NO335688B1 - Anvendelse av IL-18-inhibitorer i hypersensitivitetslidelser. - Google Patents

Abstract

SAMMENDRAG Oppfinnelsen angår anvendelsen av inhibitorer av IL-18 i fremstillingen av et medikament for behandling og/eller forebyggingen av hypersensitivitetslidelser og spesielt forsinket type hypersensitivitet.

Description

OPPFINNELSENS TEKNISKE OMRÅDE

Den foreliggende oppfinnelsen omhandler området allergi. Nærmere bestemt angår den anvendelsen av en inhibitor av IL-18 som definert i krav lfor behandlingen og/eller forebyggingen av en type IV hypersensitivitetslidelse og spesielt lidelser som involverer forsinket type hypersensitivitetsreaksjoner i det menneskelige legemet.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Uttrykket allergi eller hypersensitivitet anføres når en adaptiv immunrespons skjer i en upassende form. Allergiske eller hypersensitivitetsreaksjoner er resultatet av at normalt fordelaktige immunresponser virker upassende på fremmede antigener (vanligvis miljømessige makromolekyler) og noen ganger forårsaker betennelsesreaksjoner og vevsskade. I disse situasjonene utløser et normalt harmløst miljømessig stimuli, kalt et antigen, en immunrespons som ved gjeneksponering reaktiveres og danner patologisk skade.

Hypersensitivitetsreaksjoner er skadelige immunologiske reaksjoner overfor fremmede antigener. Det eksisterer mange hypersensitivitetsklassifikasjoner. Noen er basert på den tid som kreves for at symptomer eller hudtestreaksjoner opptrer etter eksponering overfor et antigen (for eksempel umiddelbar og forsinket hypersensitivitet), på en type antigen (for eksempel medikamentreaksjoner) eller på egenskapen til organinvolveringen. Klassifikasjoner er vanligvis overforenklede og tar ikke i betraktning at mer enn en type immunrespons kan opptre eller at mer enn en type kan være nødvendig for å produsere immunologisk skade. Den mest anvendte klassifikasjonen er følgende: Type I eller umiddelbar hypersensitivitet er IgE-mediert. Den kalles også vanlig allergi. Umiddelbar hypersensitivitets (type I) -reaksjoner skyldes bindingen mellom antigen og IgE på mastceller eller basofiler.

Lidelser med type I hypersensitivitetsreaksjoner kalles også atopiske lidelser. De inkluderer for eksempel allergisk rhinitt, allergisk konjunktivitt, atopisk dermatitt, ytre allergisk astma, urtikaria, systemisk anafylaksis. Forekomsten av astma har økt markert selv om årsakene for så vidt er ukjente. Nylig har en markert økning i type I-reaksjoner blitt merket i relasjon til eksponering overfor vannløselige proteiner i lateksprodukter (for eksempel gummihansker, tannsperrer ("dentaldams"), kondomer, rør for respiratorisk utstyr, katetere, spesielt blant medisinsk personell og pasienter eksponert overfor lateks og barn med spina bifida og urogenitale fødselsfeil. Vanlige reaksjoner på lateks er urtikaria, angioødem, konjunktivitt, rhinitt, bronkospasme og anafylaksis.

Pasienter med atopiske lidelser (inkludert atopisk dermatitt) har vanligvis en iboende predisposisjon for utvikling av IgE-antistoffmediert hypersensitivitet overfor inhalerte eller inntatte forbindelser (allergener) som er harmløse for mennesker som ikke er atopiske. Bortsett fra atopisk dermatitt medierer vanligvis IgE-antistoffer hypersensitivitet.

Type II eller cytotoksisk hypersensitivitet involverer cytotoksiske virkninger mediert av antistoff, komplement- og/eller cellulære mekanismer. Målet i type II-reaksjoner er en celleoverflate, og cellulær skade eller død er resultatet. Antistoff mot cellebundet antigen (type II) forårsaker celleødeleggelse ved å aktivere komplement eller fremme fagocytose. Eksempler på celleskade hvori antistoff reagerer med antigene komponenter på en celle er Coombs positive hemolytiske anemi, antistoffindusert trombocytopenisk purpura, leukopeni, pemfigus, pemfigoid, Goodpastures syndrom og pernisiøs anemi. Disse reaksjonene opptrer i pasienter som mottar inkompatible transfusjoner i hemolytiske sykdommer til nyfødte og i neonatal trombocytopeni og de spiller også en rolle i multisystem hypersensitivitetssykdommer (for eksempel systemisk lupus erytematose, SLE).

Skademekanismen eksemplifiseres best gjennom virkningen på røde blodceller. I hemolytiske anemier ødelegges de røde blodcellene enten gjennom intravaskulær hemolyse eller ved makrofag fagocytose, hovedsakelig i milten. In vitro-studier har vist at nærværet av komplement, noen komplementbindende antistoffer (for eksempel blodgruppeantistoffene anti-A og anti-B) forårsaker rask hemolyse. Andre (for eksempel anti-LE-antistoffer) forårsaker en sakte cellelyse; enda andre skader ikke cellene direkte, men forårsaker deres binding til og ødeleggelse av fagocytter. I kontrast til dette, aktiverer ikke Rh-antistoffer på røde blodceller komplement og de ødelegger celler hovedsakelig gjennom ekstravaskulær fagocytose. Eksempler hvori antigenet er en komponent av vevet er tidlig akutt (hyperakutt) transplantatavstøtning av en transplantert nyre som skyldes nærværet av antistoff på vaskulært endotelium og Goodpastures syndrom som skyldes reaksjon mot antistoff med glomerulær og alveolar grunnmembranendotelium. I eksperimentelt Goodpastures syndrom, er komplement en viktig mediator for skade, men komplementets rolle har ikke blitt klart bestemt i tidlig akutt transplantatavstøtning.

Eksempler på reaksjoner som skyldes haptenisk kobling med celler eller vev inkluderer mange av de hypersensitive medikamentreaksjonene (for eksempel penicillinindusert hemolytisk anemi, se nedenfor).

Antireseptor hypersensitivitetsreaksjoner endrer cellulær funksjon som et resultat av bindingen av antistoff til membranreseptorer. I mange sykdommer (for eksempel myastenia gravis, Graves sykdom, insulinresistent diabetes), har antistoffer mot cellemembranreseptorer blitt rapportert. I enkelte diabetespasienter med ekstrem insulinresistens, har det blitt vist antistoffer mot insulinreseptorer som derved forhindrer bindingen av insulin til dens reseptor. I pasienter med Graves sykdom er det blitt identifisert et antistoff mot tyroidstimulerende hormon (TSH) -reseptor som stimulerer virkningen av TSH på dens reseptor og resulterer i hypertyroidisme.

Type III-mekanismer involverer for det meste antistoffer som danner immunkomplekser med antigen. Sirkulerende komplekser aktiverer komplement, binder seg til røde blodceller (som deretter fagocyteres i milten), forlater sirkulasjonen og utløser betennelse i vevsrom (Arthus reaksjon) eller fagocyteres av makrofager som presenterer antigen, frigjør cytokiner og aktiverer B- og T-celler. IgE, IgA, IgG og IgM danner alle komplekser med antigen. Type III-reaksjoner er et resultat av avleiring av immunkomplekser i vev, spesielt huden, ledd og nyrer. Kronisk immunkompleksnefritt gjelder for de fleste tilfeller av glomerulonefritt i mennesker. Tilstander i hvilke immunkomplekser (ICer) synes å spille en rolle, er serumsykdom som følge av serum, medikamenter eller hepatittvirusantigen; systemisk lupus erytematose; reumatoid artritt; polyarteritt; kryoglobulinemi; hypersensitiv pneumonitt; bronkopulmonær aspergillose; akutt glomerulonefritt; kronisk membranproliferativ glomerulonefritt; og assosiert nyresykdom. I bronkopulmonær aspergillose, medikament- eller serumindusert serumsykdom og noen former for nyresykdom, er det antatt at en IgE-mediert reaksjon går foran type III-re aksjonen.

Standard dyremodellene av type III-reaksjoner er den lokale Arthus-reaksjonen og eksperimentell serumsykdom. I Arthus-reaksjonen (vanligvis en lokal hudreaksjon) blir dyrene først hyperimmunisert for å indusere store mengder av sirkulerende IgG-antistoffer og deretter gis dyrene en liten mengde av antigen intradermalt. Antigenet presipiterer med IgG-overskuddet og aktiverer komplement slik at en svært inflammatorisk, ødematøs, smertefull lokal skade raskt opptrer (ved 4 til 6 timer) og kan utvikles til en steril abscess som inneholder mange polymorfonukleære celler og deretter til vevsnekrose. En nekrotiserende vaskulititt med okkludert arteriolar lumina kan ses mikroskipisk. Ingen forsinkelsestid ("lag time") går forut for reaksjonen fordi antistoff allerede er tilstede.

Type I-, II- og III-reaksjoner er forårsaket av antistoffer. Type IV-reaksjoner er forårsaket av T-lymfocytter.

Type IV hypersensitivitet som involverer cellemedierte reaksjoner tar vanligvis 12 eller flere timer å utvikle og er basert på aktiverte immuncellenettverk. Inflammasjon er det grunnleggende vevsmønsteret og kronisk inflammatorisk sykdom kan være resultatet. Type IV hypersensitivitet kalles også forsinket type hypersensitivitet (type IV) eller DTH. Reaksjoner medieres gjennom interleukin-2, interferon-y og andre cytokiner frigjort av T-lymfocytter. I DTH reagerer T-lymfocytter med antigen og frigjør interleukin-9, interferon-y og andre cytokiner. Så snart T-cellene er blitt gjort sensitive av primær eksponering, etterfølges en sekundær utfordring av en forsinket type hypersensitivitetsreaksjon, en lokal betennelsesrespons som tar 2-3 dager å utvikle klinisk. Histologisk består disse reaksjonene av infiltrerende T-lymfocytter, makrofager og av og til eosinofiler. Eksperimentelt kan DTH overføres gjennom T-lymfocytter, men ikke gjennom serum, det vil si at antistoffer ikke er involvert.

DTH kan resultere fra de normale cellemedierte immunresponsene til infeksjon med virus, sopp og visse bakterier, spesielt Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae. Dersom makrofager ikke er i stand til å ødelegge inntatte organismer, kan de gjennomgå differensiering til epiteloide celler eller multinukleære gigantceller. En samling av disse cellene danner en granulom. Lokal vevsskade er en uønsket bivirkning av denne ellers beskyttende immunresponsen. Dersom DTH-responsen er fraværende eller svekket, er imidlertid T-lymfocyttene ikke i stand til å lokalisere den invaderende mikroorganismen og pasienter utvikler invasiv aggressiv spredt sykdom, slik som akutt tuberkulose.

Kontaktdermatitt mot okkuperende og andre antigener er også en type IV-reaksjon. Midler som forårsaker dette er vanligvis av forholdsvis lav molekylvekt (< 1 kD) og er ikke immunogene i seg selv, i stedet har de svært reaktive molekyler som binder seg kovalent til hud eller vevsproteiner. Det sensitiviserende kjemikalet er kjent som et hapten og vertsproteinet det kombineres med som bæreren. Rekkevidden av potensielle sensitiviserende antigener er stor. To faser av patogenese gjenkjennes: Induksjonsfasen og utløsningsfasen. I induksjonsfasen binder antigenpresenterende celler i huden, kjent som Langerhans celler, seg til det haptenbærende proteinkomplekset og presenterer dette for T-lymfocytter i assosiasjon med MHC klasse II-antigen. Induksjon av T-celler kan skje etter måneder med eksponering overfor små mengder av antigen. Re-eksponering overfor det relevante antigenet medfører utløsningsfasen hvor effektorceller migrerer til huden for å møte proteinkomplekset som presenteres av Langerhans celler i epidermis med påfølgende cytokinfrigjøring og hudinflammasjon. Diagnosen av årsaksmiddelet gjøres ved plastertesting. En mistenkt kontaktsensitiviserer påføres på pasientens rygg og tildekkes i 48 timer. Reaksjonssetet undersøkes etter 2 og 24 timer. I en positiv respons er det betennelse og herding ved testsetet.

Forsinket type hypersensitivitet er også en nøkkelmekanisme som bestemmer avstøtningen av transplanterte testorganer.

Enkelte kliniske tilstander hvori type IV-reaksjoner er antatt å være viktige, er kontaktdermatitt, hypersensitivitetspneumonitt, transplantatavstøtning, granulom som følge av intracellulære organisme, enkelte former av medikamentsensitivitet, tyroiditt og encefalomyelitt etter rabiesvaksinering. Bevis for de to siste er basert på eksperimentelle modeller og i human sykdom på tilsynekomsten av lymfocytter i det inflammatoriske eksudat av tyroidet og hjernen.

Dermatitt kalles også eksem. Det relateres til en overfladisk hudinflammasjon,karakteriserthistologisk gjennom epidermødem og klinisk gjennom vesikler (når den er akutt), dårlig avgrenset ("marginated") rødhet, ødem, utsiving av væske, skorpedannelse, flass, uvanlig kløe og "lichenisering" forårsaket av kloring eller gniing.

