KR20060126631A - 인터페론-타우의 의약으로서의 용도 - Google Patents

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요시히로 소카와
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펩젠 코포레이션
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Abstract

본 발명은 사람 피험자에게서 인터페론 요법에 반응하는 상태를 치료하기 위한 의약의 제조에서 사용되는 조성물을 기술한다. 조성물은 인터페론 타우의 부재시 환자에게서 (2',5')-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 레벨에 대하여 피험자의 혈중 OAS 레벨 증가를 생성하기에 효과적인 양으로 장관으로의 경구 투여에 적당한 제형으로 인터페론 타우를 포함한다.
인터페론, 인터페론 타우, 올리고아데닐레이트, 신테타제, 장관, 경구 투여

Description

인터페론-타우의 의약으로서의 용도{USE OF INTERFERON-TAU IN MEDICINE}
본 발명은 인터페론-타우를 함유하는 약학 조성물 및 그것의 사용 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제의 혈중 수치를 변경시키기에 충분한 양으로 인터페론-타우를 경구 투여함으로써 인터페론-타우에 반응하는 상태를 치료하는 방법에 관한 것이다.
인터페론-타우(이하, "IFNτ" 또는 "인터페론-τ")는 원래 반추 동물 수태물의 배엽에 의해 생성되는 임신 인지 호르몬으로서 발견되었다(Imakawa, K. et at, Nature, 330: 377-379, (1987); Bazer, F.W. and Johnson, H.M., Am. J. Repro. Immunol, 26: 19-22, (1991)). IFNτ 유전자의 분포는 소, 양 및 염소를 비롯한 반추 동물로 제한되지만(Alexenko, A.P. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 19: 1335-1341, (1999)), 사람 및 마우스를 비롯한 다른 종에 속하는 세포에서 활성을 갖는 것으로 나타났다(Pontzer, C.H. et al., Cancer Res., 51: 5304-5307, (1991); Alexenko, A.P. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 20: 817-822, (2000)). 예를 들면, IFNτ는 항바이러스 활성(Pontzer, C.H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 152: 801-807, (1988)), 항증식 활성(Pontzer, C.H., et al., 1991) 및 면역조절 활성(Assal-Meliani, A., Am. J. Repro. Immunol., 33: 267-275 (1995))을 갖는다고 설명되었다.
IFNτ가 I형 IFN, 예컨대 인터페론-α 및 인터페론-β와 전통적으로 연관있는 많은 활성을 나타내지만, 상당한 차이가 IFNτ와 다른 I형 IFN 간에 존재한다. 가장 현저한 차이는 반추 동물 종의 임신에서의 IFNτ의 역할이다. 다른 IFN은 임신 인지에서 유사한 활성을 나타내지 않는다. 또한, 바이러스 유도가 상이하다. IFNτ를 제외한 모든 I형 IFN은 바이러스 및 dsRNA에 의해 용이하게 유도된다(Roberts, et al., Endocrine Reviews, 13: 432 (1992)). 유도된 IFN-α 및 IFN-β 발현은 일시적이고, 대략 수 시간 지속된다. 이와는 대조적으로, IFNτ 합성은, 일단 유도되면 수 일에 걸쳐서 유지된다(Godkin, et at., J. Reprod. Fert., 65: 141 (1982)). 셀 당 기준으로, 다른 I형 IFN보다 300 배 이상의 IFN-τ가 생성된다(Cross, J.C. and Roberts, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3817-3821 (1991)).
다른 차이는 IFN-τ와 다른 I형 인터페론의 아미노산 서열에 있다. 인터페론 α2b, β1, ω1, γ 및 τ 간의 아미노산 유사 백분율은 하기 표에 요약한다.
Figure 112006038348028-PCT00001
서열 비교는 하기 참고 문헌으로부터 결정하였다:
Taniguchi et al., Gene, 10(1): 11 (1980).
Adolf et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089 (2): 167 (1991).
Streuli et al., Science, 209: 1343(1980).
Imakawa et al., Nature, 330: 377 (1987).
재조합 양 IFNτ(rIFNτ)는 IFNα2b에 48.8% 상동성이고, IFNβ1에 33.8% 상동성이다. IFNτ와 IFNα 그리고 IFNτ와 IFNβ 간의 이러한 제한된 상동성때문에, IFNτ가 경구 투여되었을 때 IFNα 또는 IFNβ와 동일한 방식으로 거동하는 지 여부를 예측할 수 없다. 또한, IFNτ는 사람 세포에 대한 I형 수용체에 대한 저 수용체 결합 친화성을 갖는 것으로 보고되었다(Brod, S., J. Interferon and Cytokine Res., 18: 841 (1999); Alexenko, A. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 17: 769 (1997)). 또한, IFNτ가 비내생 사람 단백질이라는 사실은 IFNτ가 인체로 도입될 때 전신 중화 항체 형성에 대한 가능성을 발생한다(Brod, S., J. Interferon and Cytokine Res., 18: 841 (1999)). IFNτ와 다른 인터페론 간의 이러한 차이는 IFNτ가 사람에게 투여될 때 치료 이점을 제공할 지 여부를 예측하기 어렵게 한다. IFNα, IFNβ 또는 임의의 다른 비-타우 인터페론의 경구 투여와 고련된 분야의 교시는 IFNτ에 대한 예상을 도출해내는 기준을 제공하는 데 실패하였다.
IFNτ, 뿐만 아니라 일반적인 단백질 및 폴리펩티드의 사용에서의 한 가지 제한 요인은 비경구로 제공될 때 혈장 단백질 및 혈액 세포와의 단백질 상호작용에 의해 영향을 받는 바와 같은, 생분배와 관련있다. 투여의 경구 경로는 위장에서의 단백질 분해로 인하여 더 문제가 되는데, 의도된 표적에 도달하기도 전에 산성 조건이 분자를 파괴할 수 있다. 예를 들면, 위장 및 췌장 효소의 작용에 의해 생성되는, 폴리펩티드 및 단백질 단편은 장 브러쉬 보더 멤브레인 내 엑소펩티다제 및 엔도펩티다제에 의해 개열되어 디펩티드 및 트리펩티드를 수득한다. 췌장 효소에 의한 단백질 분해를 피한다면, 폴리펩티드는 브러쉬 보더 펩티다제에 의한 분해를 받게된다. 위 통과에서 생존할 수도 있는 폴리펩티드 또는 단백질은 장 점막에서 대사되는데, 여기서 관통 배리어는 세포로의 진입을 방지한다. 이러한 이유로, 많은 노력이 일정 기간 동안 구강에서 유지되는 로젠지 또는 용액의 형태로 단백질을 구강 인두 영역으로 전달하는 것에 집중되었다.
발명의 개요
따라서, 본 발명의 목적은 인터페론 요법에 반응하는 사람 피험자의 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 IFNτ의 경구 투여에 의하여 그러한 상태를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
한 양태에서, 본 발명은 IFNτ 투여의 부재시 피험자에게서 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OSA) 레벨에 대하여 환자의 혈중 OSA 레벨의 측정 가능한 증가를 생성하기에 효과적인 양으로 IFNτ를 피험자의 장관에 경구 투여함으로써 사람 환자에게서 인터페론 요법에 반응하는 상태를 치료하는 방법을 포함한다. IFNτ을 그러한 유효량으로 피험자의 장관에 경구 투여하는 것은 적어도 1 개월 동안 주 당 수 회 이상의 정규 기준으로 계속된다.
다른 양태에서, 본 발명은 인터페론 타우 요법에 반응하는 사람 피험자의 상태 치료용 약물의 제조에 사용하기 위한 조성물을 포함하고, 상기 상태는 자가면역 상태, 암 또는 바이러스 감염 중에서 선택된다. 조성물은 인터페론-타우 투여의 부재시 피험자에게서 혈중 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OSA) 레벨에 대하여 환자의 혈중 OSA 레벨의 측정 가능한 증가를 생성하기에 효과적인 양으로 피험자의 장관에 경구 투여하도록 조제된 인터페론-타우를 포함하며, 인터페론-타우는 그러한 유효량으로, 피험자의 혈중 OAS 레벨 변화와는 독립적으로, 적어도 1 개월 동안 주 당 수 회 이상의 정규 기준으로 피험자의 장관에 투여된다.
한 구체예에서, IFNτ는 양 IFNτ이다. 특정 구체예에서, 양 IFNτ는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로 본 명세서에 식별된 서열을 가진다. 보다 일반적으로, IFNτ는 양 IFNτ와 약 80% 이상 상동성인 아미노산 서열을 가진다. IFNτ는 재조합 생성된 IFNτ일 수 있다.
계속 투여는 1일 기준 또는 주당 수 회, 예컨대 48 시간마다 수행될 수 있다.
또 다른 구체에에서, IFNτ는 다발성 경화증과 같은 자가면역 장해를 가진 피험자에게 투여된다. 이 방법에서, IFNτ는 통상적으로 피험자의 일생에 걸쳐서 환자 징후 기간 동안 투여된다.
다른 구체예에서, IFNτ는 HCV와 같은 바이러스 감염을 가진 환자에게 투여된다. 이 방법은 피험자에게서 감염의 존재를 검출하는 단계 및 감염이 더 이상 검출되지 않은 시점을 지나서 수 개월의 기간 동안 IFNτ의 투여를 계속하는 단계를 더 포함한다. 피험자는 IFNτ로 치료하는 기간 동안 제2 항바이러스제로 치료될 수 있다.
다른 구체예에서, IFNτ는 암과 같은 세포 증식을 특징으로 하는 상태를 가진 환자에게 투여된다. 피험자는 IFNτ로 치료하는 기간 동안 제2 항암제로 치료될 수 있다.
IFNτ 제형은 단백질을 주로 소장으로 전달하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 제형은 장 환경으로부터 단백질을 보호 및/또는 안정화시키는 점막점착성 중합체로 구성될 수 있다. 점막점착성 제제는 장벽을 채우는 세포에 대한 인터페론의 결합을 향상시킨다.
상기 치료는 OAS 레벨이 IFNτ의 초기 투여의 결과로서 증가하는 지를 확인하기 위해 혈중 OAS 레벨을 모니터하는 단계를 더 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 환자에게 초기 투여된 IFNτ의 양은 IFNτ을 경구 투여하기 전에 관찰된 레벨에 대하여 혈중 OAS의 측정 가능한 증가를 달성하도록 조절된다.
본 발명의 이들 및 다른 목적과 양태는 본 발명의 하기 상세한 설명을 첨부 도면과 함께 읽음으로써 보다 완전하게 이해하게 될 것이다.
도 1은 건강한 마우스에게 IFNτ를 복강내(i.p.) 또는 위내 투여한 후의 혈중 OAS 농도(pmol/dL)를 나타낸다.
도 2는 1 x 103 U, 1 x 104 U 및 1 x 105 U의 투여량으로 마우스에게 IFNτ를 위내 투여한 경우의 혈중 OAS 농도(pmol/dL)를 나타낸다.
도 3은 INFτ의 복강내 투여(105 U) 후 몇 가지 마우스 변종(ICR, BALB/c, C57BL, NZW/N 및 SJL/J)에서의 혈중 OAS 농도(pmol/dL)를 도시하는 막대 그래프이다. 대조 마우스는 IFNτ없이 10% 말토스의 용액을 경구 수용하였다. 각각의 막대는 유사한 결과로 실행된 두 실험 중 한 실험(3 내지 5 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 4a 내지 4b는 6 시간 절식 후 IFNτ의 투여 이후 마우스의 혈중 OAS 활성의 유도를 나타내는 막대 그래프이다. 도 4a는 IFNτ(105 U) 투여 후 0 시간, 8 시간, 16 시간 및 24 시간째에 취한 혈액 샘플 중의, 인터페론없이 10% 말토스의 용액으로 처치한 마우스의 혈중 OAS로서 취한 대조군의 백분율로서 표시한 혈중 OAS 레벨을 나타낸다. 도 4b는 0, 102, 103, 104 및 105 U의 농도로 IFNτ를 전달한 지 24 시간 후의 대조군의 백분율로 표시한 혈중 OAS 레벨을 나타낸다. 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 실행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 IFN-τ의 투여에 의하여 마우스의 혈중 OAS의 유도에 대한 절식 조건의 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 혈중 OAS의 유도는 인터페론없이 10% 말토스의 용액으로 처치한 마우스의 혈중 OAS로서 취한, 대조군의 백분율로 나타낸다. 처치된 마우스는 지시된 섭취 섭생 6 시간 후 INFτ 104 U를 수용하였다(복강내 주사 또는 경구 투여에 의하여). 도 5a 급식 및 급수안함; 도 5b 급수함, 음식 공급안함; 도 5c 급식함, 급수안함; 도 5d 급식 및 급수함. 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 실행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 6은 ICR 마우스에게 경구 또는 복강내 주사에 의하여 제공된 쥐과 IFNα(0, 102, 103 및 104 IU)의 투여에 의하여, 인터페론없이 10% 말토스의 용액으로 처치된 마우스의 혈중 OAS로서 취한 대조군의 백분율로서 표시한, 혈중 OAS 활성의 유도를 나타내는 막대 그래프이다. 혈중 OAS 활성은 IFNα 투여 16 시간 후 부석하였다. 각각의 막대는 유시한 결과를 가진 실행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7c는 4.9 x 108 단위/일 IFNτ의 경구 투여 후 3 명의 사람 환자의 C형 간염(HCV) RNA 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 레벨을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 1.5 x 109 단위/일 IFNτ의 경구 투여 후 3 명의 사람 환자의 C형 간염(HCV) RNA 및 아라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 레벨을 나타낸다.
도 9는 항바이러스 분석을 사용하여 측정된 바와 같은 경구 급식(채색된 막대) 또는 복강내 주사(백색 막대)에 의한 투여 후 NZW 마우스의 IFNτ의 양을 나타낸다.
도 10a 내지 도 10c는 미처치된 마우스(도 10a)와 비교하였을 때 경구 투여(10c) 및 복강내 주사(도 10b)된 SJL 마우스의 만성 재발 실험 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 예방을 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 무 IFNτ 처치(도 11a), 복강내 주사에 의한 IFNτ(도 11b) 또는 경구 급식에 의한 IFNτ 치치(도 11c)를 수용한 EAE 유도 동물로부터 림프구 침윤의 검출을 위하여 크레실 바이올렛으로 염색한 마우스 척수의 절개면을 도시한다.
도 12는 복강내 주사 또는 겨구 급식에 의하여 투여된 단일 투약 또는 장기간 IFNτ 처치에 의한 IL-10의 유도를 도시한다.
도 13은 IFNτ의 제거 후 SJL 마우스의 재발을 도시한다.
도 14는 IFNτ의 복강내 주사 및 경구 급식 후 IFNτ 처치된 마우스의 혈청 내 항IFNτ 항체의 ELISA 검출을 나타낸다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1은 양 인터페론-τ(IFN τ)를 코드화하는 합성 유전자의 뉴클레오티드 서열이다.
서열 번호 2는 성숙 양 인터페론-τ(IFNτ; oTP-1; GenBank Accession No. Y00287; PID g1358)의 아미노산 서열이다.
서열 번호 3은 서열 번호 2의 서열에 대하여 서열의 5번 및 6번 위치에서 아미노산 잔기가 변성된 성숙 양 IFNτ의 아미노산 서열에 해당한다.
서열 번호 4는 서열 번호 3의 단백질을 코드화하는 합성 유전자 서열이다.
