CN107847586A - 抗炎多肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗炎症疾病的抗炎剂、组合物和方法。

Description

抗炎多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年3月4日提交的美国申请14/638,905的优先权，该申请是2014年6月25日提交的美国申请14/368,701的部分继续申请，该部分继续申请是基于2012年12月10日提交的国际申请号PCT/US2012/068718的美国国家阶段申请，其要求2011年12月19日提交的美国临时申请号61/577,361的优先权。这些在先申请的内容通过引用整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于治疗炎症疾病的抗炎剂、组合物和方法。
背景
包括自身免疫疾病在内的炎症疾病是涉及白细胞的异常激活和随后迁移到身体受影响区域的疾病。这类病症包括了影响着全世界数百万人生活的各种疾病。虽然目前可以使用各种治疗方法，但是许多治疗方法具有显著的副作用或者在减轻所有症状方面不是很有效。因此，需要用于治疗炎症疾病的抗炎剂以及鉴定和评价这些药剂的方法。
长期以来，免疫球蛋白G(IgG)被认为通过其Fc片段介导的相互作用而介导促炎和抗炎活性。虽然Fc-FcγR相互作用负责免疫复合物和细胞毒性抗体的促炎特性，但是静脉内注射γ-球蛋白(IVIG)及其Fc片段是抗炎的并且广泛用于抑制炎症疾病。已经提出，IgG的糖基化对于调节IgG的细胞毒性和炎症潜能至关重要。例如，已经提出，IVIG的抗炎活性是Fc片段及其连接的聚糖的性质，需要末端α.2,6唾液酸键，这表明免疫抑制需要特异性多肽主链和聚糖结构的组合。(Anthony,et al.,2008,Science 320:373-376和WO 2007/117505)。
然而，IVIG中只有一小个IgG群体具有终止于α2,6唾液酸(sFc)的聚糖和抗炎活性。因此，为了抑制各种临床环境中的自身抗体引发的炎症，必须以高剂量(1-2g/kg)施用IVIG，以富集唾液酸化IgG，或以其它方式增加IgG的唾液酸化(美国申请号20080206246和20090004179以及Nimmerjahn et al.Annu Rev Immunol 26,513-533(2008))。
本发明通过鉴定非唾液酸化抗炎多肽解决并满足了上述需要。
概述
本发明涉及用于治疗炎症疾病(例如自身免疫疾病)的药剂(例如多肽和抗体)以及方法。
因此，本发明的一个方面的特征在于分离的多肽，其包含与IgG Fc区至少75％(例如，75％至100％的任意数量，包括例如75％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)相同的经修饰的序列。经修饰的序列没有唾液酸化，并且多肽具有高于亲本多肽的抗炎活性。亲本多肽可以包含IgG Fc区，例如下列SEQ ID NO：1的序列。在一些实施方案中，多肽具有结合DC-SIGN并结合hFcγRIIA或RIIB的能力。在一个实施方案中，分离多肽具有以2x10-5M或更低的KD(即5.0×104M-1或更高的KA)结合hFcγRIIA或RIIB的能力。优选地，经修饰的序列具有FA241突变。经修饰的序列可以与SEQ ID NO：2至少75％(例如，75％至100％的任意数量，包括例如75％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)相同。在一些实例中，经修饰的序列包含SEQ ID NO：2或基本上由SEQ ID NO：2组成。
另一方面，本发明提供了制备具有抗炎活性的多肽的方法。其他除外，该方法还包括以下步骤：提供具有IgG Fc区序列的亲本多肽或编码亲本多肽的第一核酸序列；和修饰亲本多肽以获得经修饰的多肽，使得经修饰的多肽不含唾液酸化并且模拟唾液酸化形式的IgG Fc区的结构。修饰步骤可以通过修饰第一核酸序列来获得编码经修饰的多肽的第二核酸来进行。本发明还提供了通过上述描述的方法制备的多肽。
在第三方面，本发明的特征在于分离的核酸，其包含编码上述多肽的序列；包含该核酸的表达载体；和包含该核酸的宿主细胞。本发明特征还在于产生多肽的方法。该方法包括在培养基中在允许表达所述核酸编码的多肽的条件下培养宿主细胞，以及从培养的细胞或细胞培养基纯化该多肽。
在第四方面，本发明的特征在于药物制剂，其包含(i)上述多肽或核酸，和(ii)药学上可接受载体。
在第五方面，本发明提供了治疗炎症疾病的方法。该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的上述多肽或编码多肽的核酸。还提供了多肽或核酸在制备用于治疗炎症疾病的药物中的用途。本发明特征还在于具有基本上如本文所示和描述的用于治疗炎症疾病的分离的多肽、核酸、表达载体、宿主细胞、组合物或方法。
另一方面，本发明还提供了一种在有需要的受试者中增加调节性T(Treg)细胞水平的方法。该方法包括向受试者施用有效量的(i)包含唾液酸化IgG Fc区的第一分离多肽；或(ii)包含经修饰的序列的第二分离多肽或编码第二多肽的核酸，所述经修饰的序列与IgGFc区至少75％(例如，75％至100％的任意数量，包括例如75％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)相同，其中经修饰的序列具有FA241突变。在一个实施方案中，受试者患有炎症疾病，例如自身免疫疾病，包括T细胞介导的自身免疫疾病。T细胞介导的自身免疫疾病的实例包括多发性硬化和I型糖尿病。因此，本发明还提供了在有需要的受试者中治疗T细胞介导的自身免疫疾病的方法。该方法包括向受试者施用有效量的上述第一分离多肽或第二分离多肽或核酸。
在优选的实施方案中，第一分离多肽中的IgG区可以比受试者中的IgG的唾液酸化水平更高的水平进行唾液酸化。经修饰的序列可以以不同水平唾液酸化或是非唾液酸化。在一些实施方案中，其是(a)基本上不唾液酸化或(b)唾液酸化水平低于受试者的IgG的唾液酸化水平。IgG Fc区可以包含SEQ ID NO：1的序列。经修饰的序列可以与SEQ ID NO：2至少75％(例如，75％至100％的任意数量，包括例如75％、80％、85％、90％、95％、99％和100％)相同。第一或第二分离多肽具有结合DC-SIGN、hFcγRIIA或hFcγRIIB的能力。优选地，分离的多肽具有以2×10-5M或更低的KD(即5.0×104M-1或更高的KA)结合hFcγRIIA或hFcγRIIB的能力。
本发明进一步提供上述第一分离多肽或第二分离多肽在制备用于治疗有需要的受试者中T细胞介导的自身免疫疾病或用于增加调节性T(Treg)细胞水平的药物中的用途。
在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施方案的细节。本发明的其它特征、目的和优点将从说明书和权利要求书中变得显而易见。
附图说明
图1A、1B、1C和1D显示F241A能够抑制血清诱导的关节炎。(图1A)非唾液酸化核心聚糖(无唾液酸化Fc)的甘露糖残基与Cγ2结构域的241位苯丙氨酸残基之间相互作用的示意图。通过唾液酸化(唾液酸化Fc)，该相互作用不再发生，导致Fc部分具有在所谓的开放和闭合构象之间切换的较高构象柔性。(图1b)将hDC-SIGN+骨髓来源的巨噬细胞用唾液酸化(sFc)或非唾液酸化(Fc)野生型Fc或F241A-Fc脉冲处理1小时。通过蛋白印迹用全细胞提取物分析IL-33的产生。肌动蛋白用作上样对照。(图1c)用非唾液酸化野生型Fc(无唾液酸化Fc)、唾液酸化野生型Fc(sFc)或F241A对来自SIGN-R1-/-或hDC-SIGN+小鼠的BMMΦ进行脉冲处理。经过充分洗涤后，细胞被过继转移到K/BxN激发(challenge)的C57BL/6小鼠中。(图1d)hDC-SIGN+BMMΦ用野生型Fc或F241A的非唾液酸化(无唾液酸化Fc)或唾液酸化(α2,6sFc)变体进行脉冲处理。将细胞过继转移到K/BxN激发的C57BL/6小鼠中。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；**p<0.01。
图2A、2B和2C显示F241A通过II型Fc受体的参与(engage)诱导抗炎反应。(图2a)用PBS、IL-4ic或F241A(0.033g/kg)处理C57BL/6野生型小鼠，并在一小时后用K/BxN血清进行激发。在处理后6天从这些小鼠收集血液，通过ELISA分析血清IL-6水平。(图2b)监测小鼠的临床评分，这反映血清诱导的关节炎的严重程度。(图2c)用K/BxN血清激发SIGN-R1-/-和hDC-SIGN+小鼠，并用唾液酸化野生型Fc(sFc)或F241A(均为0.033g/kg)进行处理。每天监测疾病的发展，直到疾病诱导后第6天。
图3A、3B和3C显示sFc/F241A激活和扩增Treg细胞。(图3a)C57BL/6野生型小鼠接受静脉内注射IVIG(1g/kg)、IVIG-F(ab`)2(0.66g/kg)、IVIG-Fc(0.33g/kg)或PBS作为对照。注射后第5天通过流式细胞术分析脾中的Treg细胞数。(图3b)K/BxN激发的C57BL/6野生型小鼠给予IVIG(1g/kg)、神经氨酸酶处理的IVIG(NA-IVIG)(1g/kg)、非唾液酸化F241A(0.033g/kg)或PBS作为对照。监测关节炎的临床征象。(图3c)处理后第5天，将小鼠安乐死，用流式细胞术分析脾中的Treg细胞。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图4A、4B、4C、4D、4E和4F显示IVIG-/F241A激活的Treg细胞在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠中有效抑制T细胞介导的自身免疫。(图4a)用MOG35-55肽免疫C57BL/6野生型小鼠以诱导EAE。从EAE诱导小鼠第五天开始，每5天静脉内注射PBS、IVIG(1g/kg)或神经氨酸酶处理的IVIG(NA-IVIG)(1μg/kg)。显示EAE的临床评分。(图4b、图4c)将小鼠安乐死，并通过流式细胞术分析来自引流淋巴结的CD4+效应T细胞(图4b)和Treg细胞(图4c)。(图4d)通过用MOG35-55肽免疫接种，在C57BL/6野生型小鼠中诱导EAE。每五天，小鼠静脉内接受非唾液酸化F241A(0.033g/kg)或PBS。对于Treg细胞耗尽，小鼠在EAE诱导前3天以及诱导后每个第5天给予Treg细胞耗尽抗体PC61(400μg)。描绘了疾病的临床评分。(图4e、图4f)分离来自EAE小鼠引流淋巴结的细胞，并通过流式细胞术分析CD4+效应T细胞(图4e)和Treg细胞(图4f)的百分比。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图5A、5B、5C和5D显示IVIG-/F241A介导的Treg细胞活化需要II型Fc受体。在所有实验中通过用MOG35-55肽免疫接种诱导EAE。在第5、10、15和20天小鼠接受静脉内注射。描绘了EAE的临床评分。(图5a)用IVIG(1g/kg)或PBS处理C57BL/6野生型和SIGN-R1-/-小鼠。(图5b)SIGN-R1-/-小鼠在EAE诱导后第5天开始每两天如上所述给予IVIG(1g/kg)或腹膜内给予IL-33(0.5μg)。(图5c)用PBS或IVIG(1g/kg)处理SIGN-R1-/-和SIGN-R1-/-hDC-SIGN+小鼠。(图5d)SIGN-R1-/-hDC-SIGN+小鼠接受非唾液酸化F241A(无唾液酸化F241A)(0.033g/kg)或PBS对照。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
