RS52224B - Upotreba inhibitora il-18 kod poremećaja preosetljivosti - Google Patents

Abstract

Upotreba proteina koji vezuje IL-18 (IL-18BP), fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata koji uključuje spojeni deo, gde je taj deo polietilen glikol (PEG), za dobijanje leka za lečenje i/ili prevenciju kontaktne preosetljivosti.Prijava sadrži još 14 patentnih zahteva.

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak odnosi se na polje alergija. Još specifičnije, odnosi se na inhibitor IL-18 za lečenje i/ili prevenciju poremećaja preosetljivosti, a pre svega poremećaja koji uključuju pozni tip reakcije preosetljivosti ljudskog organizma.

STANJE TEHNIKE

Izraz alergija ili preosetljivost se primenjuje kada jedan adaptivni imunološki odgovor nastaje u neodgovarajućoj formi. Alergijske ili reakcije preosetljivosti su posledica normalno korisnog imunološkog odgovora koji deluje neprimereno na strane antigene (obično makromolekule iz okruženja) i ponekad izazivaju zapaljenske reakcije i oštećenje tkiva. U ovim situacijama, normalno bezopasan stimulus iz okruženja, koji se naziva alergen, pokreće imunološki odgovor, koji se po ponovnom izlaganju re-aktivira da izazove patološko oštećenje.

Reakcije preosetljivosti su štetne imunološke reakcije na spoljašnje antigene. Postoje mnoge klasifikacije preosetljivosti. Neke se zasnivaju na vremenu koje je potrebno da se pojave simptomi ili reakcije testova na koži po izlaganju jednom antigenu (na pr., neposredna i odložena preosetljivost), od tipa antigena (na pr., reakcije na lekove), ili od prirode zahvaćenosti organa. Klasifikacije su obično pojednostavljene i ne uzimaju u obzir da može da postoji više od jednog tipa imunoloških odgovora ili da je potrebno više od jednog tipa da se proizvede imunološko oštećenje. Najčešće se koristi sledeća klasifikacija: Tip I ili neposredna preosetljivost je posredovana IgE. Ona se naziva i obična alergija. Reakcije neposredne preosetljivosti (tip I) su posledica vezivanja između antigena i IgE na mast ćelijama ili bazofilima.

Poremećaji sa reakcijama preosetljivosti tip I nazivaju se i atopijske bolesti, ovde spadaju, na primer, alergijski rinitis, alergijski konjunktivitis, atopijski dermatitis, alergijska ekstrinzična astma, urtikarija, sistemska anafilaksa. Incidenca astme je značajno povećana, iako se razlozi uglavnom ne znaju. Nedavno je zabeležen znatni porast reakcija tip I vezano za izlaganje akvasolubilnim proteinima u proizvodima od lateksa (na pr., gumene rukavice, štitnici za zube, cevi za respiratornu opremu, kateteri, posebno među zdravstvenim osobljem i pacijentima koji se izlažu lateksu i kod dece koja imaju spinu bifidu i urogenitalne urođene mane. Uobičajene reakcije na lateks su urtikarija, angioedem, konjunktivitis, rinitis, bronhospazam, i anafilaksa.

Pacijenti sa atopijskim bolestima (uključujući i atopijski dermatitis) obično imaju naslednu predispoziciju za razvoj preosetljivosti posredovane IgE antitelom na inhalirane i ingestirane supstance (alergens) koje su bezopasne za ljude koji nisu atopijski. Osim kod atopijskog dermatitisa, IgE antitela obično posreduju preosetljivost.

Tip II ili citotoksična preosetljivost uključuje citolitičko delovanje koje je posredovano antitelom, komplementom, i/ili ćelijskim mehanizmom. Kod reakcije tip II cilj je ćelijska površina, a posledica je ćelijsko oštećenje ili smrt. Antitelo na antigen vezan za ćeliju (tip II) dovodi do destrukcije ćelije aktivacijom komplementa ili unapređenjem fagocitoze. U primere ćelijskog oštećenja u kome antitelo reaguje sa antigenskim komponentama ćelije spadaju Kumbs-pozitivne hemolitičke anemije, antitelom-izazvana trombocitopenjska purpura, leukopenija, pemfigus, pemfigoid, Gudpasturov sindrome, i perniciozna anemija. Ove reakcije nastaju kod pacijenata koji primaju inkompatiblne transfuzije, kod hemolitičke bolesti novorođenčeta, i kod neonatalne trombocitopenije, a mogu i da igraju ulogu u multisistemskim bolestima (na pr. sistemski lupus eritematozus, SLE).

Ovaj mehanizam povređivanja se najbolje ilustruje dejstvom na crvena krvna zrnca. Kod hemolitičnih anemija, crvena krvna zrnca se uništavaju bilo intravaskularnom hemolzom ili makrofagnom fagocitozom, uglavnom u slezini.In vitroispitivanja su pokazala da u prisustvu komplementa neka antitela koja se vezuju za komplement (na pr. antitela za krvnu grupu anti-A i anti-B) dovode do brze hemolize. Ostala (na pr. anti-LE antitela) dovode do sporog liziranja ćelija; neka druga ne oštećuju ćelije direktno, već dovode do njihovog prianjanja i destrukcije od strane fagocita. Nasuprot tome, Rh antitela na crvena krvna zrnca ne aktiviraju komplement, i ona uništavaju ćelije uglavnom ekstravskularnom fagocitozom. U primere u kojima je antigen komponenta tkiva spadaju rano akutno (hiperakutno) odbacivanje grafta transplantiranog bubrega, što je posledica prisustva antitela na vaskularni endotelijum, i Gudpasturov sindrom, koji je posledica reakcije antitela sa glomerularnom i alveolarnom bazalnom membranom endotelijuma. Kod eksperimentalnog Gudpasturovog sindroma, komplement je važan medijator povrede, ali uloga komplementa još nije jasno utvrđena kod ranog akutnog odbacivanja grafta.

U primere reakcije izazvane haptenskim kupliranjem sa ćelijama ili tkivom spadaju reakcije preosetljivosti na lekove (na pr. penicilinom izazvana hemolitička anemija, vidi dole).

Anti-receptorske reakcije preosetljivosti menjaju ćelijsku funkciju kao rezultat vezivanja antitela za membranske receptore. Kod mnogih bolesti (na pr., mijastenija gravis, Grejvsova bolest, insulin-resistentni dijabetes), zabeležena su antitela na receptore ćelijske membrane. Kod nekih dijabetičnih bolesnika sa izuzetnom insulinskom rezistencijom, pokazana su antitela na insulinske receptore, koja tako sprečavaju vezivanje insulina za njegov receptor. Kod pacijenata s Grejvsovom bolešću, identifikovano je antitelo na receptor za tiroid-stimulišući hormon (TSH) koje simulira dejstvo TSH na njegov receptor, što dovodi do hipertiroidizma.

Mehanizmi tipa III uključuju uglavnom antitela koja stvaraju imune komplekse sa antigenom. Circkulišući kompleksi aktiviraju komplement, spajaju se za crvena krvna zrnca (koja se onda fagocituju u slezini), napuštaju cirkulaciju i pokreću zapaljenje u tkivnim prostorima (Artus reakcija), ili ih fagocituju makrofagi koji imaju antigen, oslobađaju citokine i aktiviraju B i T-ćelije. IgE, IgA, IgG, i IgM svi formiraju komplekse sa antigenom. Tip III reakcije nastaje od depozita imunih kompleksa u tkivima, posebno u koži, zglobovima i bubrezima. Hronični nefritis imunih kompleksa objašnjava većinu slučajeva glomerulonefritisa kod ljudi. Uslovi u kojima izgleda da imuni kompleksi (ICs) igraju neku ulogu su serumska bolest zbog seruma, lekova ili antigena virusnog hepatitisa; sistemski lupus eritematozus; reumatoidni arthritis; poliarteritis; krioglobulinemia; pneumonitis preosetljivosti; bronhopulmonarna aspergiloza; akutni glomerulonefritis; hronični membranoproliferativni glomerulonefritis; i prateće bubrežne bolesti. Kod bronhopulmonarne aspergiloze, lekovima ili serumom izazvane serumske bolesti, i kod nekih formi bubrežne bolesti, smatra se da IgE-posredovana reakcija prethodi reakciji tip III.

Standardni životinjski modeli reakcije tip III su lokalna Artus reakcija i eksperimentalna serumska bolest. Kod Artus reakcije (tipično lokalna kožna reakcija), životinje se prvo hiperimunizuju da se izazove velika količina cirkulišućih IgG antitela a onda im se da mala količina antigena intradermalno. Ovaj antigen precipitira sa viškom IgG i aktivira komplement, tako da se brzo pojavljuje visoko inflamatorna, edematozna, bolna lokalna lezija (u roku od 4 do 6 h) i može da progredira do sterilnog apscesa koji sadrži mnogo polimorfonuklearnih ćelija, a onda i do tkivne nekroze. Mikroskopski može da se vidi nekrotizirajući vaskulitis sa okludiranim arteriolarnim prečnikom. Ovoj reakciji ne prethodi nikakvo vreme, jer je antitelo već prisutno.

Reakcije Tip I, II i III su izazvane antitelima. Tip IV reakcije su izazvane T-limfocitima.

Tip IV preosetljivosti, koji uključuje ćelijski posredovane reakcije, generalno iziskuje 12 ili više sati da se razvije, i zasniva se na mrežama aktiviranih imunih ćelija. Inflamacija je osnovni tkivni model, a posledica može biti hronična inflamatorna bolest. Tip IV preosetljivosti se naziva i odloženi tip preosetljivosti (tip IV) ili DTH. Reakcije su posredovane interleukinom-2, interferonom-y drugim citokinima koje oslobađaju T-limfociti. Kod DTH, T-limfociti reaguju sa antigenom i oslobađaju interleukin-9, interferon-v i druge citokine. Kada se jednom T-ćelije senzitivišu primarnim izlaganjem, sekundarna provokacija je praćena odloženim tipom reakcije preosetljivosti, lokalnim inflamatornim odgovorom kome je za klinički razvoj potrebno 2-3 dana. Histološki, ove reakcije se sastoje od infiltrirajućih T-limfocita, makrofaga ponekog eozinofila. Eksperimentalno, DTH mogu da prenose T-iimfociti aii ne i serum, i.j. antitela nisu uključena.

DTH može da rezultira i od normalnog ćelijski posredovanog imunološkog odgovora na infekciju virusima, gljivicama i nekim bakterijama, pre svega Mvcobacterium tuberculosis i Mvcobacterium leprae. Ako makrofagi nisu u stanju da unište organizam koji je unet oralno, oni mogu da pretrpe diferencijaciju u epiteloidne ćelije ili multinukleatne gigantske ćelije. Skup ovih ćelija čini granulom. Lokalno oštećenje tkiva je neželjeno sporedno dejstvo ovog inače zaštitnog imunološkog odgovora. Ako DTH odgovora nema ili je oslabljen, onda su T-limfociti nesposobni da lokalizuju napadajući mikroorganizam pa pacijent razvija agresivnu diseminovanu bolest, kao što je akutna tuberkuloza.

Kontaktni dermatitis na profesionalne i druge antigene je takođe reakcija tip IV.

Agensi, koji ovo uzrokuju su obično relativno niske molekulske težine (< 1 kD) i nisu sami po sebi imunogeni, već su to visoko reaktivni molekuli koji se kovalentno vezuju za

kožne ili tkivne proteine. Ova senzitizirajuća hemikalija je poznata kao hapten i protein domaćina je kombinuje kao sa nosačem. Spektar potencijalno senzitizirajućih antigena je širok. Prepoznajemo dve faze patogeneze: faza indukcije i faza elicitacije. U fazi indukcije, ćelije sa antigenom u koži, poznate kao Langerhansove ćelije, vezuju kompleks hapten-noseći protein i nose ga na T-limfocite u vezi sa MHC klasom II antigena. Indukcija T-ćelije može da nastane posle više meseci izloženosti malim

količinama antigena. Ponovno izlaganje relevantnom antigenu pokreće fazu elicitacije gde efektorske ćelije migriraju do kože da se susretnu sa proteinskim kompleksom koji imaju Langerhansove ćelije u epidermisu s posledičnim oslobađanjem citokina i zapaljenjem kože. Dijagnoza agensa koji ovo uzrokuje se postavlja tzv. ,,pač" testiranjem. Na leđa pacijenta se postavlja agens osumnjičen za senzitizaciju i pokriva se u trajanju od 48 sati. Mesto reakcije se kontrološe posle 2 i 24 sata. Kada imamo pozitivni odgovor, na testiranom mestu postoje inflamacija i induracija.

Odloženi tip preosetljivosti je takođe ključni mehanizam za određivanje odbacivanja transplantiranih test organa.