발명의 상세한 설명
I. 정의
IFNτ 또는 인터페론-τ으로 약어로도 불리우는 인터페론-타우는 하기 특성의 두 군 중 어느 하나를 의미한다: (i)(a) 항백혈병 특성, (b) 항바이러스 특성, (c)항세포증식 특성; 및 (ii) α-인터페론과 약 45 내지 68% 아미노산 상동성이고, 공지된 IFNτ 서열에 70% 이상 아미노산 상동성(에컨대, Ott, et al., J. Interferon Res., 11: 357 (1991); Helmer, et al., J. Reprod. Fert., 79: 83(1987); Imakawa, et al., Mol. Endocrinol, 3: 127 (1989); Whaley, et al., J. Biol. Chem., 269: 10846 (1994); Bazer, et al., WO 94/10313 (1994)). 아미노산 상동성은, 예를 들면 디폴트 매개변수를 가진 LALIGN 프로그램을 사용하여 결정할 수 있다. 이 프로그램은 서열 비교 프로그램의 FASTA 버전 1.7을 찾아볼 수 있다(Pearson and Lipman, PNAS, 85: 2444 (1988); Pearson, Methods in Enzymology, 183: 63 (1990); 미국 버지니아주 살롯빌 조던 홀 박스 440에 소재하는 생화학부, 윌리엄 알. 피어슨으로부터 입수 가능한 프로그램). IFNτ 서열은 다양한 반추 동물 종, 예컨대 한정하는 것은 아니지만, 소(Bovine sp., Helmer S.D., J. Reprod. Fert. 79: 83 (1987); Imakawa, K. Mol. Endocrinol. 119: 532 (1988)), 양(Ovine sp.), 사향소(Ovibos sp.), 기린(Giraffa sp., GenBank Accession no. U55050), 말(Equus caballus), 얼룩말(Equus burchelli, GenBank Accession no. NC005027), 하마(Hippopotamus sp.), 코끼리(Loxodonta sp.), 라마(Llama glama), 염소(Capra sp., GenBank Accession nos. AY357336, AY357335, AY347334, AY357333, AY357332, AY357331, AY357330, AY357329, AY357328, AY357327) 및 사슴(Cervidae sp.)에서 확인되었다. 대부분의 이들 종에 대한 IFNτ의 뉴클레오티드 서열은 공공 데이터베이스 및/또는 문헌에 보고되어 있다(예를 들면, Roberts, R. M. et al., J. Interferon and Cytokine Res., 18: 805 (1998), Leaman D.W. et al., J. Interferon Res., 12: 1 (1993), Ryan, A.M. et al., Anim. Genet., 34: 9 (1996) 참조). 용어 "인터페론-타우"는 상기 열거된 두 군의 특성 각각으로부터 하나 이상의 특성을 가진, 상기 인용된 것으로 예를 들 수 있는 임의의 반추 동물로부터의 인터페론-타우 단백질을 포함하는 것으로 한다.
양 IFNτ(IFNτ)은 본 명세서에서 서열 번호 2로 확인된 바와 같은 아미노산 서열을 가진 단백질 및 본 명세서에서 서열 번호 3으로 확인된 IFNτ 단백질과 같은 단백질의 활성에 유의적인 영향을 주지 않는 아미노산 치환 및 변성, 예컨대 중성 아미노산 치환을 가진 단백질을 의미한다. 보다 일반적으로, 양 IFN-τ 단백질은 서열 번호 2로 확인된 서열에 약 80%, 보다 바람직하게는 90% 서열 상동성을 가진 것이다.
"'X' 유닛보다 큰 일일 투여량"(여기서, X는 5 x 108 또는 1.5 x 109와 같은 특정 값이다)은 단백질의 약 5 x 108 이상의 항바이러스 유닛을 제공하기에 충분한 IFNτ의 양을 의미하며, 여기서, IFNτ의 항바이러스 활성은 하기 방법 섹션에서 기재된 것과 같은, 표준 세포 변성 효과 억제 분석을 사용하여 측정된다. 'X' 유닛의 특정한 일일 투여량을 제공하는 단백질의 양(즉, mg)은 단백질의 특정한 항바이 러스 활성에 따라서 달라지는 것임을 이해해야 한다.
상태의 치료는 상태의 징후를 감소시키고/시키거나 상태의 중증도를 완화하는 데 효과적인 치료 물질을 투여하는 것을 의미한다.
경구는 입 또는 위내 투여를 비롯하여 위 또는 장으로의 직접 투여에 의한 투여를 수반하는 임의의 경로를 의미한다.
장은 위의 하문으로부터 항문으로 연장하고, 소장(십이지장, 공장 및 회장) 및 대장(상행 결장, 횡행 결장, 하행 결장, 구불 결장 및 직장)으로 구성된 소화관의 일부를 의미한다.
OAS 레벨은 혈중 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 단백질의 농도 또는 활성을 의미한다.
ALT는 알라닌 아미노트랜스퍼라제를 의미한다.
HCV는 C형 간염을 의미한다.
"측정 가능한 혈중 OAS 레벨 증가"는 OAS의 혈중 레벨(혈청 및/또는 혈액 세포)의 통계학적으로 의미있는 증가, 통상적으로 동일한 조건 하에서 측정된 전처리 레벨에 대하여 25% 이상의 증가를 의미한다. 이 레벨은 검출 가능한 OAS 효소 또는 혈중 림프구에서와 같이 세포간 OAS mRNA 레벨의 증가에 의하여 측정할 수 있다. 혈중 OAS 효소의 측정 방법은 방사선면역검정 키트를 사용하여 본 명세서에 기재되어 있을 뿐만 아니라, 문헌(Satoh, Y. et at., J. Interferon and Cytokine Res., 19: 887 (1999))에 기재되어 있다. 세포 내 OAS의 mRNA 발현의 측정 방법은 문헌(Takayama, S. et al., J. Interferon and Cytokine Res. , 19: 895 (1999))에 기재되어 있다.
II. 인터페론-τ 조성물 및 치료 방법
A. 인터페론-τ
확인하고자 하는 첫번째 IFNτ는 18 내지 19 kDa 단백질로서 양 IFNτ(IFNτ)였다. 몇 가지 이성체를 수태물(배아 및 주변 멤브레인) 호모게네이트에서 확인하였다(Martal, J., et al., J. Reprod. Fertil. 56: 63-73 (1979)). 이어서, 수태물 배양 배지로 방출된 저분자량 단백질을 정제하였으며, 열 분안정하고 프로테아제 민감한 것으로 나타났다(Godkin, J.D., et al., J. Reprod. Fertil. 65: 141-150 (1982)). IFNτ는 원래 양 세포영양막 단백질-1(oTP-1)로 불리웠는데, 그 이유는 이것이 양의 모자간 인식의 중요한 기간 중에 양 수태물의 배엽에 의해 초기에 생성되는 1차 분비 단백질이기 때문이다. 후속 실험은 IFNτ가 양 및 소와 같은 반추 동물의 임신에 대한 생리학적 반응의 확립에 필수적인 임신 인지 호르몬인 것으로 결정하였다(Bazer, F.W., and Johnson, H.M., Am. J. Reprod Immunol. 26: 19-22 (1991)).
N-말단 아미노산 서열을 나타내는 합성 올리고뉴클레오티드로 양 배반포를 프로빙함으로써 얻어진 IFNτ cDNA(Imakawa, et al., 1987)는 사람, 마우스, 래트 및 돼지로부터의 IFN-αs와 45 내지 55% 상동성이고, 현재 IFN-Ω로 불리우는 소 IFN-αII와 70% 상동성인 예측 아미노산 서열을 가진다. 상이한 아형을 나타낼 수 있는 몇 가지 cDNA 서열이 보고되었다(Stewart, H.J., et al., Mol. Endocrinol. 2: 65 (1989); Klemann, S.W., et al., Nuc. Acids Res. 18: 6724 (1990); and Charlier, M., et al., Mol. Cell Endocrinol. 76: 161-171 (1991)). 이들 모두는 23 아미노산 리더 서열 및 172 아미노산 성숙 단백질을 코드화하는 585 염기 열린 해독 프레임으로 대략 1kb이다. 병치된 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가진 4 개의 나선형 다발로서 IFN-τ의 예측되는 구조는 I형 IFN으로서의 그 분류를 더 지지한다(Jarpe, M.A., et al., Protein Engineering 7: 863-867 (1994)).
인터페론의 개관
양태 I형 I형 I형 II형
종류 α&ω β τ γ
생성 원인 백혈구 섬유아세포 영양막 림프구
항바이러스성 + + + +
항증식성 + + + +
임신 시그널링 - - + -
IFN-τ가 I형 IFN(상기 표 참조)과 전형적으로 연관된 활성의 일부를 나타내더라도, 상당한 차이가 이것과 다른 I형 IFN 사이에 존재한다. 가장 현저한 차이는 전술한 임신에서의 역할이다. 또한, 바이러스 유도도 상이하다. IFNτ을 제외한 모든 I형 IFN은 바이러스 및 dsRNA에 의해 용이하게 유도된다(Roberts, R.M., et al., Endocrin. Rev. 13: 432-452 (1992)). 유도된 IFN-α 및 IFN-β 발현은 대략 수 시간 지속하는, 일시적이다. 이와는 대조적으로, IFN-τ 합성은, 일단 유도되면, 수 일에 걸쳐 유지된다(Godkin, et al., 1982). 셀 당 기준으로, 다른 I형 IFN보다 300 배 이상의 IFN-τ가 생성된다(Cross, J.C. and Roberts, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3817-3821 (1991)).
다른 차이는 IFNτ 유전자의 조절 영역에 존재할 수 있다. 예를 들면, 소 IFNτ에 대한 유전자를 이용한 사람 영양막 세포주 JAR의 트랜스펙션은 항바이러스 활성을 가져왔지만, 소 IFN-Ω에 의한 트랜스펙션은 그렇지 않았다. 이는 IFNτ 유전자에 수반되는 독특한 처리 인자를 시사한다. IFNτ의 근단 프로모터 영역(126번 위치에서 전사 개시 부위까지)이 IFN-α 및 IFN-β의 것과 매우 상동성이지만, -126에서 -450까지의 영역은 상동성이 아니며 단지 IFNτ 발현을 향상시킨다는 관찰은 이와 일치한다(Cross, J.C., and Roberts, R.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3817-3821 (1991)). 따라서, 상이한 조절 인자는 다른 I형 IFN과 비교하였을 때 IFNτ 바현에 수반되는 것으로 보인다.
양-IFNτ의 172 아미노산 서열은, 예를 들면 미국 특허 제5,958,402호에 설명되어 있으며, 그 상동성 소-IFNτ 서열은, 예를 들면 문헌(Helmer et at., J. Reprod. Fert., 79: 83-91(1987) and Imakawa, K. et al., Mol. Endocrinol., 3: 127 (1989))에 기재되어 있다. 이러한 서열로부터의 양-IFNτ 및 소-lFNτ는 본 명세서에서 참고 인용한다. 양 IFNτ의 아미노산 서열은 본 명세서에서 서열 번호 2로 나타낸다.
1. IFN-τ의 분리
IFNτ는 문헌(Godkin, J.D., et al, J. Reprod. Fertil. 65: 141-150 (1982) and Vallet, J.L., et al, Biol. Reprod. 37: 1307 (1987))에 기재된 바와 같이 임신한 양으로부터 수집한 수태물로부터 분리하여 변성 최소 필수 배지에서 시험관내 배양할 수 있다. IFNτ는 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과에 의한 수태물 배양으로부터 정제할 수 있다. 분리된 IFNτ의 동질성은 나트륨 도데실 술페이트 폴 리아크릴아미드 겔 전기영동에 의하여 평가할 수 있으며(Maniatis, T., et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982); Ausubel, F.M., et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, JohnWiley & Sons, Inc., Media, PA (1988)), 정제된 IFNτ 샘플 내 단백질 농도의 결정은 비신코닌(BCA) 분석을 사용하여 수행할 수 있다(Pierce Chemical Co. , Rockford, IL; Smith, P.K., et al., Anal. Biochem. 150: 76 (1985)).
2. IFNτ의 재조합 생성
재조합 IFNτ 단백질은 박테리아 또는 효모 세포와 같은 적당한 발현 시스템을 사용하여 임의의 선택된 IFNτ 폴리뉴클레오티드로부터 생성할 수 있다. IFNτ 뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열의 분리는 본 명세서에서 참고 인용하는 PCT 공개 공보 WO/94/10313호에 기재되어 있다.
IFNτ 발현 벡터를 만들기 위하여, IFNτ 코드화 서열(예컨대, 서열 번호 1 또는 4)을 발현 벡터, 예컨대 박테리아 벡터에 넣고, 표준 방법에 따라 발현한다. 적당한 벡터의 예로는 람다 gt11(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) ; pGEX(Smith, P.K. et at., Anal. Biochem. 150: 76(1985)); pGEMEX(Promega); 및 pBS(Strategene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재) 벡터가 있다. 적당한 프로모터, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제 또는 tac 프로모터를 함유하는 다른 박테리아 발현 벡터도 사용할 수 있다. IFNτ 합성 폴리뉴클레오티드를 변성 pIN III omp-A 발현 벡터로 클로닝하는 것은 재료 및 방법 섹션에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 연구를 위하여, 서열 번호 4에 조재하는 IFNτ 코드화 서열을, 효모 세포의 형질전환에 적당하고, 메탄올 조절 알콜 옥시다제(AOX) 프로모터 및 Pho1 시그널 서열을 함유하는 벡터에 클로닝하였다. 이 벡터를 사용하여 피. 파스토리스(P. pastoris) 숙주 세포를 형질전환시키고, 형질전환된 세포를 사용하여 제조자의 지시에 따라 단백질을 발현하였다.(Invitrogen, 미국 샌디에고 소재).
본 발명의 방법과 함께 사용되는 IFNτ를 발현하기에 적당한 다른 효모 벡터로는 2 미크론 플라스미드 벡터(Ludwig, D.L. et al., Gene, 132: 33 (1993)),효모 통합 플라스미드(Shaw, K.J. et al., DNA, 7: 117 (1988)), YEP 벡터(Shen, L.P. et al., Sci. Sin., 29: 856 (1986)), 효모 동원체 플라스미드(YCps) 및 조절 가능한 발현을 가진 다른 벡터(Hitzeman, R.A. et al., 미국 특허 제4,775,622호, 1988년 10월 4일 특허됨; Rutter, W.J. et al., 미국 특허 제4,769,238호, 1988년 9월 6일 특허됨; Oeda, K. et al., 미국 특허 제4,766,068호, 1988년 8월 23일 특허됨)가 있다. 바람직하게는, 벡터는 유효 효모 프로모터, 예컨대 MFα1 프로모터(Bayne, M.L. et al., Gene 66: 235-244 (1988), GADPH 프로모터(글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제; Wu, D.A. et al., DNA, 10: 201 (1991)) 또는 갈락토스 유도성 GAL10 프로모터(Ludwig, D.L. et al., Gene, 132: 33 (1993); Feher, Z. et al., Curr. Genet., 16: 461 (1989)); Shen, L.P. et al., Sci. Sin., 29: 856 (1986))를 함유하는 발현 카세트를 포함한다. 통상적으로, 효모 형질전환 숙주는 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae)이지만, 전 술한 바와 같이, 형질전환에 적당한 다른 효모도 사용할 수 있다(예를 들면, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 등).