图6A、6B、6C、6D、6E、6F和6G显示F241A诱导产生的IL-33激活了Treg细胞。(图6a、图6b)连续四天腹膜内给予C57BL/6野生型小鼠IL-33(0.5μg)。在第5天，对小鼠进行安乐死，并通过流式细胞术分析脾Treg细胞的百分比。(图6c)来自C57BL/6野生型或hDC-SIGN+小鼠的骨髓衍生巨噬细胞用PBS、IVIG或非唾液酸化F241A进行脉冲处理。(图6c)分离总RNA并用于定量rtPCR，以测量IL-33mRNA水平。管家基因Gapdh用于标准化。(图6d、图6e)处理后，骨髓来源的巨噬细胞被充分洗涤并过继转移到C57BL/6野生型受体小鼠中。转移后第5天处死小鼠，用流式细胞术分析Treg细胞和ST2表达。(图6f)通过用MOG35-55肽免疫，在C57BL/6野生型小鼠中诱导EAE。诱导后小鼠每两天接受IL-33(0.5μg i.p.)。显示疾病的临床评分。(图6g)通过流式细胞术分析EAE小鼠引流淋巴结Treg细胞的百分比。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定***p<0.001。
图7A、7B、7C和7D显示IVIG/F241A通过IL-33/ST2轴的信号传导诱导Treg细胞激活。(图7a、图7b)用PBS或IVIG(1g/kg)处理K/BxN激发的C57BL/6野生型小鼠。为了阻断IL-33信号传导，小鼠接受抗ST2阻断抗体(100μg i.v.)或同种型对照。RA的临床评分如图7a所示。在疾病诱导后第五天，处死疾病诱导后小鼠，并通过流式细胞术分析脾Treg细胞(图7b)。(图7c)通过用MOG35-55肽免疫，在C57BL/6野生型小鼠中诱导EAE。在第5、10、15和20天，用PBS或非唾液酸化F241A(无唾液酸化F241A)(0.033g/kg)静脉内处理小鼠四次。每次注射先于静脉内注射抗ST2阻断抗体。显示EAE的临床评分。(图7d)处死EAE小鼠，从引流淋巴结中分离细胞。通过流式细胞术分析Treg细胞及其Foxp3和ST2表达。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；***p<0.001。
图8显示F241A与DC-SIGN结合，不依赖于唾液酸化。固定重组DC-SIGN，通过ELISA测量非唾液酸化(无唾液酸化F241A)、唾液酸化F241A(唾液酸化F241A)和非唾液酸化野生型Fc(野生型WT Fc)的结合亲和力。
图9A、9B和9C显示E318/Lys340口袋对于唾液酸化Fc的抗炎作用至关重要。(图9a)分离来自SIGN-R1-/-和hDC-SIGN+小鼠的骨髓细胞，并在体外分化成巨噬细胞(BMMΦ)。用野生型或突变型Fc将BMMΦ脉冲处理过夜。全细胞提取物用于蛋白印迹。肌动蛋白用作上样对照。(图9b)用不同的Fc制剂处理K/BxN激发的C57BL/6小鼠。在处理后第6天监测疾病临床评分。(图9c)处理后8天通过ELISA检测血清IL-6水平。
图10A、10B和10C：IVIG选择性地扩增诱导型Treg细胞。通过在CFA中乳化的MOG35-55肽免疫，在C57BL/6野生型小鼠中诱导EAE。用PBS或IVIG(1g/kg)处理小鼠。(a)描绘了EAE的临床评分。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定**p<0.01。(b)EAE小鼠的脊髓的HE和Luxol Fast Blue染色的代表性图像。针对炎症进行HE染色。Luxol Fast Blue染色中的信号丢失反映了进展性脱髓鞘。(c)分离来自引流淋巴结的细胞并分析Treg细胞数及其n Treg特异性转录因子Helios的表达。
图11A和11B显示SIGN-R1的损失消除了IVIG对Treg细胞的积极作用。将C57BL/6野生型和SIGN-R1-/-小鼠静脉内给予IVIG(1g/kg)或PBS。一小时后，用K/BxN血清激发小鼠。(图11a)激发后5天监测关节炎疾病的临床征象。(图11b)通过流式细胞术分析来自脾的Treg细胞。绘制平均值±SEM；通过学生t检验确定**p<0.01。
图12显示IL-33在体外协同促成Treg细胞分化。从C57BL/6野生型小鼠的脾中分离出原初性(naive)CD4+T细胞。细胞在抗CD3/CD28存在下培养3天。为了驱动Treg细胞分化，将TGF-β单独或与IL-33和IL-23组合加入细胞中。通过流式细胞术分析Treg细胞数和ST2表达。
图13A、13B和13C显示嗜碱性细胞耗尽不影响IVIG介导的Treg细胞刺激。用抗FcεRI抗体处理C57BL/6野生型小鼠以耗尽嗜碱性细胞，或用同种型对照处理。此外，小鼠接受IVIG(1g/kg)或PBS，并用K/BxN血清激发。(图13a)注射后5天脾嗜碱性细胞的FACS分析。(图13b)疾病诱导后第五天监测关节炎疾病的临床征象。(图13c)通过流式细胞术分析脾Treg细胞。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定*p<0.05；**p<0.01。
图14A、14B、14C和14D显示VIG优先激活iTreg细胞并保护免于实验性结肠炎。C57BL/6Rag1-/-小鼠注射CD4+CD45RBhighCD25-T细胞，以诱导T细胞转移结肠炎。在T细胞转移后四周开始，每周一次用PBS或IVIG(1g/kg)处理小鼠一次。Rag1-/-对照小鼠(CTRL)没有接受任何T细胞。(图14a)每周一次测量体重。体重减轻被用作疾病严重程度的工具。(图14b)通过FACS分析来自引流淋巴结的细胞的Treg细胞和CD4+效应T细胞的百分比。(图14c)切开并测量整个结肠。结肠缩减反映疾病严重程度并与体重减轻相关。(图14d)在c中描述切开结肠的代表性图像。绘制平均值±SEM；通过Tukey事后检验确定***p<0.001。
图15显示sFc诱导的抗炎途径的模型：唾液酸化IgG、sFc以及唾液酸化Fc类似物F241A选择性地与调节性巨噬细胞上的II型FcR如SIGN-R1或人DC-SIGN接合并诱导IL-33产生。IL-33是诱导两种不同抗炎途径的中枢介质。嗜碱性细胞响应IL-33而产生IL-4，其进而诱导效应巨噬细胞上抑制性FcγRIIB的上调。所产生的它们激活阈值的显著变化抑制了炎症。此外，IL-33还引发Treg细胞的激活和扩增，其有效抑制TH1和TH17细胞，从而改善T细胞介导的自身免疫。
详述
本发明至少部分地基于以下出乎意料的发现：非唾液酸化IgG Fc变体产生抗炎活性并模拟2,6唾液酸化Fc作为抗炎介质的作用，以及可以通过对CH2结构域的特异性氨基酸修饰来模拟由唾液酸化诱导的结构改变。同样出乎意料的是，所述变体和唾液酸化Fc都激活Treg细胞。
如本文所公开的，IVIG的抗炎活性依赖于核心IgG-Fc聚糖中存在的唾液酸，其导致CH2结构域的构象柔性增加，并且对应于FcR从I型至II型受体结合特异性的调节。唾液酸化IgG-Fc(sFc)通过刺激抑制性受体FcγRIIB的上调来提高先天效应细胞对免疫复合物的激活阈值。本发明人已经发现，可以通过对CH2结构域的特异性氨基酸修饰来模拟由唾液酸化诱导的结构改变。例如，即使在没有唾液酸化情况下，在位置241(F-A)具有点突变的IgG-Fc变体也显示抗炎活性。在由胶原蛋白和KBxN诱导的模型中，F241A和sFc保护小鼠免受关节炎，并且在T细胞介导的EAE小鼠模型中，通过特异性激活Treg细胞来抑制疾病。在抗体介导和T细胞介导的两种自身免疫疾病中，这些抗炎性Fc的保护作用需要II型FcR和IL-33的诱导。这些结果进一步阐明了IVIG在抗体介导和T细胞介导的炎症疾病中的作用机制，并证明模拟唾液酸化诱导的结构改变的Fc变体(如F241A)可用于治疗各种自身免疫疾病。
IgG和Fc唾液酸化
IgG是主要的血清免疫球蛋白。它是由两条相同的重链和两条轻链组成的糖蛋白，重链和轻链由可变结构域和恒定结构域组成。IgG在其两条重链中的每一条上的CH2结构域的Asn297上含有单个N-连接的聚糖。共价连接的复杂糖由含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖(man)的核心双分支五元多糖组成。在血清抗体中观察到核心糖结构的进一步修饰，发现易变的岩藻糖、分支GlcNAc、半乳糖(gal)和末端唾液酸(sa)部分的存在。已经检测到40多种不同的糖型共价连接到该单个糖基化位点(Fujii et al.,J.Biol.Chem.265,6009,1990)。已经证明，IgG的糖基化对维持两条重链的开放构象而与所有FcγR结合而言至关重要。Jefferis and Lund,Immune.Lett.82,57(2002),Sondermann et al.,J.Mol.Biol.309,737(2001)。据信，用于FcγR结合的这种IgG糖基化造成去糖基化IgG抗体不能介导体内触发的炎性反应，例如ADCC、吞噬作用和炎性介质的释放。Nimmerjahn andRavetch,Immunity 24,19(2006)。所报道的个体FcγR对含有或缺乏岩藻糖的IgG抗体的亲和力的改变及其对细胞毒性的后续影响已经暗示了进一步观察到的结果：IgG的个体糖型可有助于调节炎症反应。Shields et al.,J.Biol.Chem.277,26733(2002),Nimmerjahnand Ravetch,Science 310,1510(2005)。在患有类风湿性关节炎和几种自身免疫性血管疾病的患者(已经报道其中IgG抗体的半乳糖基化和唾液酸化降低)中，已经观察到了自身免疫状态和IgG抗体的特异性糖型之间的联系。Parekh et al.,Nature 316,452(1985),Rademacher et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,6123(1994),Matsumoto et al.,128,621(2000),Holland et al.,Biochim.Biophys.Acta December 27。还已经报道了IgG糖型的变化与老化相关并且在免疫接种后，尽管这些变化的体内意义尚未确定。Shikata etal.,Glycoconj.J.15,683(1998),Lastra,et al.,Autoimmunity 28,25(1998).
