TW202019469A - 抑制b型肝炎病毒複製及b型肝炎表面抗原分泌之方法 - Google Patents

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Abstract

一種用於治療B型肝炎病毒(HBV)感染之醫藥組合物包括有效量之對抗CD11b之抗體或其結合片段。一種用於治療B型肝炎病毒感染之方法包括向有需要之個體投與對抗CD11b之抗體。與CD11b結合之抗CD11b抗體可觸發如藉由以下觀測結果所證明之免疫刺激性反應：CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)中MHC II及CD86之表面表現增加；血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA之含量受到抑制；及HBV自肝臟之清除加速。

Description

抑制B型肝炎病毒複製及B型肝炎表面抗原分泌之方法
本發明係關於肝臟免疫療法，尤其B型肝炎病毒感染在之免疫清除的領域。
B型肝炎病毒(HBV)為引起急性及慢性肝炎及肝細胞癌(HCC)之主要人類病原體。儘管有效的HBV疫苗為可獲得的，但估計全球超過2.4億人長期感染HBV。未經治療個體充當病毒攜帶者且具有罹患硬化及HCC之高風險。涉及聚乙二醇化干擾素及核苷(核苷酸)類似物(拉米夫定、阿丹弗(adefovir)、因提弗(entecavir)及田諾弗(tenofovir)等)之用於慢性B型肝炎的本發明治療方案可抑制HBV DNA複製。然而，僅約3%-7%經聚乙二醇化干擾素治療之患者及1%-12%經核苷(核苷酸)類似物治療之患者顯示出持續反應。此外，經核苷(核苷酸)類似物治療可誘導耐藥性HBV變體。因此，需要探索用於治療慢性HBV感染之其他治療性策略。
肝臟為身體內最大的內部器官、對解毒、代謝活性及養分儲存負責。此外，肝臟為具有獨特性能之免疫器官，該等獨特性能包括主要的先天性免疫、較低的適應性免疫及誘導免疫耐受性。因此，肝臟通常不能施加有效的免疫反應以清除許多重要病原體，諸如B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)或瘧疾。此等病原體可避開免疫監視且在肝微環境中保持持續性感染。逆轉肝臟之免疫耐受性對於完全清除持續性感染為決定性的。
CD11b為表現於肝免疫細胞之表面上的I型跨膜醣蛋白，該等肝免疫細胞包括庫弗細胞(Kupffer cell)(肝臟常駐巨噬細胞)、樹突狀細胞(DC)、骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)、自然殺手細胞(NK)及B細胞及T細胞之子集。CD11b亦稱為整合素α M (ITGAM)，其與其β-鏈搭配物CD18非共價結合以形成官能性整合素雜二聚體CD11b/CD18。CD11b/CD18亦稱為巨噬細胞-1抗原(Mac-1)或補體受體3 (CR3)，其藉由調節細胞黏著、遷移、趨化性及噬菌作用而介導發炎。
近期研究已顯示，經活化CD11b經由泛素介導之MyD88及TRIF降解負調節TLR信號傳導(C. Han等人, Nat. Immunol., 2010, 11(8): 734-42)。經活化CD11b亦負調節DC功能以抑制T細胞活化且負調節B細胞受體(BCR)信號傳導以維持B細胞耐受性。
本發明係關於基於結合肝骨髓及淋巴免疫細胞群體上之CD11b調節免疫反應之方法。特定言之，用抗CD11b抗體與CD11b結合觸發具有以下作用中之一或多者的免疫刺激環境：增加CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)上MHC II及CD86之表面表現；抑制血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA之含量；及加速HBV自肝臟清除。
本發明之一態樣係關於一種用於治療B型肝炎病毒感染之醫藥組合物。根據本發明之一個實施例的醫藥組合物包含有效量之抗CD11b之抗體或其結合片段。有效量為將產生所需作用之量。熟習此項技術者將理解，有效量將取決於患者之病況、年齡、性別等且有效量可無需過度實驗使用常規技能即可確定。來自抗體之結合片段可包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