또한, IFNτ 폴리펩티드를 암호화하는 DNA는 적당한 숙주 시스템에서 폴리펩티드의 발현을 발생시키기 위하여 시중 구입 가능한 임의의 수의 벡터에 클로닝할 수 있다. 이러한 시스템은 전술한 박테리아 및 효모 발현 시스템뿐만 아니라 다음: 바쿨루스 발현(Reilly, P.R. et al., BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, (1992); Beames et al., Biotechniques, 11: 378 (1991); Clontech, Palo Alto CA); 식물 세포 발현, 트랜스게닉 식물 발현및 포유류 세포에서의 발현(Clontech, Palo Alto CA; Gibco-BRL, Gaithersburg MD)을 포함한다. 재조합 폴리펩티드는 융합 단백질로서 또는 본래의 단백질로서 발현될 수 있다. 다수의 양태, 예컨대 배양 배지로의 발현된 서열의 분비를 촉진하는 리더 서열을 발현 벡터로 공작할 수 있다. 통상적으로, 재조합 생성된 폴리펩티드는 용융된 세포 또는 배양 배지로부터 분리한다. 정제는 염 분별, 이온 교환 크로마토그래피 및 친화 크로마토그래피를 비롯한 당업자에게 공지된 방법에 의하여 수행될 수 있다. 면역친화 크로마토그래피는, 전술한 바와 같이, IFNτ 폴리펩티드에 기초하여 발생된 항체를 이용하여 사용할 수 있다.
재조합법 이외에, IFNτ 단백질 또는 폴리펩티드는 친화성에 기초한 방법, 예컨대 적당한 항체를 사용하여 선택된 세포로부터 분리할 수 있다. 또한, IFNτ 펩티드(예컨대, 서열 번호 2 또는 3)는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 화학적 으로 합성할 수 있다.
B. IFNτ의 경구 투여
본 발명을 지지하는 수행된 연구에서, IFN-τ를 마우스 및 사람에게 경구 투여하고, 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 활성의 유도, IFN 작용의 인지된 마커(Shindo, M. et al., Hepatology 8: 366-370, (1988)), 전혈을 모니터하였다. OAS 레벨을 모니터하는 대안의 방법이 적당하고, 정확성 및 민감성의 관점에서 이점을 제공할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, OAS의 세포질 mRNA 발현 레벨은 반정량 역전사 효소 PCT 기술을 사용하여 측정할 수 있다(Takayama, S. et al., J. Interferon and Cytokine Res. , 19 : 895(1999)).
1. 마우스에게의 IFNτ 투여
본 발명을 지지하는 수행된 연구에서, 경구 투여된 IFNτ는 OAS를 유도하는 능력에 대하여 테스트하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, IFNτ를 마우스에게 경구 또는 복강내(i.p.) 투여하였다. IFNτ 투여 24 시간 후 전혈 내 OAS 활성을 결정하고, 결과를 도 1에 나타낸다.
도 1은 10% 말토스를 함유하는 염수로 처치된 대조 동물에 대한 OAS 혈중 농도(pmol/dL)가 1,000 pmol/dL을 약간 넘었음을 보여준다. 10% 말토스를 함유하는 염수의 용액 중의 IFNτ 5 x 108 유닛으로 복강내 처치한 마우스는 OAS 혈중 레벨이 약 1700 pmol/dL을 가졌다. 동일한 IFNτ 투여량으로 경구 처치된 마우스는 OAS 혈중 레벨이 약 2000 pmol/dL이었다.
실시예 2에 기재된 다른 연구에서, IFNτ을 마우스에게 경구 투여하여 투여량 의존적 방식으로 OAS를 유도하는 능력을 결정하였다. IFNτ는 테스트 마우스의 위장 상부에 0(대조군), 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105의 유닛으로 경구 투여하였다. 경구 투여 12 시간 후, 전혈을 심장으로부터 취하고, OAS 농도를 결정하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 전혈 내 OAS 농도는 투여량 의존적 방식으로 증가하였다.
실시예 3은 마우스로 수행된 다른 연구를 기술한다. 이 연구에서, IFNτ의 투여 전에, 마우스에게 6 시간 이상 동안 음식과 음료를 주지 않고, IFNτ를 경구 또는 복강내(i.p.) 주사에 의하여 제공하였다. 경구 투여된 경우, IFNτ는 경구 공급 바늘을 사용하여 위 상부로 직접 도입하였다.
도 3은 다양한 마우스 변종: ICR, BALB/c, C57BL/9, NZW/N 및 SJL/J의 혈중 OAS 활성의 유도에 대한 IFNτ의 위내 투여 효과를 보여준다. 모든 테스트 마우스는 IFNτ(105 U)로 경구 테스트하였다. 대조 마우스는 IFNτ없이 10% 말토스의 용액을 경구 수용하였다. 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 수행된 두 실험 중 한 실험(3 내지 5 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다. 도 3에서 보는 바와 같이, 모든 마우스 변종의 OAS 활성 레벨은 IFNτ의 경구 투여 후 증가되었지만, 증가의 정도는 변종마다 달랐다. ICR, C57BL/9 및 NZW/N 마우스에서 유도된 활성의 레벨은 BALB/c 및 SJL/J 마우스에서보다 더 높았다.
다른 연구에서, OAS 활성은 IFNτ 투여 후 시간의 함수로서 모니터하였다. 이 연구에서, 동물(ICR 마우스)은 IFNτ(105 U) 투여 전에 6 시간 절식(물은 공급하 고, 음식은 공급안함)시켰다. 혈액을 IFN-τ 투여 후 8 시간, 16 시간및 24 시간째에 샘플링하였다. 결과를 도 4a에 나타낸다.
도 4a는 염수/10% 말토스 비히클로 처치한 대조 마우스의 백분율로서 표시한, IFNτ 투여 후 소정 시간 간격을 두고 취한 혈액 샘플 중의 혈중 OAS 레벨을 나타낸다. 도 4a에서, 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 수행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다. 전혈 중의 OAS 활성은 경구 또는 복강내 주사 경로와는 무관하게 시간 의존적 방식으로 증가되었지만, 최고 레벨은 복강내 주사보다는 경구 투여 후 24 시간 시점에서 관찰되었다.
다른 연구에서, 다양한 농도의 IFNτ(0, 102, 103, 104 및 105 U)의 IFNτ를 6 시간 절식 후 마우스에게 제공하였다. 혈액을 24 시간 후에 얻었으며, OAS 활성을 분석하였다. 결과를 도 4b에 나타낸다.
도 4b는 0, 102, 103, 104 및 105 U의 농도에서 IFNτ의 전달 24 시간 후 대조 마우스의 백부율로서 표시한 혈중 OAS 레벨을 나타낸다. 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 수행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E를 나타낸다. 복강내 주사 후, 활성 레벨은 저 투여량(102 U)에서 다소 높았으며, 고 투여량의 IFN-τ(104 및 105 U)에서 포화되었다. 이와는 대조적으로, 경구 투여 후 활성 레벨은 투여량 의존적으로 증가하였다.
도 4a 및 도 4b의 데이터는 경구 투여된 IFN-τ가 복강내 주사에 의해 유도 된 것보다 더 높은 레벨의 혈중 OAS 활성을 유도한다는 것을 보여준다. 특히, 경구 유도된 혈중 OAS 레벨은 약 103 U 이상의 IFN-τ 투여량 및 약 8 시간 이상의 투여 후 시간에서 복강내 주사에 의해 유도된 혈중 OAS 레벨보다 더 높았다.
다른 연구에서, IFN-τ의 투여에 의한 마우스의 혈중 OAS 유도에 대한 절식 조건의 효과를 평가하였다. 이 연구에서, 마우스는 6 시간 동안 한정된 음식 및 물로 섭취 섭생시켰다. 6 시간 섭생 후, IFNτ 104 U를 경구 급식 또는 복강내 주사에 의하여 음식 및 물과 함께 투여하였다. 섭취 섭생은 다음과 같았다: 케이스 I, 음식 또는 물을 제공안함; 케이스 II, 물은 제공하지만 음식은 제공안함; 케이스 III, 음식만 제공함; 케이스 IV, 음식과 물 모두 제공함. 전혈은 24 시간째에 심장에서 얻었으며, OAS 활성의 레벨을 결정하였다. 결과는 도 5a 내지 5d에 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 각각 상기 문단에서 정의된 케이스 I 내지 케이스 IV 음식 및 물 섭취 섭생을 받았다. 도 5a 내지 도 5d의 결과는 인터페론없이 10% 말토스의 용액으로 처치된 마우스의 혈중 OAS로서 취한, 대조군의 백분율로서 표시한 혈중 OAS의 유도를 나타낸다. 결과는 음식물을 수용하지 않은 마우스에 대한 도 5a 및 도 5b에서 최상인 것으로 보여지는 바와 같이, 고 혈중 OAS 레벨이 IFN-τ를 절식 상태의 피험자에게 경구 투여함으로써 유도된다는 것을 보여준다.
이 연구에서, 물을 공급하거나, 물을 공급하지 않거나, 거의 동일한 양의 음식이 소화된 것으로 관찰되었다. 그러나, 물 섭취는 음식물을 공급한 경우(케이스 III 및 케이스 IV)보다 음식물을 공급하지 않은 경우(케이스 I 및 케이스 II)에서 더 낮았다. 일부 동물에게서, 6 시간 절식 후, 청색 염료를 함유하는 0.2 ㎖ 말토스 용액을 경구 제공하고, 위 및 장의 염료 분포를 조사하였다(데이터 도시하지 않음). 음식물 섭취 후(케이스 III 및 케이스 IV) 마우스의 위는 팽창하였고, 염료는 주로 위에 국소화되었는데, 음식물이 염료를 흡수하였기 때문인 것으로 추정된다. 그러나, 염료는 음식물이 섭취되지 않았을 때 장으로 신속하게 전달되었다. 이 관찰은 경구 섭취된 IFNτ가 장에서 효과를 발휘하여 고 레벨의 혈중 OAS 활성을 유도한다는 것을 시사한다.
비교 연구를 행하여 혈중 OAS 레벨에 대한 MuIFN-α의 경구 투여 효과를 측정하였다. 이 연구에서, ICR 마우스를 다양한 농도(0, 102, 103 및 104 IU)의 MuIFN-α 로 경구 또는 복강내 경로에 의하여 처치하였다. MuLFN-α 투여 16 시간 후에 얻어진 혈중 OAS 활성을 분석하였다. 결과를 도 6에 나타내며, 여기서 각각의 막대는 유사한 결과를 가진 수행된 두 실험 중 한 실험(3 마리 마우스)의 평균 ± S.E.를 나타낸다.
도 6은 경구 또는 복강내 주사에 의하여 제공된 MuIFNα(0, 102, 103 및 104 IU)의 투여 후 대조 마우스의 백분율로서 표시한, 혈중 OAS 활성의 유도를 나타내는 막대 그래프이다. OAS 활성의 레벨은 투여 경로에 의해 투여량 의존적으로 증가하였는데, 복강내 주사가 경구 투여보다 더 나은 혈중 OAS 활성의 유도를 가져왔다. 이 결과는 IFNτ의 경구 투여가 IFNτ의 복강내 주사보다 더 높은 혈중 OAS 레벨을 달성한, IFNτ로 관찰된 것과는 정반대이다. 더욱이, 마우스의 체온은 MuIFN α를 투여한 경우에 약간 상승하였지만, IFNτ를 사용한 경우에는 그렇지 않았다(데이터 도시하지 않음).
도 1 내지 도 6에 제공된 데이터는 장관에 투여된 IFNτ가 생체내 OAS 반응을 유도 또는 상향조절한다는 증거를 제공한다. IFNτ의 경구 투여가 문헌(예컨대, WO 96/28183호 참조)에 이미 보고되어 있기는 하지만, 어떠한 연구도 비내생 인터페론이 경구 투여시 OAS 반응을 유도할 수 있다는 것을 보여주지는 못했다. 본 연구에서, IFNτ는 구강 점막(tunica mucosa oris)에 접촉하지 않고, 장관으로 직접 투여함으로써 인두 중앙부에서의 흡수를 배제한다. 위로부터의 IFNτ의 직접 흡수는, 특히 IFNτ의 만성 투여의 경우에서 경구 점막을 통하여 흡수되는 IFNτ와 비교하였을 때 IFNτ에 대한 항체 형성을 최소화한다.
2. C형 간염을 가진 사람에게의 투여
C형 간염에 감염된 사람 환자를 연구를 위해 모집하였다. 환자를 경구 IFNτ(서열 번호 4)로 치료하기 위한 4 개의 테스트군으로 나누었다. 실시예 4에 기재된 바와 같이, 테스트군 내 각각의 환자들은 IFNτ 1 mg/㎖ 용액의 조절된 부피를 1일 3회 자가 투여하였다. 테스트군 I, II, III 및 IV의 환자들은 각각 1 mg IFNτ, 3 mg IFNτ, 9 mg IFNτ 및 15 mg IFNτ의 1일 총 투여량을 수용하였다. 환자들은 규정된 간격으로 테스트 임상으로 복귀시켜서 (i) (a) 혈청 및 (b) 말초혈 단핵 세포 내 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 레벨; (ii) 아닐린 아미노트랜스퍼라제(ALT) 레벨; 및 (iii) 바이러스 역가 레벨(㎖ 당 C형 간염 RNA 사본)을 제공하였다.
각각의 테스트군 내 일부 환자의 결과는 하기 표 3 내지 5에 나타내고, 도 7 및 도 8에 도시한다. 표 3a 및 표 3b는 1일 3회 0.33 mg 경구 IFNτ로 처치된 투여군 I의 6 명의 환자에 대한 데이터를 제공한다. 혈청 2-5 OAS 레벨(pmol/dL)은 "2-5A(혈청)"으로 확인된 컬럼에 표시한다. 피험자 중 두 명, PAB/001 및 JRJ/006은 혈중 OAS 레벨의 증가를 나타내지 않았다. 다른 네 명의 피험자들은 측정 가능한 혈중 OAS 레벨 증가를 가졌으며, MSM/002 및 LER/004로 확인된 환자들은 유의적인 증가를 나타내었다. 피험자 MSM/002는 11.0 pmol/dL의 베이스라인 OAS 레벨을 가졌다. 테스트 15일째에 이는 51.5로 증가하였는데, 4 배 이상 증가한 것이다. 피험자 Z-I/005는 43.4 pmol/dL의 베이스라인 OAS 레벨을 가졌다. OAS 레벨은 테스트 29일째에 74.8 pmol/dL에 도달하였다.
표 4는 1일 3회 1 mg IFNτ로 처치된 투약군 II의 3 명의 환자에 대한 데이터를 제공한다. 환자 AMC/007 및 DBF/012는 IFNτ 치료에 반응하였으며, 혈중 OAS 레벨이 유의적으로 증가하였다. 예를 들면, 환자 AMC/007은 11.2 pmol/dL의 베이스라인 OAS 레벨을 가졌다. 이는 치료의 첫번째 29일에 걸쳐서 계속해서 증가하였으며, 테스트 29일째에 120 pmol/dL의 최대치가 측정되었다. OAS 레벨은 테스트 71일에 걸쳐서 베이스라인 레벨에 비하여 4 배 이상으로 남아있었다. 환자 DBF/012는 치료 전에 28.8 pmol/dL의 초기 OAS 레벨을 가졌다. 이 레벨은 71일 치료 기간에 걸쳐서 증가하고 감소하였으며, 최대 측정치는 제15일 및 제71일에 100 pmol/dL 이상이었다. 제8일과 제71일 사이에 1.5 배 이상의 증가가 관찰되었다.
표 5는 1일 3회 3 mg IFNτ로 처치된 투약군 II의 3 명의 환자에 대한 데이 터를 제공한다. 혈중 OAS의 베이스라인은 연구 당일에 취하였다. 피험자 CLR/011은 증가된 혈중 OAS 레벨에 관하여 최저 반응을 가졌다. 피험자 HCM/010은 혈중 OAS 레벨의 약 1.5 배 증가를 보이고, 피험자 VCC/009는 테스트 29일째에 4 배 이상으로 혈중 OAS 레벨이 증가하였다.