IgG Fc变体
如本文所公开的，令人惊奇的是唾液酸化或非唾液酸化的某些IgG Fc变体也产生抗炎活性。包括FA241变体在内的这些变体代表了一个较大分子类型中的一些种类，其模仿唾液酸化Fc的结构和生物学特性，但不需要唾液酸化，可被开发为抗炎治疗剂。
IVIG虽然最初开发作为低丙种球蛋白血症患者的免疫球蛋白替代疗法，但由于其免疫调节活性已经获得了广泛应用。它是经批准的用于治疗自身免疫疾病如免疫性血小板减少症(ITP)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、川崎病和吉兰-巴雷综合征的治疗剂，并且用于越来越多的自身免疫疾病和炎症疾病。已经显示其抗炎活性是由存在的特定聚糖，α2,6-唾液酸化复杂双支结构，其存在于Fc的CH2结构域上，并且在IVIG的异源抗体制备物中发现小量比例。CH2结构域上Fc聚糖的唾液酸化产生可以参与II型Fc受体例如SIGN-R1、DC-SIGN和CD23的IgG，同时降低其对I型FcR的结合亲和力。血清诱导性关节炎、抗体依赖性ITP、肾毒性肾炎和自身免疫疱病(ABD)的小鼠模型研究证实了唾液酸化Fc的抗炎活性，无论是来自IVIG还是由重组表达的IgG1产生。此外，在IVIG或重组表达的IgG1中增加唾液酸化Fc片段的百分比导致这些制剂的治疗效力增强。首次在关节炎的鼠模型中报道了对sFc诱导抗炎反应的机制的阐明，其中证明唾液酸化Fc与II型FcR的选择性结合导致调节性巨噬细胞产生IL-33，其进而刺激嗜碱性细胞分泌IL-4。IL-4诱导效应巨噬细胞上抑制性受体FcγRIIB上调，从而增加这些细胞的激活阈值并抑制炎症。随后的研究已经证实，与鼠数据一致，IVIG处理人群导致血清IL-33水平以及淋巴细胞和骨髓细胞上的FcγRIIB表达增加。
如本文所公开的，对唾液酸化和非唾液酸化IgG Fc片段的晶体学和生物物理学研究已经提供了对唾液酸化Fc的抗炎活性的结构基础的理解。IgG Fc复杂的双支聚糖的唾液酸化导致CH2结构域的构象柔性增加，从而提供II型FcR结合所需的CH2结构域的闭合构象。相比之下，非唾液酸化Fc结构一律产生开放的Fc构象，这与其对I型FcR的结合特异性一致。唾液酸化后，聚糖与CH2结构域的氨基酸残基的相互作用被破坏，为蛋白结构中观察到的构象变化提供基础，并与针对唾液酸化Fc与II型FcR的结合特异性提出的模型一致。基于这些观察，本发明人产生了一系列Fc变体，其靶向与聚糖相互作用的CH2结构域的氨基酸，目的是确定其对结合II型FcR以及由此得到的抗炎活性的影响。在本研究中检查了获得功能和失去功能的突变体。鉴定出可以模拟唾液酸化诱导的构象状态而不需要这种特定的糖修饰的获得功能性变体，可以简化用于治疗用途的抗炎IgG Fc的开发。本发明人成功地鉴定了一个突变(F241A)，预测其增加了α1,3-臂的活动性，并且即使在不存在唾液酸化情况下也重复了唾液酸化Fc的抗炎活性。本发明人已经在自身免疫炎症的抗体和T细胞模型中都将这种变体与唾液酸化Fc相比较进行了表征。
尽管如上所概述已经充分研究了抗体介导的炎症模型中IVIG保护的基础，最近的研究已经证明，IVIG也可以在经典的T细胞介导的自身免疫疾病例如EAE中以及在气道高反应性(AHR)模型中提供保护。IVIG的这种治疗效果据说是由于Treg细胞的激活和扩增，从而通过分泌IFN-γ的TH1和分泌IL-17的TH17细胞抑制T细胞应答。因此，本发明人试图研究Treg细胞的激活和扩增是否也是唾液酸化Fc或F241A变体的结果。本发明人使用F241A，唾液酸化和非唾液酸化IVIG，研究了其对Treg细胞激活和抑制T细胞依赖性自身免疫的免疫调节作用的作用机制。本发明人证明，IVIG的唾液酸化对于Treg细胞激活和扩增至关重要，并且F241A变体足以抑制EAE和实验性结肠炎模型中的T细胞依赖性炎症。此外，sFc和F241A都刺激产生白细胞介素-33(IL-33)，其进而通过ST2受体激活Treg细胞，这有助于抑制T细胞介导的自身免疫应答。
如下文实施例中所公开的，本发明人提供功能数据证明，Fc主链与Fc聚糖之间的特异性相互作用影响了唾液酸化IgG的效应物性质。本发明人证实，唾液酸化Fc的抗炎活性严格依赖于唾液酸的α2,6-连接，因为只有α2,6唾液酸化Fc而不是α2,3唾液酸化Fc与DC-SIGN结合并抑制自身抗体引起的关节炎炎症。Fc聚糖上的不同唾液酸连接如何影响Fc结构？本发明人发现，唾液酸糖残基与蛋白主链的接近度可以决定唾液酸如何与Fc上的特定氨基酸侧链相互作用。事实上，分子建模表明，只有α2,6连接的唾液酸可以拟合至由Glu318和Lys340在Cγ2-Cγ3界面形成的沟中。为了确定这种沟是否在α2,6唾液酸化Fc的抗炎活性中发挥作用，本发明人表征了具有E318N点突变的唾液酸化Fc的免疫抑制功能。有趣的是，E318Nα2,6唾液酸化Fc不能引发与野生型(WT)α2,6唾液酸化Fc相关的抗炎途径，如通过将受刺激的DC-SIGN+BMMΦ过继转移至K/BxN血清激发的小鼠而诱导的IL-33表达或保护免于关节炎炎症。因此，与唾液酸的α2,3-连接一样，本发明人提出，E318N突变消除了Fc采用其“闭合”的抗炎状态所必需的α2,6-连接的唾液酸与Fc主链的相互作用。
Fc结构通常在由CH2结构域形成的内腔内解决了Fc聚糖的α1,3臂。α1,3臂通过占据该腔而稳定了“开放”构象内一定分隔距离的CH2结构域，以便于结合I型FcR。为了使所提出的模型是正确的，唾液酸化α1,3臂必须朝CH2-CH3界面移出该腔，使得末端唾液酸可以接触E318/K340沟。因此，通过将唾液酸化α1,3臂重新定位到CH2-CH3界面，CH2结构域可以一起靠得更近，以填充现在未被占据的腔并形成“闭合”构象。不同于与Fc主链形成多个非共价相互作用的Fc聚糖的α1,6臂，α1,3臂在不存在唾液酸化情况下仅形成一个已知的接触——F241的芳族侧链。然而，在唾液酸化Fc的晶体结构中，与Fc聚糖接触以显示方向显著变化的唯一氨基酸侧链是F241的环结构。本发明人认为，观察到的F241的90°旋转消除了通常与糖形成的疏水性堆积相互作用。本发明人认为这在结构上是重要的，因为破坏这种稳定化相互作用应该赋予了Fc聚糖的唾液酸化α1,3臂更大的自由度或运动性。通过这种更大的运动性，唾液酸化α1,3臂将以更大频率提供(sample)内腔外的空间，以在CH2-CH3界面处遇到E318/K340口袋。与F241在α2,6唾液酸化Fc结构中的关键作用一致，本发明人发现，特异性地破坏该蛋白-糖接触点的F241A突变重现了不依赖于唾液酸化的唾液酸化Fc的抗炎活性。与DC-SIGN结合的α2,6唾液酸和非唾液酸化F241A Fc均结合至DC-SIGN，诱导IL-33表达，并用受刺激的DC-SIGN+ BMMΦ将抗炎活性转移至K/BxN血清激发的小鼠中，重现了IVIG和唾液酸化IgG的抗炎活性。最近，发表了质疑Fc唾液酸化调节免疫应答的重要作用的报道。这些数据和其他几个组的数据已经证实了唾液酸化Fc在多种抗体介导炎症模型中的抗炎作用。这些不一致可能是IVIG在选择性模型中非线性给药的结果，因此没有反映其中使用IVIG的生理学相关条件。
我们已经鉴定，唾液酸化Fc以及诸如F241A的变体特异性刺激iTreg细胞扩增，并足以通过选择性参与II型Fc受体SIGN-R1或其人直系物DC-SIGN而抑制EAE和实验性结肠炎模型中的T细胞介导的免疫应答。此外，本发明人鉴定IL-33作为该途径的重要介质。如图15中总结的，通过响应IVIG、唾液酸化Fc或F241A导致的II型FcR参与而诱导的IL-33起多效作用。它可以介导嗜碱性细胞的IL-4分泌以将巨噬细胞极化为M2表型，并诱导抑制性FcγRIIB表达(这是抗体介导的自身免疫性炎症中起主导作用的途径)，或者可以直接作用于Treg细胞以调节其激活和扩增。本发明人证实，通过用唾液酸化Fc的治疗性处理可以使Treg细胞变得激活，其严重依赖于通过IL-33/ST2轴的信号传导。如由Matta及其同事先前所述，本发明人不能排除IL-33依赖性Treg细胞激活主要通过树突细胞间接介导的可能性。然而，本发明人没有检测到IVIG与任何T细胞亚群(效应细胞和Treg细胞)的任何直接相互作用(与最近提出的模型相比)，本发明人也不能观察到支持IVIG提供“Tregitope”的任何证据。具体来说，本发明人可以在实验中检测Treg细胞激活和扩增，在所述实验中将IVIG处理或F241A处理的hDC-SIGN+骨髓衍生的巨噬细胞转移到原初性接受者中。由于脉冲处理的BMMΦ对该处理的反应是分泌IL-33，所以数据支持这一结论：该细胞因子是导致Treg细胞激活和扩增的途径中的主要介质。
以前的研究已经确立了IL-33与总是伴随着Treg细胞富集的不同小鼠模型中T细胞介导的炎症的改善之间的联系。另外，已证明IL-33的血清水平在人自身免疫患者施用IVIG后高度升高，从而使其成为各种抗炎反应的有效诱导剂。当使用抗体阻断阻止IL-33信号传导的ST2时，本发明人观察到这种处理显著损害了IVIG/F241A在血清转移关节炎模型以及EAE模型中的保护作用。
越来越清楚的是，抗体的Fc区域远不是一个“恒定”结构域，抗体的Fc区域表现出异质结构和功能。本文公开的本发明提出了观点：Fc片段的构象多样性用作抗体改变受体特异性以达到不同免疫结果的一般策略。IgG Fc动力学通过蛋白-聚糖相互作用进行微调，而蛋白-聚糖相互作用又由Fc聚糖的糖组成来调节。本发明人发现，Fc聚糖移动性增加的模型造成与唾液酸化IgG的抗炎活性相关的生物物理和功能性质。基于这些结构和机械学观察结果，本发明人已经开发了唾液酸化IgG的替代物，例如F241A，其提供了比IVIG更大的效力和一致性(uniformity)的益处，并且可用于针对自身抗体介导和T细胞介导的炎症疾病的临床开发。
多肽与核酸
多肽
如本文所公开的，本发明提供了分离多肽，其具有人IgG Fc变体序列，缺乏具有通过前述Asn297处的α2,6连接与半乳糖部分连接的末端唾液酸的多糖链。这种非唾液酸化IgGFc变体可以来源于天然存在的抗体或是在细胞系中表达。
在一个实施方案中，Fc区包括hIgG1氨基酸序列的一个或多个置换。虽然不限于此，但如下提供了示例性IgG1 Fc区：
hIgG1的Fc(从Kabat系统中的氨基酸210开始)：
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:1；F241和F243加下划线)
hIgG1FA241的Fc：