根據本發明之實施例，抗CD11b之抗體可為多株或單株抗體。抗CD11b之抗體可包含由NYWIN(SEQ ID NO:1)或GFSLTSNSIS (SEQ ID NO:2)之胺基酸殘基組成的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD (SEQ ID NO:3)或AIWSGGGTDYNSDLKS (SEQ ID NO:4)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR2 (HCDR2)；及由SAYANYFDY (SEQ ID NO:5)或RGGYPYYFDY (SEQ ID NO:6)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR3 (HCDR3)；及由RASQNIGTSIH (SEQ ID NO:7)或KSSQSLLYSENQENYLA (SEQ ID NO:8)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR1 (LCDR1)；由YASESIS (SEQ ID NO:9)或WASTRQS (SEQ ID NO:10)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及由QQSDSWPTLT (SEQ ID NO:11)或QQYYDTPLT (SEQ ID NO:12)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR3 (LCDR3)。
根據本發明之一些實施例，抗CD11b之抗體包含：(a)包含SEQ ID NO:13之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:23之序列的輕鏈可變區；(b)包含SEQ ID NO:14之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:24之序列的輕鏈可變區；(c)包含SEQ ID NO:15之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:25之序列的輕鏈可變區；(d)包含SEQ ID NO:16之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:26之序列的輕鏈可變區；(e)包含SEQ ID NO:17之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:27之序列的輕鏈可變區；(f)包含SEQ ID NO:18之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:28之序列的輕鏈可變區；(g)包含SEQ ID NO:19之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO: 29之序列的輕鏈可變區；(h)包含SEQ ID NO:20之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:30之序列的輕鏈可變區；(i)包含SEQ ID NO:21之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:31之序列的輕鏈可變區；或(j)包含SEQ ID NO:22之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:32之序列的輕鏈可變區。
本發明之一態樣係關於治療HBV感染之方法。根據本發明之一個實施例的方法包含向有需要之個體投與有效量之抗CD11b之抗體。與CD11b結合之抗CD11b抗體觸發如藉由以下觀測結果所證明之免疫刺激性反應：CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)中MHC II及CD86之表面表現增加；血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA之含量受到抑制；及HBV自肝臟之清除加速。
本發明之實施例係關於治療HBV感染或緩解HBV感染之病況的方法。本發明之方法係基於藉由抗體或其結合片段與肝骨髓及淋巴免疫細胞群體上之CD11b結合來調節免疫反應。本發明之發明人出人意料地發現，用抗CD11b抗體與CD11b結合觸發具有以下作用中之一或多者的免疫刺激環境：增加CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)上MHC II及CD86之表面表現；抑制血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA之含量；及加速HBV自肝臟之清除。
B型肝炎病毒(HBV)為具有共價閉合環狀雙股DNA(cccDNA)基因組之包膜病毒。HBV感染引起急性及慢性發炎性肝臟疾病。長期HBV感染會引起肝硬化及肝細胞癌。HBV之長期慢性感染由受損HBV特異性免疫反應產生，藉此免疫系統無法消除或治癒經感染肝細胞。
CD11b為表現於肝免疫細胞之表面上的I型跨膜醣蛋白，該等肝免疫細胞包括庫弗細胞(肝臟常駐巨噬細胞)、樹突狀細胞(DC)、骨髓衍生之抑制細胞(MDSC)、自然殺手細胞(NK)及B細胞及T細胞之子集。CD11b亦稱為整合素α M (ITGAM)，其與其β-鏈搭配物CD18非共價結合以形成官能性整合素雜二聚體CD11b/CD18。CD11b/CD18亦稱為巨噬細胞-1抗原(Mac-1)或補體受體3 (CR3)，其藉由調節細胞黏著、遷移、趨化性及噬菌作用而介導發炎。