표 3 내지 5의 데이터는 C형 바이러스성 간염을 가진 개체의 경구 IFNτ에 대한 다양한 반응을 설명한다. 많은 환자들은 증가된 혈중 OAS 레벨을 가졌으며, 통상적으로 초기 베이스라인에 비하여 혈중 OAS가 1.5 배, 종종 2 배, 일부 경우에서는 4 배 증가하였다. 각각의 환자의 반응은 감염 상태 및 개체화된 신체의 치료에 대한 반응을 비롯한 다수의 인자에 의존한다.
따라서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 IFNτ를 경구 투여하는 것을 도모하며, 여기서 IFNτ의 초기 투여량(들)은 특정 환자에 대한 증가된 혈중 OAS 레벨을 달성하도록 선택된다. IFNτ는 구강보다는 환자의 장관을 표적화하는 형태로 투여된다. 제형은, 예를 들면 치료 전 및 치료 개시 후에 혈중 OAS 또는 OAS mRNA를 모니터함으로써 선택하거나 확인할 수 있다. 대안으로, 유효 투여량은 상이한 질환 상태 하에 소정의 투여량에 대한 모델 환자 반응으로부터 사전 결정할 수 있다. 예를 들면, 소정의 연령 범위 내의, 특정한 상태, 예컨대 HCV 감염 또는 MS를 가진 환자를, 상이한 초기 IFN-타우 레벨에 따른 혈중 OAS 변화에 대하여 모니터하고, 그러한 연령/질환 프로필을 가진 환자에 대한 적당한 투여량을 사전 결정하며, 그러한 투여량 지침을 담당의에게 공급할 수 있다. 본 발명의 한 가지 양태는 단백질을 장관에 표적화하기에 적합한 경구 전달 제형의 IFN-타우, 예를 들면 IFN-타우 의 장용 코팅된 제형 및 상이한 환자 상태 하의 유효 투여량, 즉 OAS 혈중 레벨의 측정가능한 증가를 생성하기에 효과적인 투여량에 대한 지침을 제공하는 생성물 문헌 또는 삽입 인쇄물을 포함하는 IFN-타우 요법 키트를 포함한다. 삽입 인쇄물은 투여량 범위 및 예상되는 OAS 반응의 초기 변화를 제공하는 것이 바람직하다.
초기 투여 후, 또는 투여량이 측정 가능한 혈중 OAS 레벨을 생성하는 투여량(유효량)에 도달할 때, 유효량 IFNτ의 투여를 장기간 동안, 바람직하게는 매일 또는 주 당 수회 기준으로 계속한다. 장기간 기준으로 투여되는 유효량은 장기간 치료에 걸친 실제 혈중 OAS 레벨의 거동과는 독립적으로, 계속되는 유효량이 초기 유효량과 동일하거나 상이하거나 초기 측정가능한 혈중 OAS 증가를 생성하는 데 효과적인 것이다. 따라서, 치료 기간 동안, 혈중 OAS 레벨은 환자가 초기 측정 가능한 혈중 OAS 레벨 증가를 생성하는 데 효과적인 IFNτ 투여량을 계속 수용하고 있더라도, 고 레벨에서 일정하게 유지되고, 계속 증가, 또는 심지어 계속 감소(예를 들면, 바이러스 감염의 감소하는 레벨에 따라서) 할 수 있다. 통상적으로, 이 유효량은 105 내지 1010 유닛 IFNτ/일이고, 소정의 초기 혈중 OAS 증가, 예를 들면 1.5 내지 4 배 정상적인 미처치 레벨을 달성하도록 조절할 수 있다.
도 7 및 도 8은 연구 대상의 몇몇 환자에 대한 바이러스 역가 및 알라닌트랜스퍼라제(ALT) 레벨에 대한 데이터를 제공한다. 알라닌 트랜스퍼라제는 알라닌의 γ-케토기를 케토글루타레이트의 γ-케토기로 전달하는 것을 촉매 작용하여 옥살로아세트산 및 피루브산을 형성시키는 혈청 효소이다. ALT는 주로 간에서 발견되며, 간 질환, 예컨대 C형 간염을 가진 환자는 혈액 중에 고 ALT 레벨을 가진다(HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, Wilson et al., Eds., 12th Editions, Part Nine, page 1309, (1991)). 건강한 사람은 ALT 레벨이 약 1 내지 45 U/L이다. 도 7a 내지 도 7c는 4.9 x 108 유닛/일(0.33 mg 1일 3회)의 경구 투여 후, 투약군 I의 세 명의 환자, 환자 PAB/001(도 7a), MSM/002(도 7b) 및 DMA/003(도 7c)의 C형 간염(HCV) RNA 바이러스 역가(음영 막대) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 레벨(다이아몬드)을 나타낸다. 환자 MSM/002 및 DMA/003(도 7b, 7c)는 169일 치료 기간에 걸쳐서 ALT 레벨이 계속 증가하였다. 환자 PAB/001(도 7a)는 ALT 혈중 레벨이 더 변화하였는데, 약간 증가하였지만, IFNτ 치료 결과, 전반적으로 ALT 레벨이 감소하였다.
도 8a 및 도 8b는 1.5 x 109 유닛/일(1.0 mg 1일 3회) 경구 IFNτ로 치료된 투약군 II의 환자인, 환자 AMC/007(도 8a) 및 VCC/009 (도 8b)의 C형 간염(HCV) RNA 및 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT) 레벨을 보여준다. 두 환자는 상이하게 반응하였는데, VCC/009는 첫번째 치료 주간에 초기 ALT 증가를 나타낸 후 약 8일 내지 113일까지 계속된 ALT 레벨 감소를 나타내었다.
일부 환자 및 일부 상태에 대하여, 다른 치료제와 조합한 IFNτ의 투여가 고려된다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 다른 인식된 간염 항바이러스제와의 IFNτ의 조합은 일부 환자에게 유리할 것이다. 보다 일반적으로, IFNτ와 임의의 공지된 약제의 조합이 고려된다.
3. 실험 알레르기성 뇌척수염을 가진 마우스에게의 IFNτ 투여
자가 면역 장애의 치료를 위한 IFNτ의 경구 투여는 다발성 경화증에 대한 인식된 모델을 사용한 다른 연구로 설명하였다. 이 연구는 항원 유도 자가면역의 동물 모델인, 실험 알레르기성 뇌척수염(EAE; Zamvil, S.S. et al., Ann. Rev. Immunol., 8: 579-621 (1990))을 가진 설치류의 반응을 평가함으로써, 일반적인 자가면역 장해를 치료하는 데 있어서 IFNτ의 효능을 평가한다. EAE는 임상 및 병리학적 징후에서 사람 다발성 경화증(MS)과 닮았으며, 따라서 MS와 같은 사람 자가면역 질환에 대한 치료를 평가하는 데 사용할 수 있다. EAE는 미엘린계 단백질(MBP) 또는 뇌염 유발성 펩티드 단편을 가진 감수성 마우스, 래트 또는 기니 피그 변종을 면역화함으로써 유도되는 T-세포 매개 염증성 자가면역 미엘린 탈락 질환이다. 모델 동물 변종의 유전적 감수성은 특정한 부류 II 주조직적합성 복합체(MHC-II) 분자에 결합하는 뇌염 유발성 펩티드의 능력에 부분적으로 기초한다(Fritz, R.B., et al, J. Immunol 130 (3): 1024-1026 (1983); Wraith, D.C., et al., Cell 59: 247 (1989)). 특히, H-2u 일배체형을 가진 마우스는 EAE에 감수성이다. 감수성 마우스 변종으로는 PL/J 마우스(Klein, J., et al., Immunogenetics 17: 553 (1983)), (PL/J x SJL)F1 마우스(Zamvil, S.S. et al., Ann. Rev. Immunol., 8: 579-621 (1990); Wraith, et al., 1989), B10.PL 마우스(Figuero, F., et al., Immunogenetics 15(4): 399-404 (1982)), NZW 마우스(Kotzin, B.L., et al., J. Exp. Med. 265: 1237(1987)), 및 (NZB x NZW)F1(Kotzin, B.L., et al., J. Exp. Med. 265: 1237 (1987) ) 마우스가 있다.
본 발명을 지지하여 수행되고, 하기에서 상세하게 설명되는 연구는 경구 투여된 IFNτ 조성물이 IFNτ로 치료하여 이득을 얻는 질환 또는 질환 상태의 치료에 대하여 주사된 IFNτ 조성물에 대한 효능면에서 필적할 만하다는 것을 설명한다. 경구 투여된 IFNτ는 IFNτ 치료로부터 이득을 얻는 질환(EAE) 치료에 효과적일 뿐만 아니라, 경구 투여 경로가 주사된 IFNτ 조성물을 이용한 치료에 비하여 예상치못한 이점을 가져왔다. 예를 들면, 경구 투여된 IFNτ는 치료된 개체의 혈청 내 항IFNτ 항체의 레벨을 유의적으로 저하시켰다. 따라서, IFNτ가 숙주 면역 반응에 의해 비효과적이 되기가 쉽지 않고(즉, 치료 및/또는 투약 레벨에 대한 감도 감소가 유의적으로 감소되고), 치료를 수용한 개체는 그러한 면역 반응의 결과로서 부작용을 받기 쉽지 않기 때문에 이는 유리하다.
이들 및 관련된 발견을 설명하는 실험 결과는 하기에 제공한다.
a. 경구 투여된 IFNτ는 EAE 발달을 억제한다
실시예 5에 기재된 바와 같이, 경구 투여되고 주사된 IFNτ는 EAE 유발을 방지하는 능력에 대하여 테스트하였다. EAE는 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스에게서 소 미엘린계 단백질(bMBP)로 면역화함으로써 유발하였다. 피험체 NZW 마우스는 실험 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 유발을 위해 소 미엘린계 단백질(bMBP)로 면역화하기 48 시간 전, 당일 및 48 시간 후에 복강내 또는 경구 제공함으로써 OvIFNτ를 수용하였다.
b. OvIFNτ는 경구 투여 후 혈청에 존재한다.
경구 투여된 IFNτ가 순환계에 진입하는 지를 확인하기 위하여, 복강내 주사 또는 경구 투여에 의하여 IFNτ를 수용한 마우스의 혈청을, 실시예 6에 기재된 바와 같은 세포 변성 효과(항바이러스) 분석(Familetti, P.C. et al., Meth. Enzymol. 78: 387(1981))을 사용하여 IFNτ의 존재에 대하여 테스트하였다.
결과는 도 9에 나타낸다. 특이적인 활성은 MDBK 세포를 사용하는 항바이러스 분석으로부터 얻어진 항바이러스 유닛/mg 단백질로 표시한다. OvIFNτ는 200 U/㎖의 레벨로 경구 급식(채색된 막대) 후 2 시간까지 검출되었다. 이들 데이터는 경구 투여된 IFNτ가 순환계에 진입하고, 투여 후 약 2 시간 동안 혈청에 체류한다는 것을 가리킨다.
c. 경구 투여된 OvIFNτ로부터의 독성 결여
I형 IFNα 및 IFNβ가 사람에게 치료제로 사용되었을 때 독감과 같은 증후군, 열, 오심 및 권태로 나타나는 독성 부작용을 유발한다는 것은 이미 설명되었다(Degre, M., Int. J. Cancer 14: 699 (1974); Fent, K. and G. Zbinden, Trnds. Pharm. Sci. 56: 1-26 (1987)). 이와는 대조적으로, OvIFNτ는 시험관내 및 생체내에서 독성의 현저한 결여를 나타낸다. 본 발명을 지지하여 수행된 연구는 경구 급식에 의해 제공하였을 때 말초혈 내 림프구 저하에 의해 측정된 바와 같은 독성 유발에 대하여 OvIFNτ를 IFN α 및 β와 비교하였다. 혈액은 꼬리로부터 얻었으며, 백혈구(WBC) 계수는 혈구계를 사용하여 계수하였다. 차동 WBC 계수는 라이트-김사(Wright-Giemsa) 염색 혈액 도말 표본으로 수행하였다.
결과는 표 1a, 1b 및 1c에 나타낸다. 독성의 유의적인 레벨은 IFNα 및 β 공급된 마우스에게서 검출된 반면에, 유의적인 림프구 저하는 105, 2 x 105 또는 5 x 105 U의 OvIFNτ 또는 PBS 단독을 공급한 마우스에게서는 검출되지 않았다. 이들 데이터는 경구 투여된 OvIFNτ가 다른 I형 IFN에 대하여 유의적으로 감소된 독성을 가진다는 것을 시사한다.
경구 급식 후 독성에 대한 IFNτ, β 및 α의 비교
IFN(투여량) 세포 계수(세포 수 x 103)
경구 급식 전
총 WBC 림프구
PBS 7.0 ± 1.4 6.1 ± 1.2
τ(105) 7.5 ± 0.7 6.4 ± 0.6
τ(2 x 105) 6.5 ± 0.7 5.3 ± 0.6
τ(5 x 105) 7.5 ± 0.7 6.5 ± 0.6
β(105) 7.0 ± 0.7 5.9 ± 1.2
β(2 x 105) 7.5 ± 2.1 6.5 ± 1.8
α(105) 7.5 ± 0.7 6.6 ± 0.6
경구 급식 후 독성에 대한 IFNτ, β 및 α의 비교
IFN(투여량) 세포 계수(세포 수 x 103)
경구 급식 18 시간 후
총 WBC 림프구 림프구 저하(%)
PBS - - -
τ(105) 7.0 ± 1.4 6.0 ± 1.3 6.2
τ(2 x 105) 7.0 ± 2.8 5.9 ± 2.4 0
τ(5 x 105) 7.5 ± 2.1 6.3 ± 1.8 3.1
β(105) 6.5 ± 0.7 5.1 ± 0.6 13.6
β(2 x 105) 6.5 ± 0.7 4.1 ± 0.4† 37.0
α(105) 6.5 ± 2.1 4.7 ± 1.6 28.8
†p < 0.05
경구 급식 후 독성에 대한 IFNτ, β 및 α의 비교
IFN(투여량) 세포 계수(세포 수 x 103)
경구 급식 24 시간 후
총 WBC 림프구 림프구 저하(%)
PBS 7.5 ± 0.7 6.4 ± 0.6 0
τ(105) 8.0 ± 2.8 6.9 ± 2.4 0
τ(2 x 105) 7.0 ± 1.4 6.0 ± 1.1 0
τ(5 x 105) 8.0 ± 4.2 7.0 ± 3.6 0
β(105) 6.5 ± 3.5 5.1 ± 2.8 13.6
β(2 x 105) 6.5 ± 0.7 4.0 ± 0.4† 38.5
α(105) 7.0 ± 0 5.0 ± 0‡ 24.2
†p < 0.05 ‡p < 0.03
d. OvIFNτ은 EAE의 만성 재발을 방지한다
EAE와 관련된 징후의개시를 방지하는 것 이외에, 경구 투여된 OvIFNτ는 실시예 7에서 설명된 바와 같은 EAE의 만성 재발 모델에서 마비를 방지한다. OvIFNτ 치료를 받지않은 MBP로 면역화된(EAE를 유발하기 위하여) 5/5 마우스는 만성 재발 마비가 전개된 반면에, OvIFNτ로 처치된(복강내 주사 또는 경구 급식, 48 시간마다 투여됨) 4/5 마우스는 이 질환으로부터 완전히 보호되었다(도 10b 및 10c). 이러한 데이터는 전수한 결과를 더 지지해주며, IFNτ의 경구 투여가 만성 재발 EAE의 발달을 차단할 수 있다는 것을 가리킨다. 또한, 연구는 장기간의 치료 기간에 걸쳐서 48시간에 1회 정도로 드물게 IFNτ를 경구 투여하는 것이 IFNτ에 의한 치료에 반응하는 질환 상태를 치료하에 있어서 복강내 주사만큼 효과적이라는 것을 시사한다.