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)
hIgG1FA243的Fc：
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:3)
术语“肽”、“多肽”和“蛋白”在本文中可互换地用于描述聚合物中氨基酸残基的排列。除了稀有氨基酸和合成氨基酸类似物之外，肽、多肽或蛋白可以由标准的20种天然存在的氨基酸组成。它们可以是氨基酸的任何链，不管长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。“本发明的”肽、多肽或蛋白包括具有结合DC-SIGN、FcγRIIA和FcγRIIB的特定结构域或部分的重组或合成产生的形式。该术语还包括具有添加的氨基末端甲硫氨酸(可用于在原核细胞中表达)的多肽。
“分离的”多肽或蛋白是指已经从与其天然关联的其它蛋白、脂质和核酸分开的多肽或蛋白。多肽/蛋白可以构成纯化制剂干重的至少10％(即，10％至100％之间的任何百分比，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和99％)。纯度可以通过任何适当的标准方法测量，例如通过柱色谱法，聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析。本发明中描述的分离的多肽/蛋白可以纯化自天然来源、通过重组DNA技术或通过化学方法产生。IgGFc的功能等同物是指IgG Fc的多肽衍生物，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短的蛋白，融合蛋白或其组合。其基本上保留了IgG Fc的活性，即结合相应受体并触发相应细胞应答的能力。分离的多肽可以含有SEQ ID NO：2。通常，功能等同物与SEQ ID NO：2至少75％(例如，75％至100％之间的任意数，包括例如75％、80％、85％、90％、95％和99％)相同。
使用Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-68,1990的、如在Karlin and Altschul Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-77,1993中改良的的算法，确定两条氨基酸序列或两个核酸的“百分比同一性”。这样的算法被并入Altschul,etal.J.Mol.Biol.215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用NBLAST程序、评分＝100、字长12进行BLAST核苷酸检索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以使用XBLAST程序、评分＝50、字长3进行BLAST蛋白检索，以获得与本发明的蛋白分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在缺口的情况下，可以如Altschul et al.,NucleicAcids Res.25(17):3389-3402,1997中所述采用Gapped BLAST。当利用BLAST和GappedBLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
本文所述的多肽的氨基酸组成可以变化而不破坏多肽与相应受体结合并触发相应细胞应答的能力。例如，它可以含有一个或多个保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，例如SEQ ID NO：2中，预期的非必需氨基酸残基优选被来自同一侧链家族的另一个氨基酸残基替代。或者，可以沿着全部或部分序列随机引入突变，例如通过饱和诱变，并且可以筛选所得到的突变体结合相应受体并触发各自的细胞反应的能力，以鉴定出保留活性的突变体，如在下面的实例中所述的。
如在本发明中所述的多肽可以作为重组多肽获得。为了制备重组多肽，编码它的核酸(例如，FA241，SEQ ID NO：2)可以连接到编码融合配偶体的另一核酸，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)，6x-His表位标签，或M13基因3蛋白。所得融合核酸在合适的宿主细胞中表达融合蛋白，然后可以通过本领域已知方法分离。可以例如通过酶消化进一步处理分离的融合蛋白，以除去融合配偶体并获得本发明的重组多肽。
核酸
本发明的另一方面的特征在于分离的核酸，其包含编码上述多肽或蛋白的序列。核酸是指DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)，RNA分子(例如mRNA)或DNA或RNA类似物。DNA或RNA类似物可以从核苷酸类似物合成。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。“分离核酸”是指其结构与任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸的任何片段不同的核酸。因此，该术语涵盖例如(a)具有天然存在的基因组DNA分子的一部分序列但没有侧接在它自然存在的生物体基因组中该部分侧接的编码序列的DNA；(b)以使所得分子与任何天然存在的载体或基因组DNA不相同的方式并入至载体或原核生物或真核生物的基因组DNA中的核酸；(c)分开的分子，例如cDNA，基因组片段，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段或限制性片段；和(d)作为杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的一部分的重组核苷酸序列。上述核酸可用于表达本发明的融合蛋白。为此，可以将核酸可操作地连接到合适的调控序列以产生表达载体。
载体是指能够转运与其连接的另一核酸的核酸分子。载体能够自主复制或整合到宿主DNA中。载体的实例包括质粒、粘粒或病毒载体。载体包括适于在宿主细胞中表达核酸的形式的核酸。优选地，载体包括与待表达的核酸序列可操作地连接的一个或多个调节序列。
“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件(例如聚腺苷酸化信号)。调节序列包括指导核苷酸序列的组成型表达的序列以及组织特异性调节和/或可诱导序列。表达载体的设计可以取决于诸如待转化的宿主细胞的选择，所需的蛋白或RNA的表达水平等因素。可将表达载体导入宿主细胞以产生本发明的多肽。启动子被定义为指导RNA聚合酶结合DNA并启动RNA合成的DNA序列。强启动子是引起mRNA以高频启动的启动子。
上述任何多核苷酸或本领域技术人员可用于相同预期目的的生物等效多核苷酸可以插入合适的表达载体中并与其他DNA分子连接以形成表达该受体的“重组DNA分子”。这些载体可以由DNA或RNA组成；对于大多数克隆目的，优选DNA载体。典型的载体包括质粒，经修饰的病毒，噬菌体和粘粒，酵母人工染色体和其他形式的附加型或整合型DNA。确定适用于特定用途的载体完全在本领域技术人员的职能范围内。
可以使用各种哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达上述IgG Fc。如上所述，表达载体可以是在适当宿主中克隆DNA的转录及其mRNA的翻译所需的DNA序列。这样的载体可用于在各种宿主例如细菌、蓝绿藻、植物细胞、昆虫细胞和动物细胞中表达真核DNA。特别设计的载体允许DNA在宿主如细菌-酵母或细菌-动物细胞之间穿梭。适当构建的表达载体应含有：用于在宿主细胞中自主复制的复制起点，可选择标记，有限数量的有用限制酶位点，高拷贝数的潜力和活性启动子。表达载体可以包括但不限于克隆载体，经修饰的克隆载体，特异设计的质粒或病毒。可能合适的市售哺乳动物表达载体包括但不限于pcDNA3.neo(Invitrogen),pcDNA3.1(Invitrogen),pCI-neo(Promega),pLITMUS28,pLITMUS29,pLITMUS38和pLITMUS39(New England Bioloabs),pcDNAI,pcDNAIamp(Invitrogen),pcDNA3(Invitrogen),pMClneo(Stratagene),pXT1(Stratagene),pSG5(Stratagene),EBO-pSV2-neo(ATCC 37593)pBPV-1(8-2)(ATCC 37110),pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224),pRSVgpt(ATCC 37199),pRSVneo(ATCC 37198),pSV2-dhfr(ATCC 37146),pUCTag(ATCC37460),以及IZD35(ATCC 37565)。
也在本发明范围内的是含有上述核酸的宿主细胞。实例包括大肠杆菌细胞，昆虫细胞(例如使用杆状病毒表达载体)，酵母细胞或哺乳动物细胞。参见例如Goeddel，(1990)Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Calif。为了产生本发明的多肽，可以在允许表达由本发明的核酸所编码多肽的条件下在培养基中培养宿主细胞，并从培养的细胞或细胞的培养基纯化多肽。或者，本发明的核酸可以例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶在体外转录和翻译。
所有天然存在的IgG Fc、遗传改造的IgG Fc和化学合成的IgG Fc都可用于实施本文公开的本发明。通过重组DNA技术获得的IgG Fc可以具有与[FA241]SEQ ID NO：2或其功能等同物相同的氨基酸序列。术语“IgG Fc”也包括经化学修饰的形式。经化学修饰的IgGFc的实例包括经历构象变化、糖链的添加或缺失的IgG Fc，以及已结合化合物如聚乙二醇的IgG Fc。