在全身性紅斑性狼瘡症中，整合素-αM之變體(CD11b變體)與自體反應性B細胞相關聯，該等自體反應性B細胞對B細胞受體(BCR)交聯展現過度增生性反應。Ding等人使用經野生型或狼瘡相關聯變體的CD11b轉染之B細胞，發現變體CD11b中之突變藉由破壞CD22-CD11b直接結合來消除CD11b對BCR信號傳導之調節性作用。(C. Ding等人, Nat. Commun. 2013; 4:2813)。其等推斷CD11b負面調節BCR信號傳導以維持自體反應性B細胞耐受性。
然而，CD11b可在不同系統或疾病中扮演不同角色。舉例而言，CD11b缺陷會增強巨噬細胞中TLR介導之反應，使得小鼠更易罹患內毒素休克及大腸桿菌引起之敗血症，從而顯示CD11b係經由泛素介導之MyD88及TRIF降解而負面調節TLR信號傳導(C. Han等人, Nat. Immunol., 2010, 11(8): 734-42)。尚未知整合素-αM (CD11b)是否在諸如HBV感染之肝臟疾病中起任何作用。
因此，本發明之發明人打算研究CD11b是否在HBV感染中會有任何影響。吾人出乎意料地發現，CD11b實際上會影響對慢性HBV感染之肝免疫反應。簡言之，藉由抗CD11b抗體與CD11b結合來抑制CD11b功能，會產生免疫刺激性反應，如藉由以下所證明：CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)中MHC II及CD86之表面表現增加；血液中B型肝炎表面抗原(HBsAg)及HBV DNA之含量受到抑制；及HBV自肝臟之清除加速。
基於此等出人意料的發現，本發明之實施例係關於控制或治療HBV感染或緩解HBV感染之病況的方法。本發明之方法係基於與CD11b(尤指肝骨髓細胞及淋巴免疫細胞上之CD11b)結合之抗體。本發明之實施例將藉由以下特定實例來說明。熟習此項技術者應瞭解，此等實例僅用於說明且並不意謂限制本發明之範疇，因為其他修改及變化在不脫離本發明之範疇的情況下係可能的。抗 CD11b 抗體
本發明之實施例可使用各種抗CD11b抗體，其可為多株或單株且包括可商購的抗體。數個抗CD11b抗體可商購自各種供應商。舉例而言，CD11b單株抗體(M1/70)、CD11b單株抗體(M1/70.15)及CD11b單株抗體(ICRF44)尤其可購自Thermo Fisher Scientifics (Waltham, MA, USA)。本發明之實施例可使用此等可商購抗CD11b抗體或其CD11b結合片段中之任一者。
此外，吾人已生成數個特異性地結合於CD11b之單株抗體及人類化抗體。發現此等抗體具有類似生物活性。單株抗體之生產及抗體之人類化使用此項技術中已知的技術(參見US 2018/0362651A1，該文獻之揭示內容以引用之方式併入)。就人類化而言，針對人類抗體資料庫搜索鼠類抗人類CD11b抗體之可變域序列。作為實例，選擇與鼠類抗人類CD11b具有高同源性之10組人類構架序列作為輕鏈與重鏈兩者之人類受體。同時，分析N-糖基化基元。應因此避免候選人類可變區中之潛在糖基化位點。10條輕鏈之人類化可變域表示為VL1、VL2、VL3、VL4、VL5、LC1、LC2、LC3、LC4及LC5 (圖8)；同時，10條重鏈之人類化可變域表示為VH1、VH2、VH3、VH4、VH5、HC1、HC2、HC3、HC4及HC5 (圖9)。此等輕鏈及重鏈肽序列提供以高親和力結合至人類抗CD11b之人類化抗體或抗原結合部分。
人類化抗CD11b抗體之特異性係用流式細胞計使用已經過CD11b表現載體轉染之K562細胞來測定。如圖10中所示，測試出之所有人類化抗CD11b抗體均能夠結合表現CD11b之K562細胞。相比而言，此等抗體並不結合未經轉染之K562細胞。此等結果顯示人類化抗CD11b抗體可特異性結合CD11b抗原決定基。應注意，重鏈及輕鏈之所有組合或排列均緊密結合至CD11b。類似地，此等人類化抗體亦特異性地結合於HepG2細胞上之CD11b。
本發明之實施例可使用以上抗CD11b抗體或其抗原結合部分中之任一者，其包含以下中之至少一者：由NYWIN (SEQ ID NO:1)或GFSLTSNSIS (SEQ ID NO:2)之胺基酸殘基組成的互補決定區1 (HCDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD (SEQ ID NO:3)或AIWSGGGTDYNSDLKS (SEQ ID NO:4)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR2 (HCDR2)；及由SAYANYFDY (SEQ ID NO:5)或RGGYPYYFDY (SEQ ID NO:6)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR3 (HCDR3)；及以下中之至少一者：由RASQNIGTSIH (SEQ ID NO:7)或KSSQSLLYSENQENYLA (SEQ ID NO:8)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR1 (LCDR1)；由YASESIS (SEQ ID NO:9)或WASTRQS (SEQ ID NO:10)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及由QQSDSWPTLT (SEQ ID NO:11)或QQYYDTPLT (SEQ ID NO:12)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR3 (LCDR3)。