Neki klinički uslovi u kojima se smatra da su važne tip IV reakcije su kontaktni dermatitis, pneumonitis zbog preosetljivosti, odbacivanje alografta, granulomi usled intraćelijskih organizama, neki oblici osetljivosti na lekove, tiroiditis, i encefalomijelitis posle vakcine protiv besnila. Dokazi za poslednje dve se zasnivaju na eksperimentalnim modelima, a kod ljudi bolest se prepoznaje po pojavi limfocita u zapaljenskom eksudatu tiroideje i mozga..

Dermatitis se naziva i ekcem. On se odnosi na površinsko zapoaljenje kože, koje se histološki odlikuje epidermalnim edemom, a klinički vezikulama (kada su akutni), loše ograničenim crvenilom, curenjem, pojavom kraste, Ijuštenja, obično svraba i lihenifikacijom izazvanom trenjem ili češćanjem.

Često, ekcem se odnosi na vezikularni dermatitis, ali je ponekad ovaj izraz ograničen i označava samo hronični dermatitis. Neki koriste izraz dermatitis i za spongiozni dermatitis jer spongioza (intraepidermalni edem) predstavlja histološko obeležje.

Kontaktni dermatitis je akutno ili hronično zapaljenje, često asimetrično i neobičnog oblika, koje izazivaju supstance u dodiru sa kožom i često sa toksičnim (iritantnim) ili alergijskim reakcijama.

Dijagnoza reakcije preosetljivosti zavisi od tipa reakcije o kojoj je reč.

Može se posumnjati na reakciju tip IV kada se zapaljenska reakcija histološki odlikuje perivaskularnim limfocitima i makrofagima. Odloženi kožni testovi preosetljivosti i ,,pač" testovi su najzgodnije metode za testiranje odložene preosetljivosti.

Da se spreči pogoršanje kontaktnog dermatitisa, rade se pač testovi pošto se isključi kontaktni dermatitis. Alergen na koji se sumnja (u odgovarajućoj koncentracijama nanosi se na kožu na lepljivom flasteru koji ne apsorbuje i ostavlja se 48 sati. Ako se pečenje ili svrab pojave ranije, ovaj flaster (pač) se uklanja. Pozitivni test se sastoji od eritema s induracijom i, povremeno, razvojem vezikula. Budući da se neke reakcije ne pojavljuju dok se ovaj flaster ne ukloni, mesto se kontroliše i posle 72 i 96 č.

Preosetljivost može da nastane i kao reakcija na lekove. Pre nego što neku reakciju pripišemo leku, treba napomenuti da i placebo može da uzrokuje široki spektar simptoma pa čak i objektivnih znakova, uključujući i osip na koži (raš). Ipak, prave reakcije na lekove predstavljaju ozbiljan medicinski problem.

Kod nepodnošenja lekova, neželjena reakcija se razvija kod prve upotrebe leka. To može biti i obična toksična reakcija koja se obično očekuje sa višim dozama, ili pojačani uobičajeni neželjeni efekti (na pr. antihistaminska sedacija). Idiosinkrazija je stanje u kome je neželjena reakcija pri prvoj upotrebi leka farmakološki neočekivana i jedinstvena.

Osobine alergijske reakcije na lekove uključuju IgE-posredovane reakcije koje nastaju pošto se pacijent izloži leku (ne mora biti iz terapijskih razloga) jednom ili više puta bez incidenta. Kada se jednom preosetljivost razvije, ova reakcija može da se izazove i dozama znatno ispod terapijskih, i obično ispod onih koje izazivaju idiosinkrazijske reakcije. Kliničke osobine su u svojim manifestacijama. Raš kože (posebno urtikarija), sindrom koji liči na serumsku bolest, neočekivana temperatura, anafilaksa i eozinofilski pulmonarni infiltrati koji se pojavljuju tokom primanja leka su obično posledica preosetljivosti; kao i neki slučajevi anemije, trombocitopenije ili agranulocitoze. Retko se razvija i vaskulitis po ponovljenom izlaganju leku (na pr. sulfonamidima, jodidima, penicilinu), i intersticijski nefritis (na pr. meticilin) i oštećenje jetre (na pr. halotan) koji su zabeleženi u uslovima koji govore o specifičnoj preosetljivosti.

Anafilaksa je najteži primer preosetljivosti na lek. Međutim, daleko najčešća reakcija na lek, je morbiliformni raš, opet nepoznate etiologije. Povišena temperatura i urtikarijske reakcije su isto relativno česte alergijske reakcije. Kada se serumi životinja koriste u terapiji, komplikacija je serumska bolest, ali danas se serum životinja retko koristi. Teški sindrom bolesti koja liči na serumsku, nepoznate petogeneze bez visokih nivoa cirkulišućih IgG antitela ali obično sa pratećim IgE antitelima može da se razvije, posebno sa lekovima kao što je penicilin.

Reakcije preosetljivosti na lekove zasnivaju se na sposobnosti proteina i lekova sa velikim polipeptidima sa stimuliraju produkciju specifičnog antitela direktnim imunološkim mehanizmima. Možda je najmanji molekul koji je potencijalno antigenski glukagon, s molekulskom težinom od oko 3500. Većina molekula lekova su znatno manji i ne mogu sami da budu antigeni. Međutim, kao hapteni, neki se kovalentno vezuju za proteine, pa dobijeni konjugati stimuliraju produkciju antitela specifičnog za taj lek. Taj lek ili neki njegov metabolit, hemijski je reaktivan sa proteinom. Vezivanje proteina u serumu, koje je zajedničko za mnoge lekove, daleko je slabije i nedovoljne snage da izazove antigenost.

Specifična imunološka reakcija utvrđena je samo za benzilpenicilin. Ovaj lek se ne vezuje dovoljno čvrsto za tkivne ili serumske proteine da bi se dobio antigenski kompleks, ali glavni produkt nejgovog raspada, benzilpenicileninska kisleina, može da se kombinuje sa tkivnim proteinima da se dobije benzilpeniciloil (BPO), glavna antigenska determinanta penicilina. Nekoliko manjih antigenskih determinanti se formira u relativno malim količinama mehanizmima koji su manje razjašnjeni. Reakcije preosetljivosti (I, II, III, IV) najčešće uključuju BPO determinantu. IgE antitela na manje determinante mogu, kod nekih pacijenta, biti odgovorne za anafilaksu and urtikariju. IgG antitela su pokazana za veće, ali ne za manje determinante. Ona mogu da deluju kao "blokirajuća antitela" na BPO, modifikujući ili čak sprečavajući reakciju na BPO, dok odsustvo blokirajućih IgG antitela na veće determinante može da objasni sposobnost tih determinanti da uzrokuju anafilaksu.

Svi polu-sintentski penicilini (na pr. amoksicilin, karbenicilin, tikarcilin) su potencijalno unakrsno reaktivni sa penicilinom, tako da pacijenti osetljivi na penicilin često reaguju i na njih. Unakrsne reakcije u manjoj meri nastaju sa cefalosporinima. Tretman sa cefalosporinom treba oprezno započeti ako je pacijent ranije već teže reagovao (na pr. anafilaksa) to penicillin.

Hematološke antitelom-posredovane (citotoksične, tip II) reakcije na lekove mogu da se razviju preko jednog od sledeća tri mehanizma: Kod penicilinom indukovane anemije, antitelo reaguje s haptenom, koji se čvrsto vezuje za membranu crvenih krvnih zrnaca, dovodeći do aglutinacije i povećane destrukcije crvenih krvnih zrnaca. Kod trombocitopenije izazvane stibofenom i kinidinom lek stvara jedan solubilni kompleks sa svojim specifičnim antitelom. Ovaj kompleks onda reaguje sa okolnim trombocitima (ciljne ćelije "nevini prolaznik") i aktivira komplement, koji ostaje sam na trombocitskoj membrani i dovodi do liziranja ćelije. Kod drugih hemolitičkih anemija, lek (na pr. metildopa) izgleda hemijski menja površinu crvenih krvnih zrnaca i tako otkriva antigen koji indukuje, a onda reguje sa autoantitelom, obično sa Rh.

Toksične-idiosionkratske i anafilaktičke reakcije su obično dovoljno specifične ili ili su vremenski određene tako da se krivac lako identifikuje. Reakcije tipa serumske bolesti su najčešće izazvane penicilinima, ali su povremeno odgovorni i sulfonamidi, hidralazin, sulfonilureja, ili tiazidi. Fotosensitizacije je karakteristična za hlorpromazin, neke antiseptike u sapunima, sulfonamidima, psoralen, demeklociklin i grizeofulvin. Treba ukinuti sve lekove osim onih koji su apsolutno neophodni. Kada se sumnja na groznicu izazvanu lekom, prekida se najsumnjiviji lek (na pr. alopurinol, penicilin, izoniazid, sulfonamidi, barbiturati, kinidin). Smanjenje groznice u roku od 48 sati snažno govori o tom leku. Kada je groznica praćena granulocitopenijom, farmakotoksičnost je verovatnija od alergije i ozbiljnija.

Alergijske pulmonarne reakcije na lekove su obično infiltrativne, sa eozinofilijom, i mogu ih izazvati, između ostalih, soli gvožđa, penicilini i sulfonamidi. Najčešći uzrok akutne infiltrativne pulmonarne reakcije je nitrofurantoin. Ovo je verovatno alergijski ali obično ne i eozinofilno.

Hepatičke reakcije may mogu biti prvenstveno holestatske (najčešće su uključeni fenotijazini i eritromicin estolat) ili hepatoćelijski (alopurinol, hidantoini, soli zlata, izoniazid, sulfonamidi, valproinska kiselina i mnogi drugi). Uobičajena alergijska bubrežna reakcija je intersticijski nefritis, najčešće zbog meticilina; implicirani su i drugi antimikrobni agensi i cimetidin.

Sindrom sličan sistemskom lupus eritematozusu može da izazove nekoliko lekova, najčešće hidralazin i prokainamid. Ovaj sindrom se vezuje za pozitivni test na antinuklearno antitelo i relativno je benigni, štedi bubrege i CNS. Penicilamin može da izazove SLE i druge autoimune bolesti, pre svih mijasteniju gravis.

Godine 1989, opisana je serumska aktivnost izazvana endotoksinom koja je idnukovala interferon-y (IFN-y) dobijen iz ćelije slezine miša (Nakamura et al., 1989). Ova serumska aktivnost nije bila direktni induktor IFN-y već više ko-stimulant uz IL-2 ili mitogene. Pokušaj da se prečisti ova aktivnost iz post-endotoksinskog seruma miša otkrila je naizgled homogeni 50-55 kDa protein. Budući da drugi citokini mogu da deluju kao ko-stimulanti za produkciju IFN-y, neuspeh neutralizujućih antitela na IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, ili TNF da neutralizuju serumsku aktivnost govori da je to bio jasan faktor. Godine 1995, isti naučnici su pokazali da endotoksinom izazvani ko-stimulant za produkciju IFN-y postoji u ekstraktima jetre miša prethodno kondicioniranog sa P. acnes (Okamura et al., 1995). U ovom modelu, populacija hepatičkih makrofaga (Kupferove ćelije) se šire, pa kod tih miševa, niska doza bakterijskih lipopolisaharida (LPS), koja nije letalna kod miševa koji nisu prethodno kondicionirani, postaje letalna. Ovaj faktor, nazvan IFN-y

-indukujući factor (IGIF) i kasnije određeni interleukin-18 (IL-18), prečišćen je do homogenosti od 1,200 grama jetre miševa tretiranih sa P.acnes. Degenerisani oligonukleotidi izvedeni iz amino kiselinskih sekvenci prečišćenog IL-18 korišćeni su za kloniranje mišjeg IL-18 cDNK. IL-18 je 18-19 kDa protein od 157 amino kiselina, koji nema jasne sličnosti ni sa jednim peptidom u bazi podataka. Glasničke RNK za IL-18 i interleukin-12 (IL-12) se lako otkrivaju u Kupferovim ćelijama i aktiviranim makrofagima. Rekombinantni IL-18 indukuje IFN-gama jače nego IL-12, očigledno drugim putem (Micallef et al., 1996). Isto kao endotoksinom indukovana serumska aktivnost, IL-18 ne indukuje IFN-y sam, već deluje prvenstveno kao ko-stimulant sa mitogenima ili IL-2. IL-18 pojačava proliferaciju T ćelija, očigledno putem koji zavisi od IL-2-i pojačava produkciju Th1 citokinain vitroi pokazuje sinergiju kada se kombinuje sa IL-12 u smislu pojačanja produkcije IFN-y (Maliszewski et al., 1990).

Pošto je kloniran mišji oblik, humana cDNK sekvenca za IL-18 objavljena je 1996 (Ushioetal., 1996).

