JP2018524299A - 免疫応答を調節するための方法およびポリペプチド - Google Patents

Abstract

ＴＬＴ−１を免疫細胞に直接結合することにより、細胞の免疫抑制表現型、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲのダウンレギュレーション、および、ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションを誘導する。したがって、ＴＬＴ−１、または、ＴＬＴ−１ポリペプチドによってＰＤ−Ｌ１の発現を誘導し、ＨＬＡ−ＤＲの発現を抑制することは、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、および、移植片対宿主障害などの免疫過敏症に関連する病気を患う患者を治療するのに有益であり得る。

Description

本発明は、免疫応答の調節に関する。より詳しくは、本発明は、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）を免疫細胞に直接結合して細胞の免疫抑制表現型を誘導することによって免疫応答を調節する方法およびポリペプチドに関する。

血小板は、止血の重要なメディエーターである。最近では、血小板は、先天性免疫応答および適応免疫応答のどちらにも影響し得ることがわかってきている。活性化した血小板は、白血球と相互作用して炎症過程を調節する可溶性ＣＤ４０Ｌなどの可溶性メディエーターを放出することができ、敗血症を患う患者の免疫調節異常の一因となる可能性がある。ＴＬＴ−１は、静止血小板のα顆粒や巨核球、および、活性化した血小板の表面にしか見られないものであった。ＴＬＴ−１は、単一のＶセット免疫グロブリン（Ｉｇ）のドメイン、短い細胞質尾部、および、膜貫通領域における荷電残基からなるＴＲＥＭファミリーのメンバーである。ＴＬＴ−１に対する抗体を用いた最近の研究によって、トロンビン誘導性の血小板凝集におけるタンパク質の役割が明らかになった(Giomarelli B, Washington VA, Chisholm MM, Quigley L, McMahon JB, et al. (2007) Inhibition of thrombin-induced platelet aggregation using human single-chain Fv antibodies specific for TREM-like transcript-1. Thromb Haemost 97: 955-963) 。特許文献１は、血小板の活性を調節する方法および組成物、ならびに、被検体における血小板の活性に関連する病気または疾患を治療するための方法および組成物に関する。方法は、血小板の活性を調節するのに有効な量の一本鎖抗ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）抗体、または、その機能的フラグメントもしくは変異体を投与することを含む。

正常なヒト血清には、ＴＬＴ−１の細胞外ドメイン（１２および１４ｋＤａ）の小さい可溶性フラグメントが見られるが、血漿には見られない。研究によれば、ＴＬＴ−１は、フィブリノゲンと結合することによって血小板の凝集を促進させる止血の調節因子としての役割を果たすことが示されると共に、高濃度の可溶性ＴＬＴ−１と、播種性血管内凝固症候群スコアとの間の有意な相関関係も実証されている。特許文献２は、例えば、血液凝固、および、免疫応答などのさまざまな細胞過程を制御する調節剤として役立つＴＬＴ−１核酸およびタンパク質分子を提供する。血漿中での可溶性ＴＬＴ−１の長期間の発現は、敗血症性ショックの患者の生存の低下と関係がある(Washington AV, Gibot S, Acevedo I, Gattis J, Quigley L, et al. (2009) TREM-like transcript-1 protects against inflammation-associated hemorrhage by facilitating platelet aggregation in mice and humans. J Clin Invest 119: 1489-1501) 。特許文献３は、ＴＬＴ−１、および、ＴＬＴ−１由来ペプチドは、ＴＲＥＭ−１の活性を特異的に阻害することにより、抗炎症特性を示すことを開示している。最近では、Ｄｅｒｉｖｅ等によって、可溶性ＴＬＴ−１が可溶性ＴＲＥＭ−1リガンドに結合することにより、白血球の活性化を妨げ得ることが実証されている(Derive M, Bouazza Y, Sennoun N, Marchionni S, Quigley L, et al. (2012) Soluble TREM-like transcript-1 regulates leukocyte activation and controls microbial sepsis. J Immunol 188: 5585-5592) 。これらの可溶性ＴＬＴ−１の臨床的インビトロの研究は、敗血症におけるＴＬＴ−１の二重効果、すなわち、血小板を凝集させ、白血球機能を媒介し得ることを示唆している。

米国特許第７，５５３,９３６号明細書 米国特許出願公開第２００４／０１８０４０９号明細書 米国特許出願公開第２０１３／００２９９２１号明細書

したがって、免疫応答を調節するための薬剤または治療法の開発が必要とされている。

本発明は、免疫応答を調整する方法を提供する。方法は、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）ポリペプチドを免疫細胞に結合することによって免疫応答を抑制することを含む。一実施形態では、ＴＬＴ−１ポリペプチドを免疫細胞に結合することによって、免疫過敏症に関連する病気を治療、および／または、予防する。好ましくは、病気は、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、または、移植片対宿主障害である。いくつかの実施形態では、ＴＬＴ−１ポリペプチドは、以下に記載されたものである。