e. IFNτ의 경구 투여 후 EAE 마우스로부터의 척수의 조직학적 분석
또한, EAE를 방지하는 OvIFNτ의 능력은 척수 백색 물질 내 림프구 병변으로서 중추신경계(CNS)에서 나타나는 질환의 세포질 결과에 대한 OvIFNτ의 효과를 분석함으로써 분석하였다. 병변은 CNS로의 림프구 침윤 정도의 지표이다. MBP 면역화된 마우스는 경구 또는 복강내 경로에 의하여 OvIFNτ로 처치되거나 처치되지 않았으며(대조군), 실시예 8에 기재된 바와 같이 척수 림프절 영역의 절개부를 염색하고, 림프구에 대하여 평가하였다. 조직 절개부의 현미경 사진은 도 11a 내지 도 11c에 도시한다. 림프구 병변은 대조 동물(도 11a)의 척수 백색 물질에 존재하였지만, 복강내 주사(도 11b) 또는 경구 급식(도 11c)에 의하여 OvIFNτ로 처치된 마우스에게서는 존재하지 않았다. 이러한 데이터는 IFNτ의 보호 효과가 CNS의 림프구 침윤의 억제와 관련있다는 것을 가리킨다. 또한, 데이터는 IFNτ 치료가 단순히 징후를 차단하는 것이 아니라 면역자가 질환의 세포질 발현을 억제한다는 것을 설명해준다.
f. OvIFNτ를 이용한 처치의 중단은 마비를 재발시킨다
실시예 10은 MBP로 주사된 마우스에게서 EAE를 예방하는 데 효과적인 치료 유형 및 기간을 결정하기 위하여 수행된 연구를 기술하며, 결과는 도 13에 나타낸다. 마우스는 지속된 치료만큼(실시예 10에서 58일) 복강내 주사 또는 경구 급식(48시간마다)을 통한 OvIFNτ치료에 의하여 EAE를 방지하였지만, OvIFNτ를 중지한 후 질환의 징후가 전개되었다(도 13). 이러한 결과는 IFNτ가 EAE와 같은 자가면역 상태(예컨대, MS)를 치료할 수 없지만, 치료가 계속되는 만큼 상태의 병리학적 발현을 억제한다는 것을 시사한다.
g. OvIFNτ의 경구 투여는 항OvIFNτ 항체 반응을 감소시킨다
실시예 11에 설명된 바와 같이, 경구 투여된(주사와는 반대로) IFNτ 치료의 한 가지 이점은 경구 치료를 수용한 개체에게서의 항IFNτ 항체 역가 감소이다. OvIFNτ 치료의 제거 후, 각각의 처치군으로부터의 마우스에게서 채혈하고, 혈청을 ELISA에 의하여 항OvIFNτ 항체의 존재에 대하여 조사하였다. 복강내 주사에 의하여 IFNτ를 수용한 마우스가 항IFNτ 항체의 고 레벨을 나타낸 반면에, 경구 급식에 의하여 IFNτ를 수용한 동물은 훨씬 더 낮은 항IFNτ 항체 역가(통상적으로 3 내지 4 배 낮은)를 나타내었다. 예상대로, OvIFNτ 처치를 받지 않은 마우스는 항OvIFNτ 항체를 나타내지 않았다.
또한, 혈청은 MDBK 세포주에 대한 OvIFNτ 항바이러스 활성을 중화시키는 능력에 대하여 조사하였다. 복강내 주사 또는 경구 급식된 마우스로부터의 혈청 중 어느 것도 중화 활성을 갖지 않았다(표 7). 이러한 결과는 OvIFNτ의 경구 급식이 OvIFNτ 단백질에 대한 항체 반응을 크게 회피한다는 것을 시사한다. 경구 처치된 피험자에게서의 그러한 감소된 항체 반응은 IFNτ 치료의 바람직하지 않은 면역계 관련 부작용의 기회를 줄인다.
III. 사용 방법
제1 양태에서, 본 발명은 사람 피험자에게서 인터페론 요법에 반응하는 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다. "인터페론 요법에 반응하는" 상태는 상태의 존재, 전파 또는 징후가 인터페론, 특히 I형 인터페론, 보다 구체적으로는 인터페론-타우의 투여시 변경되는 것이다. 또한, IFNα 또는 IFNβ를 이용한 치료에 반응하는 상태도 IFNτ를 이용한 치료에 반응할 수 있다. 보다 바람직하게는, 인터페론 요법에 반응하는 상태는 상태의 존재, 전파 또는 징후가 비경구 경로, 예컨대 주사로 투여된 IFNτ에 의해 경감되는 것이다. 본 명세서에 기재된 방법은 위 및/또는 장 투여를 위하여, 피험자의 혈중 OAS 레벨 증가에 의해 입증되는 바와 같이 치료에 효과적인 양으로, 경구 투여 가능한 제형으로 IFNτ를 제공하는 단계를 포함한다.
IFNτ는 항바이러스 제제, 항증식 제제로서, 그리고 자가면역 장해의 치료에서 생물학적 활성을 가진다(예를 들면, 본 명세서에서 참고 인용하는 미국 특허 제5,958,402호; 제5,942,223호; 제6,060,450호; 제6,372,206호 참조). 따라서, 본 발명은 주사에 의해 투여되었을 때 IFN-τ에 반응하는 임의의 상태의 치료를위한 IFNτ의 경구 투여를 도모한다. 본 발명의 방법을 사용하여 치료할 수 있는 상태 및 질환으로는 자가면역, 염증, 증식성 및 과다증식성 질환, 뿐만 아니라 면역학적으로 매개된 질환이 있다.
A. 면역계 장해의 치료
본 발명의 방법은 면역계 과민증에 관련된 상태를 치료하는 데 유리하다. 면역계 과민증에는 네 가지의 유형이 있다(Clayman, C.B., Ed., AMERICAN MEDICAL ASSOCIATION ENCYCLOPEDIA OF MEDICINE, Random House, New York, N.Y., (1991)). I형 또는 즉시/아나필락시스 과민증으로는 알레르겐(예컨대, 화분)에 반응하는 비만세포 탈과립에 기인하며, 천식, 알레르기성 비염(건초열), 팽진(두드러기), 아나필락시스 쇽 및 다른 알레르기성 성질의 질환이 있다. II형 또는 자가면역 과민증은 항체 자신의 세포에 대하여 인식된 "항원"에 대한 항체에 기인한다. III형 과민증은 다양한 조직에 머무르고, 다른 면역 반응을 활성화시키는 항원/항체 면역 복합체의 형성에 기인하며, 혈청병, 알레르기성 폐포염 및 추가 백신 후 간혹 형성되는 대형 종창에 원인이 된다. IV형 과민증은 감작된 T 세포로부터의 림포킨의 방출에 기인하며, 염증성 반응을 초래한다. 그 예로는 접촉성 피부염, 홍역의 발진 및 특정한 약물에 대한 "알레르기성" 반응이다.
특정 조건이 일부 개체의 과민성을 초래할 수 있는 메커니즘은 대체로 잘 이해되지 않지만, 유전적 및 외생 인자를 수반할 수 있다. 예를 들면, 박테리아, 바이러스 또는 약물은 이미 자가면역 장해에 대한 유전적 소질을 가진 개체에게서 자가면역 반응을 유발하는 역할을 할 수 있다. 일부 유형의 과민증 유발은 상호 관련될 수 있는 것으로 시사되고 있다. 예를 들면, 통상의 알레르기를 가진 개체가 자가면역 장해에 보다 더 민감할 수 있는 것으로 제시되어 있다.
자가 면역 장해는 특정한 기관 또는 조직에 주로 국한되어 있는 것과 전신에 영향을 주는 것으로 대충 분류할 수 있다. 기관 특이적인 장해(기관에 영향을 주는)의 예로는 다발성 경화증(미엘린 코팅 온 신경 과정), I형 진성 당뇨병)(췌장), 하시모토 갑상선염(갑상선), 중증 근무력증(신경근육 접합부), 류마티스양 관절염(관절 내층), 포도막염(눈), 건선(피부), 귈랑-바레 증후군(신경 세포) 및 그라베병(갑상선)이 있다. 전신 자가면역 질환으로는 전신 홍반 루푸스 및 피부근육염이 있다.
과민성 장해의 다른 예로는 천식, 습진, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 다른 습진성 피부염, 지루성 피부염, 비염, 편평태선, 펨플루구스(Pemplugus), 수포성 펨플루구스, 수포성 표피박리증, 맥관부종, 우리트카리스(uritcaris), 혈관염, 홍반, 피부 호산구증가증, 원형탈모증, 아테롬성 동맥경화증, 1차 담관성 간경화증 및 신장 증후군이 있다. 관련 질환으로는 장 염증, 예컨대 소아지방변증, 직장염, 호산구증가 위장염, 비만세포증, 염증성 장염, 크론병 및 궤양성 대장염, 뿐만 아니라 음식 관련 알레르기가 있다.
본 발명의 방법을 사용하는 치료에 특히 수정할 수 있는 자가면역 질환으로는 다발성 경화증, I형(인슐린 의존성) 진성 당뇨병, 홍반 루푸스, 근위축성 측삭 경화증, 크론병, 류마티스양 관절염, 위염, 천식, 포도막염, 알레르기 및 건선이 있다.
본 발명의 방법은 치료학적으로 처치하고, 이에 의하여 상기 논의된 것과 같은 자가면역 장해를 경감시키는 데 사용된다. 자가면역 장해의 처치는 다발성 경화증에 대한 동물 모델인 EAE에 관하여 본 명세서에서 예를 들고 있다. 자가면역 장해를 치료하는 데 사용될 경우, IFNτ는 IFNτ 투여의 초기 단계(들) 동안 측정 가능한 OAS 증가를 달성하는 데 충분한 양으로 투여된다. 소정의 유효량이 달성되면, 환자는 더 이상의 OAS 혈중 레벨 변화에 독립적으로, 효과적인 IFNτ 투여량으로 장기간에 걸쳐서 치료된다. 치료 기간은 적어도 환자가 징후를 나타내는 시간에 걸쳐서 연장된다. 자가면역 상태와 관련된 징후의 중지시, 투여량을 하향 조절할 수 있거나, 또는 치료를 중단할 수 있다. 환자는 IFNτ 치료 기간 중에 다른 약제, 예컨대 공지된 항염증제 또는 면역억제제와 병용 치료될 수 있다.
B. 바이러스 감염의 치료
또한, 본 발명의 방법은 바이러스 감염과 관련된 상태를 치료하는 데 사용된다. IFNτ의 항바이러스 활성은 IFNα와 대체로 관련있는 독성 효과없이 넓은 치료 용도를 가지며, INFτ는 세포에 대한 부작용없이 치료 활성을 발휘한다. IFNτ의 독성의 상대적 결핍은 이것이 생체내 치료제로서 매우 가치있게 하는 것이며, 대부분의 공지된 항바이러스제 및 다른 모든 공지된 인터페론과는 구별되는 것이다.
IFNτ를 함유하는 제제는 바이러스 복제를 억제하기 위하여 경구 투여될 수 있다. 바이러스 감염을 치료하는 데 사용되는 경우, 이 단백질은 환자에게서 측정 가능한 혈중 OAS 증가를 달성하는 데 효과적인 투여량으로 투여된다. 그 후, 치료는 추가적인 혈중 OAS 레벨 변화, 예를 들면 바이러스 로드 감소로 인한 OAS 혈중 레벨 강하와는 독립적으로, 유효 투여량으로 계속된다. IFNτ의 투여는, 예를 들면 혈중 바이러스 역가로부터 또는 바이러스 감염과 관련된 징후의 임상 관찰로부터 측정하였을 때 바이러스 감염의 레벨이 감소될 때까지 계속된다. 경구 투여된 IFNτ에 의하여 치료될 수 있는 특정 바이러스 질환의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 비A 비B 비C형 간염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, HIV 감염, 포진 바이러스(EB, CML, 단순 포진), 유두종, 수두, 피코르나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, HTLV I, HTLV II 및 사람 로타바이러스가 있다. 환자는 치료 기간 중에 뉴클레오시드 유사체, 안티센스 제제 등으로서 제2 항바이러스제와 병용 치료될 수 있다.
C. 세포 증식의 상태 치료 방법
다른 구체예에서, 본 발명의 방법은 과다증식을 특징으로 하는 상태의 치료에 고려된다. IFNτ는 강력한 항세포 증식 활성을 나타낸다. 따라서, IFNτ를 경구 투여함으로써 세포 성장을 억제하는 방법이 비조절된 세포 성장을 억제, 예방 또는 지체시키기 위하여 고려된다.
경구 투여된 IFNτ에 의하여 치료될 수 있는 특정한 세포 증식의 예로는, 한정하는 것은 아니지만, 모양(毛樣) 세포성 백혈병, 카포시 육종, 만성 골수 백혈병, 다발성 골수종, 표재 방광암, 피부암(기저 세포 육종 및 악성 흑색종), 신장 세포 육종, 난소암, 저급 림프구 및 피부 T 세포 림프종 및 신경아교종이 있다.
세포 증식 조건을 치료하는 데 사용되는 경우, IFNτ는 환자에게 초기 측정 가능한 혈중 OAS 증가를 달성하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 그 후, 치료는 추가적인 혈중 OAS 레벨 변화, 예를 들면 체내 암 세포 감소로 인한 OAS 혈중 레벨 강하와는 독립적으로, 유효 투여량으로 계속된다. IFNτ의 투여는, 예를 들면 특정 조직 내 암 세포의 종양 크기 또는 종양에 의하여 측정되는 바와 같이, 소정의 퇴화 레벨이 관찰될 때까지 계속된다. 환자는 치료 기간 중에 제2 항암제, 예컨대 시스플라틴, 독소루비신 또는 탁솔과 병용 치료될 수 있다.
D. 제형 및 투여량
IFNτ를 함유하는 경구 제제는 약학 조성물의 공지된 제조 방법에 따라 조제될 수 있다. 일반적으로, IFNτ 치료 조성물은 IFNτ의 유효량이 적당한 첨가제, 담체 및/또는 부형제와 조합하여 조성물의 효과적인 경구 투여를 촉진하도록 조제된다. 예를 들면, IFNτ를 함유하는 정제 및 캡슐은 IFNτ(예컨대, 동결건조된 IFNτ 단백질)을 약학적으로 허용 가능한 담체(예컨대, 락토스, 옥수수 전분, 미정질 셀룰로스, 수크로스), 결합제(예컨대, 알파형 전분, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈), 붕괴제(예컨대, 카르복시메틸셀룰로스 칼슘, 전분, 저치환 히드록시프로필셀룰로스), 계면활성제(예컨대, 트윈 80, 폴리옥시에틸렌-폴리프로필렌 공중합체), 항산화제(예컨대, L-시스테인, 아황산나트륨, 아스코르브산나트륨), 윤활제(예컨대, 스테아르산마그네슘, 탤크) 등과 같은 첨가제와 조합함으로써 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 IFNτ 폴리펩티드는 고체, 분쇄물 또는 다른 담체, 예를 들면 락토스, 사카로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 예컨대 감자 전분, 옥수수 전분, 밀로펙틴, 셀룰로스 유도체 또는 젤라틴, 또는 정제 형성을 위해 압축된 폴리에틸렌 글리콜 왁스와 혼합할 수 있다. 담체 또는 희석제의 몇 개의 층을 사용함으로써, 서방형으로 작동하는 정제를 제조할 수 있다.