Kloniranjem IL-18 i zahvaćenih tkiva i ispitivanjem iL-18 genske ekspresije, utvrđena je tesna povezanost ovog citokina sa autoimunom bolešću. Ne-gojazni dijabetični (NOD) miš spontano razvija autoimuni insulitis i dijabetes, koji se može ubrzati i sinhronizovati samo jednim ubrizgavanjem ciklofosfamida. IL-18 mRNK je pokazana reverznom transcriptazom PCR u NOD mišjem pankreasu tokom rane faze insulitisa. Nivoi IL-18 mRNK rastu brzo po tretmanu ciklofosfamidom i prethode porastu IFN-y mRNK, i potom dijabetesa. Zanimljivo je da ova kinetika podražava IL-12-p40 mRNK, što dovodi do tesne korelacije individualnih nivoa mRNK. Kloniranje IL-18 cDNK iz pankreasne RNK praćeno sekvenciranjem otkriva identičnost sa IL-18 sekvencom kloniranom iz Kupferovih ćelija iin vivoprethodno aktiviranih makrofaga. Isto tako, NOD mišji makrofagi reagovali su na ciklofosfamid sa IL-18 genskom ekspresijom dok makrofagi iz Balb/c miševa koji su paralelno tretirani nisu. Prema tome, IL-18 ekspresija je abnormalno regulisana kod autoimunih NOD miševa i tesno povezana sa razvojem dijabetesa (Rothe et al., 1997). IL-18 potencijalno igra ulogu u imunoregulaciji ili kod zapaljenja pojačavajući funkcionalnu aktivnost Fas liganda na Th1 ćelije (Conti et al., 1997). IL-18 se eksprimira i u adrenalnoj kori i, stoga, može da bude sekretovani neuro-imunomodulator, igrajući važnu ulogu u orkestraciji imunog sistema po satresogenom iskustvu (Chater, 1986).

In vivo,IL-18 se formira cepanjem pro-IL-18, a njegova endogena aktivnost izgleda objašnjava produkciju IFN-y u P. acnes i LPS-posredovanu smrtnost. Zreli IL-18 se produkuje od svog prekursora pomoću JL-1 p konvertujućeg enzima (IL-1beta-konvertujući enzim, ICE, kaspaza-1). IL-18 receptor se sastoji od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja IL-18 visokog i niskog afiniteta naćene su u mišjim IL-12 stimulisanim T ćelijama (Yoshimoto et al., 1998), što govori o multiplom lančanom receptorskom kompleksu. Dve receptorske podjedinice su do sada identifikovane, i obe pripadaju porodici IL-1 receptora (Parnet et al., 1996). Tansdukcija signala IL-18 uključuje aktivaciju NF-kB (DiDonato et al., 1997).

Nedavno je iz humanog urina izolovan jedan solubilni protein visokog afiniteta za IL-18, a opisane su i humana i mišja cDNK (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Ovaj protein je opisan kao IL-18 vezujući protein (IL-18BP). IL-18BP nije ekstraćelijski domen nekog od poznatih IL18 receptora, već sekretovani, prirodno cirkulišući protein. On pripada novoj porodici sekretovanih proteina. Ova porodica dalje uključuje nekoliko Poxvirus-enkodiranih proteina koji imaju visoku homoiogiju za iL-18BP (Novick et ai., 1999). iL-18BP se konstitutivno eksprimira u slezini, pripada superporodici imunoglobulina i ima ograničenu homoiogiju za IL-1 tip II receptor. Njegov gen je lokalizovan na humanom hromozomu 11q13, i nije utvrđeno eksonsko kodiranje za transmembranski domen u 8.3 kb genomskoj sekvenci (Novick et al., 1999).

Četiri humana i dva mišja izoforma IL-18BP, koji proističu iz nadovezivanja mRNK, i koji su nađeni u raznim bibliotekama cDNK i eksprimirani su, prečišćeni i procenjeni na vezivanje i neutralizaciju IL-18 bioloških aktivnosti (Kim et al., 2000). Izoforma humanog IL-18BP (IL-18BPa) ispoljava najveći afinitet za IL-18 sa brzim početkom i sporim prestankom dejstva, i konstantom disocijacije (K(d)) od 399 pM. IL-18BPc deli Ig domen IL-18BPa osim za 29 C-terminalne amino kiseline; K(d) za IL-18BPc je 10 puta manji (2.94 nM). Ipak, IL-18BPa i IL-18BPc neutralizuju IL-18 >95% pri molarnom višku od dva. IL-18BPb i IL-18BPd izoforme nemaju potpuni Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutralizuju IL-18. Mišji IL-18BPc i IL-18BPd izoforme, koje imaju identični Ig domen, neutralizuju >95% mišjeg IL-18 pri molarnom višku od dva. Međutim, mišji IL-18BPd, koji ima zajednički C-terminalni motiv sa humanim IL-18BPa, takođe neutralizuje humani IL-18. Molekularno modelovanje identifikuje veliko mešano elektrostatsko i hidrofobno mesto vezivanja u Ig domenu IL-18BP, što može da objasni visoki afinitet vezivanja za ligand (Kim et al., 2000),

Godine 1998, sugerisano je da je ekspresija interleukina-18 (IL-18) uključena u patogenezu mišje kontaktne preosetljivosti (Xu et al., 1998). Xu et al. Su koristili mišji model kontaktne preosetljivosti sa oksazolonom kao kontaktnim alergenom i pokazali indukciju IL-18 ekspresije kod kožnih lezija. Najveća ushodna regulacija utvrđena je 24 sata po provokaciji alergenom, a onda je IL-18 ekspresija postepeno opadana

Potom je i Kitching et al., 2000 objavio da IL-18 indukuje DTH odgovor nezavisno od IL-18. Međutim, uloga IL-18 je ostala nejasna budući da je zabeleženo da i sam IL-18 može da bude potencijalno delotvorna terapija za pacijente sa atopijskim dermatitisom (Habu et al., 2001), što je u skladu sa nekoliko kliničkih studija koje ukazuju na to da IFN-y ublažava simptome atopijskog dermatitisa (Reinhold et al., 1990; Hanifin et al., 1993).

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da tretman miševa inhibitorima IL-18 u modelu tip IV preosetljivosti dovodi do ublažavanja reakcije preosetljivosti kod tih u odnosu na kontrolne životinje as. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnjz leka za tretman i/ili prevenciju poremećaja preosetljivosti. Korišćenje kombinacija IL-18 inhibitora sa interferonom i/ili inhibitorom TNF i/ili inhibitorima zapaljenja i/ili anti-alergijskih lekova su takođe mogući, u skladu sa ovim pronalaskom. U dodatnom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja IL-18 inhibitora za lečenje i/ili prevenciju uslova preosetljivosti. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje ćelije genetski manipulisane da eksprimiraju IL-18 inhibitore za prevenciju i/ili tretman poremećaja preosetljivosti.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 pokazuje da tretman sa IL-18BP tokom provokacije štiti od kontaktne preosetljivosti (CHS). Miševi su senzitivisani sa DNFB po leđima na dan 0 a provocirani pet dana kasnije po ušima. Otok ušiju meren je svakodnevno i izražavan kao povećanje otoka na uhu DNFB u poređenju sa kontrolnom tretiranim placebom. Tretman sa 250 p.g IL-18BP i.p. po mišu dnevno na dan 5 do dana 8 značajno je smanjilo otok uha (A), dok tretman na dane 0 do 2 nije imamo zaštitno dejstvo u ovim eksperimentalnim uslovima (B) (n = 5 miševa po grupi). Kvadratići: IL18BP tretirani miševi, Trouglovi: kontrola, t.j. životinje tretirane fiziološkim rastvorom.

Slika 2 pokazuje obim otok uha od dana 5 do 30 posle prve provokacije haptenom na dan 5 i druge provokacije na dan 19 u modelu odloženog tipa preosetljivosti sa sistemskom administracijom 250 u.g/miš/daan IL-18BP (prazni kvadrati) ili placeba (puni kvadrati) od dana 19 do 22.

Slika 3 pokazuje da IL-18BP štiti od CHS neutralizujući IL-18. IL-18 deficijentni (KO) i divlji tip C57BL/6 miševa su poređeni po sposobnosti da daju CHS odgovor. IL-18 deficijentni miševi razvijaju CHS na DNFB, iako manje izraženo nego divlji tip

miša. Međutim, nikakvo dejstvo IL-18BP nije zabeleženo kod IL-18BP deficijentnih miševa, što govori da je antizapaljenski efekat IL-18BP u CHS posledica neutralizacije IL-18. (n = 5 miševa o grupi). Krugovi: Fiziološki rastvor kod iL-18 KO miševa; rombovi: iL-18BP kod IL-18 KO miševa; kvadrati: IL-18BP kod divljeg tipa miševa (WT); trouglovi: fiziološki rastvor kod WT miševa.

Slika 4 pokazuje da IL-18BP ne smanjuje vaskularno curenje tokom CHS. CHS je indukovan kod C57BL/6 miševa. Da bi se pratio edem izazvan CHS reakcijom, Evans plavo je ubrizgano i.v. 2 h pre provokacije DNFB. Miševi su žrtvovani 24h kasnije, a uši su obrađene da se ekstrahuje boja koja je iscurila iz vaskulature i nagomilala se u okolnom tkivu. Vaskularno curenje je procenjeno kao količina boje po mg suvog tkiva uha korigovana za koncentraciju Evans plavog u serumu i izraženo kao odnos provociranog i kontrolnog uha. Dok je primena IL-18BP dana 4 i 5 smanjila otok za 56% u odnosu na kontrolu tretiranu placebom (leva slika, p < 0.01), nije bilo značajne razlika u vaskularnom curenju između ove dve grupe. Obe grupe su pokazale značajno povećani edem u poređenju sa nesenzitivisanom kontrolnom grupom (p < 0.05 and p < 0.01). Kao dodatna kontrola, miševi su tretirani sa 250|ag irelevantnog proteina BSA po životinji dnevno. Ovi miševi su razvili CHS kao i kontrolne životinje tretirane placebom. (n = 10 miševa po grupi)

Slika 5 IL-18BP tretman smanjuje zapaljensku infiltraciju uha provociranog sa DNFB.

CHS je indukovan kod miševa C57BL/6 kao što je opisano. Životinje su tretirane ili sa IL-18BP ili placebom dana 4 do 6. Tretman IL-18BP je smanjio otok na 58% u odnosu na kontrolnu sa placebom do dana 7. Miševi su žrtvovani na dan 7, provocirane uši su prikupljene, spajane po grupama (n = 8) i digestirane enzimom da se dobiju suspenzije jednih ćelija. Ćelije su se odlikovale naknadnom analizom FACS gde su se dobijale pozitivne žive CD45 ćelije. Broj apT ćelija, NK ćelija, neutrofila i monocita / makrofaga nađen u preparatima ušiju izražen je kao procenat ukupnih analiziranih ćelija (gornje vrednosti). Smanjenje ovih tipova ćelija posle IL-18BP tretmana u odnosu na kontrolu sa placebom dato je na donjim ciframa.

Slika 6 pokazuje da je aktivacija T ćelija oslabljena po IL-18BP tretmanu. Ćelije dobijene od ušiju provociranih sa DNFB ponovo su stimulisane sa 2 x 10<5>po udubljenju anti-CD3 antitelom vezanim za ploču. IL-18BP više nije dodavan tokom narednog perioda od t 24h u kulturi. Produkcija IFNy je merena u triplikatu pomoću ELISA. Ćelije dobijene od miševa tretiranim IL-18BP dale su samo 45% od IFNy nađenog u kulturama ćelija kontrolnih životinja tretiranih placebom.

Slika 7 pokazuje da tretman IL-18BP smanjuje broj ćelija koje produkuju IFNy u zapaljenskom infiltratu uha. Preparati ćelija iz uha provociranog sa DNFB stimulisani su sa 50 ng/ml PMA<*>i 500 ng/ml lonomicina tokom 4h. Sekrecija citokina blokirana je dodatkom 2fxg/ml brefeldina A tokom najmanje 2 h inkubacije. Ćelije su onda podvrgnute multikolor imunofluorescentnom prebojavanju na intraćelijski IFNy i površinske antigene. Ovaj IL-18BP tretman je smanjio ukupan broj ćelija pozitivnih na IFNy prebojavanje do 78% placebo kontrole. IFNy su produkovale CD8 T ćelije i u manjoj meri CD4 T ćelije. Nimalo IFNy nije detektovano u NK ćelijama niti a(3T ćelijama, (n.d., nije detektovano;<*>Forbol 12-Miristat 13-Acetat)

Slika 8: IL-18BP tretman ne slabi regrutovanje Langerhansovih ćelija do drenažnog limfnog čvora. Miševi su bojeni hapten FITC ili placebom aceton / dibutilftalatom (1:1) na desni, odnosno levi bok. Ingvinalni limfni čvorovi su pokupljeni 24h po bojenju. Haptenom konjugovane Langerhansove ćelije moge su se detektovati pomoću FACS kao FITC+, CD11c+ ćelije u limfnom čvoru koji drenira FITC bojeni bok, ali ne i u kontralateralnom limfnom čvoru koji drenira bok bojen samo placebom. Procenat haptena u Langerhansovim ćelijama u drenažnom limfnom čvoru bio je 1.2% ukupnih ćelija limfnih čvorova kod životinja tretiranih sa IL-18BP 24h i 1h pre bojenja. Ovo se nije signifikantno razlikovalo od broja dobijenog kod kontrolnih životinja, (n = 5 drenažnih limfnih čvorova po grupi)

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu da IL-18 inhibitor ima korisno dejstvo na oporavak od haptenske provokacije na mišjem modelu za preosetljivost tipa IV.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na korišćenju IL-18 inhibitora za proizvodnju leka za tretman i/ili prevenciju poremećaja preosetljivosti.