本発明は、配列番号１、２、もしくは、４２の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号１、２、もしくは、４２のアミノ酸配列と少なくとも約５０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１、２、または、４２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含み、好ましくは、配列番号１、２、または、４２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ポリペプチドは、組換えポリペプチド、または、合成ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ペグ化ポリペプチド、組織標的分子と結合したポリペプチド、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、組織標的分子と融合したポリペプチド、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドである。

本発明は、さらに、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチド、および、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。また、本発明は、免疫過敏症に関連する病気を治療、および／または、予防する方法を提供する。方法は、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチド、または、ＴＬＴ−１ポリペプチドを含む組成物を被検体に投与することを含む。

本発明は、さらに、１つ以上のＴＬＴ−１融合タンパク質を提供する。ＴＬＴ−１融合タンパク質は、１つ以上の異種ポリペプチド、または、本発明の他のＴＬＴ−１ポリペプチドと融合した本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。

本発明は、さらに、ペグ化ＴＬＴ−１ポリペプチドを提供する。ペグ化ＴＬＴ−１ポリペプチドは、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドのＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸残基と機能的に連結された１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む。

本発明は、さらに、免疫抑制剤と結合した本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含むＴＬＴ−１ポリペプチド結合体を提供する。

ＴＬＴ−１と白血球との間の相互作用を示す。ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）をｒｓＴＬＴ−１（組換え可溶性ＴＬＴ−１）と共に１時間インキュベートし、ビオチンヤギ抗ＴＬＴ−１抗体に結合したＡＰＣアビジンで染色することによってＴＬＴ−１の表面結合を検出した。（Ａ）は、ｒｓＴＬＴ−１で処理した場合またはしない場合のさまざまな白血球の代表的なＦＡＣＳヒストグラムを示す。単球、ＰＭＮ（多形核白血球）、および、リンパ球は、それらのＦＳＣ／ＳＳＣ特性に基づきゲーティングされている（太線は、ｒｓＴＬＴ−１で処理された細胞、破線は、未処理の細胞、細い破線は、適切なアイソタイプコントロールで処理された細胞を示す）。ＴＬＴ−１は、単球およびＰＭＮには結合するが、リンパ球には結合しない。（Ｂ）は、さまざまな濃度のｒｓＴＬＴ−１が単球およびＰＭＮに結合していることを示す。ｒｓＴＬＴ−１の単球およびＰＭＮへの結合能力は、その量に依存する。値は、３つの別々の実験からの平均値±標準誤差として示している。 単球におけるＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１分子の表面発現に対するｒｓＴＬＴ−１の効果を示す。（Ａ）単球をｒｓＴＬＴ−１（１０μｇ／ｍＬ）と共に３日間インキュベートした。図に示す時点で細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用いてＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１分子を分析した。ｒｓＴＬＴ−１で処理することにより、ＨＬＡ−ＤＲ発現のダウンレギュレーションが見られた。一方、ｒｓＴＬＴ−１は、単球におけるＰＤ−Ｌ１の発現量をアップレギュレーションさせている。（Ｂ）単球を異なる濃度のｒｓＴＬＴ−１と共に２日間インキュベートした。細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用いてＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１分子を分析した。細胞の表面発現を、コントロールの培地で処理した細胞（点線）と毎日比較して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。値は、３つの別々の実験からの平均値±標準誤差として示している。 単球におけるＰＤ−Ｌ１分子の表面発現に対するＴＬＴ−１ポリペプチドの効果を示す。（Ａ）は、ＴＬＴ−１、および、設計されたＴＬＴ−１ポリペプチドの細胞外ドメインの構造的性質を示す。（Ｂ）は、単球を、異なる長さのＴＬＴ−１ポリペプチド（１０μｇ／ｍｌ）、および、ｒｓＴＬＴ−１（１０μｇ／ｍｌ）と共に１日インキュベートしたことを示す図である。細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用いてＰＤ−Ｌ１分子を分析した。細胞の表面発現を、コントロールの培地で処理した細胞（点線）と毎日比較して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。 単球におけるＨＬＡ−ＤＲ分子の表面発現に対するＴＬＴ−１ １５〜１６ポリペプチドの効果を示す。単球を１０μｇ／ｍｌのＴＬＴ−１ １５〜６３ポリペプチド、および、１０μｇ／ｍｌのｒｓＴＬＴ−１と共に２日間インキュベートした。細胞を収穫し、フローサイトメトリーを用いてＨＬＡ−ＤＲ分子を分析した。細胞の表面発現を、コントロールの培地で処理した細胞（点線）と毎日比較して平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示した。

まず、本発明の組成物、方法、および、単離方法は変化し得るので、本発明はこれらに限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のみで用いられており、限定する意図はなく、本発明の範囲は、添付の請求項においてのみ限定されることも理解されるべきである。