경구 투여용 액상 제제는 엘릭서, 시럽 또는 현탁액의 형태, 예를 들면 IFNτ 약 0.1 중량% 내지 약 30 중량%, 당 및 에탄올, 물, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜 및 통상의 성질을 가진 가능한 다른 첨가제의 혼합물을 함유하는 용액으로 제조할 수 있다.
다른 적당한 제형은 장 점막에 의해 흡수될 때까지 위 및 장에서 생존을 위하여 단백질을 포함하는 보호 제형이다. 단백질에 대한 보호 제형은 당업계에 공지되어 있으며, 장용 코팅 및/또는 점막점착성 중합체 코팅을 포함한다. 예시적인 점막점착성 중합체 제형으로는 에틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스, Eudragil®, 카르복시비닐 중합체, 카보머 등이 있다. 활성 형태로 IFNτ를 장관, 특히 소장으로 전달하기 위하여 섭취에 의해 위로 투여하도록 설계된 제형이 고려된다. 대안으로, IFNτ는 프로테아제 억제제와 병용 투여되고, 중합성 재료로 안정화되거나, 지질 또는 중합체 입자로 캡슐화되어 위 및/또는 장 환경으로부터 보호를 제공할 수 있다.
경구 활성 IFNτ 약학 조성물은 치료가 필요한 개체에 치료학적 유효량으로 투여된다. 투여량은 상당히 다를 수 있으며, 장해의 중증도, 환자의 연령 및 체중, 환자가 섭취하고 있을 수 있는 다른 약제 등과 같은 인자에 따른다. 통상적으로, 이 양 또는 투여량은 약 1 x 104 내지 1 x 1010 유닛/일이고, 보다 바람직하게는 약 5 x 108 단위/일 이상이며, 바람직하게는 약 1 x 109 단위/일 이상이다.
혈장 중의 안정된 고레벨의 IFNτ를 요하는 장해는 약 2 내지 4 시간 간격으로 정도로 자주 투여하는 것이 유리한 반면에, 다발성 경화증과 같은 다른 장해는 덜 빈번한 간격으로, 예를 들면 1일 1회 또는 매 48 시간 1회 투여하므로써 효과적으로 치료될 수 있다. 통상적으로, 개별 투여량의 투여 속도는 담당의에 의하여 최저 총 투여량을 투여하면서 치료하고자 하는 질환의 중증도를 경감하도록 조절한다. 상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 방법은 치료가 필요한 환자에게 제1 투여량으로 IFNτ를 경구 투여하고, 제1 투여량 레벨에 대한 개별 환자 반응을 결정하기 위하여 생물학적 마커를 모니터하는 것을 고려한다. 모니터링은 채혈 및, 예를 들면 방사성면역분석 키트를 사용하는 마커, 예컨대 혈중 OAS 효소의 분석에 의하여 용이하게 수행될 수 있다. 또한, 모니터링은 채혈 및 세포 내, 예컨대 혈중 백혈구 내 OAS의 mRNA 발현 분석에 의하여 수행될 수 있다. 따라서, 다른 양태에서, 본 발명은 IFNτ에 반응하는 상태를 가진 사람을 치료하는 데 사용하기 위한 키트를 고려한다. 키트는 IFNτ의 경구 투여용으로 설계된 하나 이상의 제형 유닛을 함유하는 용기로 구성된 제1 부재 및 IFNτ의 생마커를 모니터하는 데 요구되는 성분, 예컨대 혈중 OAS 효소 또는 mRNA 레벨을 분석하는 데 필요한 성분으로 구성된 제2 부재를 포함한다.
환자의 상태 개선이 일어나면, 유지 투여량을 필요에 따라 투여한다. 그 후, 투여의 투여량 또는 빈도, 또는 둘 다를 징후의 함수로서 개선된 상태가 유지되는 레벨로 감소시킬 수 있다.
물론, 본 발명에 따른 IFNτ의 경구 투여는 다른 요법과 조합하여 사용될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를 들면, IFNτ는 면역 반응이 지정되는 항원의 투여에 의해 수행될 수 있다. 그 예로는 다발성 경화증을 치료하기 위한 미엘린계 단백질과 IFNτ; 류마티스양 관절염을 치료하기 위한 콜라겐과 IFNτ; 및 중증 근무력증을 치료하기 위한 아세틸콜린 수용체 폴리펩티드와 IFNτ의 병용 투여가 있다.
또한, IFNτ는 공지의 면역억제제, 예컨대 스테로이드와 함께 경구 투여되어 다발성 경화증과 같은 자가면역 질환을 치료할 수 있다. 면역억제제는 IFNτ와 상승작용하여 IFNτ 또는 면역억제제 단독의 등량의 투여량으로 얻어질 수 있는 것보다 효과적으로 치료할 수 있다.
유사하게, 암 또는 바이러스 질환에 대한 치료에서, IFNτ는, 예를 들면 하나 이상의 화학요법제, 예컨대 부술판, 5-플루오로우라실(5-FU), 지도부딘(AZT), 루코보린, 멜팔ㄹ란, 프레드니손, 시클로포스파미드, 다카르바진, 시스플라틴, 디피리다몰 등의 치료학적 유효량과 함께 투여될 수 있다.
IV. 실시예
하기 실시예는 본 명세서에 기재된 발명을 더 설명하는 것이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것은 결코 아니다.
물질 및 방법
A. IFNτ의 생성
한 구체예에서, 합성 IFNτ 유전자는 IFNτ 아미노산 서열을 코드화하는 DNA 서열의 인접 부분을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 결찰함으로써 표준 분자 방법(Ausubel, et al., 1988)을 사용하여 생성하였다. 사용된 DNA 서열은 서열 번호 1 또는 4 또는 문헌(Imakawa, et al., 1987)에 나타나 있는 바와 같은 서열일 수 있다. 생성된 IFNτ 폴리뉴클레오티드 코드화 서열은 16번 내지 531번 위치에 이를 수 있으며, 172 개의 아미노산으로 된 코드화 서열이다.
한 구체예에서, 전체 길이 합성 유전자 StuI/SStl 단편(540 bp)을 변성 pIN III omp-A 발현 벡터에 클로닝하고, 대장균(E. coli)의 항체 반응 능력이 있는(competent) SB221 균주로 형질전환시킬 수 있다. IFNτ 단백질의 발현을 위하여, 발헨 벡터를 담지하는 세포를, 암피실린을 함유하는 L-브로스에서 0.1 내지 1 의 OD(550 nm)로 성장시키고, 3 시간 동안 IPTG(이소프로필-1-티오-b-D-갈락토시드)로 유도하였으며, 원심분리에 의하여 수거하였다. 가용성 재조합 IFNτ는 초음파 또는 삼투 분별에 의하여 세포로부터 유리시킬 수 있다.
효모 내 발현의 경우, IFN-τ 유전자는 각각 5' 및 3' 단부에서 Stul 및 Sacl 제한 부위를 함유하는 프라이머로 PCR 프라이머폴리머라제 연쇄 반응(PCR; Mullis, K.B., 미국 특허 제4,683,202호, 1987년 7월 28일 특허됨; Mullis, K.B., et al., 미국 특허 제4,683,195호, 1987년 7월 28일 특허됨)을 사용하여 증폭시킬 수 있다. 증폭된 단편은 Stul 및 Sacil로 분해하고, pBLUESCRIPT+(KS)DML Sacll 및 Smal 부위로 결찰하여 pBSY-IFNτ를 생성하였다. 플라스미드 pBSY-IFNτ를 Sacll 및 EcoRV로 분해하고, 합성 IFNτ를 함유하는 단편을 분리하였다. 효모 발현 벡터 pBS24Ub(Ecker, D.J., et al., J. Biol. Chem. 264: 7715-7719 (1989))를 Sall로 분해하였다. 블런트 단부는 T4 DNA 폴리머라제를 사용하여 생성하였다. 벡터 DNA를 페놀로 추출하였으며, 에탄올이 침전되었다(Sambrook, J., et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). 회수된 플라스미드는 Sacll로 분해하고, 아가로스 겔 전기영동에 의하여 정제하였으며, pBSY-IFN-τ로부터 분리된 Sacll-EcoRV에 결찰하였다. 생성된 재조합 플라스미드를 pBS24Ub-IFNτ로 분해하였다.
재조합 플라스미드 pBS24Ub-lFNτ를 대장균으로 형질전환하였다. IFNτ 삽입물을 함유하는 재조합 클론을 분리하고, 제한 효소 분해에 의해 동정하였다. IFN-τ 코드화 서열을 pBS24Ub-IFNτ로부터 분리하고, 알콜 옥시다제(AOX1) 프로모터를 함유하는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 벡터(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로 클로닝하였다. 그 다음, 벡터를 사용하여 피키아 파스토리스 GS115 His- 숙주 세포를 형질전환시키고, 단백질을 제조자의 지시에 따라서 발현시켰다. 단백질을 배지로 분비시키고, 연속 DEAE-셀룰로스 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의하여, SDS-PAGE 및 은 염색에 의해 결정되는 바와 같은 전기영동 균질도로 정제하였다.
B. 특이적 항바이러스 활성을 결정하기 위한 항바이러스 분석
항바이러스 활성은 표준 세포변성 효과 분석을 사용하여 평가하였다(Familletti, P.C., et al., Methods in Enzymology, 78: 387-394 (1981); Rubinstein, S. et al., J. Virol., 37: 755-758(1981)). 간단히 말하면, IFNτ의 희석물을 매딘-다비 소 신장(MDBK) 세포로 16 내지 18 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 바이러스 복제의 억제를, 챌린지로서 소포성 구내염 바이러스를 사용하여 세포변성 효과 분석에서 측정하였다. 1 항바이러스 유닛(U)은 단층의 50% 파괴 감소를 야기하였다. 본 명세서에 기재된 대부분의 연구의 경우, IFNτ는 약 4.9 x 108 항바이러스 U/mg 단백질의 특이적 활성을 가졌다.
실시예 1
마우스로 경구 및 복강내 투여된 양 IFN-τ를 이용한 OAS의 유도
IFNτ(4.99 x 108 유닛/mg 단백질; Pepgen Corp., 미국 캘리포니아주 소재, 또는 Biological Process Development Facility, Dept. of Food Science and Technology, University of NE-Lincoln, 미국 뉴잉글랜드 링컨 소재; 서열 번호 4)을 10% 말토스 용액에 용해시켜서 IFNτ 용액을 제조하였다. 또한, IFNτ(서열 번호 2)도 본 발명에서 고려된다. IFNτ 200 ㎖를, 20 게이지 1회용 경구 소식자(Fuchigami, 일본 교토 소재)를 사용하여 ICR 마우스(평균 체중 대략 30 g, 6 주령, 암컷)에게 경구 투여하여 위장의 상부로 직접 주사하였다(위 투여; GA).
복강내 투여(i.p.)의 경우, IFNτ 용액 100 ㎖를 사용하였다. 위 상부로의 샘플 주사는 염료의 투여에 의하여 확인하였다. 투여 24 시간 후, 마우스를 넴부탈로 마취시켰다. 혈액을 마우스의 심장으로부터 취하고, 전혈 내 OAS 활성을 2-5A RIA 키트(Eiken Chemical, 일본 교토 소재; Shindo, M. et al., Hepatology, 9: 715-719 (1989))에 의하여 결정하였다.
결과는 도 1에 나타낸다.
실시예 2
마우스 내 IFN-τ의 경구 투여에 의한 OAS의 투여량 의존성 유도
실시예 1과 동일한 절차를 사용하여, IFNτ를 0, 103, 104 또는 105의 유닛으로 ICR 마우스에게 경구 투여하였다. 경구 투여 24 시간 후, 전혈을 마우스 심장으로부터 취하고, 전혈의 OAS 활성을 결정하였다. 결과는 도 2에 나타낸다.
실시예 3
IFNτ의 마우스로의 투여
ICR, BALB/c, C57BL/9, NZW/N 및 SJL/J 변종의 병변이 없는 5 주령 암컷 마 우스를 일본 하마마츠 소재의 Japan SLC. Inc.로부터 구입하였다. 마우스를 실험 전에 실험실에서 1 주 사육하였다.
본 명세서에서 서열 번호 3으로 동정한 서열을 가진 재조합 양 IFN-τ(IFN-τ)를 얻었다(Pepgen Corporation, 미국 캘리포니아주 알라메다 소재). 이 연구에서 사용된 제법은 VSV로 챌린지하고, 사람 IFN-α에 대하여 표준화한 MDBK 세포에서 분석하 바와 같이 비활성이 5 x 108 유닛(U)/mg 단백질이었다. 천연 쥐 IFN-α(MulFN-α)를 Sumitomo Pharmaceutical Co.(일본 오사카 소재)에서 입수하였는데, 그 비활성은 1 x 108 국제 유닛(IU)/mg 단백질이었다.
마우스에게 투여한 경우, IFN-τ를 10% 말토스를 함유하는 용액에 용해시켰다. 0.2 ㎖의 샘플을 경구(p.o.) 처치 또는 복강내(i.p.) 주사에 의하여 마우스(6 주령 암컷)에게 투여하였다. 경구 제공한 경우, 샘플은 20 게이지 경구 공급 바늘을 사용하여 위 상부로 직접 도입하였다. 투여 전에, 마우스를 오후 1시부터 오후 7시까지 6 시간 동안 음식과 음료를 제공하지 않았다. 절식 후, IFNτ를 경구 또는 복강내 경로에 의하여 투여하고, 6 시간째에 음식과 음료를 제공하였다. 그 다음, 전혈을 24 시간째에 심장으로부터 얻었다.
전혈 내 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 활성을 Eiken사의 2-5A RIA 키트로 분석하였다. 희석된 혈액을 폴리:C-아가로스 겔과 혼합하고, 겔 세척 후에 ATP를 가하였으며, 생성된 2-5A를 RIA법에 의하여 분석하였다(Shindo, M. et al., Hepatology, 9: 715-719 (1989)). 분석은 각 샘플에서 2회 수행하였다. 혈중 OAS 레벨의 평가를 위하여, 3 마리 이상의 마우스를 사용하였다.
실시예 4
사람 환자에게 IFN-τ의 경구 투여에 의한 감소된 ALT, 감소된 HCV 바이러스 역가 및 OAS의 유도
A. IFN-τ 제조
제1일에, IFNτ(서열 번호 4) 1 병을 냉장고에서 꺼내고, 환자가 표 2에 따라서 테스트 물질의 적당한 부피를 자가 투여하였다. IFNτ(서열 번호 2)도 제조하였으며, 동일한 방식으로 투여하였다.
재조합 Ov-IFN-τ 환자 투약군 투여
투약군 환자의 수 Ov-IFN-τ 투약 당 부피(㎖) 1일3회 전체 1일 투여량(mg)
I 6 1.0 0.33 1.0
II 6 1.0 1.0 3.0
III 6 1.0 3.0 9.0
IV 6 1.0 5.0 15.0
B. 환자 투약 설명
테스트 물질의 모든 바이알 및 주사기를 2 내지 8℃로 유지된 냉장고에 보관하였다. 약물의 자가투여 전에, 환자는 냉장고에서 한 개의 바이알과 한 개의 주사기를 꺼냈다. 캡을 주사기 끝에서 제거하고, 주사기의 끝을 약물 병에 넣어 제1일에 클리닉에서 지시한 대로 적당한 부피를 주사기로 뽑아내었다.