可以使用如下的动物模型如转基因小鼠来验证如此制备的多肽/蛋白的功效。嗜碱性细胞的IL-33体内表达或在效应巨噬细胞上的FcγRIIB受体表达的任何统计学上显著的增加表明，多肽/蛋白是治疗下述疾病的候选物。在一个实施方案中，上述测定可以基于对DC-SIGN蛋白或DC-SIGN(+)细胞结合的测量。现有技术充满了适合于测量化合物对DC-SIGN或DC-SIGN(+)细胞的能力以及由DC-SING途径调控的基因(如IL-33)的表达的相关变化的各种技术。本领域技术人员将能够组合和匹配这些各种研究工具，而无需过多的实验。一旦通过标准方法或根据下文实施例中的测定和方法纯化并测试，非唾液酸化IgG Fc变体可以包括在用于治疗炎症疾病的药物组合物中。
如本文所用，“抗体”以最广泛的含义使用，并且尤其涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们具有所需的生物活性。
如本文所用，“抗体片段”可以包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合区或可变区或抗体的保留FcR结合能力的Fc区。抗体片段的实例包括线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段优选保留了铰链的至少一部分以及任选的IgG重链的CH1区域。更优选地，抗体片段保留IgG重链的整个恒定区，并且包括IgG轻链。
如本文所用，术语“Fc片段”或“Fc区”用于限定免疫球蛋白重链的C末端区。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区通常定义为从Cys226位置或从Pro230的氨基酸残基延伸到其羧基末端。
“天然序列Fc区”包含与天然发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。本领域普通技术人员所理解的“变体Fc区”包含借助于至少一个“氨基酸修饰”而与天然序列Fc区不同的氨基酸序列。优选地，变体Fc区与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比具有至少一个氨基酸置换，例如在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约1至约10个氨基酸置换，优选约1至约5个氨基酸置换。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约75或80％的同源性，以及更优选与其具有至少约90％的同源性，更优选与其具有至少约95％的同源性，甚至更优选与其具有至少约99％的同源性。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述结合抗体Fc区的受体。在本发明的一个实施方案中，FcR是天然序列人FcR。在另一个实施方案中，包括人FcR的FcR结合IgG抗体(γ受体)，并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，其具有主要区别在于其胞质结构域的相似氨基酸序列。激活受体FcγRIIA在其胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见在Daron,Annu Rev Immunol,15,203-234(1997)中的综述；在Ravetch and Kinet,Annu Rev Immunol,9,457-92(1991)；Capel et al.,Immunomethods,4,25-34(1994)和de Haas et al.,J Lab Clin Med,126,330-41(1995),Nimmerjahn andRavetch 2006,Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology,ed William Paul5th Ed中综述过的FcR，其各自通过引用并入本文)。
术语“天然”或“亲本”是指包含Fc氨基酸序列的未经修饰的多肽。亲本多肽可以包含天然序列Fc区或具有预先存在的氨基酸序列修饰(例如添加、缺失和/或置换)的Fc区。
组合物
在本发明的范围内是含有合适载体和一种或多种上述药剂(例如非唾液酸化IgGFc变体)的组合物。组合物可以是含有药学上可接受载体的药物组合物或含有美容可接受载体的美容组合物。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性的载体的组合，使得该组合物特别适用于体内或离体的诊断或治疗用途。给药至受试者后，“药学上可接受载体”不引起不期望的生理作用。药物组合物中的载体也必须是“可接受的”，其意义在于其与活性成分相容并且能够使其稳定。一种或多种增溶剂可用作用于递送活性化合物的药物载体。药学上可接受载体的实例包括但不限于实现可用作剂型的组合物的生物相容性载体、佐剂、添加剂和稀释剂。其他载体的实例包括胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。
上述任何形式的上述组合物可用于治疗以炎症为特征的疾病。有效量是指对治疗受试者赋予治疗效果所需的活性化合物/药剂的量。根据所治疗的疾病的类型、施用途径、赋形剂的使用以及与其他治疗性治疗共同使用的可能性，本领域技术人员认识到有效剂量将是变化的。
本发明的药物组合物可以肠胃外、口服、鼻、直肠、局部(topically)或颊部施用。术语“肠胃外”是指皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内或颅内注射以及任何合适的输注技术。
无菌可注射组合物可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液。这些溶液包括但不限于1,3-丁二醇，甘露醇，水，林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质(例如，合成甘油单酯或甘油二酯)。脂肪酸(例如但不限于油酸及其甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，如天然药学上可接受的油，例如但不限于橄榄油或蓖麻油，其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，例如但不限于羧甲基纤维素或类似的分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它通常使用的表面活性剂，例如但不限于TWEEN或SPAN或其它类似的乳化剂或生物利用度增强剂也可用于该目的的配方。
用于口服施用的组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括胶囊，片剂，乳剂和水性悬浮液，分散体和溶液。在片剂的情况下，常用的载体包括但不限于乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂，例如但不限于硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括但不限于乳糖和干玉米淀粉。当口服施用水性悬浮液或乳剂时，活性成分可以与乳化剂或悬浮剂组合悬浮或溶解在油相中。如果需要，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
根据发明的用于局部施用的药物组合物可以配制成溶液，软膏，乳膏，悬浮液，洗剂，粉剂，糊剂，凝胶，喷雾剂，气溶胶或油。或者，局部制剂可以是浸渍有活性成分的贴剂或敷料的形式，其可任选地包含一种或多种赋形剂或稀释剂。在一些优选的实施方案中，局部制剂包括将增强活性剂吸收或渗透皮肤或其它受影响区域的材料。局部组合物可用于治疗皮肤的炎症疾病，包括但不限于湿疹、痤疮、酒渣鼻、牛皮癣、接触性皮炎和对毒藤的反应。
局部组合物含有安全有效量的适用于皮肤的皮肤病学可接受的载体。“美容可接受的”或“皮肤病学可接受的”组合物或组分是指适合用于与人皮肤接触而没有不适当的毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的组合物或组分。载体使得活性剂和任选的组分以适当的浓度递送至皮肤。因此，载体可以充当稀释剂、分散剂、溶剂等，以确保活性物质以适当的浓度施加并均匀分布在所选择的靶上。载体可以是固体、半固体或液体。载体可以是洗剂、乳膏或凝胶的形式，特别是具有足够的厚度或屈服点以防止活性物质沉淀的形式。载体可以是惰性的或具有皮肤病学的益处。它还应该与本文所述的活性成分物理和化学相容，并且不应该过度损害与组合物相关的稳定性、功效或其他使用益处。局部组合物可以是本领域已知的用于局部或透皮应用的形式的美容产品或皮肤病学产品，包括溶液、气溶胶、乳膏、凝胶、贴剂、软膏、洗剂或泡沫。
治疗方法
所述发明提供了治疗受试者中炎症疾病的方法。术语“炎症疾病”是指以异常或不期望的炎症为特征的病症，例如自身免疫疾病。自身免疫疾病是以非激活条件下免疫细胞的慢性激活为特征的疾病。实例包括牛皮癣，炎性肠病(例如克罗恩病和溃疡性结肠炎)，类风湿性关节炎，牛皮癣关节炎，多发性硬化症，狼疮，I型糖尿病，原发性胆汁性肝硬化和移植。
可以通过本发明的方法治疗的炎症疾病的其它实例包括哮喘，心肌梗塞，中风，炎性皮肤病(例如皮炎，湿疹，特应性皮炎，过敏性接触性皮炎，荨麻疹，坏死性血管炎，皮肤血管炎，超敏反应性血管炎，嗜酸粒细胞性肌炎，多发性肌炎，皮肌炎和嗜酸细胞性筋膜炎)，急性呼吸窘迫综合征，暴发性肝炎，超敏反应性肺部疾病(例如，超敏反应性肺炎，嗜酸粒细胞性肺炎，延迟型超敏反应，间质性肺病(ILD)，特发性肺纤维化和与类风湿性关节炎相关的ILD)和过敏性鼻炎。其他实例还包括重症肌无力，青少年发作性糖尿病，肾小球性肾炎，自身免疫性甲状腺炎，强直性脊柱炎，系统性硬化症，急性和慢性炎症疾病(例如全身过敏反应或超敏反应性反应，药物过敏，昆虫叮咬过敏，同种异体移植排斥反应，移植物抗宿主病)和舍格伦综合征。
在一个实施方案中，本发明提供了治疗T细胞介导的疾病的方法。如本文所用，T细胞介导的疾病是指由异常低水平的调节性T细胞(Treg细胞)或异常激活的T效应细胞表征的任何炎症疾病。该疾病的实例包括但不限于多发性硬化，I型糖尿病，重症肌无力，类风湿性关节炎(RA)，系统性红斑狼疮(SLE)和牛皮癣(见例如，Fundamental Immunology，Paul，W.，ed，第7版，Lippincott Williams&Wilkins，2012，p832)。