本発明では、ＴＬＴ−１を免疫細胞に直接結合することにより、細胞の免疫抑制表現型、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲのダウンレギュレーション、および、ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションを誘導するという驚くべき発見をした。したがって、ＴＬＴ−１またはＴＬＴ−１ポリペプチドによってＰＤ−Ｌ１の発現を誘導し、ＨＬＡ−ＤＲの発現を抑制することは、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、および、移植片対宿主障害などの免疫過敏症に関連する病気の治療に有益である。

［定義］
特に定義しない限り、本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解される意味と同じである。本発明の実施または試験には本明細書に記載されるものと同様または同等のいかなる方法および材料を用いることができる。したがって、変更および修正は、本開示の趣旨および範囲内に収まることが理解されよう。

特に指定しない限り、単数形は複数形を含む。

本明細書で用いられるアミノ酸残基は、以下のように短縮される：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、および、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）。

本明細書で用いられる用語「ＰＤ−Ｌ１」とは、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７４、または、Ｂ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）を指す。ＰＤ−Ｌ１は、妊娠、自己免疫疾患、がん、敗血症などの特定の事象の間、および、結核菌、サイトメガロウィルス、および、肝炎などの他の感染症において免疫系を抑制するという重要な役割を果たす４０ｋＤａのタイプ１膜貫通タンパク質である。

本明細書で用いられる用語「単球」は、単核白血球とも呼ばれ、最も重要な防御機構に関与するタイプの白血球に属し、樹枝状細胞、または、マクロファージ前駆細胞に分化され得ると認識されている。単球は、通常、血液系内を移動する。単球は、外部の刺激信号に反応して、多くの免疫調節サイトカインを分泌し、組織における感染部位に移動し、マクロファージへと分化する。

本明細書で用いられる用語「調節する」は、一般的に、コントロールと比較して統計的にまたは生理的に顕著な量で「減少する」または「低下する」だけでなく「増加する」、または、「刺激する」ことを含む。

本明細書で用いられる用語「同一性」とは、配列の比較によって決定されるような２つ以上のポリペプチド、または、タンパク質配列の間の関係を指す。技術的には、「同一性」は、そのような配列における列同士の一致によって決定されるような、ポリペプチドまたはタンパク質間の配列の相関度のことを指す。「同一性」は、周知の生体情報による方法によって簡単に計算できる。２つのポリヌクレオチド、または、２つのポリペプチド配列の「パーセント同一性」は、デフォルトパラメータを用いるＧＡＰコンピュータプログラム（ＧＣＧウィスコンシンパッケージ、バージョン１０．３を使用して配列を比較することによって決定される。

本明細書で用いられる用語「生物活性フラグメント」とは、本発明に含まれるポリペプチドのアミノ酸フラグメントを意味し、本明細書に記載されるポリペプチドの効力を有する。

本明細書で用いられる用語「変異体」とは、野生型のアミノ酸配列、または、置換、挿入、交差、欠失、および／または、他の遺伝子操作によって変更されているアミノ酸配列を意味する。本開示における変異体を生成する方法は限定されない。いくつかの実施形態では、変異体の配列は、親配列と比べて、高い、低い、または実質的に同様の活性度または特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、変異した１つ以上のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸残基は、変異体ポリペプチドにおける親ペプチドに比べて、一定、不変、または、非置換であり得る。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、構造安定性または他の特性が高められた変異体を生成するための基準として用いられる。変異体は、二次構造、三次構造、および、折り畳み度の少なくとも１つが異なってもよい。

本明細書で用いられる用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および、「タンパク質」は、それぞれ、ペプチド結合によって互いに結合される２つ以上のアミノ酸残基からなる分子のことを指す。これらの用語は、翻訳後に、または、共有結合もしくは非共有結合で修飾されたタンパク質の他に、例えば、天然タンパク質、人工タンパク質、タンパク質小片、および、タンパク質配列のポリペプチド類似体（変異体、および、融合タンパク質）を含む。ペプチド、ポリペプチド、または、タンパク質は、モノマーまたはポリマーであってよい。

本明細書で用いられる用語「ポリペプチドフラグメント」とは、対応する完全長タンパク質と比べて、アミノ末端、および／または、カルボキシ末端が欠失したポリペプチドのことを指す。フラグメントは、例えば、１〜５のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端を予測したものと異ならせるようなタンパク質分解（または他の）処理によって生じ得る。フラグメントは、さらに、その一端または両端に、例えば、異なる自然のタンパク質からのアミノ酸の配列、または、人工アミノ酸配列（例えば人工リンカー配列もしくはタグタンパク質）などの１つ以上の追加のアミノ酸を有し得る。

本明細書に用いられる用語「薬学的に許容可能な担体」とは、活性成分以外の、被検体に対して毒性のない医薬組成物中の成分を指す。薬学的に許容可能な担体は、これに限定されないが、緩衝液、賦形剤、安定剤、または、防腐剤を含む。

本明細書で用いられる用語「被検体」とは、脊椎動物、好ましくは、哺乳類、より好ましくは、ヒトを意味する。哺乳類は、これらに限定されないが、ヒト、家畜、変種動物、および、ペットである。