Ofte refereres eksem til som vesikkeldermatitt, men noen ganger betyr uttrykket begrenset eksem kronisk dermatitt. Noen refererer også til dermatitt som spongiotisk dermatitt fordi spongiose (intraepidermisk ødem) er et histologisk trekk.

Kontaktdermatitt er en akutt eller kronisk inflammasjon, ofte asymmetrisk eller underlig formet, fremkalt av forbindelser som kommer i kontakt med huden og forårsaker toksisk (irriterende) eller allergiske reaksjoner.

Diagnosen av hypersensitive reaksjoner avhenger av typen av involvert reaksjon.

En type IV-reaksjon kan være mistenkt når en inflammatorisk reaksjon erkarakteriserthistologisk gjennom perivaskulære lymfocytter og makrofager. Forsinket hypersensitivitetshudtester og plastertester er de enklest tilgjengelige fremgangsmåtene for å teste forsinket hypersensitivitet.

For å forhindre forverring av kontaktdermatitt, utføres plastertester etter at kontaktdermatitten er borte. Det mistenkte allergenet (i passende konsentrasjon) påføres på huden under et ikke-absorberende klebende plaster og etterlates i 48 timer. Dersom brenning eller kløe utvikles tidlig, fjernes plasteret. En positiv test består av erytem med noe herding og av og til vesikkeldannelse. Fordi enkelte reaksjoner ikke opptrer før etter at plasteret er fjernet, inspiseres setene igjen etter 72 og 96 timer.

Hypersensitivitet kan også opptre som en reaksjon på medikamenter. Før en gitt reaksjon sies å være forårsaket av et medikament, bør det bemerkes at placeboforbindelser også kan forårsake en rekke symptomer og til og med objektive tegn slik som hudutslett. Ikke desto mindre utgjør ekte medikamentreaksjoner et stort medisinsk problem.

I medikamentintoleranse utvikles bivirkningsreaksj onen ved den første anvendelsen av medikamentet. Det kan være den samme toksiske reaksjonen som vanligvis forventes ved høyere doser eller det kan være en forverring av en vanlig mild bivirkning (for eksempel antihistaminsedasjon). Idiosynkrasi er en tilstand hvori bivirkningsreaksj onen ved første anvendelse av medikamentet er farmakologisk uventet og unik.

Karakteristikker for allergiske reaksjoner overfor medikamenter inkluderer IgE-medierte reaksjoner som kun opptrer etter at pasienten har blitt eksponert overfor medikamentet (ikke nødvendigvis for terapi) en eller flere ganger uten noen hendelser. Med en gang hypersensitiviteten er utviklet, kan reaksjonen fremstilles av doser langt under terapeutiske mengder og vanligvis under de nivåer som produserer overfølsomhetsreaksjoner. Kliniske trekk er begrenset i deres manifestasjoner. Hudutslett (spesielt urticaria), serumsykdomslignende syndrom, uventet feber, anafylaksis og eosinofile pulmonære infiltrater som opptrer gjennom medikamentterapi skyldes vanligvis hypersensitivitet; noen tilfeller av anemi, trombocytopeni eller agranulocytose. Sjelden utvikles vaskulitt etter gjentatt eksponering overfor et medikament (for eksempel sulfonamider, jodider, penicillin) og interstitiell nefritt (for eksempel meticillin) og leverskade (for eksempel halotan) er blitt rapportert i tilfeller som er samsvarende med utvikling av spesifikk hypersensitivitet.

Det mest alvorlige eksempelet på medikamenthypersensitivitet er anafylaksis. Imidlertid er den mest vanlige medikamentreaksjonen hovedsakelig et meslinglignende utslett, igjen av ukjent etiologi. Feber og urticariale reaksjoner er også relativt vanlige konsekvenser av medikamentallergi. Når dyresera ble anvendt for terapi, var serumsykdom en komplikasjon, men dyresera anvendes sjelden i dag. Et alvorlig serumsykdomslignende syndrom av ukjent patogenese uten høye nivåer av sirkulerende IgG-antistoff men vanligvis assosiert med IgE-antistoffer kan opptre, spesielt med medikamenter slik som penicillin.

Medikamenthypersensitivitetsreaksjoner er basert på kapasiteten til proteiner og større polypeptidmedikamenter til å stimulere spesifikk antistoffproduksjon gjennom enkle immunologiske mekanismer. Det kanskje minste molekylet som potensielt er antigent er glukagon med en molekylvekt på omtrent 3500. De fleste medikamentmolekyler er mye mindre og kan ikke virke alene som antigener. Som haptener binder imidlertid noen seg kovalent til proteiner og de resulterende konjugatene stimulerer antistoffproduksjon spesifikt for medikamentet. Medikamentet eller ett av dets metabolitter, er kjemisk reaktivt med protein. Serumproteinbindingen som er vanlig for mange medikamenter er mye svakere og med utilstrekkelig styrke for antigenisitet.

Den spesifikke immunologiske reaksjonen har kun blitt bestemt for benzylpenicillin. Dette medikamentet binder seg ikke sterkt nok til vev eller serumproteiner til å danne et antigenkompleks, men dets viktigste degraderingsprodukt, benzylpenicillinsyre, kan kombineres med vevsproteiner for å danne benzylpenicilloyl (BPO), den viktigste antigene determinanten til penicillin. Flere mindre antigene determinanter dannes i relativt små mengder gjennom mekanismer som er mindre godt definerte. Hypersensitivitetsreaksjoner (I, III, III, IV) involver vanligvis BPO-determinanten. IgE-antistoffer mot mindre determinanter kan være ansvarlige for anafylaksis og urticaria i noen pasienter. IgG-antistoffer har blitt funnet mot de større men ikke mot de mindre determinantene. De kan virke som "blokkerende antistoffer" mot BPO, modifisere eller til og med forhindre en reaksjon mot BPO, mens mangelen på blokkerende IgG-antistoffer mot de mindre determinantene kan forklare disse determinantenes evne til å indusere anafylaksis.

Alle halvsyntetiske penicilliner (for eksempel amoksicillin, karbenicillin, tikarcillin) kan kryssreagere med penicillin slik at penicillinsensitive pasienter ofte også reagerer på disse. Kryssreaksjoner skjer med cefalosporiner i en mindre grad. Behandling med et cefalosporin bør startes med stor forsiktighet dersom pasienten har en historie med alvorlige reaksjoner (for eksempel anafylaksis) overfor penicillin.

Hematologisk antistoffmedierte (cytotoksisk, type II) medikamentreaksjoner kan utvikles gjennom enhver av de tre mekanismene: I penicillinindusert anemi reagerer antistoffet med haptenet som er fast bundet til den røde blodcellemembranen, som produserer agglutinering og økt ødeleggelse av røde blodceller. I stibofen- og kinidinindusert trombocytopeni danner medikamentet et løselig kompleks med dets spesifikke antistoff. Komplekset reagerer deretter med nærliggende blodplater (de "uskyldige bivånende" målcellene) og aktiverer komplement som alene forblir på blodplatemembranene og induserer cellelyse. I andre hemolytiske anemier synes medikamentet (for eksempel metyldopa) å endre den røde blodcelleoverflaten kjemisk og derved vise et antigen som induserer og deretter reagerer med et autoantistoff, vanligvis Rh-spesifikt.

Toksiske idiosynkratiske og anafylaktiske reaksjoner er tilstrekkelig unike av type og i tid slik at årsaksmedikamentet vanligvis lett kan identifiseres. Serum sykdomstypereaksjoner skyldes oftest penicillinene, men av og til er sulfonamider, hydralazin, sulfonylureaer eller tiazider ansvarlige. Fotosensitivisering er kjennetegnet av kloropromazin, visse antiseptiske midler i såper, sulfonamider, psoralener, demeclosyklin og griseofulvin. Alle medikamenter bortsett fra de som absolutt er essensielle bør stanses. Når medikamentfeber mistenkes, stanses det mest sannsynlige medikamentet (for eksempel allopurinol, penicillin, isoniazid, sulfonamider, barbiturater, kinidin). Reduksjon i feber i løpet av 48 timer antyder sterkt det medikamentet. Dersom feber følges av granulocytopeni, er medikamenttoksisitet mer sannsynlig enn allergi og er mye mer alvorlig.

Allergiske lungereaksjoner mot medikamenter er vanligvis infiltrative med eosinofili og kan fremkalles av blant annet gullsalter, penicillin og sulfonamider. Den vanligste årsaken til en akutt infiltrerende lungereaksjon er nitrofurantoin. Denne er sannsynligvis allergisk, men vanligvis ikke eosinofilisk.

Hepatiske reaksjoner kan primært være kolestatiske (fenotiaziner og erytromycinestolat er hyppigst involvert) eller hepatocellulær (allopurinol, hydantoiner, gullsalter, isoniazid, sulfonamider, valproinsyre og mange andre). Den vanlige allergiske nyrereaksjonen er indre nefritt, vanligst som følge av meticillin; andre antimikrobielle midler og cimetidin har også vært innblandet.

Et syndrom som ligner på systemisk lupus erytematose kan fremkalles av flere medikamenter, mest vanlig av hydralazin og prokainamid. Syndromet er assosiert med en positiv test for antinukleært antistoff og er relativt godartet og sparer nyrene og CNS. Penicillinamin kan fremkalle SLE og andre autoimmune sykdommer, mest bemerkelsesverdig myastenia gravis.

I 1989 ble en endotoksinindusert serumaktivitet som induserte interferon-y (IFN-y) oppnådd fra musemiltceller beskrevet (Nakamura et al., 1989). Denne serumaktiviteten fungerte ikke som en direkte igangsetter av IFN-y, men snarere som et samstimulerende middel sammen med IL-2 eller mitogener. Et forsøk på å rense aktiviteten fra postendotoksin museserum avslørte et tilsynelatende homogent 50-55 kDa protein. Ettersom andre cytokiner kan virke som samstimulanter for IFN-y-produksjon, ble det antatt at det var en distinkt da nøytraliserende antistoffer mot IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 eller TNF ikke lykkes i å nøytralisere serumaktiviteten. I 1995 viste de samme forskerne at den endotoksininduserte samstimulanten for IFN-y-produksjon var tilstede i leverekstrakter fra mus som var predisponert med P. acnes (Okamura et al., 1995). I denne modellen ekspanderer den hepatiske makrofagpopulasjonen (Kupfferceller) og i disse musene blir en liten dose av bakterielt lipopolysakkarid (LPS) dødelig, og som i ikke-predisponerte mus ikke er dødelig. Faktoren som kalles IFN-y-induserende faktor (IGIF) og senere kalt interleukin-18 (IL-18), ble renset til homogenitet fra 1200 gram av P. acnes-behandlede muselevere. Degenererte oligonukleotider utledet fra aminosyresekvensen av renset IL-18 ble anvendt for å klone et IL-18 muse cDNA. IL-18 er et 18-19 kDa protein med 157 aminosyrer som ikke har noen åpenbare likheter med noe annet peptid i databasene. Budbringer-RNA-forbindelser for IL-18 og interleukin-12 (IL-12) påvises lett i Kupfferceller og aktiverte makrofager. Rekombinant IL-18 induserer IFN-gamma kraftigere enn IL-12, tilsynelatende gjennom en separat reaksjonsvei (Micallef et al., 1996). Lignende til den endotoksininduserte serumaktiviteten, induserer ikke IL-18 IFN-y av seg selv, men fungerer primært som en samstimulant med mitogener eller IL-2. IL-18 forsterker T-celleproliferasjon, tilsynelatende gjennom en IL-2-avhengig reaksjonsvei og forsterker Thl cytokinproduksjon in vitro og har synergis me ved kombinasjon med IL-12 med hensyn til en forsterket IFN-y-produksjon (Maliszewski et al., 1990).

Etter at museformen var klonet ble den humane cDNA-sekvensen for IL-18 rapportert i 1996 (Ushio et al., 1996).

Ved å klone IL-18 fra angrepet vev og studere IL-18-genekspresjon, ble det funnet en klonassosiasjon av dette cytokinet med en autoimmun sykdom. Ikke overvektige diabetiske (NOD) mus utvikler spontant autoimmun insulitt og diabetes som kan akselereres og synkroniseres med en enkelt injeksjon av syklofosfamid. IL-18 mRNA ble demonstrert gjennom revers transkriptase PCR i NOD-musebukspyttkjertelen i tidlige stadier av insulitt. Nivåer av IL-18 mRNA økte raskt etter syklofosfamidbehandling og fikk en økning i IFN-y mRNA og påfølgende diabetes. Det er interessant at denne kinetikken etterligner den til IL-12-p40 mRNA og resulterer i en nær korrelasjon av individuelle mRNA-nivåer. Kloning av IL-18 cDNA fra bukspyttkjertel RNA etterfulgt av sekvensering, avslørte identitet med IL-18-sekvensen klonet fra Kupfferceller og in vivo-preaktiverte makrofager. Også NOD-musemakrofager svarte på syklofosfamid med IL-18 genekspresjon, mens makrofager fra Balb/c-mus behandlet parallelt ikke responderte. IL-18-ekspresjon er derfor unormalt regulert i autoimmune NOD-mus og nært assosiert med diabetesutvikling (Rothe et al., 1997). IL-18 spiller en potensiell rolle i immunregulering eller i betennelse gjennom forsterkning av den funksjonelle aktiviteten til Fas-ligand på Thl-celler (Conti et al., 1997). IL-18 uttrykkes også i binyrebarken ("adrenal cortex") og kan derfor være en utskilt nevroimmunmodulator som spiller en viktig rolle i arrangementet av immunsystemet etterfulgt av en stressende opplevelse (Chater, 1986).