주사기의 끝을 입에 넣고, 주사기 내용물을 플런저를 누름으로써 입으로 비웠다. 필요에 따라서 환자는 물 한잔을 마시게 하였다. 환자는 그의 일기 카드에 테스트 물질의 투여량이 투여된 날짜와 시간을 기록하였다.
상기 단계를 대략 8 시간 간격으로 아침에 한번, 점심에 한번 및 저녁에 한번, 1일 3회 반복하였다.
C. 결과
혈액 샘플을 169일 테스트 기간에 걸쳐서 소정 간격으로 취하였다. 샘플을 혈청 및 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 레벨에 대하여 2-5A RIA 키트(Eiken Chemical, 일본 도쿄 소재)를 사용하여 분석하였다. 희석된 혈액을 폴리:C-아가로스 겔과 혼합하고, ATP를 겔 세척 후에 가하였으며, 생성된 2-5A를 RIA법(Shindo, M. et al., Hepatology, 9: 715-719 (1989))에 의하여 분석하였다. 분석은 각각의 샘플에 대하여 2회 수행하였다. 역전사 효소 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 C형 간염의 바이러스 역가를 측정하고, 아라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)의 혈청 농도도 측정하였다.
각각의 피험자에 대한 결과는 하기 표 3 내지 5에 나타내며, 도 7 및 도 8에 도시하였다. 양 IFN-τ 경구 투여 후 OAS 레벨 증가와, ALT 및 바이러스 역가 레벨 감소를 관찰하였다.
투약군 1의 3 명의 환자의 바이러스 역가, ALT 및 2-5A 레벨 (0.33 mg IFNτ 1일 3회)
환자 이니셜/# 시점 HCV RT-PCR ALT (IU/L) 혈청 OAS pmol/dL
PAB/001 스크린 790,000 64 12.46
PAB/001 제1일 290,000 63 10.00
PAB/001 제2일 - - 10.00
PAB/001 제3일 1,700,000 57 5.00
PAB/001 제8일 530,000 56 5.00
PAB/001 제15일 580,000 61 -
PAB/001 제22일 13,000 66 2.50
PAB/001 제29일 230,000 40 10.00
PAB/001 제43일 - 42 7.50
PAB/001 제57일 640,000 37 16.67
PAB/001 제71일 - - 12.46
PAB/001 제85일 960,000 50 13.86
PAB/001 제113일 160,000 53 0.00
MSM/002 스크린 4,600,000 258 11.50
MSM/002 제1일 5,100,000 164 16.67
MSM/002 제2일/24시간 - - 10.00
MSM/002 제3일 6,300,000 154 29.30
MSM/002 제8일 5,100,000 133 33.08
MSM/002 제15일 9,100,000 100 54.62
MSM/002 제22일 - 103 51.54
MSM/002 제29일 8,600,000 91 28.60
MSM/002 제43일 - 86 12.46
MSM/002 제57일 3,400,000 82 18.77
MSM/002 제71일 - - 36.15
MSM/002 제85일 3,700,000 49 26.14
MSM/002 제113일 3,800,000 64 42.31
DMA/003 스크린 780,000 115 28.60
DMA/003 제1일 990,000 115 26.14
DMA/003 제3일 660,000 121 30.00
DMA/003 제8일 9200,000 105 36.15
DMA/003 제15일 580,000 107 26.14
DMA/003 제22일 - 105 27.74
DMA/003 제29일 170,000 97 27.54
DMA/003 제43일 - 85 23.33
DMA/003 제57일 650,000 74 59.23
DMA/003 제71일 - - 36.15
DMA/003 제85일 11,000 49 16.00
DMA/003 제107일 880,000 45 -
DMA/003 제115일 50,000 55 20.24
DMA/003 - 460,000 47 -
투약군 1의 3 명의 환자의 바이러스 역가, ALT 및 2-5A 레벨 (0.33 mg IFNτ 1일 3회)
환자 이니셜/# 시점 HCV RT-PCR ALT (IU/L) 혈청 OAS pmol/dL
LER/004 스크린 6,100,000 118 33.95
LER/004 제1일 6,000,000 108 33.95
LER/004 제3일 11,000,000 120 53.68
LER/004 제8일 1,900,000 109 29.51
LER/004 제15일 3,400,000 120 41.84
LER/004 제22일 - 94 34.74
LER/004 제29일 640,000 109 43.42
LER/004 제43일 - 99 49.74
LER/004 제57일 4,400,000 106 37.89
LER/004 제71일 - - 81.00
LER/004 제85일 3,900,000 67 3.20
LER/004 제113일 3,200,000 107 -
Z-I/005 스크린 3,400,000 151 43.42
Z-I/005 제1일 4,600,000 134 43.42
Z-I/005 제2일 - 144 45.00
Z-I/005 제3일 1,400,000 109 46.58
Z-I/005 제8일 4,000,000 94 12.93
Z-I/005 제15일 1,100,000 107 48.95
Z-I/005 제22일 - 107 47.37
Z-I/005 제29일 2,200,000 144 74.82
Z-I/005 제43일 - 111 26.10
Z-I/005 제57일 4,400,000 122 43.42
Z-I/005 제71일 - - 10.00
Z-I/005 제85일 1,100,000 122 17.80
Z-I/005 제113일 3,200,000 132 -
JRJ/006 스크린 21,000,000 111 52.11
JRJ/006 제1일 8,500,000 104 21.90
JRJ/006 제3일 6,000,000 98 26.53
JRJ/006 제8일 950,000 124 24.21
JRJ/006 제15일 3,700,000 118 19.09
JRJ/006 제22일 - 109 22.07
JRJ/006 제29일 3,300,000 93 19.75
JRJ/006 제43일 - 122 24.88
JRJ/006 제57일 7,000,000 78 35.62
JRJ/006 제71일 - - 52.92
JRJ/006 제85일 5,000,000 88 42.92
JRJ/006 제113일 >5,000,000 - -
투약군 2의 3 명의 환자의 바이러스 역가, ALT 및 2-5A 레벨 (1 mg IFNτ 1일 3회)
환자 이니셜/# 시점 HCV RT-PCR ALT (IU/L) 혈청 OAS pmol/dL
AMC/007 스크린 1,700,000 44 11.20
AMC/007 제1일 1,300,000 48 18.40
AMC/007 제3일 810,000 44 27.60
AMC/007 제8일 630,000 50 42.40
AMC/007 제15일 290,000 54 50.67
AMC/007 제22일 - 53 94.50
AMC/007 제29일 410,000 36 120.00
AMC/007 제43일 - 29 81.33
AMC/007 제57일 930,000 36 55.33
AMC/007 제71일 - - 51.33
AMC/007 제85일 - -
AMC/007 제113일 - -
AMC/007 제169일 - -
ALW/008 스크린 30,000,000 47 53.33
ALW/008 제1일 3,000,000 38 10.00
ALW/008 제3일 3,200,000 42 42.00
ALW/008 제8일 5,400,000 31 14.40
ALW/008 제15일 17,000,000 29 10.00
ALW/008 제22일 - 27 10.40
ALW/008 제29일 11,000,000 25 10.00
ALW/008 제43일 - 40 14.40
ALW/008 제57일 18,000,000 31 12.80
ALW/008 제71일 - - 16.40
ALW/008 제85일 - - -
ALW/008 제113일 - - -
ALW/008 제169일 - - -
DBF/012 스크린 5,300,000 84 28.80
DBF/012 제1일 9,300,000 77 26.00
DBF/012 제3일 9,400,000 71 10.00
DBF/012 제8일 7,900,000 86 53.33
DBF/012 제15일 9,100,000 67 108.00
DBF/012 제22일 - 64 42.67
DBF/012 제29일 9,900,000 58 52.00
DBF/012 제43일 - 61 58.00
DBF/012 제57일 15,000,000 70 61.33
DBF/012 제71일 - - 168.00
DBF/012 제85일 - - -
DBF/012 제113일 - - -
DBF/012 제169일 - - -
투약군 3의 3 명의 환자의 바이러스 역가, ALT 및 2-5A 레벨 (3 mg IFNτ 1일 3회)
환자 이니셜/# 시점 HCV RT-PCR ALT (IU/L) 혈청 OAS pmol/dL PBMC OAS pmol/5 x106 PBMC/㎖
VCC/009 스크린 5,100,000 113 17.20 -
VCC/009 제1일 4,300,000 128 58.67 286.88
VCC/009 제2일 - - 10.00 -
VCC/009 제3일 3,500,000 126 18.40 218.57
VCC/009 제8일 1,600,000 130 24.80 -
VCC/009 제15일 2,200,000 118 25.20 624.38
VCC/009 제22일 - 99 18.00 -
VCC/009 제29일 1,500,000 93 30.67 1261.43
VCC/009 제43일 - 72 15.20 -
VCC/009 제57일 2,700,000 62 10.00 -
VCC/009 제71일 - - 18.40 -
VCC/009 제85일 - - - -
VCC/009 제113일 - - - -
VCC/009 제169일 - - - -
HCM/010 스크린 3,00,000 60 28.84 -
HCM/010 제1일 5,000,000 47 12.31 998.1
HCM/010 제2일/24시간 - - - -
HCM/010 제3일 5,100,000 52 22.56 1336.67
HCM/010 제8일 5,100,000 50 18.6 -
HCM/010 제15일 5,300,000 49 30 1336.67
HCM/010 제22일 - 49 47.08 -
HCM/010 제29일 3,000,000 57 50 1524.76
HCM/010 제43일 - 45 246 -
HCM/010 제57일 4,300,000 59 16.67 -
HCM/010 제71일 - - 15.26 -
HCM/010 제85일 - - - -
HCM/010 제113일 - - - -
HCM/010 제169일 - - -
HCM/010 스크린 12,000,000 58 10.00 -
CLR/011 제1일 19,000,000 66 30.00 960.48
CLR/011 제3일 28,000,000 55 11.05 922.86
CLR/011 제8일 >5,000,000 55 12.46 -
CLR/011 제15일 23,000,000 63 19.82 1035.71
CLR/011 제22일 - 65 10.00 -
CLR/011 제29일 13,000,000 58 36.00 998.1
CLR/011 제43일 - 63 20.80 -
CLR/011 제57일 18,000,000 61 10.00 -
CLR/011 제71일 - - -
CLR/011 제85일 - - - -
CLR/011 제113일 - - - -
CLR/011 제169일 - - -
실시예 5
경구 투여된 OvIFN T 는 실험 알레르기성 뇌척수염의 전개를 차단한다
수용체 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스에게 실험 알레르기성 뇌척수염(EAE)의 유도를 위하여 소 미엘린계 단백질(bMBP) 투여 48 시간 전, 당일 및 48 시간 후에 복강내 주사 또는 경구 급식에 의하여 OvIFNτ(105 U/㎖)를 제공하였다. 105 U의 IFNτ를 PBS로 총 부피 100 ㎕로 혼합하였으며, 식도 아래 위로 급식 튜브를 넣었다. 인산염 완충 염수 중의 IFNτ 희석을 투여 직전에 행하였다.
NZW 마우스에게 EAE를 유도하기 위하여, 소 미엘린계 단백질(bMBP) 300 ㎍을, H37Ra(Mycobacterium tuberculosis, Difco, 미국 미시건주 디트로이트 소재) 8 mg/㎖를 함유하는 완전 프로인트 보조제(CFA) 중에 유화시키고, 꼬리 기부의 한 측 상에 주사하였다. 또한, 면역 당일 및 48 시간 후에, 백일해 독소(List Biologicals, 미국 캘리포니아주 캠벨 소재)를 주사하였다. SJL/J 마우스에게서 EAE를 유도하기 위하여, 기재된 바와 동일한 프로토콜을 사용하였으나, 마우스를 초기 면역화 후 7일째에 다시 면역화하였다. 마우스를 EAE 징후에 대하여 매일 조사하였으며, 질환의 중증도를 다음 스케일로 등급을 매겼다.
스코어 징후/중증도
1 꼬리 정상상태의 손실
2 뒷다리 약화
3 하반신 마비
4 양측 하반신 마비
5 빈사 상태/사망
EAE의 예방이 OvIFNτ 처치에 특이적인 지를 결정하기 위하여, 항-OvIFNτ 모노클론 항체(mAb), HL127을 사용하여 EAE를 차단하는 OvIFNτ를 중화시켰다(서열 번호 2의 아미노산 잔기 139-172로 향하는 항체 HL127은 MDBK 세포주를 사용하는 항바이러스 분석에서 OvIFNτ의 항바이러스 활성을 중화시킴). HL127의 1:10 희석물을 2 시간 동안 복강내 주사 또는 경구 급식에 의하여 투여 전에 OvIFNτ로 2 시간 동안 인큐베이션하였다. IFNτ 항원으로 향하는 항체는 항체 생성에 대한 공지 기술(예컨대, Harlow, E., et al. ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988))과 조합한, 본 명세서의 정보를 사용하여 발생할 수 있다.
결과는 하기 표 6에 나타낸다. OvIFNτ의 경구 급식 및 복강내 주사는 둘 다 EAE의 급성 유도에 대하여 보호하였다. 복강내 주사에 의하여 IFNτ를 수용한 동물 중 어느 것도 EAE의 징후를 나타내지 않은 반면에, IFNτ를 경구 수용한 동물의 9 마리 중 7 마리(78%)가 보호되었다. 항OvIFNτ 항체 HL127은 EAE를 차단하는 OvIFNτ의 능력을 부분적으로 중화시키는 데 효과적이었다. 이들 데이터는 경구 투여된 IFNτ가 다발성 경화증의 동물 모델의 치료로서 효과적이라는 것을 가리킨다.
마우스에게서 급성 EAE의 개시 및 중증도에 대한 경구 투여된 IFNτ의 효과
투여 경로 처치 질환 발생률 평균 개시일 평균 중증도
복강내 염수 4/4 24.8 ± 2.1 2.5 ± 0
복강내 OvIFNτ 0/4 - -
복강내 OvIFNτ + HL127Ab 3/4 20.7 ± 1.2 2.3 ± 0.6
경구 염수 7/9 22.0 ± 1.0 2.7 ± 0.6
경구 OvIFNτ 2/9 19 3
경구 OvIFNτ + HL127Ab 5/8 20.7 ± 0.6 3 ± 0
OvIFNτ(105 U)는 MBP 면역화 48 시간 전, MBP 면역화 당일 및 MBP 면역화 48 시간 후에 복강내 주사 도는 경구 급식에 의하여 투여하였다. OvIFNτ에 특이적인 모노클론 항체인 HL127은 투여 전에 2 시간 동안 OvIFNτ로 인큐베이션하였다.
실시예 6
경구 투여 후 혈청 내 OvIFNτ의 검출
마우스(상기와 같이 처치됨)의 혈청에서 검출 가능한 OvIFNτ의 양을 OvIFNτ의 경구 급식 또는 복강내 주사 후 경시적으로 비교하였다. 마우스에게 OvIFNτ 3 x 105 U를 투여하고, IFNτ 투여 후 0.5, 2, 4, 6, 24 및 48 시간째에 출혈시켰다. 혈청을 세포 변성 효과(바이러스 플라크) 분석(Familetti, P.C. et al., Meth. Enzymol. 78: 387 (1981))에서 테스트하여 샘플 중의 IFNτ의 양을 측정하였다.