本明細書で用いられる用語「有効量」とは、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量を意味する。有効量は、複数回に分けて投与されてよい。本発明によれば、有効量は、病状を診断、緩和、改善、安定、回復、または、病状の進行を遅らせるもしくは遅延させるのに十分な量のことを指す。

本明細書で用いられる用語「治療」、「治療する」などは、一般的に、所望の薬理学的、および／または、生理学的効果を得ることを意味する。効果は、病気またはその症状を完全に、または、一部予防するという観点では、予防であってよく、および／または、病気、および／または、病気の副作用を一部または完全に安定化または治癒する観点では治療であってよい。本明細書で用いられる「治療」とは、哺乳類、特に、ヒトの病気のあらゆる治療を含み、（ａ）病気またはその症状になりそうだがまだそうとは診断されていない患者がその病気または症状になるのを予防する、（ｂ）病徴を阻害する、すなわち、病気の発症を抑制する、または、（ｃ）病徴を軽減する、すなわち、病気または症状を退行させることを含む。

本明細書で用いられる用語「予防」とは、患者または被検体が病状または病態になるのを阻止する予防または予防的手段が取られていることを意味する。予防とは、患者または被検体が病態または病状になる可能性を低減し、その病状または病態の発症を阻害または抑制することも含む。

値の範囲が与えられる場合、特に明確に指示しなければ、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値（文脈によって明示的に示されない限り、下限値の単位の１０分の１まで）、および、その記載範囲の中の任意の他の記載値または介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値および下限値は、独立してより小さい範囲内に含まれ得、また、本発明内に包含され、記載範囲内の任意の具体的に除外された限界に従う。記載範囲が一方または両方の限界を含む場合には、それらの包含された限界の一方または両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。

［免疫応答の調節］
本発明では、ＴＬＴ−１を免疫細胞に直接結合することにより、ＨＬＡ−ＤＲのダウンレギュレーション、および、ＰＤ−Ｌ１のアップレギュレーションといった細胞の免疫抑制表現型を誘導するという驚くべき発見をした。

本発明の一側面では、免疫応答を調整する方法が提供される。方法は、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）ポリペプチドを免疫細胞に結合することによって免疫応答を抑制することを含む。一実施形態では、ＴＬＴ−１ポリペプチドは以下に記載されたものである。

一実施形態では、本発明は、免疫過敏症に関連する病気を治療、および／または、予防する方法を提供する。方法は、有効量のＴＬＴ−１ポリペプチドを被検体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、病気は、これらに限定されないが、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、および、移植片対宿主障害を含む。

ＴＬＴ−１ポリペプチドを単球に結合することによって、ＰＤ−Ｌ１の発現が誘導され、ＨＬＡ−ＤＲの発現が抑制される。それによって、免疫過敏症に関連する病気を治療することができる。免疫細胞に結合できるＴＬＴ−１ポリペプチドは、全長ＴＬＴ−１、および、そのポリペプチドフラグメントを含み、上記のようなＰＤ−Ｌ１およびＨＬＡ−ＤＲの発現を調節できる。

［ＴＬＴ−１ポリペプチド］
本発明では、ＴＬＴ−１の細胞外ドメインの配列が免疫細胞への結合に関与しているという驚くべき発見をした。好ましくは、配列は、少なくとも３０のアミノ酸（ＴＬＴ−１ ３４〜６３）、少なくとも４９のアミノ酸（ＴＬＴ−１ １５〜６３）、または、少なくとも１４７のアミノ酸ＴＬＴ−１ １１６〜１６２）からなる。免疫細胞にＴＬＴ−１ポリペプチドを結合することによってＰＤ−Ｌ１の発現を誘導し、ＨＬＡ−ＤＲの発現を抑制することができる。したがって、ＴＬＴ−１またはＴＬＴ−１ポリペプチドによるＰＤ−Ｌ１発現の誘導およびＨＬＡ−ＤＲ発現の抑制は、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、および、移植片対宿主障害などの免疫過敏症に関連する病気の治療に有益であり得ることを示唆している。

本発明の他の側面では、配列番号１の少なくとも５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチドを提供する。
ＩＬＶＱＣＨＹＲＬＱＤＶＫＡＱＫＶＷＣＲＦＬＰＥＧＣＱＰＬＶ（配列番号１）。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ポリぺプチドは、配列番号２の５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含む。
ＧＱＧＩＶＧＳＬＰＥＶＬＱＡＰＶＧＳＳＩＬＶＱＣＨＹＲＬＱＤＶＫＡＱＫＶＷＣＲＦＬＰＥＧＣＱＰＬＶ（配列番号２）。