In vivo dannes IL-18 ved kløyving av pro-IL-18 og dets endogene aktivitet synes å gjelde for IFN-y-produksjon i P. acnes og LPS-mediert dødelighet. Modent IL-18 fremstilles fra dets forløper gjennom det IL-l^-konverterende enzymet (IL-lbeta-konverterende enzym, ICE, kaspase-1). IL-18-reseptoren består av i det minste to komponenter som samarbeider i ligandbinding. Høy- og lavaffinitets bindingsseter for IL-18 ble funnet i IL-12-stimulerte T-celler fra mus (Yoshimoto et al., 1998), noe som antyder et multippelt kjedereseptorkompleks. To reseptorunderenheter har blitt identifisert så langt, begge tilhørende IL-l-reseptorfamillien (Parnet et al., 1996). Signaloverføringen av IL-18 involverer aktivering av NF-kB (DiDonato et al., 1997).

Nylig ble et løselig protein med en høy affinitet for IL-18 isolert fra urin fra mennesker, og cDNA fra menneske og mus ble beskrevet (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Proteinet ble kalt IL-18-bindende protein (IL-18BP). IL-18BP er ikke det ekstracellulære domenet til en av de kjente IL-18-reseptorene, men et utskilt, naturlig sirkulerende protein. Det tilhører en ny familie av utskilte proteiner. Denne familien inkluderer ytterligere flere Poxviruskodede proteiner som har en høy homologi med IL-18BP (Novick et al., 1999). IL-18BP uttrykkes konstitutivt i milten, tilhører immunoglobulinsuperfamilien og har begrenset homologi med IL-1 type II-reseptoren. Dets gen ble lokalisert på humant kromosom 1 lql3, og det ble ikke funnet noe ekson som koder for et transmembrant domene i en 8,3 kb genomsekvens (Novick et al., 1999).

Fire humane og to museisoformer av IL-18BP som er et resultat fra mRNA-spleising og funnet i forskjellige cDNA-biblioteker og som har blitt uttrykt, renset og vurdert for binding og nøytralisering av IL-18 biologiske aktiviteter (Kim et al., 2000). Human IL-18BP-isoform a (IL-18BPa) utviste den største affiniteten for IL-18 med en rask påhastighet, en treg avhastighet, og en dissosiasjonskonstant (K(d)) på 399 pM. IL-18BPc deler Ig-domenet med IL-18BPa, bortsett fra den 29 aminosyrer lange C-terminalen; K(d) av IL-18BPc er 10 ganger mindre (2,94 nM). Ikke desto mindre nøytraliserer IL-18BPa og IL-18BPc IL-18 > 95% med et molart overskudd på to. IL-18BPb- og IL-18BPd-isoformene mangler et fullstendig Ig-domene og mangler evnen til å binde eller nøytralisere IL-18. Muse IL-18BPc- og IL-18BPd-isoformene som har det identiske Ig-domenet, nøytraliserer også > 95% muse IL-18 ved et molart overskudd på to. Muse IL-18BPd, som deler et felles C-terminalt motiv med humant IL-18BPa, nøytraliserer også humant IL-18. Molekylær modellering identifiserer et stort blandet elektrostatisk og hydrofobt bindingssete i Ig-domenet til IL-18BP, noe som kan forklare dets høye bindingsaffinitet til liganden (Kim et al., 2000).

I 1998 ble det forslått at ekspresjon av interleukin-18 (IL-18) var innblandet i patogenesen av kontakthypersensitivitet hos mus (Xu et al., 1998). Xu et al. anvendte en musemodell for kontakthypersensitivitet med oksazolon som kontaktallergen og viste en induksjon i IL-18-ekspresjon i hudskader. Høyest oppregulering ble funnet 24 timer etter utfordring med allergenet, deretter sank IL-18-ekspresjonen gradvis.

En ytterligere rapport om IL-18 sin evne til å indusere en DTH-respons uavhengig av IL-18 ble publisert av Kitching et al., 2000. Rollen til IL-18 forblir imidlertid uklar, ettersom IL-18 også ble rapport i seg selv å være en potensielt effektiv terapi for pasienter med atopisk dermatitt (Habu et al., 2001), noe som var på linje med flere kliniske forsøk som foreslo at IFN-y forbedrer symptomer på atopisk dermatitt (Reinhold et al., 1990; Hanifin et al., 1993).

EP110969A, EP0974600A og EP0864585A angår IL-18BP eller anti-IL18-mAb, eller IL-18 reseptorproteiner for anvendelse i behandling av allergi, inflammasjon eller autoimmune sykdommer.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på det funnet at behandling av mus med inhibitorer av IL-18 i en modell av type IV hypersensitivitet resulterer i en svekkelse av hypersensitivitetsreaksjonen i dyret sammenlignet med kontrolldyr. Oppfinnelsen angår derfor anvendelsen av en IL-18-inhibitor i følge krav 1 for fremstillingen av et medikament for behandling og/eller forebygging av hypersensitivitetslidelser. anvendelsen av kombinasjoner av en IL-18-inhibitor med et interferon og/eller en inhibitor av TNF og/eller inhibitorer av inflammasjon og/eller antiallergiske medikamenter, er også omfattet ifølge oppfinnelsen. I et ytterligere aspekt angår oppfinnelsen anvendelsen av en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen til en IL-18-inhibitor for behandlingen og/eller forebyggingen av hypersensitivitetstilstander. Oppfinnelsen angår ytterligere anvendelsen av celler som er genetisk konstruert for å uttrykke IL-18-inhibitorer for forebyggingen og/eller behandlingen av hypersensitivitetslidelser.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 viser at behandlingen med IL-18BP gjennom utfordring beskytter mot kontakthypersensitivitet (CHS). Mus ble gjort følsomme med DNFB på ryggen ved dag 0 og utfordret tidligst fem dager senere. Øresvelling ble målt daglig og uttrykt som økningen i svelling av DNFM-utfordringen versus vehikkelbehandlet kontrolløret. Behandling med 250 fig IL-18BP i.p. per mus daglig ved dagene 5 til 8 reduserte markert øresvelling (A), mens behandling ved dagene 0 til 2 ikke var beskyttende i denne eksperimentelle utformingen (B) (n = 5 mus pr gruppe). Kvadrater: IL-18BP-behandlede mus, trekanter: Kontroll, det vil si saltbehandlede dyr. Figur 2 viser graden av øresvelling fra dag 5 til dag 30 etter først haptenutfordring ved dag 5 og en andre utfordring ved dag 19 i en forsinket type hypersensitivitetsmodell med systemisk administrering av 250 ng/mus/dag IL-18BP (åpne kvadrater) eller vehikkel (fylte kvadrater) fra dagene 19 til 22. Figur 3 viser at IL-18BP beskytter mot CHS gjennom nøytralisering av IL-18. IL-18-svikt (KO) og villtype C57BL/6-mus ble sammenlignet for deres evne til å fremkalle en CHS-respons. Mus med IL-18-svikt utviklet CHS mot DNFB selv om det var mindre uttalt enn i villtype mus. Ingen effekt av IL-18BP-behandling ble imidlertid observert i mus med IL-18-svikt, noe som indikerer at den antiinflammatoriske virkningen av IL-18BP i CHS skyldes nøytralisering av IL-18. (n = 5 mus pr gruppe). Sirkler: Saltoppløsning i IL-18 KO-mus; diamanter: IL-18BP i IL-18 KO-mus;

kvadrater: IL-18BP i villtype (WT) mus; trekanter: Saltoppløsning i WT-mus.

Figur 4 viser at IL-18BP ikke reduserer vaskulær lekkasje i løpet av CHS. CHS

ble indusert i C57BL/6-mus. For å overvåke ødem forårsaket av CHS-reaksjonen, ble Evansblått injisert i.v. 2 timer forut for utfordring med DNFB. Mus ble ofret 24 timer senere og ører behandlet for å ekstrahere fargestoffet som hadde lekket fra vaskulaturen og akkumulert i det omkringliggende vevet. Vaskulær lekkasje ble vurdert som mengden av

fargestoff pr mg tørket ørevev korrigert for konsentrasjonen av Evansblått i serumet og uttrykt som forholdet mellom utfordret versus kontrolløre. Mens behandling med IL-18BP ved dag 4 og dag 5 redusert svelling med 56% av de vehikkelbehandlede kontrollene (venstre panel, p < 0,01), var det ingen signifikant forskjell i vaskulær lekkasje mellom disse to gruppene. Begge gruppene viste signifikant økt ødem sammenlignet med den ikke sensitiviserte kontrollgruppen (p < 0,05 og p < 0,01). Som en ytterligere kontroll, ble mus behandlet med 250 fig av det irrelevante proteinet BSA pr dyr og dag. Disse musene utviklet CHS lik de vehikkelbehandlede kontrolldyrene (n = 10 mus pr gruppe).

Figur 5 IL-18BP-behandling reduserte inflammatorisk infiltrasjon av det DNFB-utfordrede øret. CHS ble indusert i C57BL/6-mus som beskrevet. Dyrene ble IL-18BP- eller vehikkelbehandlet ved dagene 4 til 6. IL-18BP-behandlingen reduserte svellingen med 58% av vehikkelkontrollen ved dag 7. Mus ble ofret på dag 7, utfordrede ører oppsamlet, samlet i gruppe (n = 8) og enzymfordøyd for å oppnå enkle cellesuspensjoner. Celler blekarakterisertgjennom påfølgende FACS-analyse rettet mot CD45-positive levende celler. Antallet apT-celler, NK-celler, nøytrofiler og

monocytter/makrofager funnet i ørepreparatene, ble uttrykt som prosent av totale celler analysert (øvre verdier). Reduksjonen av disse celletypene etter IL-18BP-behandling relativ til vehikkelkontrollen, er gitt i nedre figurer. Figur 6 viser at T-celleaktivering svekkes ved IL-18BP-behandling. Celler oppnådd fra DNFB-utfordrede ører ble igjen stimulert ved 2 x 10<5>pr brønn med platebundet anti-CD3-antistoff. Intet ytterligere IL-18BP ble tilsatt i løpet av den påfølgende 24 timers dyrkningsperioden. IFNy-produksjon ble målt i triplikat ved hjelp av ELISA. Cellene oppnådd fra IL-18BP-behandlede mus fremstilte kun 45% av IFNy funnet i cellekulturene av celler fra vehikkelbehandlede kontrolldyr. Figur 7 viser at IL-18BP-behandling reduserer antallet av IFNy-produserende celler i det inflammatoriske infiltratet av øret. Cellepreparater fra DNFB-utfordrede ører ble stimulert med 50 ng/ml PMA<*>og 500 ng/ml ionomycin i 4 timer. Cytokinsekresjon ble blokkert ved tilsetningen av 2Hg/ml brefeldin A i minst 2 timer av inkuberingen. Celler ble deretter utsatt for flerfarget immunfluorescensfarging for intracellulær IFNy og overflateantigener. IL-18BP-behandlingen reduserte det totale antallet av celler positive for IFNy-farging til 78% av vehikkelkontrollen. IFNy ble fremstilt fra CD8 T-celler og i en mindre grad fra CD4 T-celler. Intet

IFNy ble påvist i NK-celler og aPT-celler. (n.d., ikke påvist;<*>Phorbol 12-myristat 13-acetat).

Figur 8 IL-18BP-behandling svekker ikke rekrutteringen av Langerhans celler til den tappende lymfeknuten. Mus ble farget med haptenet FITC eller oppløsningen aceton/dibutylftalat (1:1) på henholdsvis høyre og venstre side. Lymfeknuter i lysken ble oppsamlet 24 timer etter fargingen. Haptenkonjugerte Langerhansceller kunne påvises ved hjelp av FACS som FITC+, CD1 lc+-celler i lymfeknuten som tapper den FITC-fargede siden, men ikke i den kontralaterale lymfeknuten som tapper flanken farget kun med vehikkel. Forholdet av haptenbærende Langerhansceller i den tappende lymfeknuten var 1,2% av totale lymfeknuteceller i dyr behandlet med IL-18BP 24 timer og 1 time forut for fargingen. Dette skilte seg ikke signifikant fra antallet oppnådd med kontrollbehandlede dyr. (n = 5 tappende lymfeknuter pr gruppe).

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen er basert på funnet at en IL-18-inhibitor utviser en fordelaktig virkning på helbredelsen fra haptenutfordring i en musemodell av type IV hypersensitivitet.

Oppfinnelsen angår derfor anvendelsen av en IL-18-inhibitor i følge krav lfor fremstillingen av et medikament for behandling og/eller forebygging av hypersensitivitetslidelser.

Innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelsen, anvendes uttrykkene "hypsersensitivitetslidelse" og "allergisk lidelse" som synonymer. Begge uttrykkene angår lidelser eller reaksjoner forårsaket av en upassende adaptiv immunrespons. Hypersensitivitetsreaksjoner er resultatet av normalt fordelaktige immunresponser som virker upassende mot fremmede antigener slik som for eksempel vanlige miljømessige makromolekyler som kan føre til betennelsesreaksjoner og vevsskade. I hypersensitivitetslidelser utløser et normalt harmløst stimuli, allergenet, en immunrespons som ved reeksponering reaktiverer og danner patologisk skade.

Hypersensitivitetslidelser så vel som deres kliniske symptomer og implikasjoner har blitt beskrevet i detalj i "Bakgrunn for oppfinnelsen" og anvendelsen ifølge oppfinnelsen angår hypersensitivitetslidelsene nevnt deri.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, velges hypersensitivitetslidelsen fra gruppen som består av lidelser med type IV hypersensitivitetsreaksjoner.

Lidelser med type I hypersensitivitet kalles blir også kalt umiddelbar hypersensitivitet eller vanlig allergi. Hypersensitiviteten er IgE-mediert. Umiddelbare hypersensitivitets (type I)-reaksjoner skyldes bindingen mellom antigen og IgE på mastceller eller basofiler. Innenfor betydningen av lidelser med type I hypersensitivitetreaksjoner, er atopiske lidelser slik som, allergisk rhinitt, allergisk konjunktivitt, atopisk dermatitt, allergisk ytre astma, urticaria, systemisk anafylaksis. Anafylaksis er alvorlig, livstruende allergisk reaksjon som følge av type I (umiddelbar) hypersensitivitet.

Type II eller cytotoksisk hypersensitivitet involverer cytolytiske virkninger mediert gjennom antistoff, komplement og/eller cellulære mekanismer. Antistoff til cellebundet antigen (type II) forårsaker celleødeleggelse ved å aktivere komplement eller fremme fagocytose. Lidelser med type II hypersensitivitet omfatter for eksempel Coombs positive hemolytiske anemier, antistoffindusert trombocytopenisk purpura, leukopeni, pemfigus, pemfigoid, Goodpastures syndrom og ondartet anemi. Disse reaksjonene kan opptre i pasienter som mottar uforenlige transfusjoner, i hemolytiske sykdommer til nyfødte og i neonatal trombocytopeni, og de kan også spille en rolle i multisystemiske hypersensitivitetslidelser (for eksempel systemisk lupus erytematose, SLE).

Lidelser med type III hypersensitivitet involverer reaksjoner hvori antistoffer danner immunkomplekser med antigen. Sirkulerende komplekser aktiverer komplement, angriper røde blodceller som deretter fagocyteres i milten, forlater sirkulasjonen og utløser betennelses i vevsrom. Denne reaksjonen kalles Arthusreaksjon. Alternativt fagocyteres komplekser av makrofager som presenterer antigen, frigjør cytokiner og aktiverer B- og T-celler. IgE, IgA, IgG og IgM danner alle komplekser med antigen. Type III-reaksjoner resulterer vanligvis fra avleiringer av immunkomplekser i vev, spesielt huden, ledd og nyrer. Kronisk immunkompleksnefritt er ansvarlig for de fleste tilfellene av glomerulonefritt i mennesker. I henhold til oppfinnelsen, omfatter hypersensitivitetslidelser av type III for eksempel serumsykdom som følge av serum, medikamenter eller hepatittvirusantigen; SLE; reumatoid artritt (RA); polyarteritt; kryoglobulinemi; hypersensitiv pneumonitt; bronkopulmonær aspergillose; akutt glomerulonefritt; kronisk membranproliferativ glomerulonefritt; og assosiert nyresykdom.

Lidelser med type IV hypersensitivitet involverer cellemedierte reaksjoner og tar vanligvis 12 eller flere timer å utvikle. Type IV hypersensitivitetslidelser kan involvere betennelse, og kronisk betennelsessykdom kan være resultatet. Type IV hypersensitivitet kalles også forsinket type hypersensitivitet eller DTH. Så snart T-cellene har blitt sensitivisert gjennom primær eksponering, følger en sekundær utfordring ved en forsinket type hypersensitivitetsreaksjon. Denne reaksjonen er en lokal betennelsesrespons som noen ganger tar 2-3 dager å utvikle klinisk.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er hypersensitivitetslidelsen forsinket type hypersensitivitet. Oppfinnelsen angår følgelig alle typer av kliniske tilstander hvori type IV-reaksjoner er viktige, slik som forsinket type kontakthypersensitivitet, dermatitt, kontaktdermatitt, hypersensitivitetspneumonitt, transplantatavstøtning, granulom som følge av intracellulære organismer, enkelte former for medikamentsensitivitet, tyroiditt og encefalomyelitt etter rabiesvaksinering.

DTH kan være et resultat av den normale cellemedierte immunresponsen mot infeksjon med virus, sopp og visse bakterier, spesielt Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium leprae. Ytterlige eksterne midler som fremkaller DTH kan være plante-, dyre-, insekts- eller reptilsekresjoner, kjemiske eller biokjemisk antigener. De kan utledes fra syntetiske eller naturlige kilder. Forskjellige typer av fibere, stoffer slik som lateks anvendt i kirurgiske hansker, kan utløse T-cellemediert hypersensitivitetsreaksjon i visse individer. De forårsakende eksterne midlene kan være vannbårne midler slik som oppløste salter og mineraler, omfattet for eksempel i miljøet, gruvedrift, metallurgiske eller kjemiske fremstillingsoperasjoner.

I en annen foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, er hypersensitivitetslidelsen kontaktdermatitt eller kontakthypersensitivitet. Kontaktdermatitt, også en type IV-reaksjon, er en reaksjon overfor ervervsmessige og andre antigener. Midler som fremkaller kontaktdermatitt er vanligvis av forholdsvis lav molekylvekt (< 1 kD) og ikke immunogene i seg selv, i stedet er de svært reaktive molekyler som binder seg kovalent til hud- eller vevsproteiner. Det sensitiviserende kjemikaliet kalles et hapten og vertsproteinet det danner forbindelse med kalles bæreren. Mange haptener som fremkaller kontaktdermatitt er kjent. For å finne ut hvorvidt et individ vil utvikle kontaktdermatitt mot et gitt sensitiviserende middel, påføres et mistenkt kontaktsensitiviserende middel på pasientens rygg og dekkes i 48 timer. Reaksjonssetet inspiseres etter 2 og 24 timer. I en positiv respons er det betennelse og herding ved testsetet.

Forsinket type hypersensitivitet er også en nøkkelmekanisme som bestemmer avstøtningen av transplanterte testorganer, og oppfinnelsen angår derfor videre anvendelsen av en IL-18-inhibitor for å forebygge transplantatavstøtning.

Uttrykket "inhibitor av IL-18" innenfor rammen av denne oppfinnelsen henviser til ethvert molekyl i følge krav 1 som modulerer IL-18-produksjon og/eller virker på en slik måte at IL-18-produksjon og/eller virkning svekkes, reduseres eller delvis, i alt vesentlig eller fullstendig forhindres eller blokkeres. Uttrykket "IL-18-inhibitor" er ment å omfatte inhibitorer av IL-18-produksjon så vel som inhibitorer av IL-18-virkning.

En produksjonsinhibitor kan være ethvert molekyl som negativt påvirker syntesen, prosesseringen eller modningen av IL-18. Inhibitorene som kommer i betraktning i henhold til oppfinnelsen kan for eksempel være genekspresjonsundertrykkere av interleukin IL-18, antisens mRNA-forbindelser som reduserer eller forhindrer transkripsjonen av IL-18 mRNA eller medfører degradering av mRNA, proteiner som svekker korrekt folding eller som delvis eller i alt vesentlig forhindrer IL-18-sekresjon, proteaser som degraderer IL-18 så snart det har blitt syntetisert, inhibitorer av proteaser som kløyver pro-IL-18 for å danne modent IL-18, slik som inhibitorer av kaspase-1.

En inhibitor av IL-18-virkning kan for eksempel være en IL-18-antagonist. Antagonister kan enten binde seg til eller skille ut IL-18-molekylet selv med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet for delvis eller i alt vesentlig å nøytralisere IL-18 eller IL-18-bindingssete(r) som er ansvarlig for IL-18-binding til dets ligander (slik som for eksempel dets reseptorer). En antagonist kan også inhibere IL-18-signalreaksjonsveien som aktiveres inne i cellene ved IL-18/reseptorbinding.

Inhibitorer av IL-18-virkning kan også være løselige IL-18-reseptorer eller molekyler som etterligner reseptorene, eller midler som blokkerer IL-18-reseptorene eller IL-18-antistoffer, slik som polyklonale eller monoklonale antistoffer, eller ethvert annet middel eller molekyl som forhindrer bindingen av IL-18 til dets mål, og derved ødelegger eller forhindrer igangsettingen av de intra- eller ekstracellulære reaksjonene mediert av IL-18.

I en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er IL-18-inhibitoren som definert i følge krav 1.

Uttrykket "IL-18-bindende proteiner" som anvendt heri er synonymt med "IL-18-bindingsprotein" eller "IL18BP". Det omfatter IL-18-bindende proteiner som definert i WO 99/09063 eller i Novick et al., 1999, som inkluderer spleisevarianter og/eller isoformer av IL-18-bindingsproteiner som definert i Kim et al., 2000, som binder seg til IL-18. Spesielt er humane isoformer a og c av IL-18BP anvendelige i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Proteinene som er anvendelige ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan være glykosylerte eller ikke-glykosylerte, de kan være utledet fra naturlige kilder slik som urin, eller de kan fortrinnsvis fremstilles rekombinant. Rekombinant ekspresjon kan utføres i prokaryote ekspresjonssystemer slik som E. coli eller i eukaryote og fortrinnsvis i pattedyrekspresjonssystemer.

Som anvendt heri, henviser uttrykket "muteiner" til analoger av et IL-18BP eller analoger av et virus IL-18BP hvori en eller flere av aminosyrerestene av et naturlig IL-18BP eller virus IL-18BP er erstattet av forskjellige aminosyrerester eller er deleterte, eller en eller flere aminosyrerester er tilsatt til den naturlige sekvensen av IL-18BP, eller et virus IL-18BP, uten betydelig å endre aktiviteten til de resulterende produktene sammenlignet med villtype IL-18BP eller virus IL-18BP. Disse muteinene fremstilles ved hjelp av kjente syntese- og/eller ved hjelp av seterettede mutageneseteknikker eller ved enhver annen kjent teknikk egnet for dette.

Muteiner inkluderer proteiner som er kodet for av en nukleinsyre slik som DNA eller RNA, som hybridiserer til DNA eller RNA, som koder for et IL-18BP eller koder for et virus IL-18BP i henhold til den foreliggende oppfinnelsen under stringente betingelser. Uttrykket "stringente betingelser" henviser til hybridisering og påfølgende vaskebetingelser slik som de fagfolk vanligvis henviser til som "stringente". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§ 6.3 og 6.4 (1987, 1992) og Sambrook et al., supra. Uten begrensning inkluderer eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20°C under den beregnede Tm til hybridet som studeres, i for eksempel 2 x SSC og 0,5% SDS i 5 minutter, 2 x SSC og 0,1% SDS i 15 minutter; 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 37°C i 30-60 minutter og deretter en 0,1 x SSC og 0,5% SDS ved 68°C i 30-60 minutter. Fagfolk på området forstår at stringente betingelser også avhenger av lengden til DNA-sekvensen, oligonukleotidprobene (slik som 10-40 baser) eller blandingen av oligonukleotidprober. Dersom blandede prober anvendes, er det foretrukket å anvende tetrametylammoniumklorid (TMAC) i stedet for SSC. Se Ausubel, supra.

Identitet reflekterer et forhold mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser bestemt ved sammenligning av sekvensene. Generelt henviser identitet til en eksakt nukleotid til nukleotid- eller aminosyre til aminosyre-korrespondanse mellom henholdsvis de to polynukleotid- eller polypeptidsekvensene over den lengden av sekvensene som sammenlignes.

For sekvenser hvor det ikke er en eksakt korrespondanse, kan en "% identitet" bestemmes. Generelt sammenstilles de to sekvensene som skal sammenlignes for å gi en maksimal korrelasjon mellom sekvensene. Dette kan inkludere å sette inn "gap" i enten den ene eller begge sekvensene for å øke sammenstillingsgraden. En % identitet kan bestemmes over hele lengden av hver av sekvensene som sammenlignes (såkalt global sammenstilling) som er spesielt egnet for sekvenser av lik eller svært lik lengde, eller over kortere definerte lengder (såkalt lokal sammenstilling) som er mer egnet for sekvenser av ulik lengde.