在本發明之一些實施例中，抗CD11b抗體或其抗原結合部分包含(i)包含重鏈可變區之重鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO:1之H-CDR1、包含SEQ ID NO:3之H-CDR2及包含SEQ ID NO:5之H-CDR3，及(ii)輕鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO:7之L-CDR1、包含SEQ ID NO:9之L-CDR2及包含SEQ ID NO:11之L-CDR3；或(iii)包含重鏈可變區之重鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO:2之H-CDR1、包含SEQ ID NO:4之H-CDR2及包含SEQ ID NO:6之H-CDR3，及(iv)輕鏈可變區，其包含有包含SEQ ID NO:8之L-CDR1、包含SEQ ID NO:10之L-CDR2及包含SEQ ID NO:12之L-CDR3。
在本發明之一些實施例中，人類化抗CD11b抗體或其抗原結合部分包含： (a)包含由SEQ ID NO:13組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:23組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (b)包含由SEQ ID NO:14組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:24組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (c)包含由SEQ ID NO:15組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:25組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (d)包含由SEQ ID NO:16組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:26組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (e)包含由SEQ ID NO:17組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:27組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (f)包含由SEQ ID NO:18組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:28組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (g)包含由SEQ ID NO:19組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:29組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (h)包含由SEQ ID NO:20組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:30組成之胺基酸序列的輕鏈可變區； (i)包含由SEQ ID NO:21組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:31組成之胺基酸序列的輕鏈可變區；或 (j)包含由SEQ ID NO:22組成之胺基酸序列的重鏈可變區，及包含由SEQ ID NO:32組成之胺基酸序列的輕鏈可變區。經抗 CD11b 抗體治療增強了 CD11b + 免疫細胞之抗原呈現能力。
為了評估抗CD11b抗體抗慢性HBV感染之治療效果，吾人利用藉由將pAAV/HBV1.2質體高壓流體注射(HDI)至CBA/caJ小鼠中產生之HBV攜帶者小鼠模型。簡言之，將10微克pAAV/HBV1.2 DNA以高壓方式注入至雄性CBA/caJ小鼠之尾部靜脈中。在注射之後，定期對小鼠抽血以監測HBsAg及HBV DNA之血清含量。(Huang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2006年11月21日;103(47):17862-17867)。