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一のアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３の５つのアミノ酸からなるアミノ酸配列、配列番号４２のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含む。
ＱＧＩＶＧＳＬＰＥＶＬＱＡＰＶＧＳＳＩＬＶＱＣＨＹＲＬＱＤＶＫＡＱＫＶＷＣＲＦＬＰＥＧＣＱＰＬＶＳＳＡＶＤＲＲＡＰＡＧＲＲＴＦＬＴＤＬＧＧＧＬＬＱＶＥＭＶＴＬＱＥＥＤＡＧＥＹＧＣＭＶＤＧＡＲＧＰＱＩＬＨＲＶＳＬＮＩＬＰＰＥＥＥＥＥＴＨＫＩＧＳＬＡＥＮＡＦＳＤＰＡＧＳＡＮＰＬＥＰＳＱＤＥＫＳＩＰ（配列番号３）。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または、１００％同一のアミノ酸配列を有する。

本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＴＬＴ−１アミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の挿入、置換、および／または、欠失を含むポリペプチドが提供される。好ましくは、ＴＬＴ−１アミノ酸配列は、配列番号１、２、または、３のアミノ酸配列である。

ポリペプチドは、組換え方法、および、化学合成によって生成され得る。

さらに、本発明では、機能的に同等なポリペプチドの使用も見出された。機能的に同等なポリペプチドは、アミノ酸残基の欠失、追加、または、置換を含み、結果としてサイレント変化をもたらすことによって、機能的に同等な遺伝子産物を生成する。アミノ酸の置換は、置換される残基の極性、荷電、溶解性、疎水性、親水性、および／または、両親媒性に基づいてなされ得る。本明細書で用いられる「機能的に同等な」ポリペプチドとは、実質的に同様なインビボ活性を示すことができるタンパク質を指す。

ポリペプチドは、当技術分野では周知である技法を用いる遺伝子組換え技術、または、合成技術によって生成されてよい。コード配列、および、適切な転写／翻訳制御信号を含む発現ベクターを構築するために、当業者には周知の方法が用いられてよい。これらの方法は、例えば、インビトロでの遺伝子組換え技術、合成技術、および、インビボの組換え／遺伝子組換えを含む。あるいは、対象とするポリペプチドをコードすることが可能なＲＮＡが化学的に合成されてよい。

一般的に、コード配列は、比較的大量の遺伝子産物を生成するための所望の宿主細胞内で機能するプロモーターの制御下にある。きわめて多くの種類のプロモーターが周知であり、特定の用途に基づいて本発明の発現ベクターで用いられてよい。通常、プロモーターの選択は、プロモーターが活性化する細胞に基づく。リボソーム結合部位、転写終結部位などの他の発現制御配列も任意で含まれる。これらの制御配列の１つ以上を含む構築物を「発現カセット」と称する。発現は、特定の宿主細胞に適したプロモーター、および、他の調節剤を用いて、原核細胞および真核細胞において生じ得る。宿主細胞の例は、これらに限定されないが、大腸菌、他の細菌宿主、イースト、および、ＣＯＳ細胞株、ＣＨＯ細胞株、ＨｅＬａ細胞株、骨髄腫細胞株などのより高等な真核細胞が挙げられる。

発現すると、組換えポリペプチドは、硫安沈殿、アフィニティーカラム、イオン交換および／またはサイズ排除クロマトグラフィーを含む当技術では標準的手法によって精製されうる（R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982), Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification., Academic Press, Inc. N.Y. (1990)参照) 。

組換え方法に代わるものとしては、ポリペプチドは、化学的に合成されてよい。このような方法は、一般的に、固体によるアプローチが取られるが、液体の化学的性質を利用してもよく、または、固体と液体とのアプローチを組み合わせてもよい。タンパク質を合成するための固体による方法の例は、Merrifield (1964) J. Am. Chem. Soc. 85:2149; and Houghton (1985) Proc. Natl. Acad. Sci., 82:5132に記載されている。本発明のポリペプチドのフラグメントは、合成可能であり、結合可能である。このような反応を実行する方法は、Grant (1992) Synthetic Peptides: A User Guide, W.H. Freeman and Co., N.Y.、および、"Principles of Peptide Synthesis," (Bodansky and Trost, ed.), Springer-Verlag, Inc. N.Y., (1993)に記載されている。

本発明の他の側面では、ＴＬＴ−１融合タンパク質が提供される。ＴＬＴ−１融合タンパク質は、１つ以上の異種ポリペプチド、または、本発明の他のＴＬＴ−１ポリペプチドと融合した本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。ＴＬＴ−１ポリペプチドは、１つ以上の異種ポリペプチド、または、本発明の他のＴＬＴ−１ポリペプチドと直接、または、アミノ酸リンカーを介して共有結合する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、一般的にＣ末端とＮ末端とが結合するが、Ｃ末端とＣ末端、Ｎ末端とＮ末端、または、Ｎ末端とＣ末端とが結合してもよい。融合タンパク質のポリペプチドは、いかなる順序でもよく、構成要素であるポリペプチドのいずれかまたは両方を２つ以上含んでよい。異種ポリペプチドの例は、これらに限定されないが、アルブミン、血清アルブミン結合ペプチド、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）、組織標的分子、および、免疫抑制ペプチドが挙げられる。好ましくは、異種ペプチドは、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドである。