Fremgangsmåter for å sammenligne identiteten og homologien til to eller flere sekvenser er velkjente. For eksempel er følgende programmer tilgjengelige i Wisconsin sekvensanalysepakken, versjon 9.1 (Devereux J et al., 1984), for eksempel programmene BESTFIT og GAP kan anvendes for å bestemme % identitet mellom to polynukleotider og % identitet og % homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT anvender den "lokale homologi"-algoritmen til Smith og Waterman (1981) og finner den beste enkle regionen av likhet mellom to sekvenser. Andre programmer for å bestemme identitet og/eller likhet mellom sekvenser er også kjent, for eksempel BLAST-programfamilien (Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, tilgjengelig gjennom hjemmesiden til NCBI ved www.ncbi.nlm.nih.gov) og FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Ethvert slikt mutein har fortrinnsvis en aminosyresekvens som er tilstrekkelig egnet for fordobling med en IL-18BP eller tilstrekkelig egnet for fordobling med et virus IL-18BP, slik at den har i alt vesentlig den samme aktiviteten som IL-18BP. En aktivitet til IL-18BP er dets kapasitet til å binde IL-18. Så lenge som muteinet i alt vesentlig har bindingsaktivitet til IL-18, kan det anvendes i rensingen av IL-18, slik som ved hjelp av affinitetskromatografi og følgelig betraktes å ha i alt vesentlig lik aktivitet som IL-18BP. Følgelig kan det bestemmes hvorvidt et gitt mutein i alt vesentlig har den samme aktiviteten som IL-18BP ved hjelp av rutineeksperimentering som omfatter å utsette et slikt mutein for for eksempel en enkel "sandwich" konkurranseanalyse for å bestemme hvorvidt eller ikke det binder seg til et passende merket IL-18, slik som radioimmunanalyse eller ELISA-analyse.

Ethvert slikt mutein i det minste 40% identitet eller homologi med sekvensen til enten et IL-18BP eller en viruskodende IL-18BP-homolog som definert i WO 99/09063. Mer foretrukket har det i det minste 50%, i det minste 60%, i det minste 70%, i det minste 80% eller mest foretrukket i det minste 90% identitet eller homologi dertil.

Muteiner av IL-18BP-polypeptider eller muteiner av virus IL-18BP, eller nukleinsyrer kodende derfor, inkludert et endelig sett av i alt vesentlig korresponderende sekvenser som substitusjonspeptider eller polynukleotider som rutinemessig kan oppnås av fagfolk uten vesentlig eksperimentering basert på læren og rettledningene presentert heri.

Foretrukne muteinendringer er de som er kjent som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyresubstitusjoner av IL-18BP-polyepeptider eller -proteiner eller virus IL-18BP kan inkludere synonyme aminosyrer innenfor en gruppe som har tilstrekkelig like fysiokjemiske egenskaper slik at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil bevare den biologiske funksjonen til molekylet (Grantham, 1974). Det er klart at innsettinger og delesjoner av aminosyrer også kan utføres i de ovenfor nevnte sekvenser uten å endre deres funksjon, spesielt dersom innsettingen eller delesjonen kun involverer et fåtall aminosyrer, for eksempel under 30, og fortrinnsvis under 10 og ikke fjerner eller flytter aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, som for eksempel cysteinrester. Proteiner og muteiner fremstilt gjennom slike delesjoner og/eller innsettinger omfattes av den foreliggende oppfinnelsen.

De synonyme aminosyregruppene er fortrinnsvis de som er definert i tabell 1. Mer foretrukket er de synonyme aminosyregruppene de som er definert i tabell 2; og mest foretrukket er de synonyme aminosyregruppene de som er definert i tabell 3.

Eksempler på produksjon av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan anvendes for å oppnå muteiner av IL-18BP-polypeptider eller proteiner, eller muteiner av virus IL-18BP inkluderer alle kjente fremgangsmåtetrinn slik som de presentert i US-patentene 4,959,314, 4,588,585 og 4,737,462 til Mark et al; 5,116,943 til Koths et al., 4,965,195 til Nåmen et al; 4,879,111 til Chong et al; og 5,017691 til Lee et al; og lysinsubstituerte proteiner presentert i US patent nr. 4,904,584 (Shaw et al).

Uttrykket "kondensert protein" henviser til et polypeptid som omfatter et IL-18BP eller et virus IL-18BP eller et mutein eller et fragment derav, kondensert med et annet protein som for eksempel har en forlenget oppholdstid i kroppsvæsker. Et IL-18BP eller et virus IL-18BP kan følgelig kondenseres til et annet protein, polypeptid eller lignende, for eksempel et immunoglobulin eller et fragment derav.

"Funksjonelle derivater" som anvendt heri dekker derivater av IL-18BP eller et virus IL-18BP eller deres muteiner og kondenserte proteiner som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder på restene eller de N- eller C-terminale gruppene ved hjelp av kjente midler og er inkludert i oppfinnelsen så

lenge de forblir farmasøytisk akseptable, det vil si at de ikke ødelegger aktiviteten til proteinet som i alt vesentlig er lik aktiviteten til IL-18BP eller virus IL-18BP, og som ikke gir preparatet som inneholder det toksiske egenskaper.

Disse derivatene kan inkludere polyetylenglykolsidekjeder som kan maskere antigene seter og forlenge oppholdstiden til et IL-18BP eller et virus IL-18BP i kroppsvæsker. Det beskrives også heri andre derivater som inkluderer alifatiske estere av karboksylgrupper, amider av karboksylgrupper gjennom omsetting med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater av frie aminogrupper av aminosyrerestene dannet med acylenheter (for eksempel alkanoyl-eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (for eksempel de til seryl- eller treonylrestene) dannet med acylenheter.

Som "aktive fraksjoner" av et IL-18BP eller et virus IL-18BP, kondenserte proteiner, dekker den foreliggende oppfinnelsen ethvert fragment eller forløper av

polypeptidkjeden til proteinmolekylet alene eller sammen med assosierte molekyler eller rester bundet dertil, for eksempel sukker- eller fosfatrester eller aggregater av proteinmolekylet eller sukkerrestene gjennom dem selv, forutsatt at nevnte fraksjon i alt vesentlig har lik aktivitet som IL-18BP.

Uttrykket "salter" heri henviser til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper av IL-18-inhibitormolekyl eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved hjelp av kjente midler og inkluderer uorganiske salter, for eksempel natrium-, kalsium-, ammonium-, jern-eller sinksalter, og salter med organiske baser som for eksempel de dannet med aminer slik som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain. Syreaddisjonssalter inkluderer for eksempel salter med mineralsyrer slik som for eksempel saltsyre eller svovelsyre og salter med organiske syrer slik som for eksempel eddiksyre eller oksalsyre. Selvfølgelig må alle slike salter bibeholde den biologiske aktiviteten til IL-18-inhibitoren som er relevant for den foreliggende oppfinnelsen, slik som å utøve en fordelaktig virkning på for eksempel DHT.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform, er inhibitoren av IL-18 et IL-18-antistoff. Anti-IL-18-antistoffer kan være polyklonale eller monoklonale, kimære, humaniserte eller til og med fullstendig humant. Rekombinante antistoffer og fragmenter derav er kjennetegnet gjennom høy affinitetsbinding til IL-18 in vivo og lav toksisitet. Antistoffene er kjennetegnet gjennom deres evne til å behandle pasienter i et tidsrom som er tilstrekkelig til å ha en god til ypperlig tilbakegang eller lindring av den patogene tilstanden eller ethvert symptom eller gruppe av symptomer relatert til en patogen tilstand og en lav toksisitet.

Nøytraliserende antistoffer dannes lett i dyr slik som kaniner, geiter eller mus gjennom immunisering med IL-18. Immuniserte mus er spesielt anvendelige for å tilveiebringe kilder av B-celler for fremstilling av hybridomer som igjen dyrkes for å fremstille større mengder av anti-IL-18 monoklonale antistoffer.

Kimære antistoffer er immunoglobulinmolekyler kjennetegnet gjennom to eller flere segmenter eller deler utledet fra forskjellige dyrearter. Generelt er den variable regionen av det kimære antistoffet utledet fra et ikke-humant pattedyrantistoff, slik som monoklonalt antistoff fra mus, og den konstante immunoglobulinregionen er utledet fra et humant immunoglobulinmolekyl. Begge regionene og kombinasjonen har fortrinnsvis lav immunogenisitet som rutinemessig bestemt (Elliott et al., 1994). Humaniserte antistoffer er immunoglobulinmolekyler som er dannet gjennom genteknologiske teknikker hvori de konstante museregionene er erstattet med humane motparter mens den antigene bindingsregionen fra mus bibeholdes. Det resulterende muse-humane kimere antistoffet har fortrinnsvis redusert immunogenisitet og forbedret farmakokinetikk i mennesker (Knight et al., 1993).

I en ytterligere foretrukket utførelsesform er følgelig IL-18-antistoffet et humanisert IL-18-antistoff. Foretrukne eksempler på humaniserte anti-IL-18-antistoffer er for eksempel beskrevet i den europeiske patentsøknaden EP 0 974 600.

I enda en ytterligere foretrukket utførelsesform, er IL-18-antistoffet fullstendig humant. Teknologien for å fremstille humane antistoffer er beskrevet i detalj i for eksempel WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 eller AU5336100. Fullstendig humane antistoffer er rekombinante antistoffet, fortrinnsvis fremstilt i transgene dyr, for eksempel xenomus som omfatter alle eller deler av funksjonelle humane immunoglobulinloki.

I en svært foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er IL-18-inhibitoren et IL-18BP som definert i krav 1.

Sekvensene til IL-18BP og dets spleisevarianter/isoformer kan tas fra WO99/09063 eller fra Novick et al., 1999, så vel som fra Kim et al., 2000.

Funksjonelle derivater av IL-18BP kan være konjugert til polymerer for å forbedre egenskapene til proteinet slik som stabiliteten, halveringstiden, biotilgjengeligheten, det humane legemets toleranse eller immunogenisitet. For å oppnå dette målet, kan IL-18BP være bundet til for eksempel polyetylenglykol (PEG). PEGylering kan utføres ved hjelp av kjente fremgangsmåter som for eksempel er beskrevet i WO 92/13095.

I en foretrukket utførelsesform omfatter følgelig det funksjonelle derivatet i det minste en enhet bundet til en eller flere funksjonelle grupper som opptrer som en eller flere sidekjeder på aminosyrerestene. En utførelsesform hvori enheten er en polyetylenglykol (PEG) -enhet, er svært foretrukket.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, omfatter IL-18-inhibitoren en immunglobulinfusjon, det vil si at IL-18-inhibitoren er et kondensert protein som omfatter alle eller deler av et IL-18-bindende protein som er kondensert til alle eller en del av et immunglobulin. Fremgangsmåter for å fremstille immunglobulinfusjonsproteiner er velkjente, for eksempel slik som de som er beskrevet i WO 01/03737. Fagfolk på området vil forstå at det resulterende fusjonsproteinet ifølge oppfinnelsen bibeholder den biologiske aktiviteten til IL-18BP, spesielt bindingen til IL-18. Fusjonen kan være direkte eller via et kortere linkerpeptid som kan være så kort som 1 -3 aminosyrerester i lengde eller lengre, for eksempel 13 aminosyrerester i lengde. Nevnte linker kan være et tripeptid av sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) for eksempel, eller en 13 aminosyrer lang linkersekvens som omfatter Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introdusert mellom IL-18BP-sekvensen og immunglobulinsekvensen. Det resulterende fusjonsproteinet har forbedrede egenskaper slik som en forlenget oppholdstid i kroppsvæsker (halveringstid), økt spesifikk aktivitet, økt ekspresjonsnivå eller forenklet rensing av fusjonsproteinet.

I en foretrukket utførelsesform kondenseres IL-18BP til den konstante regionen av et Ig-molekyl. Fortrinnsvis kondenseres det til den tunge kjederegionen slik som for eksempel CH2- og CH3-domenene til humant IgGl. Dannelsen av spesifikke fusjonsproteiner som omfatter IL-18BP og en del av et immunglobulin er beskrevet i eksempel 11 i WO 99/09063. Andre isoformer av Ig-molekyler er også egnet for fremstillingen av fusjonsproteiner i henhold til foreliggende oppfinnelsen, slik som isoformene IgG2eller IgG4, eller andre Ig-klasser, slik som IgM eller IgA for eksempel. Fusjonsproteiner kan være monomere eller multimere, hetero- eller homomultimere.

Interferoner er fortrinnsvis kjent for inhibitoriske virkninger på virusreplikasjon og cellulær proliferasjon. For eksempel spiller interferon-y en viktig rolle i å fremme immun- og inflammasjonsresponser. Interferon p (IFN-p, et interferon type I) sies å spille en antiinflammatorisk rolle.

Oppfinnelsen angår derfor anvendelsen av en kombinasjon av en inhibitor av IL-18 og et interferon i fremstillingen av et medikament for behandlingen av hypsersensitivitetslidelser.

Interferoner kan også konjugeres til polymerer for å forbedre stabiliteten til proteinene. Et konjugat mellom interferon p og polyolen polyetylenglykol (PEG) har blitt beskrevet i for eksempel W099/55377.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen er interferonet interferon-p (IFN-p) og mer foretrukket IFN-p la.

Inhibitoren av IL-18-produksjon og/eller -virkning anvendes fortrinnsvis samtidig, sekvensielt eller separat med interferonet.

I enda en ytterligere utførelsesform av oppfinnelsen anvendes en inhibitor av IL-18 i kombinasjon med en TNF-antagonist. TNF-antagonister utøver sin virkning på flere måter. For det første kan antagonister binde seg til eller isolere TNF-molekylet selv med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet for delvis eller i alt vesentlig å nøytralisere TNF-epitopen eller epitopene som er ansvarlige for TNF-reseptorbinding (heretter kalt "isoleringsantagonister"). En isoleringsantagonist kan for eksempel være et antistoff rettet mot TNF.