HBV攜帶者小鼠表現B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、B型肝炎核心抗原(HBcAg)及HBV DNA之高血清含量，但在肝臟中具有血清丙胺酸轉胺酶(ALT)之正常含量且不具有顯著發炎。此小鼠模型關於HBV續存的特徵類似於免疫耐受性階段中人類慢性HBV感染之彼等。(Chou等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2015年2月17日;112(7):2175-80)。
如圖1中所示，將HBV攜帶者小鼠(在高壓流體注射後4週)劃分為兩組且用5 mg/kg對照物IgG (ctrl IgG)或抗CD11b抗體治療。每3-4天重複注射持續4次。收集血液樣品以用於在第2、4、6及8週分析。
在初次抗體治療之後兩週評估HBV攜帶者小鼠中CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)之活化狀態。相比於經Ctrl IgG治療之小鼠，抗CD11b抗體之投與導致CD11b+ PBMC中MHC II及CD86表現程度之增加(圖2)。此等結果指示用抗CD11b抗體治療可增強CD11b+免疫細胞之抗原呈現能力，其將有利於先天性及授受性免疫活化(adoptive immune activation)以消除HBV攜帶者小鼠中之病毒。因此，抗CD11b抗體可能為治療HBV感染之適用治療劑。抗 CD11b 抗體治療導致 HBV 感染清除加速
檢查HBV攜帶者小鼠中抗CD11b抗體抗慢性HBV感染之治療效果。相比於ctrl IgG治療組，經抗CD11b抗體治療在抗體注射之後兩週顯著抑制血清HBsAg含量(圖3)。抗CD11b抗體治療亦在初次抗體注射之後兩週顯著降低HBV複製程度(藉由較低DNA含量證明) (圖4)。在接受抗CD11b抗體數週之小鼠中觀測到持續病毒抑制。此外，血清HBsAg及HBV DNA反彈並未在經抗CD11b抗體治療之大部分小鼠中出現(圖3及圖4)。無感染反彈指示病毒藉由經增強之免疫反應消除，而非暫時抑制。此等結果顯示抗CD11b抗體治療可誘導HBV清除加速且不出現感染恢復。藉由抗 CD11b 抗體治療增強之抗原呈現能力與 HBV 感染之清除相關聯
如上文所提及，用抗CD11b抗體治療可增強CD11b+免疫細胞之抗原呈現能力，從而導致經增強免疫反應。為了研究在HBV感染之清除與CD11b+免疫細胞之抗原呈現能力之間是否存在關係，評定CD11b+ PBMC中血清HBV DNA、MHC II與CD86表現之間的相關性。
如圖5中所示，CD11b+ PBMC中MHCII及CD86之表面表現增加與血清HBV DNA含量負相關。此等結果指示藉由抗CD11b抗體治療增強之抗原呈現能力與HBV感染清除增強相關聯。抗 CD11b 抗體抑制經 HBV 轉染之人類肝癌 HepG2 細胞株的 HBsAg 生產且誘導 DNA 脫胺酶 ， 包括可降解 HBV 共價閉合環狀 DNA ( cccDNA ) 之脂蛋白元 B mRNA 編輯酶催化性多肽樣 ( APOBEC ) 蛋白質
除了以上HBV小鼠模型以外，亦使用感染人類HBV之HepG2細胞研究抗CD11b抗體在治療HBV感染中之功效。細胞表面上之CD11b表現係藉由流式細胞計分析。如圖6A中所示，HepG2細胞上之CD11b表現比人類單核球上之CD11b表現低得多。人類HepG2細胞經HBV質體轉染，且培養物混成物中HBsAg之效價係用HBsAg定量ELISA套組分析。在抗CD11b抗體處理3天之後，經HBV轉染之HepG2細胞之HBsAg的效價快速且顯著降低(圖6B)。
APOBEC3B為胞嘧啶核苷脫胺酶，已發現其為HBV之細胞限制因子，因為APOBEC3B可編輯細胞核中之HBV cccDNA，從而導致其降解。(Chen等人, Antiviral Res., 2018年1月;149:16-25)。在經抗CD11b抗體處理之經HBV轉染之HepG2細胞中，APOBEC3B表現之RNA增加(圖6C)。此等結果顯示，在抗CD11b抗體處理後，至少由非細胞溶解機制部分負責HBsAg清除。此外，使用抗CD11b抗體處理可能涉及功能抑制及/或降解HBV cccDNA，其可由抗CD11b抗體透過表觀遺傳修飾、誘導DNA脫胺酶APOBEC蛋白質、微RNA、抑制鬆環DNA (rcDNA)轉化為cccDNA、阻斷rcDNA運輸至細胞核中及/或抑制cccDNA轉錄，來達成目標。使用抗 CD11b 抗體處理誘導肝臟中之 HBV DNA 減少
以上結果顯示，抗CD11b抗體可顯著降低HBsAg及DNA含量。此是否歸因於暫時性抑制HBV (例如，使病毒休眠)抑或長期作用(例如，減少或消除來自肝臟之HBV)則係藉由經過治療很久之後的肝臟中之HBV DNA含量來進一步研究。舉例而言，在抗CD11b抗體治療後36週，定量肝臟中之常駐HBV DNA。簡言之，在液氮中研磨肝臟且提取總肝臟基因組DNA (gDNA)。HBV DNA係採用即時PCR，使用HBx特異性引子(正向引子：5'-CCGATCCATACTGCGGAAC-3'，SEQ ID NO: 33；反向引子：5'-GCAGAGGTGAAGCGAAGTGCA-3'，SEQ ID NO: 34)來偵測。