U kontekstu ovog pronalaska, izrazi "poremećaj preosetljivosti" i "alergijski poremećaj" koriste se kao sinonimi. Oba izraza se koriste za poremećaje ili reakcije izazvane neodgovarajućim adaptivnim imunološkim odgovorom. Reakcije preosetljivosti su posledica normalno korisnog imunološkog odgovora delujući neodgovarajuće na strane antigene, kao što su na pr. obično makromolekuli u životnoj sredini, što može da dovede do zapaljenske reakcije i oštećenja tkiva. Kod poremećaja preosetljivosti, jedan normalno bezopasan stimulus, alergen, pokreće imunološki odgovor, koji po ponovnom izlaganju, biva reaktiviran da se generiše patološko oštećenje.

Poremećaj preosetljivosti, kao i njegovi klinički simptomi i implikacije, detaljno su opisani u „Prikazu pronalaska" i upotrebe u skladu sa pronalaskom odnosi se na, ali se ne ograničava na, poremećaj preosetljivosti koji su pomenuti ovde.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, poremećaj preosetljivosti je odabran iz grupe koja se sastoji od poremećaja sa tip I reakcijom preosetljivosti, poremećaja sa tip II reakcijom preosetljivosti, poremećaja sa tip III reakcijom preosetljivosti ili poremećaja sa tip IV reakcijom preosetljivosti.

Poremećaji sa tip I preosetljivosti se nazivaju i neposredna preosetljivost ili obična alergija. Ova preosetljivost je IgE-posredovana. Reakcije neposredne preosetljivosti (tip I) su posledica vezivanja antigena i IgE na mast ćelije ili bazofile. U okviru značenja poremećaja sa tipom I reakcije preosetljivosti nalaze se i atopijske bolesti, kao što su, ali ne ograničavajući se na alergijski rinitis, alergijske konjunktivitis, atopijski dermatitis, alergijske ekstrinzične astme, urtikarija, sistemska anafilaksa. Anafilaksa je teška, po život opasna alergijska reakcija usled tipa I (neposredne) preosetljivosti.

Tip il ili citotoksična preosetljivost uključuje citolitička dejstva posredovana antitelom, komplementom, i/ili ćelijskim mehanizmima. Antitelo na antigen vezan za ćeliju (tip II) dovodi do destrukcije ćelije aktivacijom komplementa ili unapređenjem fagocitoze. Poremećaji sa tipom II preosetljivosti u okviru ovog pronalaska obuhvataju na pr. Kumbs-pozitivnu hemolitičku anemiju, antitelom-indukovanu trombocitopenijsku purpuru, leukopeniju, pemfigus, pemfigoid, Gudpasturov sindrom, i pernicioznu anemiju. Ove reakcije mogu da nastanu kod pacijenata koji primaju nekompatiblne transfuzije, kod hemolitičke bolesti novorođenčeta, i kod neonatalne trombocitopenije, a mogu da igraju i ulogu kod multisistemskih bolesti preosetljivosti (na pr. sistemski lupus eritematozus, SLE), na primer.

Poremećaji sa tipom III preosetljivosti uključuju reakcije kod kojih antitela formiraju imune komplekse sa antigenom. Cirkulišući kompleksi aktiviraju komplement, spajaju se za crvena krvna zrnca, koja se onda fagocituju u slezini, napuštaju cirkulaciju i pokreću zapaljenje u tkivnim prostorima. Ova reakcija se naziva Artus reakcija. Alternativno, kompleksi se fagocituju od strane makrofaga koji imaju antigen, oslobađaju citokine i aktiviraju B i T-ćelije. IgE, IgA, IgG, i IgM svi stvaraju kompleksi sa antigenom. Tip III reakcije generalno potiču od depozita imunih kompleksa u tkivima, posebno u koži, zglobovima i bubrezima. Hronični imuni kompleks nefritis je odgovran za najveći broj slučajeva glomerulonefritisa kod ljudi. U skladu sa ovim pronalaskom, poremećaj preosetljivosti tip III obuhvata na pr. serumsku bolest zbog antigena seruma, lekova, ili virusnog hepatitisa; SLE; reumatoidni arthritis (RA); poliarteritis; krioglobulinemia; pneumonitis zbog preosetljivosti; bronhopulmonarna aspergiloza; akutni glomerulonefritis; hronični membranoproliferativni glomerulonefritis; i prateće bubrežne bolesti.

Poremećaji sa tipom IV preosetljivosti uključuju ćelijski posredovane reakcije i generalno im je potpebno više od 12 sati da se razviju. Tip IV poremećaja preosetljivosti može da uključi zapaljenje, pa rezultat može biti hronična zapaljenska bolest. Tip IV preosetljivosti se naziva i odloženi tip preosetljivosti ili DTH. Kada se T-ćelije jednom senzitizuju primarnim izlaganjem, sekundarna provokacija je praćena odloženim tipom reakcije preosetljivosti. Ova reakcija je lokalni zapaljenski odgovor, kome je ponekad potrebno 2-3 dana da se klinički razvije.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, poremećaj preosetljivosti je odloženi tip preosetljivosti. Prema tome, ovaj pronalazak se uglavnom odnosi na sva klinička stanja u kojima su važne tip IV reakcije, kao što su odloženi tip kontaktne preosetljivosti, dermatitis, kontaktni dermatitis, pneumonitis preosetljivosti, odbacivanje alografta, granulomi zbog intraćelijskih organizama, neki oblici osetljivosrti na lekove, tiroiditis, i encefalomijelitis po vakcini protiv besnila.

DTH može da proistekne iz normalnog ćelijski posredovanog imunološkog odgovora na infekcije virusima, gljivicama i nekim bakterijama, pre svih Mvcobacterium tuberculosis i Mvcobacterium leprae. Dodatni spoljašnji agensi koji izazivaju DTH mogu biti biljni, životinjski, insektni ili reptilni sekreti, hemijski ili biohemijski antigeni. Oni se mogu izvoditi iz sintetskih ili prirodnih izvora. I razne vrste vlakana, tkanina i slično, kao što je lateks, koji se koristi za hirurške rukavice, mogu da dovedu do T-ćelijski posredovane reakcije preosetljivost kod nekih ljudi. Spoljašnji agensi koji ovo mogu da provociraju mogu biti iz vode, kao što su rastvorene soliu i minerali, koji se sreću, na primer u prirodi, ili u rudarstvu, metalurgiji i hemijskoj proizvodnji.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, poremećaj preosetljivosti je kontaktni dermatitis ili kontaktna preosetljivost. Kontaktni dermatitis, takođe tip IV reakcija, jeste reakcija na profesionalne i druge antigene. Agensi koji izazivaju kontaktni dermatitis su obično relativno niske molekulske težine (< 1 kD) i nisu po sebi imunogeni, umesto toga, oni su visoko reaktivni molekuli koji se vezuju kovalentno za kožu i tkivne proteine. Senzitizujuća hemikalija je hapten, a protein domaćina je kombinuje sa onim što se naziva nosač. Poznati su mnogi hapteni koji izazivaju kontaktni dermatitis. Da bi se utvrdilo da li će neko da razvije kontaktni dermatitis protiv date senzitizujuće supstance, sumnjivi kontaktni sensitizer se nanosi na leđa pacijenta i pokriva se u trajanju od 48 sati. Mesto reakcije se kontroliše posle 2 i 24 sata. Kada je odgovor pozitivan, imamo zapaljenje i induraciju na testiranom mestu.

Odloženi tip preosetljivosti je i ključni mehanizam koji određuje odbacivanje transplantiranih test organa, pa se tako pronalazak dalje odnosi na upotrebu IL-18 inhibitora za prevenciju odbacivanja grafta.

Izraz "inhibitor IL-18" u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svaki molekul koji modulira IL-18 produkciju i/ili akciju na takav način da IL-18 produkcija i/ili akcija bude ublažena, smanjena ili delimično, supstancijalno ili potpuno sprečena ili blokirana. Izraz "IL-18 inhibitor" treba da obuhvati inhibitore produkcije IL-18 kao i inhibitore akcije IL-18.

Inhibitor produkcije može biti svaki molekul koji negativno utiče na sintezu, obradu ili sazrevanje IL-18. Inhibitori koji se uzimaju u obzir po ovom pronalasku mogu biti, na primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisens mRNK koja smanjuje ili sprečava transkripciju IL-18 mRNK ili dovodi do degradacije mRNK, proteini koji slabe ispravno nabiranje, ili delimično ili supstancijalno sprečavaju sekreciju IL-18, proteaze koje degradiraju IL-18, kada se jednom sintetizuje, inhibitore proteaze koja čepa pro-IL-18 da se generišu zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspaze-1, i slično.

Inhibitor dejstva IL-18 može da bude, na primer, IL-18 antagonist. Antagonisti mogu da se vezuju za ili da sekvestriraju sam IL-18 molekul dovoljnim afinitetom i specifičnošču da delimično ili supstancijalno neutralizuju mesta vezivanja IL-18 ili IL-18 odgovorna za vezivanje IL-18 za njegove ligande (kao, na pr. za svoje receptore). Jedan antagonist može da inhibira i IL-18 signalni put, koji je aktiviran u okviru ćelije povezivanju IL-18/za receptor.

Inhibitori dejstva IL-18 mogu biti i rastvorljivi IL-18 receptori ili molekuli koji imitiraju ove receptore, ili agensi koji blokiraju ove IL-18 receptore, ili IL-18 antitela, kao što su poliklonska ili monoklonska antitela, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za ciljeve, i na taj način umanjuje ili sprečava pokretanje intra-ili ekstraćelijske reakcije posredovane prekolL-18.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se odabira od inhibitora kaspaze-1 (ICE), antitela usmerenog protiv IL-18, antitela usmerenog protiv svih IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujićih proteina, izoforma, muteina, fuziranih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili njihovih cirkularlno permutovanih derivata koji imaju istu aktivnost.

Izraz "IL-18 vezujući proteini" kao sinonim sa "IL-18 vezujući protein" ili "IL18BP". On obuhvata IL-18 vezujuće proteine kako su definisani u WO 99/09063 ili kod Novick et al., 1999, uključujući nadovezane varijante i/ili izoforme IL-18 vezujućih proteina, kako je to definisano kod Kim et al., 2000, koji se vezuje za IL-18. Pre svega, humane izoforme a i c IL-18BP su korisne u skladu sa ovim pronalaskom. Proteini koji su korisni u skladu u skladu sa ovim pronalaskom mogi biti glikozilirani ili ne-glikozilirani, mogu biti dobijeni iz prirodnih izvora, ako što je urin, ili mogu, po mogućstvu, da se proizvedu rekombinantno. Rekombinantna ekspresija može da se sprovede u prokariotskim ssitemima ekspresije kao što je E. coli, ili u eukariotskim, i po mogućstvu u sisarskim sistemima ekspresije.

U smislu u kome se ovde koristi, izraz "muteini" se odnosi na analoge IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP, u kome jedan ili više amino kiselinskih ostataka prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP bude zamenjeno drugim amino kiselinskim ostacima, ili se delecira, ili se jedan ili više amino kiselinskih ostataka dodaje prirodnoj sekvenci IL-18BP, ili virusnom IL-18BP, ne menjajući značajno aktivnost dobijenog proizvoda u poređenju sa divljim tipom IL-18BP ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikom mutageneze usmerenom na mesto, ili ma kojom drugom podobnom tehnikom.

Muteini u skladu sa ovim pronalaskom uključuju proteine enkodirane nukleinskom kiselinom kao što je DNK ili RNK, koji hibridizuju do DNK ili RNK, što enkodira IL-18BP ili enkodira virusni IL-18BP, u skladu sa ovim pronalakom, pod strogim uslovima. Izraz "strogi uslovi" odnosi se na hibridizaciju i uslove". Vidi Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology(Tekući protokoli u molekularnoj biologiji), supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), i Sambrook et al., supra. Bez ograničenja, primeri strogih uslovi uključuju uslove pranja 12-20°C ispod izračunate Tm hibrida koji se ispituje u,na pr.,2 x SSC i 0.5% SDS tokom 5 minuta, 2 x SSC i 0.1% SDS tokom 15 minuta; 0.1 x SSC i 0.5% SDS na 37°C tokom 30-60 minuta i onda, n 1 v QQP<i>n Cn5 na fifi°r* f«''''"""« ^n.«n minuta<O>n<i>tniirna i<* n\/n etnikaZna'U da se strogost uslova određuje i dužinom DNK sekvenci, oligonukleotidnih proba (kao što je 10-40 baza) ili mešanim oligonukleotidnim probama. Ako se koriste mešane probe, preporučuje se da se koristi tetrametil amonijum hloride (TMAC) umesto SSC. Vidi Ausubel, supra.