“受试者”是指人和非人的动物。非人动物的实例包括所有脊椎动物，例如哺乳动物，例如非人哺乳动物，非人灵长类动物(特别是高级灵长类动物)，狗，啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，豚鼠，猫和兔和非哺乳动物，例如鸟，两栖动物，爬行动物等。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者是实验性非人动物或适合作为疾病模型的动物。
可以通过炎症疾病的标准诊断技术来鉴定该疾病的受试者。任选地，可以通过本领域已知的方法检查受试者获得的受试样品中一种或多种细胞因子或细胞的水平或百分比。如果水平或百分比等于或低于阈值(其可以从正常受试者获得)，则受试者是本文所述治疗的候选者。为了确认抑制或治疗，可以评估和/或验证治疗后受试者中一种或多种上述细胞因子或细胞的水平或百分比。
“治疗”是指化合物或药剂施用于患有疾病的受试者，其目的在于治愈、缓解、减轻、补救、延迟发作，预防或改善疾病、疾病的症状、继发于该疾病的疾病状态或疾病的倾向。
“有效量”或“治疗有效量”是指能够在所治疗受试者中产生医学上理想的结果的化合物或药剂的量。治疗方法可以在体内或体外进行，单独或与其它药物或治疗联合进行。治疗有效量可以以一种或多种施用、应用或剂量施用，并不旨在限于特定的制剂或施用途径。
药剂可以在体内或离体施用，单独施用或与其它药物或治疗联合施用(即鸡尾酒疗法)。如本文所用，术语“共同施用”是指向受试者施用至少两种药剂或疗法。在一些实施方案中，两种或更多种药剂/疗法的共同施用是同时发生的。在其它实施方案中，在第二药剂/疗法之前施用第一药剂/疗法。本领域技术人员理解，所使用的各种药剂/疗法的制剂和/或施用途径可以变化。
在体内方法中，向受试者施用化合物或药剂。通常，将化合物或药剂悬浮在药学上可接受载体(例如但不限于生理盐水)中，并口服施用或通过静脉内输注，或皮下、肌内、鞘内、腹膜内、直肠内、阴道内、鼻内、胃内，气管内或肺内注射或植入。
所需剂量取决于施用途径的选择；配方的性质；患者病的性质；受试者的体积，体重，表面积，年龄和性别；正在施用的其他药物；和主治医师的判断。合适的剂量范围为0.01-100mg/kg。鉴于可用的化合物/药剂的多样性以及各种施用途径的不同效率，可预期所需剂量的变化。例如，预计口服施用需要比通过i.v.注射施用更高的剂量。这些剂量水平的变化可以使用如本领域中所熟知的用于优化的标准经验程序进行调整。化合物在合适的递送载体(例如聚合物微粒或可植入装置)中的封装可以提高递送的效率，特别是用于口服递送。
实施例
实施例1：一般方法与材料
本实施例描述了下面实施例2-8中使用的一般方法和材料。
小鼠
六至十周龄、年龄和性别匹配的C57BL/6、SIGN-R1-/-和SIGN-R1-/-hDC-SIGN+小鼠用于所有实验，均符合联邦法律和由洛克菲勒大学批准的学会指南。SIGN-R1-/-小鼠与CD11c-hDC-SIGN+小鼠交配以产生SIGN-R1-/-hDC-SIGN+小鼠。KRN T细胞受体转基因小鼠是C57BL/6背景，并且与NOD小鼠交配以产生K/BxN小鼠(Korganow et al.，Immunity 1999,10(4)：451-461)。通过收集K/BxN小鼠的血液样品制备K/BxN血清。将血清从血液中分离、合并并冷冻至等分试样以供进一步使用。为了诱导血清转移性关节炎，腹膜内注射200μl合并的K/BxN血清。关节炎的严重程度通过爪子的临床检查进行评分。所有四个爪子指数的增加反映了疾病的严重程度。0为不受影响，1是一个关节的肿胀，2是多于一个关节的肿胀，3是整个爪子的严重肿胀。在所有实验中，每组使用4-5只小鼠，平均值和平均值的标准误差(SEM)绘制在图中。
药剂与处理
IVIG(Octagam，Octapharma)和F241A(Merck)以每个图例中所示的浓度使用。IVIG-Fc和IVIG-F(ab`)2制剂通过IVIG在37℃下葡萄糖蛋白酶消化2小时制备。通过神经氨酸酶处理进行IVIG和F241A的脱唾液酸化。将100mg抗体制剂在37℃下与700单位神经氨酸酶(NEB)孵育20小时。通过Protein-G亲和纯化来纯化抗体，并在注射前用PBS透析。所有抗体制剂的唾液酸含量通过使用SNA-生物素(Vector laboratories)的SNA凝集素印迹进行验证。静脉内(i.v.)施用所有IVIG和F241A制剂。
嗜碱性细胞每天用10μg抗FcεRI(MAR-1，eBioscience)或仓鼠IgG同种型对照(Sigma)腹部注射连续4天耗尽。
在EAE诱导前3天以及每次IVIG/F241A注射后一天直到实验结束，腹部施用400μg抗CD25(Setiady et al.Eur J Immunol 2010,40(3):780-786))(PC61,BioXcell)耗尽Treg细胞。
通过在第0天以及EAE诱导后每5天静脉内注射100μg抗T1/ST2(DJ8，MDBiosciences)，阻断IL-33受体ST2。
对于细胞因子处理，小鼠在EAE实验中连续4天或每两天接受单个静脉内注射2.5μg IL-4ic(Peprotech)或腹内注射0.5μg IL-33。
如所述的，通过体内细胞因子捕获测定来测量IL-6血清水平(Finkelman etal.Curr Protoc Immunol 2003,Chapter 6:Unit 6.28)。根据制造商(eBioscience)的建议，通过ELISA分别检测并测量细胞培养上清液中的IL-33。
流式细胞术
为了分析淋巴细胞和骨髓细胞，从脾、淋巴结和骨髓制备单细胞悬液。红细胞裂解细胞用相应抗体染色后，使用FACSCalibur(BD Biosciences)进行分析。用于鼠细胞染色的抗体是来自eBiosciences的抗CD4(GK1.5)、抗Foxp3(FJK-16s)、抗IFNγ(XMG1.2)和来自BioLegend的抗CD25(PC61)、抗IL-17A(TC11-18H10.1)、抗CD209(9E9A8)、抗Helios(22F6)、抗CD11c(N418)、抗F4/80(BM8)和抗-T1/ST2(MD Biosciences)。
骨髓来源的巨噬细胞的分化和转移
从股骨和胫骨中分离骨髓细胞，在含有补充有20％胎牛血清、2％青霉素/链霉素(Invitrogen)、1％L-谷氨酰胺200mM(Invitrogen)、0.1％β-巯基乙醇和M-CSF(40ng/mL，Peprotech)的DMEM的10厘米板中，在37℃下培养5-7天。流式细胞术用于分析细胞培养物(>90％CD11b+ F4/80+细胞)中的骨髓来源的巨噬细胞(BMMΦ)。从板中回收细胞，洗涤并接种在新鲜组织培养板中，随后在37℃用PBS、IVIG(15mg/mL)或F241A(80μg/ml)脉冲处理3小时。然后将细胞充分洗涤，并将1×106个巨噬细胞静脉内施用于受体小鼠。转移后1小时，用K/BxN血清激发小鼠。
定量实时PCR
使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)从骨髓来源的巨噬细胞中分离总RNA，并用Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)逆转录。用针对IL-33的(5`-TCACTGCAGGAAAGTACAGCA-3`(正向，SEQ ID NO：4)和5`-AGTAGCACCTGGTCTTGCTC-3'(反向，SEQ ID NO：5))和针对Gapdh的(5`-ACAGTCCATGCCATCACTGCC-3`(正向，SEQ ID NO：6)和5`-GCCTGCTTCACCACCTTCTTG-3`(反向，SEQ ID NO：7))的引物组，使用C1000Touch ThermalCycler(BioRad)进行定量PCR来测量IL-33mRNA水平。通过对Gapdh mRNA水平进行标准化计算基因表达水平。
体外Treg细胞分化
从原初性C57BL/6野生型小鼠的脾和淋巴结，制备单细胞悬浮液。通过磁力细胞分离(Miltenyi Biotec)分离原初性CD4+T细胞，并在补充有10％胎牛血清、2％青霉素/链霉素(Invitrogen)、1％L-谷氨酰胺200mM(Invitrogen)和0.1的β-巯基乙醇、抗CD3(17A2，eBioscience)和抗CD28(37.51，eBioscience)抗体的RPMI中，在用抗仓鼠IgG(MP Bio)包被的24孔细胞培养板中培养3天。对于Treg细胞分化，加入TGF-β(2.5ng/mL，Peprotech)。如图例中所示，向细胞培养物中加入IL-33(1ng/mL，BioLengend)或IL-23(20ng/mLPeprotech)。在第3天，回收细胞，通过FACS分析Treg细胞(CD4+CD25+Foxp3+)。
T细胞转移结肠炎
对于T细胞转移结肠炎，分选5×105个来自C57BL/6野生型动物的原初性CD4+CD45RBhiCD25-T细胞并腹膜内注射入C57BL/6Rag1-/-受体小鼠。每周测量两次体重减轻，用作疾病严重程度的方式。
实验性自身免疫脑脊髓炎
用200μl由在完全弗氏佐剂(Difco Laboratories)中乳化的200μg MOG35-55肽(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，AnaSpec，SEQ ID NO：8)组成的乳剂皮下免疫6至8周龄小鼠C57BL/6、SIGN-R1-/-或SIGN-R1-/-hDC-SIGN+小鼠。在第0天和第2天，小鼠腹膜内接受200μg百日咳毒素(List Biological)。根据以下标准每天监测疾病发展：0—无临床症状；0.5—部分软绵的尾巴(limp tail)；1—瘫痪的尾巴(paralyzed tail)；2—协调运动丧失；后肢轻瘫；2.5—一只后肢瘫痪；3—两只后肢瘫痪；3.5—后肢瘫痪且驼背；4—严重驼背且前肢无力；4.5—前肢瘫痪；5—垂死(Stromnes et al..Nat Protoc 2006,1(4):1810-1819)。
实施例2.F241A模拟唾液酸化IgG-Fc并保护免于自身抗体诱导的炎症