Alternativt kan TNF-antagonister inhibere TNF-signaliseringsreaksjonsveien aktivert gjennom celleoverflatereseptorer etter TNF-binding (heretter kalt "signaliseringsantagonister").

Begge grupper av antagonister er anvendelige, enten alene eller sammen, i kombinasjon med en IL-18-inhibitor, i terapien av hypersensitivitetslidelser.

TNF-antagonister identifiseres lett og vurderes gjennom rutineanalyse av kandidater for deres virkning på aktiviteten til naturlig TNF på mottakelige cellelinjer in vitro, for eksempel humane B-celler hvori TNF forårsaker proliferasjon og immunglobulinsekresjon. Analysen inneholder TNF-formulering med forskjellige fortynninger av kandidatantagonist, for eksempel fra 0,1 til 100 ganger den molare mengden av TNF anvendt i analysen og kontroller uten TNF eller bare antagonist (Tucci et al., 1992).

Isoleringsantagonister er fortrinnsvis TNF-antagonistene som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Blant isoleringsantagonistene er de polypeptidene som binder TNF med høy affinitet og besitter lav immunogenisitet foretrukket. Løselige TNF-reseptormolekyler og nøytraliserende antistoffer mot TNF er spesielt foretrukket. For eksempel er løselig TNF-RI og TNF-RII anvendelige i den foreliggende oppfinnelsen. Forkortede former av disse reseptorene, omfattende de ekstracellulære domenene av reseptorene eller funksjonelle deler derav, er mer spesielt foretrukne antagonister i henhold til den foreliggende oppfinnelsen. Forkortede løselige TNF type-I- og type-II-reseptorer er beskrevet i for eksempel EP914431.

Forkortede former av TNF-reseptorene er løselige og har blitt påvist i urin og serum som 30 kDa og 40 kDa TNF-inhibitoriske bindingsproteiner som kalles henholdsvis TBPI og TBPII (Engelmann et al., 1990). Samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse av IL-18-inhibitoren med TNF-antagonisten og/eller et interferon er foretrukket ifølge oppfinnelsen.

Ifølge oppfinnelsen er TBPI og TBPII foretrukne TNF-antagonister som anvendes i kombinasjon med en IL-18-inhibitor. Derivater, fragmenter, regioner og biologisk aktive deler av reseptormolekylene som funksjonelt ligner reseptormolekylene kan også anvendes ifølge oppfinnelsen. Slike biologisk aktive ekvivalenter eller derivater av reseptormolekylene henviser til den delen av polypeptidet eller sekvensen som koder for reseptormolekylet som er av tilstrekkelig størrelse og er i stand til å binde TNF med en slik affinitet at interaksjonen med den membranbundne TNF-reseptoren inhiberes eller blokkeres.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform, er humant løselig TNF-RI (TBPI) den TNF-antagonisten som anvendes ifølge oppfinnelsen. De naturlige eller rekombinante løselige TNF-reseptormolekylene og fremgangsmåter for deres fremstilling er blitt beskrevet i de europeiske patentene EP 308 378, EP 398 327 og EP 433 900. IL-18-inhibitoren kan anvendes samtidig, sekvensielt eller separat med TNF-inhibitoren.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, omfatter medikamentet ytterligere et antiinflammatorisk middel, slik som et NS AID (ikke-steroidale antiinflammatoriske medikamenter). I en foretrukket utførelsesform anvendes en COX-inhibitor, mest foretrukket en COX-2-inhibitor, i kombinasjon med en IL-18-inhibitor. COX-inhibitorer er kjent i teknikkens stand. Spesifikke COX-2-inhibitorer er for eksempel beskrevet i WO 01/00229. De aktive komponentene kan anvendes samtidig, sekvensielt eller separat.

Hypersensitivitetsreaksjoner behandles ofte med antiallergiske medikamenter slik som antihistaminer, kromolyn, glukokortikoider eller sympatomimetiske midler. Den foreliggende oppfinnelsen angår derfor ytterligere kombinasjonsterapi omfattende en inhibitor av IL-18 og et antiallergisk medikament. Anvendelsen av et antihistamin og/eller kromolyn og/eller et glukokortikoid og/eller et sympatomimetisk middel for separat, sekvensiell eller samtidig anvendelse med en inhibitor av IL-18, er foretrukket i henhold til den foreliggende oppfinnelsen.

I en ytterligere foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, anvendes inhibitoren av IL-18 i en mengde på omtrent 0,0001 til 1000 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,001 til 100 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 0,1 til 5 mg/kg eller omtrent 1 til 3 mg/kg kroppsvekt. IL-18-inhibitoren i henhold til den foreliggende oppfinnelsen administreres fortrinnsvis topisk, det vil si lokalt. For for eksempel kontaktdermatitt, kan IL-18-inhibitoren administreres direkte på det påvirkede området av huden.

I en annen utførelsesform av oppfinnelsen administreres IL-18-inhibitoren systemisk og fortrinnsvis subkutant eller intramuskulært.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen av en inhibitor av IL-18 i fremstillingen av et medikament for forebyggingen og/eller behandlingen av hypersensitivitetslidelser. En genterapitilnærming er følgelig vurdert for å levere IL-18-inhibitoren til setet hvor den er nødvendig. For å behandle og/eller forhindre en hypersensitivitetslidelse kan genterapivektoren som omfatter sekvensen til en inhibitor av IL-18-produksjon og/eller -virkning injiseres direkte til det syke vevet for eksempel, og dermed unngå problemer involvert med systemisk administrering av genterapivektorer, slik som fortynning av vektorene, å kunne nå og treffe målcellene eller -vevet, og bivirkninger.

Anvendelsen av en vektor for å indusere og/eller øke den endogene produksjonen av en inhibitor av IL-18 i en celle som normalt ikke uttrykker en IL-18-inhibitor, eller som uttrykker mengder av inhibitoren som ikke er tilstrekkelig, er også omfatte ifølge oppfinnelsen. Vektoren kan omfatte regulatoriske sekvenser som fungerer i cellene som det er ønskelig skal uttrykke inhibitoren av IL-18. Slike regulatoriske sekvenser kan for eksempel være promotorer eller forsterkere. Den regulatoriske sekvensen kan introduseres i det høyre lokus av genomet ved hjelp av homolog rekombinasjon og derved operativt binde den regulatoriske sekvensen med genet, hvis ekspresjon avhenger av å bli indusert eller forsterket. Teknologien henvises vanligvis til som "endogen genaktivering" (EGA) og er beskrevet i for eksempel WO 91/09955.

Det skal forstås av fagfolk på området at det også er mulig å avslutte IL-18-ekspresjon direkte uten å anvende en inhibitor av IL-18 med den samme teknikken. For å gjøre det, kan et negativt regulering se lement som for eksempel et dempende element ("silencing element") introduseres i genlokuset til IL-18, og dermed medfører nedregulering eller forhindrer IL-18-ekspresjon. Fagfolk på området vil forstå at slik nedregulering eller demping av IL-18-ekspresjon har den samme effekten som anvendelsen av en IL-18-inhibitor for å forhindre og/eller behandle sykdom.

Oppfinnelsen angår videre anvendelsen av en celle som har blitt genetisk modifisert for å fremstille en inhibitor av IL-18 i fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forebyggingen av hypersensitivitetslidelser.

Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske preparater, spesielt anvendelige for forebygging og/eller behandling av hypersensitivitetslidelser, som omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en inhibitor av IL-18 og/eller en terapeutisk effektiv mengde av et interferon og/eller en farmasøytisk effektiv mengde av en TNF-inhibitor og/eller en farmasøytisk effektiv mengde av et antiinflammatorisk middel og/eller en farmasøytisk effektiv mengde av et antiallergisk middel, spesielt et antihistamin. IL-18BP, kondenserte proteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner i følge krav 1, er foretrukne aktive ingredienser av de farmasøytiske sammensetningene.

Interferonet omfattet i den farmasøytiske sammensetningen er fortrinnsvis IFN-|5.

I ytterligere en annen foretrukket utførelsesform, omfatter den farmasøytiske sammensetningen terapeutisk effektive mengder av en inhibitor av TNF alfa. Den farmasøytiske sammensetningen ifølge oppfinnelsen kan ytterligere omfatte en eller flere COX-inhibitorer.

Definisjonen "farmasøytisk akseptabel" er ment å omfatte enhver bærer som ikke påvirker effekten av den biologiske aktiviteten til den aktive ingrediensen og som ikke er toksisk for verten som den administreres til. For eksempel kan de aktive proteinene/proteinet formuleres i en enhetsdoseform for injeksjon i bærere så som saltoppløsning, dekstroseløsning, serum albumin og Ringers løsning for parenteral administrering.

De aktive ingrediensene av det farmasøytiske preparatet ifølge oppfinnelsen kan administreres til et individ på en rekke forskjellige måter. Administreringsrutene inkluderer intradermale-, transdermale- (for eksempel i langsom frigjørende formuleringer), intramuskulære-, intraperitoneale-, intravenøse-, subkutane-, orale-, intrakraniale-, epidurale-, topiske-, rektale- og intranasale ruter. Enhver annen terapeutisk effektiv administreringsrute kan anvendes, for eksempel absorpsjon gjennom epitel- eller endotelvev eller ved hjelp av genterapi hvori et DNA-molekyl som koder for det aktive middelet administreres til pasienten (for eksempel via en vektor) som forårsaker at det aktive middelet uttrykkes og utskilles in vivo. I tillegg kan proteinene ifølge oppfinnelsen administreres sammen med andre komponenter av biologisk aktive midler slik som farmasøytisk akseptable overflateaktive midler, eksipienter, bærere og dilluenter og vehikler.

For parenteral (for eksempel intravenøs, subkutan, intramuskulær) administrering kan de aktive proteinene/proteinet formuleres som en løsning, suspensjon, emulsjon eller lyofilisert pulver i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel parenteral vehikkel (for eksempel vann, saltoppløsning, dekstroseløsning) og additiver som opprettholder isotonisitet (for eksempel mannitol) og kjemisk stabilitet (for eksempel konserveringsmidler og buffere). Formuleringen steriliseres ved hjelp av vanlig anvendte teknikker.

Biotilgjengeligheten til det aktive proteinet/proteinene i henhold til den foreliggende oppfinnelsen kan også bedres ved anvendelse av konjugeringsprosedyrer som øker halveringstiden til molekylet i menneskekroppen, for eksempel ved å binde molekylet til polyetylenglykol som beskrevet i PCT patentsøknaden WO 92/13095.

De terapeutisk effektive mengdene av det aktive proteinet/proteinene vil være en funksjon av mange variabler, inkludert typen antagonist, affiniteten til IL-18-antagonisten, enhver cytotoksisk restaktivitet utøvet av antagonistene, administreringsruten, pasientens kliniske tilstand (inkludert ønsket om å opprettholde et ikke-toksisk nivå av endogen IL-18-aktivitet).

En "terapeutisk effektiv mengde" er en slik som når den administreres, resulterer IL-18-inhibitoren i hemming av den biologiske aktiviteten til IL-18. Den administrerte dosen som enkel eller multiple doser til et individ vil variere avhengig av en rekke faktorer, inkludert IL-18-inhibitorens farmakokinetiske egenskaper, administreringsruten, pasientens tilstand og egenskaper (kjønn, alder, kroppsvekt, helse, størrelse), grad av symptomer, pågående behandling, behandlingsfrekvens og ønsket effekt. Justering og manipulering av etablerte doseområder er velkjent for fagfolk på området, så vel som in vitro og in vivo metoder for å bestemme IL-18-inhiberingen i et individ.

Ifølge oppfinnelsen anvendes IL-18-inhibitoren i en mengde på omtrent 0,001 til 100 mg/kg eller omtrent 0,01 til 10 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,1 til 5 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 1 til 3 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 2 mg/kg kroppsvekt.

Administreringsruten om foretrekkes ifølge oppfinnelsen, er administrering gjennom subkutan rute. Intramuskulær administrering er videre foretrukket ifølge oppfinnelsen. For å administrere IL-18-inhibitoren direkte til virkningsstedet, er det foretrukket å administrere den topisk.

I ytterligere foretrukne utførelsesformer administreres IL-18-inhibitoren daglig eller annenhver dag.

De daglige dosene gis vanligvis i delte doser eller i forsinkede frigjøringsformer for effektivt å oppnå de ønskede resultatene. Andre eller påfølgende administreringer kan utføres ved en dose som er lik, mindre eller større enn den innledende eller forrige dosen som administreres til individet. En andre eller påfølgende administrering kan administreres i løpet av eller forut for sykdommens begynnelse.