Identičnost oslikava odnos između dve ili više polipeptidnih sekvenci ili dve ili više polinukleotidnih sekvenci, određeno poređenjem tih sekvenci. Generalno, identičnost se odnosi na tačnu korespodenciju nukleotid prema nukleotidu ili amino kiselina prema amino kiselini kada se radi o dve polinukleotidne ili dve polipeptidne sekvence, po celoj dužini sekvence koja se poredi.

Za sekvence gde ne postoji tačna korespodencija, može se odrediti "% identičnosti". U principu, dve sekvence koje se porede se stave jedna pred druge da se dobije maksimalna korelacija između sekvenci. Ovo može da uključi i inserciju "praznih mesta" u bilo jednoj ili obe sekvence, da se pojača stepen sličnosti. Procenat % identičnosti se može odrediti za celu dužinu sekvenci koje se porede (takozvano globalno poređenje), što je posebno pogodno za sekvence iste ili vrlo slične dužine, ili za kraće, definisane dužine (takozvano lokalno poređenje), koje je pogodnije za sekvence nejednake dužine.

Metode za poređenje identičnosti i homologije dve ili više sekvenci dobro su poznate u struci. Tako na primer, programi koji postoje u paketu za analizu VVisconsin Sekvence Analvsis Package, verzija 9.1 (Devereux J et al., 1984), na primer programi BESTFIT i GAP, mogu da se koriste da se dobije % identičnosti između dva polinukleotida i % identičnosti i % homologije između dve polipeptidne sekvence. BESTFIT koristi algoritam "lokalne homologije" Smitha i VVatermana (1981) i nalazi najbolji pojedinačni region sličnosti između dve sekvence. Drugi programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvenci poznatisu u struci, na primer porodica programa BI_AST (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, dostupno preko Interneta na adresi NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Svaki takav mutein po mogućstvu ima sekvencu amino kiseline dovoljno duplikativnu u odnosu na IL-18BP, ili dovoljno duplikcativnu u odnosu na virusni IL-18BP, tako da ima suštinski istu aktivnost kao i IL-18BP. Jedna aktivnost IL-18BP je njegova sposobnost da vezuje IL-18. Sve dok taj mutein ima supstancijainu vezujuću aktivnost za IL-18, može se koristiti za prečišćevanje IL-18, na primer pomoću afinitetne hromatografije, i na taj način se može smatrati da ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP pomoću rutinskih eksperimenata koji podrazumevaju da se takav mutein podvrgne, na pr., prostom eseju sendvič kompeticije da se odredi da li se ili ne on vezuje za odgovarajuće obeleženi IL-18, kao što je radioimunoesej ili ELISA esej.

U preporučenom obliku, svaki takav mutein ima najmanje 40% identičnosti ili homologije sa sakvencom bilo IL-18BP ili virusno enkodiranog IL-18BP homologa, kako je to definisano kod WO 99/09063. Još bolje, ima najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili, što je najbolje, najmanje 90% identičnosti ili homologije sa istim.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnog IL-18BPs, koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom, ili nukleinska kiselina koja kodira za njih, uključuje konačni skup supstancijalno korespondirajućih sekvenci kao supstitucionih peptida ili polinukleotida koje rutinski može da dobije stručnjak za ovu oblast, bez nepotrebnog eksperimentisanja, na osnovu uputstava i znanja iznetih ovde.

Preporučene promene za muteine u skladu sa ovim pronalakom su ono što se naziva "konzervativnim" supstitucijama. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnih IL-18BP, mogu da uključe sinonimne amino kiseline u okviru grupe koja ima dovoljno slične fizikohemijske osobine da supstitucija između članova grupe čuva biološku funkciju tog molekula (Grantham, 1974). Jasno je da insercije i delecije amino kiselina mogu da se naprave i u gore pomenutim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako te insercije ili delecije uključuju samo nekoliko amino kiselina, na pr., manje od trideset, ili još bolje manje od deset, i ne uklanja, niti pomera amino kiseline koje su ključne za funkcionalnu konformaciju, na pr., cisteinske reziduume. Proteini i muteini koji su proizvedeni takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u okvir ovog pronalaska.

Po mogućstvu, sinonimne amino kiselinske grupe su one definisane na Tabeli 1. Još bolje, sinonimne amino kiselinske grupe su one definisane na Tabeli 2; i najbolje, sinonimne amino kiselinske grupe su one definisane na Tabeli 3.

Primeri produkcije amino kiselinskih supstitucija u proteinima koji se mogu koristiti za dobijanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnog IL-18BPs, za upotrebu u ovom pronalasku uključuju sve poznate korake metoda, kako su prikazani u patentima SAD 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, na ime Mark et al; 5,116,943 na ime Koths et al., 4,965,195 na ime Namen et al; 4,879,111 na ime Chong et al; i 5,017,691 na ime Lee et al; i lizinom zamenjeni proteini prikazani u patentima SAD No. 4,904,584 (Shaw et al).

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili virusni IL-18BP, ili mutein ili njegov fragment, fuziran sa drugim proteinom, koji, na pr., ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. IL-18BP ili virusni IL-18BP, mogu tako biti fuzirani za drugi protein, polipeptid ili slično, na pr., imunoglobulin ili njegov fragment.

"Funkcionalni derivati" kako se ovde koriste obuhvataju derivate IL-18BPs ili virusni IL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji se mogu pripremati od funkcionalnig grupa koje nastaju na bočnim lancima na reziduumima ili N- ili C-terminalnim grupama, načinima poznatim u struci, i oni su uključeni u ovaj pronalazak sve dok su farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost proteina koja je supstancijalno ista kao i aktivnost IL-18BP, ili virusnih IL-18BP, i ne donosi toksična svojstva sastavima u koje ulazi.

Ovi derivati mogu, na primer, uključuju polietilen glikol bočne lance, koji mogu da maskiraju antigenska mesta i proširuju boravak IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim tečnostima. Ostali derivati uključuju alifatične estre karboksilnih grupa, amide karboksilnih grupa reakcijom sa amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih amino grupa amino kiselinskih ostataka formirani sa acil sredinama (na pr. alkanoil ili karbocikličnim aroil grupama) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer seril ili treonil ostataka) formirani sa acil sredinama.

Kao "aktivne frakcije" IL-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteini i fuzirani proteini, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnog lanca samog proteinskog molekula ili zajedno sa povezanim molekulima ili ostacima vezanim za njih, na pr., šećerni ili fosfatni ostaci, ili agregati proteinskog molekula ili šećerni ostaci sami, pod uslovom da pomenuta frakcija ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP.

Izraz "soli" ovde se odnosi i na soli karboksilne grupe i na kiseli dodatak soli amino grupa IL-18 inhibitornog molekula, ili njihove analoge. Soli karboksilne grupe mogu se oformiti načinima poznatim u struci i uključuju neorganske soli, na primer, natrijumove, kalciumove, amonijumove, gvožđe ili cinkove soli, i slično, kao i soli sa organskim bazama kao što su one formirane, na primer, sa aminima, kao što su trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. Soli sa kiselim dodatkom čine, na primer, soli sa mineralnim kiselinama, kao što su, na primer, hlorovodonična kiselina ili sumporna kiselina, i soli sa organskim kiselinama, kao što su, na primer, sirćetna kiselina ili oksalna kiselina. Naravno, svaka takva so mora da zadrži biološku aktivnost IL-18 inhibitora relevantnu za ovaj pronalazakkao što je, na primer, vršenje korisnog dejstva na DHT.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je jedno IL-18 antitelo. Anti-IL-18 antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerička, humanizovana, ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihovi fragmenti se odlikuju visokim afinitetom vezivanja za IL-18in vivoi niskom toksičnošću. Antitela koja se mogu koristiti za ovaj pronalazak odlikuju se sposobnošću da se tretiraju pacijenti tokom perioda dovodljno dugog da se dobije dobra do odlična regresija ili ublažavanje patogenog stanja ili ma kog simptoma ili grupe simptoma koji se odnose na patogeno stanje i niskom toksičnošću.

Neutralizujuća antitela se lako izazivaju kod životinja kao što su zec, koza ili miševi imunizacijom sa IL-18. Imunizovani miševi su posebno korisni za izvor B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se za uzvrat gaje da proizvedu velike količine anti-IL-18 monoklonskih antitela.

Himerska antitela su imunoglobulinski molekuli koji se odlikuju sa dva ili više segmenata ili delova izvedenih iz različitih životinjskih vrsta. Generalno, promenljivi region himerskog antitela izvodi se iz ne-humanog antitela sisara, kao što je mišje monoklonsko antitelo, i imunoglobulinski konstantni region se izvodi iz humanog imunoglobulinskog molekula. Po mogućstvu, oba regiona i kombinacija imaju nisku imunogenost koja se rutinski određuje (Elliott et al., 1994). Humanizovana antitela su imunoglobulinski molekuli koji su stvoreni tehnikama genetskog inženjeringa u kojima su mišji konstantni regioni zamenjeni humanim odgovarajućim regionima dok su zadržavali mišje regione za vezivanje antigena. Dobijeno mišje-humano himersko antitelo po mogućstvu ima smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (Knight et al., 1993).

Prema tome, u još jednom preporučenom obliku, IL-18 antitelo je humanizovano II. 1R antitpln Pnannri if^oni nrimori hi imanj^m/anih anti.ll _1 ft antitola nnicani cn na primer, u Evropskoj patentnoj prijavi (European Patent Application) EP 0 974 600.

U još jednom preporučenom obliku, IL-18 antitelo je potpuno humano. Tehnologija za proizvodnju humanih antitela detaljno je opisana na pr. u VVO00/76310, VVO99/53049, US 6,162,963 ili AU5336100. Potpuno humana antitela su rekombinantna antitela, po mogućstvu proizvedena u transgenim životinjama, na pr. ksenomiševima, i obuhvataju sve ili delove funkcionalnih lokusa humanih imunoglobulina.

U visoko preporučenom obliku, ovog pronalaska inhibitor IL-18 je IL-18BP, ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutovani derivat istih. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18, i po mogućstvu u suštini imaju najmanje jednu aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, ovakvi proteini imaju pojačanu biološku aktivnost u poređenju sa neizmenjenim IL-18BP. Preporučene aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja nego aktivnost IL-18BP, ili koja ima druge prednosti, kao što je bolja stabilnost ili niska toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvesti u velikim količinama, ili ih je lakše pročistiti.

Sekvence IL-18BP i njihove nastavljene varijante/izoforme mogu se uzeti iz VVO99/09063 ili od Novick et al., 1999, kao i od Kim et al., 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu biti konjugovani u polimere da bi se poboljšala svojstva proteina, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, tolerancija u telu čoveka ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj, IL18-BP može biti povezan za na pr. polietilenglikol (PEG). PEGilacija može da se obavi poznatim metodama, koje su opisane, na primer, u WO 92/13095.

Prema tome, u preporučenom obliku, funkcionalni derivati obuhvataju najmanje jednu sredinu vezanu za jednu ili više funkcionalnih grupa, koje nastaju kao jedna ili više bočnih lanaca na amino kiselinskim ostacima. Prednost se daje jednom obliku u kome je ta sredina polietilen glikolna (PEG) sredina.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 obuhvata spajanje imunoglobulina, t.j. inhibitor IL-18 je jedan fuzirani protein koji obuhvata sve ili deo IL-18 vezujućeg proteina, koji je fuziran za ceo ili za deo jednog imunoglobulina. Metode za pravljenje imunoglobulinskih fuzionih proteina dobro su poznate u struci, kao što su one opisani, na primer, u WO 01/03737. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti da resultujući fuzioni protein ovog pronalaska zadržava biološku aktivnost IL-18BP, pre svega u vezivanju za IL-18. Ova fuzija može biti direktna, ili preko kratkog linkerskog peptida koji može biti sasvim kratak, odnosno od 1 do 3 amino kiselinska ostatka dužine, ili duži, na primer, 13 amino kiselinskih ostataka dužine. Pomenuti linker može biti tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili 13-amino kiselinska linkerska sekvenca koja obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koji se uvode između IL-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultujući fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što su produženi boravak u telesnim tečnostima (polu-život), povećanu specifičnu aktivnost, povišeni nivo ekspresije, ili se olakšava fuzija proteina.