本発明は、また、ペグ化ＴＬＴ−１ポリペプチドを提供する。ペグ化ＴＬＴ−１ポリペプチドは、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドのＮ末端における少なくとも１つのアミノ酸残基と機能的に連結された１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含む。分子のペグ化は、例えば、Youngster et al., Curr Pharm Des (2002),8:2139に記載された方法によってなされ得る。ペグ化されたポリペプチドは機能的に活性であり、当技術分野では周知の方法によって分析可能であるという条件で、いかなる種類のポリエチレングリコールも本発明に用いられ得る。好ましくは、本発明のポリエチレングリコールは、ＰＥＧ１０００、２０００、３０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、２００００、４００００、または、５００００である。一実施形態では、ペグ化されたＴＬＴ−１ポリペプチドは、単量体ＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。他の例では、ペグ化された分子は、オリゴマーＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。さらに他の例では、ペグ化されたＴＬＴ−１ポリペプチドは、マルチアームＰＥＧを含み、１つ以上の単量体ＴＬＴ−１ポリペプチドは、マルチアームＰＥＧに機能的に連結される。

本発明は、また、ＴＬＴ−１ポリペプチド結合体を含む。ＴＬＴ−１ポリペプチド結合体は、免疫抑制剤、組織標的分子、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドと結合した本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。

［本発明のポリペプチドの組成物］
他の側面では、本発明は、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、このような組成物が被検体に投与されてよい。いくつかの実施形態では、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドは、これらに限定されないが、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、防腐剤、および／または、組成物の使用目的に適した他のいかなる成分を含む、１つ以上の異なる成分を有する組成物に含まれてよい。このような組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョンなどの形態をとり得る。用語「薬学的に許容可能な担体」とは、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチド、タンパク質、および／または、タンパク質複合体を供給するためのさまざまな希釈剤、賦形剤、および／または、ビヒクルを含む。薬学的に許容可能な担体は、これに限定されないが、ヒトおよび／または他の動物の被検体への送達に安全なことが知られている、および／または、連邦または州政府の規制機関によって認可されている、および／または、米国薬局方に掲載されている、および／または、他の一般的に認識されている薬局方に掲載されている、および／または、人間および／または他の動物に使用するために１つ以上の一般的に認識されている規制機関から特定または個別の承認を受けている担体を含む。このような薬学的に許容可能な担体は、これらに限定されないが、水、水溶液（食塩水、緩衝液など）、有機溶剤（特定のアルコール、および、石油、動物油、植物性または合成油（落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油など）を含む油）などを含む。

一実施形態では、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドは、１つ以上の追加の免疫抑制薬などの１つ以上の追加の活性成分を含む組成物に含まれ得る。免疫抑制薬は、これらに限定されないが、グルココルチコイド、細胞増殖抑止剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、抗ＣＤ２０抗体、ムロモナブＣＤ３、バシリキシマブ、ダクリズマブ、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、および、ミリオシンを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、「有効量」の本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを含む。「有効量」とは、所望の成果を得るのに必要とされる量である。本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドの、所望の成果を得るために有効な量は、様々な要因に左右される。様々な要因は、これらに限定されないが、対象とする被検体の種（ヒトかまたは他の動物種かどうか）、対象とする被検体の年齢および／または性別、計画された投与経路、計画された投与方式、進行中の病気または状態の重篤度などを含む。ある範囲の有効量は、例えば、インビトロアッセイ、および／または、対象とする被検体種、または、適切な動物モデル種におけるインビボアッセイを用いて、過度の実験なしの標準的な技術によって決定され得る。適切なアッセイは、これらに限定されないが、用量反応曲線、および／または、インビトロおよび／またはインビボモデルシステムから導出された他のデータからの外挿を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、特定の状況に基づく医師または獣医の判断に従い決定され得る。

一実施形態では、ＴＬＴ-１ポリペプチドの有効量は、一回の投与につき約０．０００２ｍｇ／ｋｇ（体重）〜２０ｍｇ／ｋｇである。

［投与方法］
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のＴＬＴ−１ポリペプチドを被検体に投与する方法を提供する。このような方法は、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、および、移植片対宿主障害などの免疫過敏症に関連する病気を患う患者を治療するための方法を含み得る。

本発明のＴＬＴ−１ポリペプチド、または、このようなＴＬＴ−１ポリペプチドを含む組成物が（例えば治療方法の過程で）投与される被検体は、あらゆる動物種を含む。いくつかの実施形態では、被検体は、哺乳類種である。哺乳類の被検体は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯動物、ウサギ、および、フェレットを含む。

当技術分野ではさまざまなデリバリーシステムが周知であり、本発明の組成物を被検体に投与するためにいかなる適切なデリバリーシステムが用いられてよい。このようなデリバリーシステムは、これらに限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および、経口デリバリーシステムを含む。本発明の組成物は、例えば、点滴またはボーラス注射、上皮または皮膚粘膜裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜）を介した吸収によるいかなる都合のよい経路によって投与されてよく、他の生物活性材料と共に投与されてもよい。投与は、全身または局所投与であってよい。