非唾液酸化和唾液酸化IgG分子的晶体结构显示重链方向的差异。虽然非唾液酸化IgG(G0F型)保持开放构象并提供能够与I型Fc受体相互作用的结构，但唾液酸化IgG(G2FS2型)更灵活，其允许替代的构象(开放和闭合)(Ahmed et al.J Mol Biol 2014,426(18):3166-3179)，使其能够结合II型Fc受体(Sondermann et al.Proc Natl Acad Sci US A 2013,110(24):9868-9872)。如图1a所示，非唾液酸化Fc结构中F241的芳香族侧链相对于彼此层叠(图1a，左图)。在该方向中，苯丙氨酸侧链与Fc聚糖的α1,3臂中的糖残基形成疏水相互作用。令人惊奇的是，唾液酸化Fc结构中F241的芳香环相对于非唾液酸化Fc结构中F241芳环呈现近90°的旋转(图1a，右图)。这表明在唾液酸化后，F241与Fc聚糖的α1,3臂之间的相互作用可能被破坏，这可能造成所观察到的抗体结构和功能的变化。
因此，为了模拟蛋白-聚糖相互作用的这种破坏，本发明人在残基F241上引入了丙氨酸点突变(F241A)，并测定该突变如何改变唾液酸化和非唾液酸化Fc的活性。本发明人通过在稳定地过表达糖基转移酶ST6GalI和β4GalTI的293细胞中表达重组蛋白，来产生α2,6-唾液酸化F241A Fc。为了比较，随后用神经氨酸酶处理该唾液酸化F241A Fc制剂的一部分，以除去唾液酸得到非唾液酸化F241A Fc。本发明人通过凝集素印迹证实了两种F241AFc制剂的唾液酸化状态。本发明人接下来证明，唾液酸化F241A Fc保留了ELISA形式的DC-SIGN结合活性，如通过相对于非唾液酸化WT Fc增加的受体结合亲和力所证实的(图8)。然而，F241A Fc的神经氨酸酶处理没有消除DC-SIGN结合，这确定了F241A突变赋予的DC-SIGN结合活性与唾液酸无关。
为了确定F241A突变是否导致功能性DC-SIGN结合和信号传导，本发明人研究了F241A和sFc在表达DC-SIGN的骨髓来源的巨噬细胞(BMMΦ)中诱导IL-33表达的能力。仅sFc在这些细胞中诱导IL-33表达，而唾液酸化和非唾液酸化F241A Fc均以DC-SIGN依赖性方式在BMMΦ中诱导IL-33的表达(图1b)。此外，在转运到用关节炎K/BxN血清激发的小鼠时，用非唾液酸化F241A Fc以及sFc刺激的hDC-SIGN+ BMMΦ以DC-SIGN依赖性方式抑制了足垫肿胀(图1c)。此外，只有用唾液酸化野生型Fc才实现了保护，而Fc突变体F241A即使在非唾液酸化时也能够保护小鼠(图1d)。因此，在开发用于测量唾液酸化Fc活性的测定中，F241A突变重复了(recapitulate)几种Fc功能。
为了进一步定义作为抗炎分子的F241A的活性，本发明人用K/BxN血清对C57BL/6野生型小鼠进行了激发，并用PBS、IL-4ic或非唾液酸化F241A(0.033g/kg)处理它们。接受IL-4或F241A的小鼠中，血清lL-6水平显著降低(图2a)。与此观察结果一致，IL-4ic处理和F241A处理的小鼠显示减少的关节炎临床征象(图2b)，这表明，与IVIG和sFc相当，F241A足以抑制炎症(Kaneko et al.Science 2006,313(5787):670-673和Anthony et al.Science2008,320(5874):373-376)。
为了证实F241A的这种抑制是II型FcR依赖性的，本发明人使用了SIGN-R1-/-或SIGN-R1-/-hDC-SIGN+接受者。小鼠接受唾液酸化野生型Fc或神经氨酸酶处理的非唾液酸化F241A(均为0.033g/kg)，并用K/BxN血清激发。通过两种制剂均实现了关节炎炎症抑制；然而，只有表达BAC转基因人DC-SIGN(hDC-SIGN+)的小鼠得到了保护(图2c)，证明II型Fc受体SIGN-R1或其人直向同源DC-SIGN的存在分别是唾液酸化Fc和F241A诱导的免疫调节作用所需的。
唾液酸可以α2,3、α2,6或α2,8构象与复杂的双支Fc聚糖的倒数第二半乳糖连接。本发明人之前已经报道，只有唾液酸的α2,6连接的糖型是生物活性的(Anthony etal.Science 2008,320(5874):373-376)。以前关于不同Fc唾液酸型的结构分析的建模数据(Sondermann et al.Proc Natl Acad Sci U S A 2013,110(24):9868-9872)预测了，Cγ2-Cγ3界面上的Glu318/Lys340口袋是α2,6唾液酸化Fc的生物学活性所需要的并且可以独特地适应这种糖型，而α2,3连接的唾液酸将在空间上受到抑制而不能拟合于该口袋中。为了测试这一预测，本发明人将E318N点突变引入IgG1Fc，并在α2,6唾液酸化时将其性质与野生型α2,6唾液酸化Fc进行比较。尽管与野生型相比，突变体实现了相当程度的唾液酸化，但只有野生型唾液酸化Fc能够刺激hDC-SIGN+BMMΦ中IL-33的表达(图9a)。接受用α2,6唾液酸化野生型Fc而不是α2,6唾液酸化E318N Fc刺激的BMMΦ的小鼠表现出减少的疾病临床征象(图9b)以及较低水平的IL-6(图3c)。这些结果一起将F241和E318定义为促成α2,6唾液酸化F的抗炎活性的残基。
实施例3.唾液酸化Fc/F241A激活Treg细胞
最近在患者中和动物模型中的研究表明，IVIG的施用可导致Treg细胞的扩增(Ephrem et al.Blood 2008,111(2):715-722和Bayry J et al.Rheumatol,vol.39:Canada,2012,pp 450-451)，通过增加Treg细胞的数量和抑制能力来有效地抑制T细胞依赖性自身免疫反应(Kessel et al.J Immunol 2007,179(8):5571-5575)。为了确定IVIG制剂的哪种成分可能对此起作用，本发明人使用IVIG的IVIG(1g/kg)、F(ab')2(0.66g/kg)或Fc(0.33g/kg)制剂以等摩尔浓度静脉内施用于C57BL/6野生型小鼠。注射后4天，本发明人通过流式细胞术分析脾CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞的百分比。与PBS处理的小鼠相比，施用完整的IVIG或其Fc片段导致Treg细胞的两倍扩增，并通过使用IVIG-F(ab')2将其消除(图3a)。
接下来我们确定在持续的炎症反应中Fc唾液酸化在Treg细胞扩增中的作用。用PBS、IVIG(1g/kg)、神经氨酸酶处理的非唾液酸化IVIG(NA-IVIG)(1g/kg)或F241A(0.033g/kg))处理K/BxN激发的C57BL/6小鼠，评估疾病进展和Treg细胞扩增。如以前观察到的(Schwab et al.Eur J Immunol 2014,44(5):1444-1453和Anthony et al.Nature 2011,475(7354):110-113)，关节炎的临床评分显示，IVIG和F241A但不是非唾液酸化IVIG保护小鼠免于关节炎(图3b)。在IVIG和F241A处理的小鼠中观察到Treg细胞扩增，但在非唾液酸化IVIG处理的小鼠中没有观察到Treg细胞扩增(图3c)，这表明Treg细胞亚群分别被唾液酸化Fc和F241A选择性地扩增。
实施例4.IVIG-/F241A激活的Treg细胞抑制了CD4+T细胞应答
为了评估对IVIG/F241A的Treg细胞扩增能否抑制CD4+T细胞应答，本发明人通过在CFA中乳化的MOG35-55肽免疫接种，在C57BL/6野生型小鼠中诱导EAE。诱导后5天，用PBS、IVIG或NA-IVIG(均为1g/kg)处理小鼠以鉴别唾液酸化IgG特异性引发的作用。EAE的临床评分显示，与PBS处理的小鼠相比，接受IVIG的小鼠的临床评分显著降低(图4a)。然而，当施用非唾液酸化IVIG(NA-IVIG)时，保护作用被消除。为了确定这种效应的潜在机理基础，本发明人表征来自处理动物的淋巴结的细胞，并分析了CD4+效应T细胞的百分比。CD4+效应T细胞、TH1(IFN-γ+)、TH17(IL-17A+)和IFN-γ+ IL-17A+ CD4+ T细胞的所有亚群以相似的百分比存在(图4b)；然而，与PBS处理组或NA-IVIG处理组相比，给予IVIG的小鼠中CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞的百分比显著升高(图4c)。
为了评估是否通过Treg细胞的激活和扩增来特异性介导疾病保护，本发明人在未处理的和Treg细胞耗尽的小鼠中测试了F241A作为IVIG替代物的保护潜力。通过施用抗CD25抗体(PC61)完成Treg细胞耗尽。与PBS处理的小鼠相比，单独用F241A(0.033g/kg)处理的小鼠受到保护(图4d)，这表明F241A与IVIG在保护免受T细胞应答方面同样有效。然而，在Treg细胞耗尽的小鼠中，这种保护作用显著降低。FACS分析表明，F241A和PC61处理均未显著影响CD4+效应T细胞(图4e)，而PC61处理降低了Treg细胞水平(图4f)。因此，Treg细胞的耗尽与用F241A处理的动物中所观察到的保护免受EAE的丧失相关。为了区分天然(nTreg)和诱导型Treg(iTreg)细胞，本发明人在IVIG处理和PBS处理的EAE小鼠中分析了Treg细胞中其nTreg特异性转录因子Helios的表达(Thornton et al.J Immunol 2010,184(7):3433-3441)。Treg细胞的扩增与Helios表达的增加无关(图10c)，这表明明显保护小鼠免于EAE(图10a和b)的IVIG(1g/kg)特异性诱导CD4+CD25+Foxp3+Helios-诱导型Treg(iTreg)细胞。
这些结果一起表明，唾液酸化IVIG以及F241A导致Treg细胞的激活和扩增，导致在EAE中抑制CD4+效应T细胞应答和临床疾病。
实施例5.II型Fc受体是sFc介导的保护免受EAE侵害所必需的
已经充分研究了自身抗体介导的疾病和刺激IL-33产生的背景下，sFc诱导的炎症抑制对II型Fc受体SIGN-R1和hDC-SIGN的需求(Anthony et al.Nature 2011,475(7354):110-113)。因此，本发明人检查了sFc介导的Treg细胞刺激对II型Fc受体SIGN-R1的需求。在C57BL/6野生型或SIGN-R1-/-小鼠中诱导EAE，然后用IVIG(1g/kg)或PBS作为对照处理。虽然野生型小鼠再次通过IVIG受到保护而免受EAE，但在SIGN-R1敲除小鼠中这种保护作用显著降低(图5a)。这与SIGN-R1-/-背景下IVIG(1g/kg)既不保护免受K/BxN诱导的关节炎(图11a)也不诱导Treg细胞激活(图11b)的观察结果一致。相比之下，当通过施用外源性IL-33重建IL-33水平时，SIGN-R1-/-小鼠被部分保护免于EAE(图5b)，其与增加的Treg细胞数相关(数据未显示)。类似地，hDC-SIGN的转基因表达补充了SIGN-R1的丧失(Anthony et al.Nature2011,475(7354):110-113)，并且导致IVIG(1g/kg)和F241A(0.033g/kg)处理的小鼠中EAE临床评分均降低(图5c和d)。