U preporučenom obliku, IL-18BP je fuziran za konstantni region jednog Ig molekula. Po mogućstvu, on je fuziran za regione teških lanaca, kao CH2 i CH3 domeni humanog lgG1, na primer. Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji obuhvataju IL-18BP i deo imunoglobulina opisani su u primeru 11 u WO 99/09063, na primer. Drugi izoformi Ig molekula su takođe pogodni za genrisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi lgG2ili lgG4, ili druge klase Ig, kao što su IgM ili IgA, na primer. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Interferoni prevashodno poznati po svojm inhibitornom dejstvu na virusnu replikaciju i ćelijsku proliferaciju. lnterferon-y, na primer, igra važnu ulogu u promociji imunih i zapaljenskih odgovora. Smatra se da Interferon p (IFN-p, interferon tipa I), igra anti-zapaljensku ulogu.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu kombinacije inhibitora IL-18 i interferona u proizvodnji leka za lečenje poremećaja preosetljivosti.

Interferoni mogu i da se konjuguju u polimere da bi se poboljšala stabilnost proteina. U VV099/55377, na priemr, opisan je konjugat između Interferona p i poliol polietilenglikola (PEG).

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, interferon je Interferon-p (IFN-p), i još bolje IFN-p 1a.

Inhibitor produkcije i/ili dejstva IL-18 se po mogućstvu koristi istovremeno,

sekvencijalno ili odvojeno sa interferonom.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u kombinaciji sa TNF antagonistom. TNF antagonisti vrše svoju aktivnost na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju ili da sekvestriraju sam TNF molekul sa dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supstancijalno neutralizuju TNF epitop ili epitope odgovorne za TNF receptorsko vezivanje (u deljem tekstu "sekvestrirajući antagonisti"). Sekvestri raj ući antagonist može da bude, na primer, jedno antitelo usmereno protiv TNF.

Alternativno, TNF antagonisti mogu da inhibiraju TNF signalni put koji se aktivira ćelijskim površinskim receptorom po vezivanju TNF (u daljem tekstu "signalni antagonisti"). Obe grupe antagonista su korisne, bilo same ili zajedno, u kombinaciji sa IL-18 inhibitorom, za lečenje poremećaja preosetljivosti.

TNF antagonisti se lako identifikuju i procenjuju rutinskim skriningom kandidata za takvo dejstvo na aktivnost nativne TNF na osetljive ćelijske linijein vitro,na primer humane B ćelije, kod kojih TNF izaziva proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Esej sadrži TNF formulacije u različitim razblaženjima kandidata antagonista, na pr. od 0.1 do 100 puta molarne količine TNF korišćene u eseju, i kontrole bez TNF ili samo antagoniste (Tucci et al., 1992).

Sekvestrirajući antagonisti su preporučeni TNF antagonisti za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom. Među sekvestrirajućim antagonistima, oni polipeptidi koji vezuju TNF visokim afinitetom i koje imaju nisku imunogenost imaju prednost. Prednost se posebno daje rastvorljivim TNF receptorskim molekulima i neutralizujućim antitelima na TNF. Na primer, rastvorljivi TNF-RI i TNF-RII su korisni za ovaj pronalazak. Razgranate forme ovih receptora, koje obuhvataju ekstraćelijske domene receptora ili njihove funkcionalne delove, smatraju se posebno preporučenim antagonistima u skladu sa ovim pronalaskom. Razgranati rastvorljivi TNF tip-l i tip-ll receptori su opisani, na primer,UEP914431.

Razgranate forme TNF receptora su rastvorljive i otkrivene su u urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorni vezujući proteini, koji se nazivaju TBPI, odnosno TBPII (Engelmann et al., 1990). Istovremena, sekvencijalna ili odvojena upotreba IL-18 inhibitora sa TNF antagonistom i/ili Interferonom se preporučuje, u skladu sa pronalaskom.

U skladu sa ovim pronalaskom, TBP I i TBPII su preporučeni TNF antagonisti koji se koriste u kombinaciji sa IL-18 inhibitorom. Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalno liče na receptorske molekule koji mogu da se koriste i za ovaj pronalazak. Ovakav biološki aktivan ekvivalent ili derivat receptorskog molekula odnosi se na deo polipeptida, ili sekvence koja enkodira receptorski molekul, koji je dovoljno veliki i sposoban da vezuje TNF takvim afinitetom da interakcija sa TNF receptorom vezanim za membransku bude inhibirana ili blokirana. II ir\S iaHnnm nranAri irpnAm nhljL'i i hi irvtpni r<p>e<+>%/i^r<lii>\#<i>TMF-DI /TRDI\ ja TKtF \jjUu jvui lOm f^i iv/iii ^uihvu, iiuiiiCiiii i CiOk vvi iji «i i 111 i \i yiwii jjv iiii antagonist koji će se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Prirodni i rekombinantni rastvorljivi TNF receptorski molekuli i metode za njihovu produkciju u opisani u Evropskim patentima EP 308 378, EP 398 327 i EP 433 900. IL-18 inhibitor može da se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno sa TNF inhibitorom.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj medikament dalje obuhvata jedan anti-zapaljenski agens, kao što su NSAIL (nesteroidniant\- zapaljenskifekovi). U preporučenom obliku, COX-inhibitor, po mogućstvu jedan COX-2 inhibitor, se koristi u kombinaciji sa IL-18 inhibitorom. COX-inhibitori su poznati u struci. Specifični COX-2 inhibitori su otkriveni u WO 01/00229, na primer. Aktivne komponente se mogu koristiti istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno

Reakcije preosetljivosti se često tretiraju anti-alergijskim lekovima kao što su antihistaminici, kromolin, glukokortikoidi ili simpatomimetici. Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na kombinovanu terapiju koja obuhvata jedan inhibitor IL-18 i jedan anti-alergijski lek. Upotreba antihistaminika i/ili kromolina i/ili glukokrtikoida i/ili simpatomimetika za odvojenu, sekvencijalnu ili istovremenu upotrebu sa inhibitorom IL-18 se preporučuje u skladu sa ovim pronalakom.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 1000 mg/kg telesne težine, ili oko 0.001 do 100 mg/kg telesne težine ili oko 0.01 do 10 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 do 5 mg/kg ili oko 1 do 3 mg/kg telesne težine. IL-18 inhibitor u skladu sa ovim pronalaskom se po mogućstvu daje topićki, t.j. lokalno. Za kontaktni dermatitis, na primer, IL-18 inhibitor može da se daje direktno na zahvaćenu površinu kože.

U još jednom obliku ovog pronalaska, IL-18 inhibitor se daje sistemski, i po mogućstvu supkutano ili intramuskularno.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na upotrebu vektora ekspresije koji obuhvata sekvence kodiranja inhibitora IL-18 u preparatu medikamenta za prevenciju i/ili tretman poremećaja preosetljivosti. Tako, pristup genskom terapijom se smatra primerenim kada treba da se IL-18 inhibitor dovede do mesta na kome je potreban. Da bi se tretirao i/ili prevenirao poremećaj preosetljivosti, vektori genske terapije koji obuhvataju sekvence inhibitora IL-18 produkcije i/ili dejstva mogu da se ubrizgaju direktno u obolelo tkivo, na primer, izbegavajući probleme uključene u sistemsku primenu vektora genske terapije, kao što su dilucija vektora, dostizanje i pogađanje ciljnih ćelija ili tkiva, i neželjena dejstva.

Upotreba vektora za izazivanje i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji koja je normalno nema za ekspresiju IL-18 inhibitora, ili koja eksprimira količine inhibitora koje nisu dovoljne, takođe su obuhvaćene u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj vektor može da obuhvati regulatorne sekvence funkcionalne u ćelijama za kože želimo da eksprimiraju inhibitor ili IL-18. Ovakve regulatorne sekvence mogu biti promoteri ili enhanseri, na primer. Ove regulatorne sekvence onda mogu da se uvode u pravi lokus genoma homolognom rekombinacijom, i na taj način se operativno povežu sa regulatornim sekvencama sa genom, čija ekspresija treba da se indukuje ili pojača. Ova tehnologija se obično naziva "Endogenska Genska Aktivacija"

(EGA), i opisana je na pr. u WO 91/09955.

Stručnjak za ovu oblast će razumeti i da je moguće da se direktno zatvori IL-18 ekspresija, bez korišćenja inhibitora IL-18, istom tehnikom. Da bi se to uradilo, negativni regulacioni element, kao na pr. element za utišavanje, može da se uvede u genski lokus IL-18, i tako dovede do nishodne regulacije ili prevencije IL-18 ekspresije. Stručnjak za ovu oblast će razumeti i da takva nishodna regulacija ili utišavanje IL-18 ekspresije ima isto dejstvo kao i korišćenje IL-18 inhibitora da se prevenira i/ili leči bolest.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede inhibitor IL-18 za proizvodnju leka za lečenje i/ili prevenciju poremećaja preosetljivosti.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav, posebno koristan za prevenciju i/ili tretman poremećaja preosetljivosti, što obuhvata terapijski efikasnu količinu inhibitora IL-18 i/ili terapijski efikasnu količinu interferona i/ili farmaceutski efikasnu količinu TNF inhibitora i/ili farmaceutski efikasnu količinu anti-zapaljenskog agensa i/ili farmaceutski efikasnu količinu anti-alergijskog agensa, pre svega antihistaminika.

Kao inhibitor IL-18, ovaj sastav može da obuhvati inhibitore kaspaze-1, antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitore IL-18 signalnog puta, antagoniste IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili cirkulamo permutovane derivate istih koji imaju istu aktivnost. IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili cirkularno permutovani derivati kako je gore opisano, predstavljaju preporučene aktivne sastojke ovih farmaceutskih sastava.

Interferon uključen u ovaj farmaceutski sastav je po mogućstvu IFN-p.

U još jednom preporučenom obliku, ovaj farmaceutski sastav obuhvata terapijski efikasne količine inhibitora TNF alfa. Farmaceutski sastav u skladu sa ovim pronalaskom može dalje da obuhuvata jedan ili više COX-inhibitora.

Definicija "farmaceutski prihvatljivog" obuhvata svaki nosač, koji ne utiče na delotvornost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i nije toksičan kao i da nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekcije u nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci u farmaceutskom sastavu u skladu sa ovim pronalaskom mogu se davati pacijentu na čitav niz raznih načina. U načine davanja spadaju intradermalni, transdermalni (na pr. u formulacijama sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, topički, rektalni i intranazalni načini. Mogu se koristiti i svi drugi terapijski efikasni načini davanja, na primer apsorpcija preko epitelijalnog ili endotelijalnog tkiva ili genskom terapijom gde DNK molekul koji enkodira aktivni agen biva dat pacijentu (na pr. preko vektora) koji dovodi do toga da se aktivni agens eksprimira i sekretujein vivo.Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju skupa sa drugim komponentama biološki aktivnih agenasa, kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipijenti, nosači, diluenti i podloge.

Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskularnu) primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu kao rastvor, suspenzija, emulzija ili liofilizovani prah uz farmaceutski prihvatljivi parenteralni nosač (na pr. voda, fiziološki ili dekstrozni rastvor) i dodatak za izotoničnost (na pr. manitol) ili hemijsaku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Ova formulacija se sterilizuje uobičajeno korišćenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih proteina u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša korišćenjem konjugacionih procedura koje produžavaju polu-život molekula u telu čoveka, na primer povezujući molekul za polietilenglikol, kako je opisano u PCT

Patent Application WO 92/13095.

Terapijski efikasne količine aktivnih proteina biće u funkciji mnogih promenljivih, uključujući i tip antagonista, afinitet antagonista za IL-18, svaku rezidualnu citotoksičnu aktivnost koju pokazuju antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući poželjnost da se održava ne-toksični nivo endogene IL-18 aktivnosti).

"Terapijski efikasna količina" je ona što kada se da, IL-18 inhibitor dovodi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza, kao pojedinačna ili kao multipla, zavisiće od pacijenta do pacijenta zbog raznih faktora, uključujući farmakokinetička svojstva IL-18 inhibitora, način davanja, stanje i osobine pacijenta (pol, godine starosti, telesna težina, zdravlje, veličina), obim simptoma, prateću terapiju, učestalost tretmana i željeni efekat. Podešavanja i manipulacije utvrđenog raspona doze su u okviru znanja stručnjaka za ovu oblast, kao iin vitroiin vivometode za određivanje inhibicije IL-18 kod pacijenata.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.001 do 100 mg/kg ili oko 0.01 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0. 1 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 2 mg/kg telesne težine.

Način davanja kome se daje prednost u skladu sa ovim pronalaskom jeste davanje supkutanim načinom. Dalje se, u skladu sa ovim pronalaskom preporučuje i intramuskularno davanje. Da bi se IL-18 inhibitor dao direktno na mesto dejstva, preporučuje se topičko nanošenje.

U dalje preporučenim oblicima, inhibitor IL-18 se daje svaki ili svaki drugi dan.

Dnevna doza se obično daje u podeljenim dozama ili u obliku sa kontrolisanim oslobađanjem da se dobiju željeni rezultati. Drugo i naknadna davanja mogu da se obave u dozama koje su iste, manje ili veće od prve ili prethodne doze date pacijentu. Druga i naredne doze se mogu davati tokom ili pre početka bolesti.