いくつかの実施形態では、単回投与が望ましい。しかしながら、他の実施形態では、所望の効果をもたらすべく、同じまたは異なる経路で追加の投与が行われてよい。いくつかの実施形態では、投与方式は、単回投与を含み得る。他の実施形態では、投与方式は、複数回投与を含み得る。

以下、実施例で用いられる材料および方法を記載する。

ヒト細胞の単離および培養
有志で構成された健康な被験者の白血球濃縮物を台湾血液基金会（台北市、台湾）から入手した。本研究の各参加者にインフォームドコンセントを記入してもらい、馬偕紀念医院の施設内倫理委員会の承認を得た。ヒト単球を上記のとおり単離した。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥヘルスケア社）を用いた勾配遠心分離によって単離した。ＣＤ１４ ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社）を用いてＣＤ１４の選定を行うことにより、単球をさらに精製した。フローサイトメトリー分析により確認した単球の純度は、およそ９０％であった。

［組換え可溶性ＴＬＴ−１、および、ＴＬＴ−１ポリペプチドの生成］
組換え可溶性ＴＬＴ−１（ｒｓＴＬＴ−１）を生成すべく、ヒトＴＬＴ−１細胞外ドメイン（Ｇｌｕ１６〜Ｐｒｏ１６２）をコードするｐＥＴ２８ａ（＋）組換え可溶性ＴＬＴ−１を、Ｎ末端にポリヒスチジンタグを付加して大腸菌を用いて発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて精製した。ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて、組換えタンパク質の純度を決定し、クマシーブルー染色を用いて視覚化した（＞９５％）。精製したタンパク質に混入しているエンドドキシンを、ＬＡＬアッセイ（ＱＣＬ−１０００）を用いて検査した。すべてのタンパク質は無菌であり、エンドドキシンの濃度は、検出可能な限界値（１μｇのタンパク質当たり０．１ＥＵ）より低かった。ＴＬＴ−１ポリペプチドを科羅耐国際科技有限公司（台北市、台湾）にて化学的に合成した。

［フローサイトメトリー分析］
ＴＬＴ−１の結合を試験すべく、３７℃、５％ＣＯ_２を含む湿気のある雰囲気下で、ＡＩＭ−Ｖ培地（ライフテクノロジーズ社）にて末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を一晩インキュベートして細胞表面の血小板を取り除いた。ＴＬＴ−１と特異的に結合する白血球を識別すべく、単離したＰＢＭＣをさまざまな濃度のＴＬＴ−１、および、競合ペプチドと共に、３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、ビオチン結合ヤギ抗ＴＬＴ−１抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）で染色した。単球、多形核白血球（ＰＭＮ）、および、リンパ球を、それらのＦＳＣ／ＳＳＣ特性に基づいてゲーティングした。ＴＬＴ−１、または、ＴＬＴ−１ポリペプチドで刺激した単球の表面表現型を分析すべく、１％のＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であるＨＬＡ−ＤＲ−ＰＥ、ＰＤ−Ｌ１−ＦＩＴＣ、および、ＣＤ１４−ＰｅｒＣＰ（ＢＤバイオサイエンス社）と共に、細胞を、暗所にて氷上で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒを用いて蛍光を検出し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓバージョン３（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いてデータを分析した。

［統計分析］
Ｐｒｉｓｍ６．０（グラフパッド）を用いてデータを分析し、平均値±標準誤差として示した。スチューデントｔ検定を用いてグループ間の比較を行った。ピアソンの相関係数を用いて相関を決定した。Ｐ値＜０．０５を有意であるとみなした。

［実施例１ ＴＬＴ−１と白血球との間の相互作用］
ＴＬＴ−１が白血球に結合するか決定すべく、白血球を１０μｇ／ｍＬの組換え可溶性ＴＬＴ−１と共に１時間インキュベートし、ＴＬＴ−１の細胞表面への結合を、フローサイトメトリーを用いて検出した。図１（Ａ）に示すように、ＰＭＮおよび単球への組換え可溶性ＴＬＴ−１の結合を検出したが、リンパ球への結合は検出しなかった。さらに、組換え可溶性ＴＬＴ−１のＰＭＮおよび単球への結合は、用量に依存することを観察した（図１（Ｂ））。これらの結果は、ヒトＰＭＮおよび単球にはＴＬＴ−１の受容体が存在することを示唆している。