Ifølge oppfinnelsen kan IL-18-inhibitoren administreres profylaktisk eller terapeutisk til et individ forut for, samtidig med eller sekvensielt med andre terapeutiske regimer eller midler (for eksempel multiple medikamentregimer), i en terapeutisk effektiv mengde, spesielt med et interferon og/eller en TNF-inhibitor og/eller andre antiinflammatoriske midler slik som en COX-inhibitor og/eller et antiallergisk middel. Aktive midler som administreres samtidig med andre terapeutiske midler, kan administreres i den samme eller i forskjellige sammensetninger.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstillingen av et farmasøytisk preparat som omfatter blanding av en effektiv mengde av en IL-18-inhibitor og/eller et interferon og/eller en TNF-antagonist og/eller en COX-inhibitor med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for behandling av hypersensitivitetslidelser som omfatter administrering av en farmasøytisk effektiv mengde av en IL-18-inhibitor til en pasient med behov for dette.

EKSEMPLER

Eksempel 1: IL- 18BP- behandling reduserer kontakthypersensitivitet

Metoder

Musemodeller av eksperimentelt indusert kontakthypersensitivitet (CHS) ble anvendt i alle eksemplene nedenfor. Graden av CHS måles ved hjelp av øresvelling som respons på et lokalt påført sensitiveringsmiddel.

Museøresvellingstesten som ble anvendt for å danne dataene presentert i figurene 1 til 3 (se nedenfor) er blitt beskrevet i detalj (Garrigue et al., 1994). Kort fortalt ble mus gjort sensitive ved topisk påføring av 25 \ il 0,5% 2,4-dinitrofluorbenzen (DNFB; Sigma Chemical Co.) løsning i aceton/olivenolje (4:1) til den barberte buken (dag 0). Fem dager senere ble 20 (il av 0,2% DNFB i den samme oppløsningen påført på høyre øre og vehikkel alene på venstre øre.

Alle mottok mus daglig fra dag 5 til dag 8 enten 250 (ig/mus/dag av rhIL-18BP (rekombinant humant IL-18BP) eller saltoppløsning i kontrollgruppen intraperitonealt (i.p.) (figur 1 A), eller de mottok IL-18BP ved dagene 0 til 2 (figur

IB).

Øretykkelse ble målt med en gradert ("dial") tykkhetsmåler (Mitutoyo Corp., Kawasaki, Japan) og øresvelling ble estimert ved å trekke verdien før utfordring fra verdien etter utfordring og ved ytterligere å trekke fra enhver svelling påvist i det løsningsutfordrede kontralaterale øret.

Øresvelling ble målt på dagene 0, 5, 6, 7, 8, 9, 12, 14 og 16.

En annen modell ble anvendt for å danne dataene presentert i figurene 4 til 6, se eksemplene nedenfor. IL-18-bindingsprotein (IL-18BP) ble anvendt for å nøytralisere IL-18 under eksperimentelt indusert kontakthypersensitivitet (CHS) mot 2,4-dinitrofluorbenzen (DNFB). Det eksperimentelle oppsettet var som følger:

1. Dag 0: Sensitivering

25 (il DNFB (0,5% i aceton/olivenolje (4/1) som bærer) på barbert rygg.

2. Dag 5: Utfordring

5 (il DNFB (0,2%) hver på bakre og buksiden av det høyre øret 5 (il vehikkel hver på bakre og buksiden av det venstre øret.

3. Dag 6 ff: Avlesing (" readout")

Overvåk øretykkelse som et mål på inflammasjon.

Uttrykk skår som økning i svelling [(im] av utfordring mot kontrolløre.

4. Dag 6 eller 7: Bearbeid ører for analyse

I denne modellen topper svellingen mellom dag 6 og dag 7. IL-18 ble nøytralisert ved daglige injeksjoner av 250 (ig IL-18BP (i saltoppløsning) pr dyr, enten gjennom sensitivering ved dag 0, dag 1 og dag 2, eller gjennom utfordring ved dag 4, dag 5 og dag 6.

Resultater

Kontakthypersensitivitetsresponser (CHS) er haptenspesifikke hudbetennelser mediert gjennom T-celler. De fleste haptener gir opphav til en oligoklonal T-cellerespons bestående hovedsakelig av CD8<+>effektor T-celler, mens CD4<+>T-celler har en nedregulerende rolle i CHS-responsen (Bour, H., et al. 1995; Grabbe et al., 1998). For å teste funksjonen til IL-18 i CHS ble mus epikutant senstivisert med DNFB og deretter utfordret 5 dager senere med haptenapplikasjon på ørehud. Samtidig med haptenutfordringen ble mus injisert i.p. med enten 250 (ig/mus/dag rhIL-18BP eller med saltoppløsning. IL-18BP eller saltoppløsning som kontroll ble administrert daglig i 3 dager, ved dagene 5 til 8 etter den første DNFB-sensitiviseringen (dag 0). DNFB-utfordring ved dag 5 induserte signifikant øresvelling i begge grupper (figur 1 A). Svellingsgraden i mus behandlet med saltoppløsning (trekanter) var mye mer uttalt enn i mus behandlet med IL-18BP (kvadrater) og gikk tilbake til nesten normal tilstand allerede ved dag 9.

Endringen i øresvelling observert med IL-18BP-behandling ved dagene 0 til 2 var ikke statistisk signifikant (figur 1 B). Timingen av IL-18BP-administrering synes å være en viktig faktor for å oppnå en fordelaktig virkning av IL-18BP-behandling.

Konklusjon:

I denne etablerte musemodellen for kontakthypersensitivitet/kontaktdermatitt, hadde en tre dagers behandling med en IL-18-inhibitor en signifikant fordelaktig virkning på graden av svelling/inflammasjon fremkalt gjennom behandling med et hapten.

Eksempel 2: IL18BP- behandling reduserer kontakthypersensitivitet etter en andre utfordring

Fremgangsmåter

C57BL/6-mus ble gjort følsomme gjennom epikutan påføring av 25 fil 0,5% DNFB-løsning på den barberte buken (dag 0). Musene mottok en første utfordring med 20 \ il av 0,2% DNFB på ørene ved dag 5. Ved dag 19 mottok musene en andre utfordring med DNFB. Øresvelling ble målt ved dagene 0 (haptensensitivisering), 5 (første haptenutfordring), 6, 7, 8, 9, 12, 14, 16, 19 (andre haptenutfordring), 20, 21, 22, 23, 26, 28 og 30. Gjennomsnittsverdier med SD for hver gruppe er presentert i figur 2. Musene ble behandlet daglig enten med 250 (ig/mus/dag IL-18BP i.p.

(n = 5; figur 2 åpne kvadrater) eller med saltoppløsning (n = 5; figur 2, lukkede kvadrater fra dag 19 til dag 23).

Resultat

Som vist i figur 2, reduserte IL-18BP-behandling signifikant øresvelling, spesielt etter den andre utfordringen med hapten. IL-18BP-terapi er derfor spesielt egnet for terapi av hypersensitivitetslidelser, hvori pasienter vanligvis gjentatt utfordres med det samme allergenet og må behandles for å overkomme betennelsesreaksjonene fremkalt av utfordringene.

Eksempel 3: IL- 18BP beskytter mot CHS gjennom nøytralisering av IL- 18

For å verifisere at beskyttelsen mot svelling som er observert med IL-18BP-behandling skyldtes nøytraliseringen av IL-18, ble mus med IL-18-svikt (KO) og villtype C57BL/6-mus sammenlignet for sin evne til å fremkalle en CHS-respons. Mus med IL-18-svikt utviklet CHS mot DNFB selv om det var mindre uttalt enn hos villtypemus. Ingen effekt av IL-18BP-behandling ble imidlertid observert i mus med IL-18-svikt som vist i figur 3, hvilket indikerer at den antiinflammatoriske virkningen av IL-18BP i CHS skyldes nøytraliseringen av IL-18 (n = 5 mus pr gruppe).

Eksempel 4: IL- 18BP reduserer ikke vaskulær lekkasje

Fremgangsmåter

CHS ble indusert i C57BL/6-mus som beskrevet ovenfor. For å overvåke ødem forårsaket av CHS-reaksjonen, ble Evansblått injisert i.v. 2 timer forut for utfordring med DNFB. Mus ble ofret 24 timer senere og ører bearbeidet for å ekstrahere fargestoffet som hadde lekket fra vaskulaturen og akkumulert i det omkringliggende vevet. Vaskulær lekkasje ble vurdert som mengden av fargestoff pr mg tørket ørevev korrigert for konsentrasjon av Evansblått i serum og uttrykt som forholdet mellom utfordring versus kontrolløre. Mens behandling med IL-18BP ved dag 4 og dag 5 reduserte svelling med 56% av vehikkelbehandlede kontroller (figur 4, venstre søyle, p < 0,01), var det ingen signifikant forskjell i vaskulær lekkasje mellom de to gruppene (figur 4, høyre søyle). Begge gruppene viste signifikant økning av ødem sammenlignet med den ikke sensitiviserte kontrollgruppen (p < 0,05 og p < 0,01). Som en ytterligere kontroll ble mus behandlet med 250 \ i$ irrelevant protein BSA pr dyr og dag. Disse musene utviklet CHS slik som de vehikkelbehandlede kontrolldyrene (n = 10 mus pr gruppe).

In vivo analyse for vaskulær lekkasje ( Evansblått)

Prinsipp: Injeksjon (iv) av Evansblått og ekstraksjon fra målvev (øre)

Rådata å vurdere:

• Standardkurve for Evansblått (OD62o/ng)

• Konsentrasjon av Evansblått i blod (henholdsvis OD62o/ml eller fig/ml)

• Vekt av tørket ørevev (lpsi og kontralateral, mg)

• Innhold av Evansblått i ører (lpsi og kontralateral, henholdsvis OD62o/fig eller ng/mg)

Protokoll i kombinasjon med DNFB- indusert CHS:

• ved dag 5 av eksperimentelt indusert CHS injiseres 100 fil Evansblått"" iv retroorbitalt 2 timer forut for utfordring av mus med DNFB

• injisert IL-18BP i.p. 1 time forut for utfordring

• ved dag 6 (24 timer etter øreutfordring med DNFB) måes svelling og dyrene avlives

• blodprøver tas og bearbeides som følger:

a 7,5 mg/ml Evansblått (X 2129) i fysiologisk NaCl, 100 jil, iv

°tilsett 30 fil seram til 970 fil formamid (— > 1/33 fortynning)

°bestem OD ved 620 nm (-► 1 OD62otilsvarer 33 OD62o/ml)

høst ipsilateral og kontralateralt øre og bearbeid som følger:

» tørk i 24 timer ved 80°C

°bestem tørrvekt

°finhakk og ekstraher fargestoff med 1 ml formamid, forsiktig risting i

24 timer ved 55°C

°filtrer for å fjerne rester^, fyll små skåler, la stå ved romtemperatur i

flere timer for å tillate lipider å flyte til overflaten

°bestem OD ved 620 nm

Verdier som skal beregnes:

Resultater:

I hovedsak er det to prosesser som bidrar til svellingen som observeres gjennom CHS-reaksjonen. Lekkasjen av væske fra vaskulaturen inn i omkringliggende vev forårsaker ødem og bloduttredelse fra inflammatoriske celler fra blodårene til vevsskadestedet.

Ved anvendelse av Evansblått som en markør, ble det vist at til tross for den totale reduksjonen av svelling, reduserte ikke behandlingen med IL-18BP vaskulær lekkasje (figur 4).

p Prøvefremstillingsfilter Whatman 5 nm PTFE-sikt, #6984.0350

Eksempel 5: IL- 18BP- behandling reduserer den infiammatoriske infiltrasjonen og IFNy- produksjonen i DNFB- utfordret øre

Fremgangsmåter

CHS ble indusert i C57BL/6-mus som beskrevet. Dyrene ble IL-18BP- eller vehikkelbehandlet ved dagene 4 til 6. IL-18BP-behandling reduserte svellingen til 58% av vehikkelkontrollen ved dag 7. Mus ble ofret ved dag 7, utfordrede ører oppsamlet, samlet i grupper (n = 8) og enzymfordøyd for å oppnå enkle cellesuspensjoner. Celler blekarakterisert vedpåfølgende FACS-analyse rettet mot CD45-positive levende celler. Antallet apT-celler, NK-celler, nøytrofiler og monocytter/makrofager funnet i ørepreparatene er uttrykt som prosent av totalt analyserte celler. Reduksjonen av disse celletypene etter IL-18BP-behandling relativ til vehikkelkontrollen ble også beregnet.

For måling av IFNy-produksjon, ble celler oppnådd fra DNFB-utfordrede ører re-stimulert ved 2 x IO<5>pr brønn med platebundet anti-CD3-antistoff. Intet ytterligere IL-18BP ble tilsatt gjennom den påfølgende 24 timers dyrkningsperioden. IFNy-produksjon ble målt i triplikat ved hjelp av ELISA.

Cellepreparater fra DNFB-utfordrede ører ble stimulert med 50 ng/ml PMA<*>og 500 ng/ml ionomycin i 4 timer. Cytokinsekresjon ble blokkert ved tilsetningen av 2Hg/ml brefeldin A i i det minste 2 timer av inkuberingen. Celler ble deretter utsatt for multifarge immunfluorescensfarging for intracellulært IFNy og overflateantigener. IFNy ble produsert av CD8 T-celler og i en mindre grad av CD4 T-celler. Intet IFNy ble påvist i NK-celler og yST-celler. (n.d., ikke påvist;<*>forbol 12-myristat 13-acetat).