圖7顯示來自此研究之結果。HBV DNA係以1 μg小鼠gDNA中複本之數目表示。Ctrl IgG及抗CD11b抗體處理組中之HBV DNA平均值分別為1.01×106 及2.26×105 。因此，抗CD11b抗體處理組中的HBV複本數目比對照物IgG處理組中的HBV複本數目顯著降低(約22%)。Ctrl IgG及抗CD11b抗體處理組中之肝臟HBV清除率分別為12.5% (八分之一之小鼠HBV DNA為不可偵測的)及37.5% (八分之三之小鼠HBV DNA為不可偵測的)。此等結果指示肝臟HBV DNA在經抗CD11b抗體治療之小鼠中顯著減少。更重要的係，此等結果係在治療後較長一段時間，從而表明治療作用為耐久的且歸因於病毒自肝臟之清除，而非歸因於對病毒之暫時性抑制。因此，使用抗CD11b抗體之本發明之方法對治療HBV感染極有前景。方法及材料 基於高壓流體注射之 HBV 攜帶者小鼠及治療協定
將總共10 μg溶解於8%體重PBS中之pAAV/HBV1.2注入至6至8週齡的CBA/caJ小鼠之尾部靜脈中。總積係在5-7秒內遞送。(Chou等人,  Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2015; 112(7): 2175-80)。pAAV/HBV1.2含有跨核苷酸1400-3182/1-1987之HBV片段，該等核苷酸藉由AAV之反向末端重複序列側接。(Huang等人, Proc Natl Acad Sci U.S.A., 2006, 103(47): 17862-17867)。四週後，小鼠經5 mg/kg抗CD11b Ab或同型對照物Ab腹膜內(i.p.)治療。每3-4天重複注射持續4次。在National Taiwan University College of Medicine Laboratory of Animal Center中，所有小鼠均維持在特定的無病原體條件下。實驗係根據由National Taiwan University College of Medicine指定之實驗動物使用準則實施。血清 HBsAg 及 HBV DNA 分析
血清B型肝炎表面抗原(HBsAg)係使用AXSYM®系統套組(Abbott Diagnostika, Abbot Park, IL, USA)定量。檢定係根據製造商之協定執行。為了偵測血清HBV DNA，自各血清樣品提取總DNA且HBV DNA係藉由即時PCR與HBx特異性引子偵測。肝臟 HBV DNA 分析
為了偵測肝臟HBV DNA，在液氮中研磨肝臟且總肝臟基因組DNA (gDNA)係使用可商購套組來提取。HBV DNA係用即時PCR使用HBx特異性引子偵測(上文所描述)。流式細胞計分析
檢查CD11b+ PBMC之抗原呈現能力以用於MHC II及CD86標記之表現。將PBMC與螢光結合之抗CD11b (M1/70, ICRF44)、CD86 (GL-1)、MHC II (M5/114.15.2)或適當同型對照抗體一起培育20 min。在Beckman Coulter (Indianapolis, IN, USA) CytoFLEX流式細胞儀上操作樣品，且使用來自Beckman Coulter之Kaluza分析軟體版本2.0執行資料獲取及分析。HepG2 細胞感染檢定
HepG2細胞係用10% DMEM培養基維持及使用Lipofectamine3000持續8小時培育來轉染有pAAV/HBV1.2質體(由Dr. PEI-JER CHEN, National Taiwan University, Taipei, Taiwan提供)。在轉染之後，細胞經PBS沖洗三次且用具有/不具有抗人類CD11b抗體(10 μg/ml)之10% DMEM培養基不斷培養。每天收集細胞培養混成物且HBsAg之效價係藉由HBsAg定量ELISA套組Rapid-II (Beacle Inc., Kyoto, Japan)量測。HepG2細胞之RNA係藉由RNeasy Mini Kit提取且經DNase治療以移除基因組DNA污染。APOBEC3之基因表現係藉由如先前所描述之即時PCR評估(J. Lucifora等人, Specific and nonhepatotoxic degradation of nuclear hepatitis B virus, Science. 2014年3月14日; 343(6176):1221-8)。統計分析
資料係使用Prism 6.0 (GraphPad)分析且以平均值± SEM表示。各組之間的比較係使用史都登氏t試驗法執行。相關性係使用皮爾森相關係數測定。小於0.05之p值視為顯著的。
圖1顯示描繪根據本發明之一個實施例之治療協定的示意圖。
圖2顯示抗體治療後的基於高壓流體注射之HBV攜帶者小鼠中CD11b+外周血液單核細胞(PBMC)上MHC II及CD86之表面表現。
圖3顯示抗體治療後的基於高壓流體注射之HBV攜帶者小鼠中血清HBsAg的動態變化。資料顯示為平均值± SEM (*p ＜ 0 . 05 ，史都登氏t 試驗法)。
