉末制剂的眼用组合物(Afli/F6H8)与炎症细胞浸润稍微减少有关。
图1示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白阿柏西普对血管生长(血管生成)的抑制。稀释的商业水性组合物(“Afli”；5mg/ml阿柏西普溶解在10mM磷酸钠缓冲液中，pH 6.2)以及在F6H8中的蛋白粉末制剂(包含阿柏西普)的非水性眼用悬浮液(“Afli/F6H8”；5mg/ml阿柏西普悬浮于F6H8中)二者显著抑制血管向内生长(p<0.05)。
图2示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白阿柏西普对淋巴管生长(淋巴管生成)的抑制。稀释的商业水性组合物(“Afli”；5mg/ml阿柏西普溶解在10mM磷酸钠缓冲液中，pH 6.2)以及在F6H8中的蛋白粉末制剂(包含阿柏西普)的非水性眼用悬浮液(“Afli/F6H8”；5mg/ml阿柏西普，在F6H8中的悬浮液)二者显著抑制淋巴管向内生长(p<0.01)。
图3示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白安维汀对血管生长(血管生成)的抑制。稀释的商业水性组合物(“贝伐单抗”；5mg/ml溶解在10mM磷酸钠缓冲液中，pH 6.2)以及在F6H8中的蛋白粉末制剂(包含贝伐单抗)的非水性眼用悬浮液(“Be/F6H8”；5mg/ml贝伐单抗；在F6H8中的悬浮液)二者抑制血管向内生长。
图4示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中使用抗VEGF蛋白安维汀对淋巴管生长(淋巴管生成)的抑制。稀释的商业水性组合物(“贝伐单抗”；5mg/ml溶解在10mM磷酸钠缓冲液中，pH 6.2)以及在F6H8中的蛋白粉末制剂(包含贝伐单抗)的非水性眼用悬浮液(“Be//F6H8”；5mg/ml贝伐单抗；在F6H8中的悬浮液)二者抑制淋巴管向内生长。
图5示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中，在早期时间点，即在缝合诱导后5天和10天后，利用抗VEGF蛋白阿柏西普对血管生长和淋巴管生长的抑制(给药方案：每天3次，每次3μl)。
图6示出在缝合诱导的炎性新生血管形成小鼠模型中，在早期时间点即在缝合诱导后5天后，采用低剂量应用方案(给药方案：每天1次；3μl)利用抗VEGF蛋白阿柏西普对血管生长和淋巴管生长的抑制。
图7示出在早期时间点即在缝合诱导后3天后，炎症细胞如CD45+细胞和LYVE-1巨噬细胞的浸润。
SEQUENCE LISTING
<110> 诺瓦利克有限责任公司
<120> 用于治疗眼部新生血管形成的组合物和方法
<130> NVL19P01CN1
<150> EP19156934.2
<151> 2019-02-13
<150> EP19171487.2
<151> 2019-04-29
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 431
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-融合多肽
<400> 1
Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu
1 5 10 15
Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val
20 25 30
Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr
35 40 45
Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe
50 55 60
Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu
65 70 75 80
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85 90 95
Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met
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210 215 220
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225 230 235 240
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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
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<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组人源化单克隆抗体轻链
<400> 2
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<213> 人工序列
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Leu Ser Pro Gly Lys
450

Claims (16)

1.一种非水性眼用组合物，其包含悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中的蛋白粉末制剂的颗粒，
其中所述蛋白粉末制剂的颗粒包含选自以下的抗VEGF蛋白：阿柏西普或与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的序列。
2.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒是通过喷雾干燥或冻干包含所述抗VEGF蛋白的水性组合物获得的。
3.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述蛋白粉末制剂的颗粒还包含一种或多种选自以下的蛋白质稳定剂：多元醇、糖、氨基酸、胺和盐析盐、聚合物、表面活性剂和精氨酸。
4.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述抗VEGF蛋白在所述组合物中的浓度在约1至60mg/ml之间，优选地所述抗VEGF蛋白的浓度为约5mg/ml。
5.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中通过激光衍射测量，90％的悬浮的蛋白粉末制剂颗粒的尺寸在1至100μm之间。
6.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述半氟化烷烃具有式F(CF2)n(CH2)mH，其中n是4至8的整数且m是4至10的整数。
7.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中所述半氟化烷烃选自F4H4、F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8或F8H8。
8.根据任一前述权利要求所述的组合物，其中当将所述组合物在2℃-8℃下储存长达3个月时，90％的悬浮颗粒保持其初始粒度。
9.根据任一前述权利要求所述的组合物，其用作药物。
10.在用于预防和/或治疗眼部新生血管形成的方法中的根据权利要求9所述的用于所述用途的组合物。
11.根据权利要求9至10所述的用于所述用途的组合物，用于抑制血管和/或淋巴管生长的方法中。
12.在预防和/或治疗角膜新生血管形成和/或角膜血管生成中的根据权利要求9至11所述的用于所述用途的组合物。
13.根据权利要求9至12所述的用于所述用途的组合物，其中将所述组合物局部施用于眼睛或眼部组织。
14.根据权利要求9至13所述的用于所述用途的组合物，其中将所述组合物施用于经历角膜移植的受试者。
15.一种试剂盒，其包含根据权利要求1至14中任一项所定义的眼用组合物、用于容纳所述组合物的容器，所述容器适于施用于眼睛或眼部组织。
16.一种制备根据权利要求1至8中任一项所定义的含有抗VEGF蛋白的稳定非水性眼用组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)使包含抗VEGF蛋白和任选的蛋白质稳定剂和/或缓冲剂的水溶液经受喷雾干燥或冻干以形成蛋白粉末制剂的颗粒
(b)将所述蛋白粉末制剂的颗粒悬浮在包含半氟化烷烃的液体媒介物中以形成所述含有抗VEGF蛋白的组合物。
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