［実施例２ ＴＬＴ−１は、単球におけるＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１分子の表面発現を変える］
組換え可溶性ＴＬＴ−１の存在によって単球におけるＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１の発現が調節され得るかを調べるべく、ヒト単球を、まず、組換え可溶性ＴＬＴ−１（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、ＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１の発現を３日間連続して検査した。図２（Ａ）の左のグラフに示すように、開始から２４時間では組換え可溶性ＴＬＴ−１によってＨＬＡ−ＤＲの発現が著しくアップレギュレーションし、その後の時点では、発現が急速にダウンレギュレーションしている。ＰＤ−Ｌ１の発現も２４時間以内に著しく増加するが、以降３日間の実験の間もアップレギュレーションを保っている（図２（Ａ）の右側のグラフ）。次に、ＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１の発現に対する組換え可溶性ＴＬＴ−１の用量効果を調べた。図２（Ｂ）の左側のグラフは、組換え可溶性ＴＬＴ−１と共にインキュベートしてから４８時間を経た時点で単球におけるＨＬＡ−ＤＲの発現が減少し、このダウンレギュレーションは、組換えＴＬＴ−１の濃度の上昇と有意に相関していることを示している。それに対し、ＰＤ−Ｌ１の発現は、組換え可溶性ＴＬＴの濃度の上昇と共に著しいアップレギュレーションを示した（図２（Ｂ）の右のグラフ）。これらのデータは、組換え可溶性ＴＬＴ−１で刺激された単球が免疫抑制表現型を有していることを示している。

［実施例３ ＴＬＴ−１ １５〜６３ポリペプチドは、単球におけるＨＬＡ−ＤＲおよびＰＤ−Ｌ１分子の表面発現を変える］
ＴＬＴ−１は、βストランドＢとＦとの間の保存ジスルフィド結合によって係合された２つの逆平行βシートを形成する９つのβストランドを含む単一の細胞外免疫グロブリン可変（ＩｇＶ）ドメインを有する。さらに、ＴＬＴ−１は、そのＣ−Ｃ’のβヘアピンを安定させる他のジスルフィド架橋を有する。組換え可溶性ＴＬＴ−１の機能ドメインを調べるべく、そのＶ型免疫グロブリン構造に従い、異なる長さのポリペプチドを合成した。（図３（Ａ））。ポリペプチド配列を以下の表１に示す。ヒト単球を異なるポリペプチド（１０μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートし、ＰＤ−Ｌ１の発現を２４時間検査した。図３（Ｂ）に示すように、ＴＬＴ−１ １５〜６３ペプチドで処理された単球では、２４時間以内にＰＤ−Ｌ１の発現が著しく増加した。さらに、ＴＬＴ−１ ３４〜６３ペプチドで処理してもＰＤ−Ｌ１の発現を誘導した。ＴＬＴ−１ １５〜６３ペプチドでインキュベートした単球におけるＨＬＡ−ＤＲの発現は、４８時間を経た時点で減少した（図４）。このように、ＴＬＴ−１ １５〜６３は、ＰＤ−Ｌ１の発現のアップレギュレーション、および、ＨＬＡ−ＤＲの発現のダウンレギュレーションを通じて、免疫過敏に関連する病気を治療するための治療薬としての役割を果たし得る。

Claims (21)

1. 免疫応答を調節する方法であって、ＴＲＥＭ様転写物１（ＴＬＴ−１）ポリペプチドを免疫細胞に結合することによって、免疫応答を抑制する、方法。
2. 前記ＴＬＴ−１ポリペプチドを前記免疫細胞に結合することによって、免疫過敏症に関連する病気を治療および／または予防する、請求項１に記載の方法。
3. 前記免疫過敏症に関連する病気は、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、または、移植片対宿主障害である、請求項２に記載の方法。
4. 前記免疫細胞は、単球、または、好中球である、請求項１または２に記載の方法。
5. 前記ＴＬＴ−１ポリペプチドは、配列番号１の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ポリペプチドは、配列番号２の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記ポリペプチドは、配列番号３の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含む、請求項５に記載の方法。
8. 前記ポリペプチドは、配列番号１、２、または、３のアミノ酸配列を有する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 配列番号１の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチド。
10. 配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載のポリペプチド。
11. 配列番号２の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチド。
12. 配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
13. 配列番号３の少なくとも５つのアミノ酸を有するアミノ酸配列、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一のアミノ酸配列、または、その生物活性フラグメントもしくは変異体を含むポリペプチド。
14. 配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載されたポリペプチド。
15. 前記ポリペプチドは、ペグ化ポリペプチド、組織標的分子と結合したポリペプチド、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
16. 前記ポリペプチドは、組織標的分子と融合したポリペプチド、アルブミン、または、血清アルブミン結合ペプチドである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
17. 請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、および、薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
18. １つ以上の追加の免疫抑制薬をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記免疫抑制薬は、グルココルチコイド、細胞増殖抑止剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、メトトレキセート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン、抗ＣＤ２０抗体、ムロモナブＣＤ３、バシリキシマブ、ダクリズマブ、シクロスポリン、タクロリムス、シロリムス、インターフェロン、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質、ミコフェノール酸、フィンゴリモド、または、ミリオシンである、請求項１８に記載の組成物。
20. 免疫過敏症に関連する病気を治療、および／または、予防する方法であって、請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、または、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の組成物を被検体に投与することを含む、方法。
21. 前記病気は、自己免疫疾患、過敏性反応、移植拒絶、または、移植片対宿主障害である、請求項２０に記載の方法。