U skladu sa ovim pronalaskom, IL-18 inhibitor može da se daje profilaktički ili terapijski pacijentima pre, istovremeno ili sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili agensima (na pr. multipli režim lekova), u terapijski efikasnoj količini, posebno sa interferonom i/ili TNF inhibitorom i/ili drugim anti-zapaljenskim agensom, kao što je COX inhibitor i/ili anti-alergijski agens. Aktivni agensi koji se daju istovremeno sa drugim terapijskim agensima mogu da se daju u istom ili u drugom sastavu.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za pripremu farmaceutskog sastava koji podrazumeva mešanje delotvorne količine IL-18 inhibitora i/ili interferona i/ili TNF antagonista i/ili COX inhibitora s farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu za tretman poremećaja preosetljivosti, i obuhvata davanje farmaceutski efikasne količine IL-18 inhibitora paciojentu kome je to potrebno.

Pošto smo sada potpuno opisali ovaj pronalazak, stručnjaci za ovu oblast će razumeti da isto može da se uradi sa širokim spektrom ekvivalentnih parametara, koncentracija i uslova a da se ne udaljimo od duha i obima pronalaska i bez nepotrebnog eksperimentisanja.

lako je ovaj pronalazak opisan u vezi sa specifičnim oblicima, jasno je da mogu postojati i druge modifikacije. Ova primena ima za cilj da obuhvati sve modifikacije, upotrebe ili adaptacije za ovaj pronalazak prateći opšte principe samog pronalaska i uključujući sva odstupanja od ovog opisa kada uđe u opštu ili uobičajenu praksu u struci na koju se pronalazak odnosi, jer se može primenjivati na osnovne osobine koje su ovde iznete i spadaju u obim navedenih zahteva.

Sve reference koje su ovde citirane, uključujući članke i apstrakte iz časopisa, objavljene ili neobjavljene u SAD ili inostrane patentne prijave, odobrene SAD ili inostrane patente ili ma koje druge reference, u celini su obuhvaćene samim pozivanjem na njih, uključujući sve podatke, tabele, slike i tekst prikazane u tim referencama. Uz to, celokupni sadržaj svih referenci neveden u referencama takođe je potpuno uključen pozivom na reference.

Pozivanje na poznate medicinske metode, konvencionalne stadijume metoda, poznate metode, konvencionalne metode ni na koji način ne znači da se priznaje da ma koji aspekt, opis ili oblik ovog pronalaska je otkriven, naznačen ili predložen u relevantnoj struci.

Goreopisani prikaz specifičnih oblika će u celini otkriti opštu prirodu pronalaska da drugi mogu, primenjujući znanje iz struke (uključujući i sadržaj referenci koje su ovde uključene) da lako modifikuje i/ili adaptira za različite primene kao što su drugi specifični oblici, bez nepotrebnog eksperimentisanja, i ne udaljavajući se od opšteg koncepta ovog pronalaska. Prema tome, ovakve adaptacije i modifikacije su, po nameri pronalazača, uključene u obim i značene spektra ekvivalenata ovde prikazanih oblika, na osnovu saznanja i smernica koji su ovde uključeni. Treba razumeti da frazeologija i terminologija koji se ovde koriste služi samo za opis, a ne da ograniče.

Prema tome, stručnjak treba da razume i izraze i fraze koji su ovde korišćeni u datoj specifikaciji u svetlu saznanja i smernica koje su ovde sadržane, u kombinaciji sa saznanjima stručnjaka za ovu oblast.

PRIMER!

Primer 1:IL- 18BP tretman smanjuje kontaktnu preosetljivost

Metode

Mišji modeli eksperimentalno izazvane kontaktne preosetljivosti (CHS) korišćeni su u svim primerima dole. Obim CHS meri se otokom uha kao odgovor na lokalno naneti agens za senzitizaciju.

Test otoka uha miša koji je korišćen za generisanje podataka prikazanih na Slikama 1 do 3 (vidi dole) opisan je detaljno (Garrigue et al., 1994). Ukratko miševi su topički senzitivisani nanošenjem 25ul 0.5% 2,4-dinitrofluorobenzena (DNFB; Sigma Chemical Co.) rastvora u acetonu/maslinovom ulju (4:1) na obrijani abdomen (dan 0). Pet dana kasnije, 20^l 0.2% DNFB i isti nosač je nanet na desne uši, a sam nosač

(placebo) na leve.

Svi miševi su dobijali svakodnevno od dana 5 do dana 8, bilo 250^g/miš/dan rhll_-18BP (rekombinantni humani IL-18BP) ili fiziološki rastvor u kontrolnog grupi intraperitonealno (i.p.) (Slika 1 A), ili su primali IL-18BP na dan 0 do 2 (Slika 1B).

Debljina uha je merena meračem debljine (Mitutovo Corp., Kawasaki, Japan), a otok uha je procenjen oduzimanjem vrednosti pre provokacije od vrednosti posle provokacijem kao i daljim oduzimanjem svakog otoka otkrivenog u kontralateralnom uhu koje je provocirano samo placebom.

Otok uha je meren sledećih dana: 0, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14,16.

Drugi model je korišćen da se generišu podaci prikazani na Slikama 4 do 6, vidi primere dole. IL-18 vezujući protein (IL-18BP) je korišćen da se neutralizuje IL-18 tokom eksperimentalno izazvane kontaktne preosetljivosti (CHS) na 2,4-Dinitrofluorobenzen (DNFB). Eksperimentalni protokol je bio sledeći:

1. Dan 0: Sensitizacija

25uJ DNFB (0.5% u acetonu / maslinovom ulju (4/1) kao nosaču/placebu) na obrijana leđa

2. Dan 5: Provokacija

5ul DNFB (0.2%) na dorzalnu i ventralnu stranu desnog uha 5|il placeba na dorzalnu i ventralnu stranu levog uha

3. Dan 6: Očitavanje

Pratiti debljinu kao znak zapaljenja

"' Izraziti rezultat kao povećanje otoka [|im] provociranog u odnosu na kontrolno uho

4. Dan 6 ili 7: obrada uha za analizu

U ovom modelu, otok najveću vrednost postiže dana 6 i 7. IL-18 je neutralizovan svakodnevnim injekcijama 250ug IL-18BP (u fiziološkom rastvoru) po životinji, bilo tokom senzitizacija, na dan 0, dan 1 i dan 2, ili tokom provokacije na dan 4, dan 5 i dan 6.

Rezultati

Odgovori na kontaktnu preosetljivost (CHS) su hapten-specifična kožna zapaljenja posredovana T ćelijama. Većina haptena dovodi do oligoklonalnog T-ćelijskog odgovora koji se uglavnom sastoji od CD8<+>efektorskih T ćelija, dok CD4<+>T ćelije imaju ulogu nishodne regulacije u CHS odgovoru (Bour, H., et al. 1995; Grabbe et al., 1998). Da bi se ispitala uloga IL-18 u CHS, miševi su epikutano sensitivisani sa DNFB, a onda 5 dana kasnije provocirani nanošenjem haptena na kožu uha. Istovremeno sa haptenskom provokacijom, miševima je ubrizgavano i.p. ili 250 ug/miš/dan rhlL-18BP ili fiziološki rastvor. IL-18BP, ili fiziološki rastvor kao kontrola, davani su svakodnevno tokom 3 dana, odnosno na dane 5 do 8 posle prve DNFB sensitizacije (dan 0). DNFB provokacija na dan 5 dovela je do signifikantnog otoka ušiju kod obe grupe (Slika 1 A). Obim otoka kod miševa tretiranih fiziološkim rastvorom

(trouglovi) daleko izraženiji nego kod miševa tretiranih sa IL-18BP (kvadratići), i vratili su se na normalnu do dana 9.

Pramena otoka ušiju zabeležena kada je korišćen IL-18BP tretman na dane 0 do 2 nije bila statistički signifikantna (Slika 1 B). Vreme primene IL-18BP je izgleda važan faktor da se dobije koristan efekat IL-18BP tretmana.

Zaključak:

U ovom utvrđenom mišjem modelu kontaktne preosetljivosti/kontaktnog dermatitisa, trodnevni tretman inhibitorom IL-18 imao je signifikantno korisno dejstvo na obim otoka /zapaljenja izazvanog tretmanom haptenom.

Primer 2: IL- 18BP tretman smanjuje kontaktnu preosetljivost posle druge

provokacije

Metode

C57BL/6 miševi su bili sensitivisani epikutanim nanošenjem 25 |xl 0.5% DNFB rastvora na obrijani abdomen (dan 0). Miševi su provocirani nanošenjem 20 ul 0.2% DNFB na uši dana 5. Na dan 19, miševi su drugi put provocirani pomoću DNFB. Oticanje ušiju mereno je na dan 0 (haptenska sensitizacija), 5 (prva haptenska provokacija), 6, 7, 8, 9, 12, 14,16, 19 (druga haptenska provokacija), 20, 21, 22, 23, 26, 28, 30. Srednje vrednosti SD za svaku grupu prikazane su na Slici 2. Miševi su tretirani svakodnevno bilo sa 250 ug/miš/dan IL-18BP i.p. (n = 5; Slika 2 beli kvadratići) ili fiziološkim rastvorom (n = 5; Slika 2, tamni kvadratići od dana 19 do dana 23.

Rezultat

Kao što pokazuje Slika 2, IL-18BP-tretman značajno smanjuje otok uha posebno posle druge provokacije haptenom.

Prema tome, IL-18BP terapija je posebno pogodna za lečenje poremećaja preosetljivosti, gde su pacijenti posebno provocirani istim alergenom i treba da budu lečeni da bi savladali zapaljenske reakcije koje su izazvane ovim provokacijama.

Primer3: IL- 18BP štiti od CHS neutralizuiući IL- 18

Da bismo verifikovali da je zaštita koju smo zabeležili sa IL-18BP tretmanom bila uzrokovana neutralizacijom IL-18, IL-18 deficijentni (KO) divlji tip C57BL/6 miševa su poređeni u smislu njihove sposobnosti da proizvedu CHS odgovor. IL-18 deficijentni miševi razvijaju CHS na DNFB, iako manje izraženo od divljeg tipa miša. Međutim, nikakvo dejstvo IL-18BP tretmana nijen zabeleženo kod IL-18 deficijentnih miševa, kako pokazuje Slika 3, što govori da je anti-zapaljenski efekat IL-18BP kod CHS bio posledica neutralizacije IL-18 (n = 5 miševa po grupi).

Primer 4;IL- 18BP ne smanjuje vaskularno curenje

Metode

CHS je indukovan kod C57BL/6 miševa kako je gore opisano. Da bi i se pratio edem izazvan CHS reakcijom, Evans plavo je ubrizgavao i.v. 2 h pre provokacije sa DNFB. Miševi su žrtvovani 24h kasnije, a uši su obrađene da se ekstrahuje boja koja je isurila iz vaskulature i nagomilala se u okolnom tkivu. Vaskularno curenje je procenjeno kao količina boje po mg suvog tkiva uha korigovano za koncentraciju Evans plavog u serumu i izraženo kao odnos provociranog vs. kontrolno uvo. Dok je tretman sa IL-18BP dana 4 i 5 smanjio otoke za 56% u odnosu na kontrolu tretiranu placebom (Slika 4, leva strana, p < 0.01), nije bilo signifikantne razlike u vaskularnom curenju između ove dve grupe (Slika 4, desna strana). Obe grupe su pokazale signifikantno povećani edem u poređenju sa nesenzitizovanom kontrolnom grupom (p < 0.05 i p < 0.01). Kao dodatna kontrola, miševi su tretirani sa 250 jig irelevantnog proteina BSA po životinji dnevno. Ovi miševi su razvili CHS kao životinje kontrolisane placebom (n = 10 miševa po grupi).

In vivo esej za vaskularno curenje ( Evans plavo)

Princip: Injekcija (iv) Evans plavog i ekstrakcija sa ciljnog tkiva (uho)

Sirovi podaci za procenu:

• Standardna kriva Evans plavog (OD620/ng)

• Koncentracija Evans plavog u krvi (OD62o/ml ili ng/ml, po grupama)

• Tećina suvog tkiva uha (sa iste i sa suprotne strane, mg)

• Sadržaj Evans plavog u ušima (sa iste i sa suprotne strane, OD620/|ig ili ng/mg, po grupama)

Protokol u kombinaciji sa DNFB indukovanim CHS:

• Na dan 5 eksperimentalno izazvanog CHS ubrizgati 100jil Evans plavog" iv retroorbitalno 2h pre provokacije miša sa DNFB

• ubrizgati IL-18BP i.p. 1h pre provokacije

• na dan 6 (24h po provokaciji uha sa DNFB) meriti otok i žrtvovati životinju

• uzeti uzorke krvi i obraditi na sledeći način:

o dodati 30 |xl seruma u 970 ul formamida (-»razblaženjel/33)

o odrediti OD na 620 nm (-> 1 OD620odgovara 33 OD620/ml)

• uzeti i ipsilateralno i kontralateralno uho i obraditi ih na sledeći način:

o sušiti 24h na 80°C

o odrediti suvu težinu

o samleti i odrediti sadržaj boje sa 1 ml formamida, blago mućkajući 24h na

55°C

o filtrirati da se ukloni ostatak", napuniti kivete, ostaviti na sobnoj

temperaturi nekoliko sati da se omogući da masti isplivaju na površinu

o odrediti OD na 620 nm

Vrednosti koie treba izračunati:

Rezultati:

U osnovi dva procesa doprinose otoku koji je zabeležen tokom reakcije CHS: Curenje tečnosti iz vaskulature u okolno tkivo zazivanjem edema, i ekstravasacija zapaljenskih ćelija iz krvnih sudova na mesto oštećenja tkiva.