实施例6.IL-33是sFc触发的Treg细胞激活的关键介质
通过唾液酸化Fc上调效应物巨噬细胞上的FcγRIIB严重依赖于警报素(alarmin)IL-33的产生和分泌(Anthony et al.Nature 2011,475(7354):110-113)。此外，最近的研究结果表明，IL-33本身对Treg细胞的刺激和激活具有积极的作用(Turnquist et al.JImmunol 2011,187(9):4598-4610,和Matta et al.J Immunol 2014,193(8):4010-4020)，从而有助于抑制实验性结肠炎小鼠模型中的炎症(Schiering et al.Nature 2014,513(7519):564-568)。为了测试sFc诱导的IL-33的产生可能还有助于Treg细胞刺激的可能性，本发明人观察到从C57BL/6野生型小鼠中分离出的原初性CD4+T细胞，并在抗CD3、抗CD28抗体和TGF-β的存在下培养3天以特异性驱动Treg细胞分化。细胞未处理或与IL-33和IL-23组合处理。培养物中CD4+Foxp3+ Treg细胞百分比的流式细胞术分析表明，添加IL-33对Treg细胞分化以及Foxp3表达具有协同作用(图12)，如先前Schiering及其同事报道的(Schieringet al.Nature 2014,513(7519):564-568)。此外，IL-33诱导Treg细胞上IL-33受体ST2的上调。将IL-23加入到Treg细胞培养物中抵消了IL-33的作用(图12)，这与IL-23是ST2的负调节因子一致(Schiering et al.Nature 2014,513(7519):564-568和Izcue et al.Immunity2008,28(4):559-570)。
接下来，本发明人测定了IL-33的施用是否也影响体内的Treg细胞。每天给予C57BL/6野生型小鼠IL-33(0.5μg)连续4天。在第五天，分析脾的Treg细胞数。与PBS处理的对照小鼠相比，IL-33施用导致Treg细胞显著增加(图6a和b)。hDC-SIGN+ BMMΦ用PBS、IVIG或非唾液酸化F241A进行脉冲处理，并且通过定量rtPCR测量IL-33表达，显示IVIG和F241A以DC-SIGN依赖性方式明显诱导IL-33表达(图6c)。处理后，BMMΦ随后转入C57BL/6野生型小鼠。细胞转移后5天，只有接受IVIG脉冲处理或F241A脉冲处理的hDC-SIGN+BMMΦ的小鼠具有明显更高水平的Treg细胞(图6d和e)。这种表型与这些细胞上IL-33受体ST2的增强表达相关(图6d)。此外，EAE的IL-33治疗导致EAE症状的显著改善，其与引流淋巴结中Treg细胞的增加相关(图6f和g)。
由于已经证明效应巨噬细胞上FcγRIIB的上调需要嗜碱性细胞的存在(Anthonyet al.Nature 2011,475(7354):110-113)，本发明人研究了嗜碱性细胞是否也在sFc介导的Treg细胞激活途径中起作用。小鼠用PBS或IVIG(1g/kg)处理并用K/BxN血清激发。也用抗FcεRI抗体来耗尽嗜碱性细胞或用同种型对照处理小鼠(Sokol et al.Nat Immunol 2008,9(3):310-318)。尽管如本发明人以前已经显示(Anthony et al.Nature 2011,475(7354):110-113)，嗜碱性细胞耗尽(图13a)破坏了IVIG在K/BxN关节炎模型中的保护作用(图13b)，IVIG扩增Treg细胞的能力不受影响(图13c)。这表明IL-33是Treg细胞激活所必需的；然而，嗜碱性细胞在这个途径中没有贡献。
实施例7.sFc/F241A通过IL-33/ST2轴激活诱导型Treg细胞
为了进一步探索响应于sFc与II型FcR受体接合的Treg细胞扩增和激活的机制，本发明人着重研究了IL-33受体ST2的作用。正如最近报道的那样，用PBS或IVIG(1g/kg)单独或与ST2阻断抗体组合处理的K/BxN激发的小鼠表明，阻断IL-33受体降低了IVIG在血清转移关节炎模型中的保护作用(Anthony et al.Nature 2011,475(7354):110-113)(图7a)。这些小鼠的Treg细胞数的FACS分析显示，IL-33信号传导的抑制也消除了Treg细胞的扩增(图7b)。在EAE模型中观察到类似的结果，其中F241A(0.033g/kg)的治疗效果通过阻断IL-33受体(图7c)而显著降低，伴随Treg细胞扩增的减少(图7d)。
最后，为了确定sFc对T细胞介导的疾病的影响的观察结果的一般性，本发明人使用实验性结肠炎小鼠模型，并且在T细胞转移后四周开始，每周一次用IVIG(1g/kg)或PBS对照处理，直到实验结束。使用体重减轻作为疾病严重性的量度，其显示了IVIG处理介导的保护作用(图14a、c和d)，并且再次伴随着Treg细胞的显著富集(图14b)，而PBS处理和IVIG处理组中CD4+效应T细胞水平相当。基于只有CD4+CD25- T细胞被过继转移以诱导急性结肠炎的事实，这些小鼠中IVIG扩增的Treg细胞起源于外周CD4+ T细胞，并因此是iTreg细胞。
优选实施例的上述示例和描述应当被认为是说明而不是限制由权利要求限定的本发明。本文引用的所有出版物通过引用整体并入本文。如将容易理解的，在不脱离如权利要求的本发明的情况下，可以利用上述特征的许多变化和组合。这些变化不被认为是偏离本发明的范围，并且所有这些变化都意图包括在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> 洛克菲勒大学（Rockefeller University）
<120> 抗炎多肽
<130> 070413.20212
<150> 14/368,701
<151> 2014-06-25
<150> PCT/US2012/068718
<151> 2012-12-10
<150> 61/577,361
<151> 2011-12-19
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Tyr Arg Asn Gly Lys
20

Claims (20)

1.一种增加有需要的受试者中调节性T(Treg)细胞水平的方法，包括向受试者施用有效量的
(i)第一分离多肽，其包含被唾液酸化的IgG Fc区；或者
(ii)第二分离多肽或编码第二多肽的核酸，所述第二多肽包含与所述IgG Fc区至少75％相同的经修饰的序列，其中所述经修饰的序列具有FA241突变。
2.权利要求1的方法或权利要求20的用途，其中所述第一分离多肽中IgG区以比受试者中IgG的唾液酸化水平更高的水平被唾液酸化。
3.权利要求1-2中任一项的方法或权利要求20的用途，其中所述受试者患有炎症疾病。
4.权利要求3的方法或用途，其中所述炎症疾病是自身免疫疾病。
5.权利要求4的方法或用途，其中所述自身免疫疾病是T细胞介导的自身免疫疾病。
6.权利要求5的方法或用途，其中所述T细胞介导的自身免疫疾病选自多发性硬化和I型糖尿病。
7.权利要求1-6和20中任一项的方法或用途，其中所述IgG Fc区包含SEQ ID NO：1的序列。
8.权利要求1-7和20中任一项的方法或用途，其中所述第一或第二分离多肽具有结合DC-SIGN、hFcγRIIA或hFcγRIIB的能力。
9.权利要求8的方法或用途，其中所述分离多肽具有以2x10-5M或更低的KD(即5.0×104M-1或更高的KA)与hFcγRIIA或hFcγRIIB结合的能力。
10.权利要求1-9和20中任一项的方法或用途，其中所述经修饰的序列是(a)基本上没有唾液酸化或(b)以比受试者中IgG的唾液酸化水平更低的水平被唾液酸化。
11.权利要求1-11和20中任一项的方法或用途，其中所述经修饰的序列与SEQ ID NO：2至少75％相同。
12.一种在有需要的受试者中治疗T细胞介导的自身免疫疾病的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的
(i)第一分离多肽，其包含唾液酸化的IgG Fc区；或者
(ii)第二分离多肽或编码第二多肽的核酸，所述第二分离多肽包含与所述IgG Fc区至少75％相同的经修饰的序列，其中所述经修饰的序列具有FA241突变。
13.根据权利要求12的方法，其中所述第一分离多肽中IgG区以比受试者中IgG的唾液酸化水平更高的水平被唾液酸化。
14.权利要求12或13的方法，其中所述T细胞介导的自身免疫疾病选自多发性硬化和I型糖尿病。
15.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述IgG Fc区包含SEQ ID NO：1的序列。
16.根据权利要求12-15中任一项的方法，其中所述第一或第二分离多肽具有结合DC-SIGN、hFcγRIIA或hFcγRIIB的能力。
17.根据权利要求16的方法，其中所述分离多肽具有以2x10-5M或更低的KD(即5.0×104M-1或更高的KA)与hFcγRIIA或hFcγRIIB结合的能力。
18.根据权利要求12-17中任一项的方法，其中所述经修饰的序列是(a)基本上没有唾液酸化或(b)以比受试者中IgG的唾液酸化水平更低的水平被唾液酸化。
19.根据权利要求12-18中任一项的方法，其中所述经修饰的序列与SEQ ID NO：2至少75％相同。
20.第一分离多肽或者第二分离多肽或编码第二多肽的核酸在制备用于治疗T细胞介导的自身免疫疾病或增加调节性T(Treg)细胞的水平的药物中的用途，其中(i)第一分离多肽包含唾液酸化IgG Fc区；(ii)第二分离多肽包含与IgG Fc区至少75％相同的经修饰的序列，其中所述经修饰的序列具有FA241突变。
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