圖4顯示抗體治療後的基於高壓流體注射之HBV攜帶者小鼠中血清HBV DNA的動態變化。資料顯示為平均值± SEM (*p ＜ 0 . 05 , **p ＜ 0 . 01 ，史都登氏t試驗法)。
圖5顯示抗體治療後的基於高壓流體注射之HBV攜帶者小鼠中CD11b+ PBMC上血清HBV DNA、MHC II及CD86表現之程度之間的關係。相關性係使用皮爾森相關係數(Pearson's correlation coefficient)測定。
圖6A顯示HepG2細胞上之CD11b表現。圖6B顯示HBsAg之效價，且圖6C顯示抗CD11b抗體治療後的經HBV轉染之HepG2細胞之脂蛋白元B mRNA編輯酶催化性多肽類(APOBEC-B) RNA表現之效價。資料顯示為平均值± SEM。
圖7顯示肝臟中HBV DNA定量之結果。提取總肝臟DNA且藉由即時PCR用HBx特異性引子測得1 μg之gDNA。各點表示來自1隻小鼠肝臟之HBV DNA。所偵測極限為1000個複本/微克。
圖8顯示10種人類化抗CD11b抗體之輕鏈可變區序列。
圖9顯示10種人類化抗CD11b抗體之重鏈可變區序列。
圖10顯示如用流式細胞計分析之10種人類化抗CD11b抗體與表現於K562細胞上之CD11b的結合。
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Claims (5)

  1. 一種用於治療B型肝炎病毒(HBV)感染之醫藥組合物，其包含有效量之對抗CD11b之抗體或其結合片段。
  2. 如請求項1之醫藥組合物，其中該對抗CD11b之抗體為單株抗體。
  3. 如請求項1之醫藥組合物，其中該對抗CD11b之抗體包含由NYWIN(SEQ ID NO:1)或GFSLTSNSIS(SEQ ID NO:2)之胺基酸殘基組成的重鏈互補決定區1 (HCDR1)；由NIYPSDTYINHNQKFKD (SEQ ID NO:3)或AIWSGGGTDYNSDLKS(SEQ ID NO: 4)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR2 (HCDR2)；及由SAYANYFDY (SEQ ID NO:5)或RGGYPYYFDY (SEQ ID NO:6)之胺基酸殘基組成的重鏈CDR3 (HCDR3)；及由RASQNIGTSIH (SEQ ID NO:7)或KSSQSLLYSENQENYLA (SEQ ID NO:8)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR1 (LCDR1)；由YASESIS(SEQ ID NO:9)或WASTRQS(SEQ ID NO:10)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR2 (LCDR2)；及由QQSDSWPTLT(SEQ ID NO:11)或QQYYDTPLT(SEQ ID NO:12)之胺基酸殘基組成的輕鏈CDR3(LCDR3)。
  4. 如請求項1至3中任一項之醫藥組合物，其中該抗CD11b之抗體包含： (a)包含SEQ ID NO:13之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:23之序列的輕鏈可變區； (b)包含SEQ ID NO:14之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:24之序列的輕鏈可變區； (c)包含SEQ ID NO:15之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:25之序列的輕鏈可變區； (d)包含SEQ ID NO:16之序列的重鏈可變區，包含及SEQ ID NO:26之序列的輕鏈可變區； (e)包含SEQ ID NO:17之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:27之序列的輕鏈可變區； (f)包含SEQ ID NO:18之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:28之序列的輕鏈可變區； (g)包含SEQ ID NO:19之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:29之序列的輕鏈可變區； (h)包含SEQ ID NO:20之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:30之序列的輕鏈可變區； (i)包含SEQ ID NO:21之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:31之序列的輕鏈可變區；或 (j)包含SEQ ID NO:22之序列的重鏈可變區，及包含SEQ ID NO:32之序列的輕鏈可變區。
  5. 一種用於治療B型肝炎病毒感染之方法，其包括：向有此需要之個體投與有效量之抗CD11b之抗體或其結合片段。
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