Fremstilling av enkel cellesuspensjon

Enzymfordøying av museører for å oppnå enkel cellesuspensjon var basert på protokollene til Schuler, G. og Steinman, R.M. (1985) og Stingi et al. (1983).

1. kutt ører, fordel 5 ører pr preparering

2. rens med 70% etanol

3. fordel ved hjelp av en skalpell

4. plasser dermal side ned på 7,5 ml HBSS<1>ved 37°C

5. tilsett 5 ml av 2,5% trypsin (10x) for å oppnå endelig konsentrasjon på 1%<1>Hanks balanserte saltløsning uten Ca<2+>og Mg<2+>(GIBCO #14170.070)

6. inkuber i 35 minutter ved 37°C

7. overfør ørehalvdeler med dermal side ned til en nylonsikt (cellefordeler) plassert i 10 ml HBSS/80% FCS på is og sikt forsiktig for å løsne cellene fra ekstracellulær matrise

8. fjern sikter med store rester

9. vask 2 ganger med kald HBSS/10% FCS

10. tell celler

FACS- analyse

1. resuspender celler i FACS fargebuffer<3>, alle påfølgende trinn på is

2. anvend IO<6>celler pr farging

3. tilsett 1 fig FC-blokkering, 10 minutter

4. tilsett anti-CD45-antistoff i kombinasjon med antistoffer rettet mot markører av interesse, 1 fig hver, 30 minutter

5. vask 2 ganger

6. oppnå 0,5 x IO<6>totale hendelser ved FACS

7. analyser spesifikke markører etter fasting på CD45+, levende celler Resultater

For å undersøke det inflammatoriske infiltratet ved utfordringssetet, ble enkle cellesuspensjoner tilberedt fra naturlige og utfordrede ører analysert ved hjelp av

FACS, festet på CD45+ levende celler (figur 5). CD45+-cellene som var tilstede på de naturlige ørene ble vist å være hovedsakelig yST-celler og dendrittiske hudceller. Det inflammatoriske infiltratet var etter 24 timers utfordring sammensatt av CD8 og CD4 T-celler, nøytrofiler, monocytter og NK-celler, og hvor det totale antallet CD45+-celler i øret økte med omtrent to ganger. Tilsvarende til reduksjonen i svelling, reduserte IL-18BP-behandling det totale antallet leukocytter som infiltrerte utfordringssetet. Dette påvirket alle de forskjellige celletypene i det inflammatoriske infiltratet. Reduksjonen var på mellom 20% og 40% avhengig av celletypen.

Ytterligere karakterisering av mengden av infiltratet som ble oppnådd fra ørene av IL-18BP-behandlede mus avslørte en svekket IFNy-produksjon ved anti-CD3-

2 2,5% trypsin/EDTA (10x) (GIBCO #35400-027) 3 1% fosterserum albumin i fosfatbufret saltoppløsning restimulering (figur 6). FACS-analyse viste at IFNy hovedsakelig var produsert av CD8 T-celler og i mindre mengder av CD4 T-celler. Det er interessant at NK-celler og yoT-celler ikke bidro til IFNy-produksjonen (figur 7).

Eksempel 6: IL- 18BP svekker ikke rekrutteringen av Langerhans celler Fremgangsmåte: Mus ble farget med hapten FITC (50 fil av en 4 mg/ml løsning) eller oppløsningen aceton/dibutylftalat (1:1) på henholdsvis høyre og venstre flanke. Lymfeknutene fra lysken ble oppsamlet 24 timer etter fargingen. Haptenkonjugerte Langerhansceller bør kunne påvises gjennom FACS som FITC+, CD1 lc+-celler i lymfeknuten som tømmer den FITC-fargede siden, men ikke i den kontralaterale lymfeknuten som tømmer den flanken som kun var farget med vehikkel. (n = 5 tømmende lymfeknuter pr gruppe).

Resultater:

Migreringen av Langerhansceller (LC) som bærer antigen mot den tømmende lymfeknuten er avhengig av de proinfiammatoriske cytokinene IL-lp og TNFa og regulert av kaspase-1 (Antonopoulos et al, 2001; Kimber et al., 1992). Tilsvarende har IL-18 blitt antatt å bidra til LC-trafikk (Cumberbatch et al., 2001). Behandling med IL-18BP kan derfor svekke LC-rekruttering og derfor redusere immunresponsen mot DNFB gjennom utfordringsfasen. For å teste denne hypotesen, ble mus farget med haptenet FITC eller vehikkelen på henholdsvis den høyre og venstre siden. Hud som tapper lymfeknuter fra lysken ble oppsamlet 24 timer etter fargingen og antallet FITC+-celler pr lymfeknute ble vurdert. Behandlingen av dyrene med IL-18BP 24 timer og 1 time forut for fargingen, endret ikke antallet haptenbærende LC tilstede i den tappede lymfeknuten 24 timer etter fargingen (figur 8). Derfor er det ikke noe stort bidrag fra IL-18 på LC-trafikken i denne modellen.

Eksempel 7: IL- 18BP reduserer graden av forsinket type hypersensitivitet i en annen musemodell av DTH

Fremgangsmåter

Forsinket type hypersensitivitet

Mus ble gjort følsomme ved hjelp av intravenøs injeksjon av IO<6>BALB/c-splenocytter og utfordret på dag 5 med 13 x IO<6>BALB/c-splenocytter (50 \ sX PBS) i den høyre fotputen. Venstre kontrollfotpute mottok 50 fil PBS. Høyre fotputesvelling ble beregnet på forskjellige dager ved å trekke fra verdien før utfordring og enhver svelling målt i venstre fotpute fra verdien etter utfordring.

For adoptive overføringseksperimenter, ble cellesuspensjoner fra lymfeknuter av BALB/c-splenocyttsensitiviserte eller ubehandlede kontrolldyr uttynnet i B220<+->og CD8<+->celler ved hjelp av inkubering med rotte antimuse B220-FITC og CD8-FITC etterfulgt av separering i MACS-kolonner med paramagnetisk anti-FITC mikrokuler (Miltenyi Biotech, Auburn, California, USA). Eluerte CD4<+>T-celleberikede preparater injiseres i halevenen til mottakermus (2 x IO<7>celler/mus). Etter 16 timer ble mus utfordret ved å injisere 13 x IO<6>BALB/c-splenocytter (uten røde blodceller) inn i høyre fotputer og svelling ble overvåket gjennom de etterfølgende dagene.

Resultater

Forsinket type hypersensitivitet (DHT) frembrakt gjennom CD4<+>T-celler med tydelige nedregulatoriske virkninger av CD8<+>T-celler (Grabbe et al., 1998). Oppførselen til CD4<+>T-celler fra mus behandlet med IL-18BP studeres i en DTH-modell. C57BL/6-dyr ble gjort følsomme ved hjelp av intravenøs injeksjon av IO<6>allogene BALB/c-splenocytter. Fem dager senere ble 13 x IO<6>BALB/c-splenocytter injisert inn i høyre fotputer sammen med enten 10 mg/kg rekombinant humant IL-18BP i.p. eller vehikkel. Lokal inflammasjon ble målt ved å bestemme fotputesvelling ved 24 timer.

REFERANSER

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997. 2. Antonopoulos, C, M. Cumberbatch, R.J. Dearman, R.J. Daniel, I. Kimber and R.W. Groves. 2001. Functional caspase-1 is required for Langerhans cell migration and optimal contact sensitization in mice. J Immunol 166: 3672-3677. 3. Bour, H., et al. 1995. Major histocompatibility complex class I-restricted CD8 + T cells and class II-restriced CD4 + T cells, respectively, mediate and regulate contact sensitivity to dinitrofluorobenzene. Eur. J. Immunol. 25: 3006-3010. 4. Chater, K.F. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54. 5. Conti, B., J.W. Jahng, C. Tinti, J.H. Son, and T.H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272: 2035-2037. 6. Cumberbatch, M., R.J. Dearman, C. Antonopoulos, R.W. Groves, and I. Kimber. 2001. Interleukin (IL)-18 induces Langerhans cell migration by a tumour necrosis factor-alpha- and IL-lbeta-dependent mechanism. Immunology 102: 323-330.

7. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

8. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517. 9. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127. 10. Engelmann, H., D. Novick, and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor-binding proteins purified from human urine. Evidence for immunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265: 1531-1536. 11. Garrigue JL, Nicolas JF, Fraginals R, Benezra C, Bour H, Schmitt D. Contact Dermatitis 1994 Apr; 30(4): 231-7. 12. Grabbe, S., and Schwarz, T. 1998. Immunoregulatory mechanisms involved in elicitation of allergic contact hypersensitivity. Immunol. Today. 19: 37-44. 13. Habu et al., J. Immunol. 2001, 166: 5439-5347.

14. Hanifin et al. (1993). J. Am. Acad. Dermatol. 28: 189.

15. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proe Nati Acad Sei U S A 2000; 97: 1190-1195. 16. Kimber, I. andM. Cumberbatch. 1992. Stimulation of Langerhans cell migration by tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha). J Invest Dermatol. 99: 48S-50S. 17. Maliszewski, C.R., T.A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S.K. Dower, J. Slack, M.P. Beckmann, and K.H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144: 3028-3033. 18. Micallef, M.J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26: 1647-51 issn: 0014-2980. 19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb; 57(2): 590-5. 20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136. 21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oet; 63(10): 3966-72. 22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1995), J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

23. Reinhold et al. (1990). Lancet 335: 1282.

24. Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H. J Clin Invest 1997 Feb 1; 99(3): 469-74. 25. Schuler, G. and Steinman, R.M. (1985). Murine epidermal Langerhans cells mature into potent immunostimulatory dendritic cells in vitro. J Exp. Med. 757, 526-546. 26. Stingi, L.A., Sauder, D.N., Iijima, M., Wolff, K., Pehamberger, H., and Stingi, G. (1983). Mechanism of UV-B-induced impairment of the antigen-presenting capacity of murine epidermal cells. J Immunol 130, 1586-1591. 27. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J. Immunol. 148, 2778-2784. 28. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1; 156(11): 4274-9. 29. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

30. Xu et al. (1998). J. of Interferon and Cytokine Research 18: 653-659.

Claims (17)

1. Anvendelse av en IL-18-inhibitor for fremstillingen av et medikament for behandling og/eller forebygging av en type IV-hypersensitivitetslidelse, hvori IL 18-inhibitoren er valgt fra: IL-18-bindende protein (IL-18BP), et IL-18-BP kondensert til et immunglobulin eller et fragment derav, hvori det kondenserte proteinet binder til IL-18, et funksjonelt derivat av IL-BP, hvori IL-18BP er bundet til polyetylenglykol (PEG), eller aktiv fraksjon derav med liknende aktivitet som IL-18BP.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori hypersensitivitetslidelsen er forsinket type hypersensitivitet.

3. Anvendelse ifølge krav 1 eller 2, hvori hypersensitivitetslidelsen er kontakthypersensitivitet.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori medikamentet ytterligere omfatter et interferon for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvori interferonet er interferon-p.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori medikamentet ytterligere omfatter en inhibitor eller tumor nekrosefaktor (TNF) for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse.

7. Anvendelse ifølge krav 6, hvori inhibitoren av TNF er TBP I og/eller TBP II.

8. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori medikamentet ytterligere omfatter et antiinflammatorisk middel for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse.

9. Anvendelse ifølge krav 8, hvori det antiinflammatoriske middelet er en COX-inhibitor.

10. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori medikamentet ytterligere omfatter et antiallergisk middel for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse.

11. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori inhibitoren av IL-18 anvendes i en mengde på omtrent 0,001 til 1000 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,01 til 100 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 0,1 til 10 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 5 mg/kg kroppsvekt.

12. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori IL-18-inhibitoren administreres subkutant.

13. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori IL-18-inhibitoren administreres intramuskulært.

14. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, hvori IL-18-inhibitoren administreres topisk.

15. Anvendelse av en ekspresjonsvektor som omfatter den kodende sekvensen av en inhibitor av IL-18 i fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forebyggingen av en type IV-hypersensitivitetslidelse, hvori IL-18-inhibitoren velges fra IL-18-bindende protein (IL-18BP), kondensert protein, funksjonelt derivat som definert i krav 1, eller aktiv fraksjon derav med en liknende aktivitet som IL-18BP.

16. Anvendelse av en vektor for å indusere og/eller forsterke den endogene produksjonen av en IL-18-inhibitor i en celle i fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forebyggingen av en type IV-hypersensitivitetslidelse, hvori IL-18-inhibitoren velges fra IL-18-bindende protein (IL-18BP), kondensert protein, funksjonelt derivat som definert i krav 1, eller aktiv fraksjon derav med en liknende aktivitet som IL-18BP.

17. Anvendelse av en celle som er blitt genetisk modifisert for å produsere en IL-18-inhibitor i fremstillingen av et medikament for behandlingen og/eller forebyggingen av en type IV-hypersensitivitetslidelse, hvori IL-18-inhibitoren velges fra IL-18-bindende protein (IL-18BP), kondensert protein, funksjonelt derivat som definert i krav 1, eller aktiv fraksjon derav med en liknende aktivitet som IL-18BP.