Korišćenjem Evans plavog kao trejsera, pokazano je da uprkos ukupnog smanjenja otoka, tretman sa IL-18BP nije smanjio vaskularno curenje (Slika 4).

Primer5: IL- 18BP tretman smanjuje zapaliensku infiltraciju i IFNy produkciju uha

provociranom sa DNFB

Metode

<a>7.5 mg/ml Evans plavog (I 2129) u fiziološkom rastvoru NaCl, 100 ul, iv)

<p>priprema uzorka sa VVhatman filterom gustina mreže 5um PTFE, #6984.0350

CHS je indukovan kod C57BL/6 miševa kako je opisano. Ove životinje su tretirane sa IL-18BP ili placebom na dane 4 do 6. Tretman IL-18BP je smanjio otok na 58% u odnosu na placebo kontrolu do dana 7. Miševi su žrtvovani na dan 7, provocirane uši su uzete, skupljene po grupama (n = 8) i enzimski digestirane da se dobije suspenzija jedne vrste ćelija. Ćelije su dodatno određivane gejtingom FACS analizom na CD45 pozitivne žive ćelije. Broj apT ćelija, NK ćelija, neutrofila i monocita / makrofaga nađenih u preparatima ušiju izražen je kao procenat ukupnog broja analiziranih ćelija. Izračunavano je i smanjenje ovih tipova ćelija po tretmanu IL-18BP u odnosu na placebo kontrolu.

Za merenje produkcije IFNy, ćelije dobijene iz ušiju provociranih DNFB ponovo su stimulisane u količini od 2 x 10<5>po udubljenju sa anti-CD3 antitelom vezanim za ploču. U narednih 24 h u kulturu više nije dodavan IL-18BP. Produkcija IFNy je merena u triplikatu pomoću ELISA eseja.

Preparati ćelija iz ušiju provociranih DNFB stimulisani su sa 50 ng/ml PMA<*>i 500 ng/ml ionomicina tokom 4h. Sekrecija citokina je blokirana dodavanjem 2^g/ml brefeldina A u poslednja 2 h inkubacije. Ćelije su onda podvrgnute višebojnom imunofluorescentnom prebojavanju na intraćelijski IFNy i površinske antigene. IFNy su produkovale CD8 T ćelije i u manjoj meri CD4 T ćelije. U NK ćelijama i y5T ćelijama IFNy nije otkriven, (n.d., nije detektovan;<*>Forbol 12-Miristat 13-Acetat)

Priprema suspenzije sa jednom vrstom ćelija

Enzimska digestija ušiju miša da se dobije suspenzija jedne vrste ćelija baziraana je na protokolu Schuler,G. i Steinman.R.M. (1985) kao i Stingl et al. (1983).

1. odseći uši, spojiti 5 ušiju po preparatu

2. isprati sa 70% etanola

3. podeliti uz pomoć klešta

4. staviti dermalnu stranu na dole, na 7.5ml HBSS<1>na 37°C

5. dodati 5ml 2.5% Tripsina<2>(10x) da se dobije finalna koncentracija od 1%

6. inkubirati 35 min na 37°C

7. preneti polovine ušiju sa dermalnom stranom nadole na najlonsko sito (za ceđenje ćelija) postavljeno u 10ml HBSS / 80%FCS na led i polako mešati da se ćelije izdvoje iz extraćelijske matrice<1>Hanks balansirani slain rasctvo bez Ca<2+>i Mg<2+>(GIBCO# 14170.070)

2 2.5% Tripsin/ EDTA (10x) (GIBCO#35400-027)

8. ukloniti mreže sa puno ostatka (debrisa)

9. isprati 2x hladnim HBSS / 10%FCS

10. izbrojati ćelije

Analiza FACS

1. Ponovo suspendovati ćelije u FACS puferu za bojenje<3>, svi naredni koraci se rade na ledu

2. uzeti 10<6>ćelija po prebojavanju

3. dodati 1 ug FC-Block, 10 min

4. dodati anti-CD45 antitela u kombinaciji sa antitelima protiv markera koji nas interesuje, po 1 p.g, 30 min

5. oprati 2x

6. uključiti 0.5 x 10<s>ukupnih događaja (registracija) FACS-om

7. analizirati specifične markere po gejtingu na CD45+, žive ćelije

Rezultati:

Da se ispita zapaljenski infiltrat na mestu provokacije, suspenzije pojedinih vrsta ćelija pripremljenih od netaknutih i provociranih ušiju analizirane su pomoću FACS, gejting na CD45+ živim ćelijama (Slika 5). Pokazano je da su CD45+ ćelije prisutne u netaknutom uhu uglavnom y8T ćelije i dendritske ćelije kože. Zapaljenski infiltrat 24h po provokaciji bio je sastavljen od CD8 i CD4 T ćelija, neutrofila, monocita i NK ćelija, povećavajući ukupni broj CD45+ ćelija u uhu približnop dva puta. Odgovarajući na smanjenje otoka, tretman IL-18BP smanjio je ukupni broj leukocita koji se infiltriraju na mesto provokacije. Ovo je uticalo na sve različite ćelijske tipove zapaljenskih infiltrata. Smenjenje je iznosilo 20% i 40% zavisno od tipa ćelija.

Dalja karakterizacija tipa infiltrata dobijenih iz ušiju miševa tretiranih IL-18BP otkrila je smanjenu produkciju IFNy po ponovnoj stimulaciji anti-CD3 (Slika 6). FACS analiza je pokazala da je IFNy uglavnom produkovan od strane CD8 T ćelija i u manjoj količini od strane CD4 T ćelija. Interesantno da NK ćelije i y5T ćelije nisu doprinosile produkciji IFNy (Slika 7).

Primer 6:IL- 18BP ne smanjuje regrutovanie Langerhanovih ćelija

<3>1 % goveđi serumski albumin u slanom fosfatnom puferu

Metod:

Miševi su bojeni haptenom FITC (50u.l rastovra 4mg/ml) ili placebo (nosač) aceton / dibutilftalat (1:1) na desni, odnosno levi bok. Ingvinalni limfni čvorovi su prikupljeni 24h po prebojavanju. Haptenom konjugovane Langerhansove ćelije mogle su se otkriti pomoću FACS kao FITC+, CD11c+ ćelije u limfnim čvorovima koji dreniraju FITC obojeni bok, ali ne i u kontralateralnom limfnom čvoru koji drenira bok bojen samo placebom. (n = 5 drenažnih limfnih čvorova po grupi)

Rezultati:

Migracija Langerhansovih ćelija (LC) koje nose antigen do drenažnog limfnog čvora zavisi od prozapaljenskih citokina 1L-1|3 i TNFa i reguliše se pomoću kaspaze-1 (Antonopoulos et al., 2001; Kimber et al., 1992). U skladu sa tim, smatra se da IL-18 doprinosi prenošenju LC (Cumberbatch et al., 2001). Prema tome, tretman sa IL-18BP bi mogao da oslabi regrutovanje LC i tako smanji imunološki odgovor na DNFB tokom faze provokacije. Da se testira ova hipoteza, miševi su bojeni haptenom FITC ili placebom na desnom, odnosno levom boku. Kožni limmfni čvorovi koji dreniraju ingvinalni deo prikupljeni su 24h po bojenju i onda je utvrđivan broj FITC+ ćelija po limfnom čvoru. Tretman životinja sa IL-18BP 24h i 1h pre bojenja nije promenio broj LC sa sadržejem haptena u drenažnom limfnom čvoru 24h po bojenju (Slika 8). Prema tome, nema značajnijeg doprinosa IL-18 na prenos LC u ovom modelu.

Primer 7: IL- 18BP smanjuje obim odloženog tipa preosetljivosti u drugom

tipu mišjem modelu DHT

Metode

Odloženi tip preosetljivosti

Miševi su senzitizovani intravenskom injekcijom 10<6>BALB/c splenocita, i provocirani na dan 5 sa 13 x 10<6>BALB/c splenocita (50 u' PBS) u desnu šapicu. Kontrolne leve šapice dobile su po 50 ul PBS. Oticanje desne šapice izračunavano je različitih dana tako što se oduzimala vrednost pre provokacije i svaki otok meren u levoj šapici od vrednosti posle provokacije.

Za eksperimente adoptivnog transfera, ćelijske suspenzije iz limfnih čvorova BALB/c splenocit-sensitizovanih ili netretiranih kontrolnih životinja su lišene B220<+>i CD8<+>ćelija inkubacijom sa pacovskim anti-miš B220-FITC i CD8-FITC, posle čega je rađena separacija u MACS koloni paramagnetnim anti-FITC mikroperlama (Miltenvi Biotech, Auburn, California, USA). Elucirani CD4<+>T ćelijama obogaćeni preparati su ubrizgavani u repnu venu recipijentnog miša (2 x 107 ćelije/miš). Posle 16 sati, miševi su provocirani ubrizgavanjem 13 x 106 BALB/c splenocita (bez crvenih krvnih ćelija) u desnu šapicu, pa je pojava otoka posmatrana tokom narednih dana.

Rezultati

Odloženi tip preosetljivosti (DHT) izazivan je pomoću CD4<+>T ćelija s očiglednim nishodno regulirajućim dejstvom CD8<+>T ćelija (Grabbe et al., 1998). Ponašanje CD4<+>T ćelija od miša tretiranog sa IL-18BP ispšitivano je na DTH modelu. C57BL/6 životinja je sensitizovano intravenskom injekcijom 10<6>alogenih BALB/c splenocita. Pet dana kasnije, 13 x 10<6>BALB/c splenocita je ubrizgano u desne šapice, zajedno sa bilo 10 mg/kg rekombinantnog humanog IL-18BP i.p. ili placebo. Lokalno zapaljenje je mereno određivanjem otoka posle 24 sata.

Claims (15)

1. Upotreba proteina koji vezuje IL-18 (IL-18BP), fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata koji uključuje spojeni deo, gde je taj deo polietilen glikol (PEG), za dobijanje leka za lečenje i/ili prevenciju kontaktne preosetljivosti.

2. Upotreba u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time da taj funkcionalni derivat sadrži najmanje jednu grupu spojenu za jednu ili više funkcionalnih grupa, što se dešava na jednom ili više bočnih lanaca na aminokiselinskim ostacima.

3. Upotreba u skladu sa zahtevom 2, naznačeno time da je ta grupa polietilen glikol (PEG).

4. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da taj lek još sadrži i interferon, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

5. Upotreba u skladu sa zahtevom 4, naznačeno time da taj interferon bude interferon beta.

6. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da taj lek još sadrži i faktor tumorske nekroze (TNF), za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

7. Upotreba u skiadu sa zahtevom 6, naznačeno time da taj TNF bude TBP i i/ili TBP II.

8. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da taj lek još sadrži i antiinflamatorni agens, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

9. Upotreba u skladu sa zahtevom 8, naznačeno time da taj antiinflamatorni agens COX-inhibitor.

10. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da taj lek još sadrži i antialergijski agens, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

11. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da se inhibitor IL-18 koristi u količini od 0,001 do 1000 mg/kg telesne težine, ili 0,01 do 100 mg/ kg telesne težine, ili 5 mg/kg telesne težine.

12. Upotreba u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time da se inhibitor IL-18 daje supkutano, intramuskularno ili topički.

13. Upotreba ekspresionog vektora koji uključuje sekvence kodiranja inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju kontaktne preosetljivosti, u skladu sa zahtevom 1 naznačeno time da taj inhibitor IL-18 bude odabran iz IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP), fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata koji uključuje spojeni deo, gde je taj deo polietilen glikol (PEG).

14. Upotreba vektora za indukovanje i/ili pojačavanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju kontaktne preosetljivosti, u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time da taj inhibitor IL-18 bude odabran iz IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP), fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata koji uključuje spojeni deo, gde je taj deo polietilen glikol (PEG).

15. Upotreba ćelije koja je genetski modifikovana tako da produkuje inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju kontaktne preosetljivosti, u skladu sa zahtevom 1, naznačeno time da taj inhibitor IL-18 bude odabran iz IL-18 vezujućeg proteina (IL-18BP), fuzionisanog proteina, funkcionalnog derivata koji uključuje spojeni deo, gde je taj deo polietilen glikol (PEG).