요컨대, IFNτ의 희석물을 편평 저부 96 웰 플레이트에서 컨플루언시 상태로 성장시킨 MDBK에 가하고, 18 내지 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 소포성 구내염 바이러스(VSV)를 45 분 동안 실온에서 플레이트에 가하였다. 바이러스를 제거하고, 메틸 셀룰로스를 가하였으며, 플레이트를 48 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 메틸 셀룰로스의 제거 후, 플레이트를 플라크의 시각화를 위하여 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. IFN 중화 측정을 위하여, 5000 U/㎖ 농도의 OvIFNτ를 1 시간 동안 37℃에서 혈청 또는 HL127(OvIFNτ에 특이적인 모노클론 항체)로 인큐베이션하였다. 1 항바이러스 유닛은 VSV로 감염된 미처치 MDBK 세포(대조 플레이트)에 대하여 단층의 50% 파괴 감소를 야기하였다. 모든 샘플을 동시에 분석하여 분석간 변수를 제거하였다.
도 9에 도시된 바와 같이, OvIFNτ를 200 U/㎖의 레벨에서 경구 급식(채색된 막대) 후 0.5 시간 및 2 시간째에 검출하였다. 비교를 위하여, 다소 높은 레벨의 OvIFNτ를 복강내 주사(백색 막대) 후 24 시간에 걸쳐서 분석하였다. 이들 데이터는 IFNτ의 상기 투여량이 경구 투여 후 약 2 시간 동안 혈청에서 검출될 수 있음을 보여준다.
실시예 7
경구 투여된 OvIFNτ에 의한 실험 알레르기성 뇌척수염의 만성 재발 방지
하반신 마비를 방지하는 OvIFNτ의 능력은 EAE의 만성 재발 모델을 사용하여 조사하였으며, MBP로 면역화된 SJL 마우스는 질환의 만성 형태로 발달하는데, 징후의 출현은 재발 진정 방식으로 일어난다(Zamvil, S.S. et al., Ann. Rev. Immunol. 8: 579-621(1990)).
EAE를 본질적으로 전술한 바와 같이 SJL 마우스에게서 유도하였다. 마우스를 면역화 당일(제0일) 및 그 후 치료 기간 동안 48 시간 마다 복강내 주사 또는 경구 급식에 의하여 IFNτ 105 U로 치료하였다. 결과를 도 10a에 나타내며, MBP로 면역화하였지만, IFNτ 처치를 수용하지 않은 SJL 마우스는 질환의 5/5 발병률로 만성 재발 하반신 마비로 발전하였으며, 피크 평균 중증도는 실험 시작 후 14 일째에 ~2.5로 발생하였다. 이와는 대조적으로, 복강내 주사 또는 경구 급식(각각, 도 10b 및 도 10c)에 의한 OvIFNτ를 이용한 치료는 EAE로부터의 보호를 가져왔다. 두 IFNτ 처치군의 질환 발병률은 1/5 동물로 감소하였으며, 평균 중증도는 ~1.0이었다. 이들 데이터는 INFτ의 경구 투여가 만성 재발 EAE의 전개를 차단할 수 있다는 것을 가리키며, IFNτ를 장기간에 걸쳐서 약 48 시간마다 공급한 경우, 경구 투여된 IFNτ가 복강내 주사만큼 효과적일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8
조직학적 분석
조직학적 분석을 수행하여 경구 및 복강내 경로에 의하여 OvIFNτ로 처치된 MBP 면역화된 마우스의 CNS로의 림프구 침윤의 정도를 결정하였다.
마우스를 4% 파라포름알데히드로 관류하고, 척추를 제거하였으며, 2 내지 3 일 동안 포르말린으로 처리하였다. 척수를 절개하고, 0.5% 수크로스에 4℃에서 밤새도록 침지시켰다. 척수 절개부를 삽입하고, 절개부를 박절기로 절단하였다. 절개부를 4% 파라포름알데히드로 슬라이드로 고정하고, 염증성 침윤의 시각화를 위하여 크레실 바이올렛으로 염색하였다.
결과를 222x의 최종 배율로 도 11a 내지 도 11c에 나타낸다. 림프구 병변은 중앙 척수 백색 물질에 존재하였다(도 11a). 이와는 대조적으로, 복강내 주사(도 11b) 또는 경구 급식(도 11c)에 의해 OvIFNτ로 처치된 마우스에게서는 림프구 침윤이 검출되지 않았다. 이들 데이터는 IFNτ의 보호 효과가 CNS의 림프구 침윤의 억제와 연관있다는 것을 시사한다.
실시예 9
OvIFNτ를 이용한 치료에 의한 IL-10의 유도
만성 재발 EAE의 에방을 위한 SJL의 OvIFNτ의 과정 중에, 마우스를 출혈시키고, 혈청을 인터루킨 10(IL-10)의 존재에 대하여 조사하였다. 단일 IFNτ(105 U) 처치(복강내 또는 경구 급식에 의하여), 장기간 IFNτ(105 U) 처치(20 일 이상 동안 복강내 주사 또는 경구 처치에 의하여)를 수용하거나 처치를 수용하지 않은 마우스로부터의 혈청을, 제조자의 지시에 따라서, IL-10 ELISA 키트(Genzme, 미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재)를 사용하여 효소 연결된 면역흡수 분석(ELISA)에 의하여 IL-10에 대하여 조사하였다. 모든 혈청 샘플을 두 벌로 테스트하였다.
세포 증식 상태를 치료하는 데 사용하기 위하여, IFNτ는 환자에게서 초기 측정 가능한 혈중 OAS 증가를 달성하기에 충분한 투여량으로 투여한다. 그 후, 치료는 혈중 OAS 레벨의 추가 변화, 예를 들면 체내 암 세포 감소에 기인한 OAS 혈중 레벨 강하와 독립적으로, 유효 투여량으로 계속한다. 유효량으로의 IFNτ의 투여는, 예를 들면 특정 조직 내 암 세포의 종양 크기 또는 정도에 의하여 측정하였을 때 소정 레벨의 완화가 관찰될 때까지 계속한다. 환자는 치료 기간 중에 제2 항암제(예컨대, 시스플라틴, 독소루비신 또는 탁솔 공급)과 병용 치료될 수 있다. 장기간 IFNτ(105 U) 처치(20 일 이상 동안 복강내 주사 또는 경구 치료) 또는 무치료는 제조자의 지시에 따라서 IL-10 ELISA 키트(Genzyme,미국 매사츄세츠주 캠브리지 소재)를 사용하여 효소 연결 면역흡수 분석(ELISA)에 의하여 IL-10에 대하여 조사하였다. 모든 혈청을 두 벌로 테스트하였다.
결과는 도 12에 나타낸다. IL-10은 대조 마우스 또는 복강내 주사 또는 경구 급식에 의한 OvIFNτ의 단일 요법을 수용한 마우스에게서 검출되지 않았다. 이와는 대조적으로, 20 일 이상 동안 48 시간마다 복강내 주사 또는 경구 급식에 의해 OvIFNτ를 수용한 SJL 마우스는 그 혈청 중에서 IL-10의 검출 가능한 레벨을 가졌다. 이 데이터는 IL-10의 IFNτ 유도 생성이 OvIFNτ가 EAE의 전개를 방지하는 데 기여하는 메커니즘일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 10
OvIFNτ를 이용한 치료의 중지는 재발 하반신 마비를 초래한다
복강내 주사 또는 경구 급식(48 시간 마다)에 의한 OvIFNτ에 의하여 EAE로부터 보호된 SJL 마우스를 58 일 동안 주시하고, 그 기간 중에 질환 전개는 관찰되지 않았다. 그 다음, OvIFNτ를 이용한 처치를 제거하고, 마우스를 추가로 22 일 동안 질환의 징후에 대하여 관찰하였다.
결과는 도 13에 나타낸다. IFNτ 처치는 그래피 아래에 양의 기호로 표기하였으며, IFNτ 처치의 제거는 음의 기호로 표기하였다. 각 처치군의 질환 발병률은 다음과 같았다: PBS 대조군 = 3/4(사각형); 복강내 주사 = 3/3(삼각형); 경구 급식 = 3/4(원).
OvIFNτ 처치에 의하여 EAE로부터 이미 보호되던 두 군의 마우스는 OvIFNτ 처치의 제거 6 내지 12 일 후에 하반신 마비의 징후가 전개되었다. 이들 데이터는 복강내 주사 또는 경구 급식에 의한 IFNτ의 진행 중인 투여가 EAE의 만성 재발 모델에게서 EAE의 계속된 보호에 바람직하다는 것을 가리킨다.
실시예 11
OvIFNτ의 경구 투여는 항OvIFNτ 항체 반응을 감소시킨다
상기 실시예 10에 기재된 실험에서 OvIFNτ 처치의 제거 후, 각 처치군으로부터의 마우스를 출혈시키고, 혈청을 항OvIFNτ 항체(Ab)의 존재에 대하여 조사하였다.
항원 OvIFNτ를 플라스틱 조직 배양 웰의 편평한 바닥에 밤새도록 600 ng/웰의 농도로 흡착시킨 후, 증발 건조시켰다. 플레이트를 PBS 중의 5% 밀크(Carnation)로 처리하여 비특이적인 결합을 차단한 다음, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS로 3회 세척하엿다. 미처치된 마우스로부터의 혈청의 다양한 희석물, 복강내 주사에 의해 처치된 OvIFNτ 및 경구 급식에 의해 처치된 OvIFNτ를 가하고, 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 결합은 양고추냉이 퍼옥시다제에 결합된 염소 항마우스 면역글로불린으로 평가하였다. 색 전개는 o-페닐렌디아민 및 H2O2를 가하고, 반응을 2 M H2SO4로 종결시킨 후 492 nm에서 ELISA 플레이트 해독기로 모니터하였다.
예시적인 결과는 도 14에 나타낸다. 미처치군, 복강내 주사된 OvIFNτ처치군 및 경구 급식된 OvIFNτ 처치군(2 마리 마우스/군)으로부터의 혈청을 1:30(백색 막대) 및 1:120(음영 막대)를 포함하는 다중 희석액을 사용하여 ELISA에 의해 조사하였다. 경구 급식에 의하여 OvIFNτ를 수용한 마우스는 최소 항체 레벨을 나타낸 반면에, 복강내 주사에 의하여 OvIFNτ를 수용한 마우스는 고레벨의 항OvIFNτ Ab를 나타내었다. 예상한 대로, OvIFNτ 처치를 받지 않은 마우스는 항OvIFNτ Ab를 나타내지 않았다.
또한, 혈청을 전술한 바와 같이 MDBK 세포에 대한 OvIFNτ 항바이러스 활성을 중화시키는 그 능력에 대하여 조사하였다. 결과는 하기 표 7에 나타낸다. 복강내 주사되거나 경구 공급된 마우스로부터의 혈청은 어느 것도 중화 활성을 갖지 않았다. 이들 데이터는 IFNτ를 이요한 경구 처치가 복강내 주사 처치된 개체에게서 관찰되는 OvIFNτ 단백질에 대한 항체 반응을 피하고, 통상적으로 어떠한 처치도 중화 항체의 생성을 초래하지 않는다는 것을 시사한다.
OvIFNτ로 처치된 마우스 내 혈청 OvIFNτ 역가
OvIFNτ 500 U/㎖를 하기로부터 유래한 혈청으로 공배양함 OvFNτ 역가 (U/㎖)
미처치군 500
복강내 주사군 500
경구 급식군 500
HL127 <50
본 발명을 특정 구체예를 참고로 설명하였지만, 당업자라면 다양한 변경과 수정이 본 발명을 벗어나지 않고 이루어질 수 있음을 이해할 것이다.
<110> Pepgen Corporation <120> Use of Interferon-Tau in Medecine <130> US-06P-0471 <150> US 10/698,927 <151> 2003-10-31 <150> US 10/719,472 <151> 2003-11-21 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 516 <212> DNA <213> Ovis aries <400> 1 tgctacctgt cgcgaaaact gatgctggac gctcgagaaa atttaaaact gctggaccgt 60 atgaatcgat tgtctccgca cagctgcctg caagaccgga aagacttcgg tctgccgcag 120 gaaatggttg aaggtgacca actgcaaaaa gaccaagctt tcccggtact gtatgaaatg 180 ctgcagcagt ctttcaacct gttctacact gaacattctt cggccgcttg ggacactact 240 cttctagaac aactgtgcac tggtctgcaa cagcaactgg accatctgga cacttgccgt 300 ggccaggtta tgggtgaaga agactctgaa ctgggtaaca tggatccgat cgttactgtt 360 aaaaaatatt tccagggtat ctacgactac ctgcaggaaa aaggttactc tgactgcgct 420 tgggaaatcg tacgcgttga aatgatgcgg gccctgactg tgtcgactac tctgcaaaaa 480 cggttaacta aaatgggtgg tgacctgaat tctccg 516 <210> 2 <211> 172 <212> PRT <213> Ovis aries <400> 2 Cys Tyr Leu Ser Arg Lys Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu 85 90 95 Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr 115 120 125 Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 <210> 3 <211> 172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant IFNTau Based on Ovis aries Seuence <400> 3 Cys Tyr Leu Ser Glu Arg Leu Met Leu Asp Ala Arg Glu Asn Leu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Arg Met Asn Arg Leu Ser Pro His Ser Cys Leu Gln Asp 20 25 30 Arg Lys Asp Phe Gly Leu Pro Gln Glu Met Val Glu Gly Asp Gln Leu 35 40 45 Gln Lys Asp Gln Ala Phe Pro Val Leu Tyr Glu Met Leu Gln Gln Ser 50 55 60 Phe Asn Leu Phe Tyr Thr Glu His Ser Ser Ala Ala Trp Asp Thr Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Gln Leu Cys Thr Gly Leu Gln Gln Gln Leu Asp His Leu 85 90 95 Asp Thr Cys Arg Gly Gln Val Met Gly Glu Glu Asp Ser Glu Leu Gly 100 105 110 Asn Met Asp Pro Ile Val Thr Val Lys Lys Tyr Phe Gln Gly Ile Tyr 115 120 125 Asp Tyr Leu Gln Glu Lys Gly Tyr Ser Asp Cys Ala Trp Glu Ile Val 130 135 140 Arg Val Glu Met Met Arg Ala Leu Thr Val Ser Thr Thr Leu Gln Lys 145 150 155 160 Arg Leu Thr Lys Met Gly Gly Asp Leu Asn Ser Pro 165 170 <210> 4 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Recombinant IFNTau Based on Ovis Aries Seuence <400> 4 tgctacctgt cggagcgact gatgctggac gctcgagaaa atttaaaact gctggaccgt 60 atgaatcgat tgtctccgca cagctgcctg caagaccgga aagacttcgg tctgccgcag 120 gaaatggttg aaggtgacca actgcaaaaa gaccaagctt tcccggtact gtatgaaatg 180 ctgcagcagt ctttcaacct gttctacact gaacattctt cggccgcttg ggacactact 240 cttctagaac aactgtgcac tggtctgcaa cagcaactgg accatctgga cacttgccgt 300 ggccaggtta tgggtgaaga agactctgaa ctgggtaaca tggatccgat cgttactgtt 360 aaaaaatatt tccagggtat ctacgactac ctgcaggaaa aaggttactc tgactgcgct 420 tgggaaatcg tacgcgttga aatgatgcgg gccctgactg tgtcgactac tctgcaaaaa 480 cggttaacta aaatgggtgg tgacctgaat tctccg 516

Claims (7)

  1. 인터페론 타우 요법에 반응하는 사람 피험자의 상태를 치료하기 위한 의약의 제조용 조성물로서, 상기 상태는 자가면역 상태, 암 또는 바이러스 감염 중에서 선택되고, 상기 조성물은 인터페론 타우 투여의 부재 하에서 피험자의 혈중 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제(OAS) 레벨에 대하여 피험자의 혈중 OAS 레벨의 초기 측정 가능한 증가를 생성하기에 효과적인 양으로 피험자의 장관으로의 경구 투여를 위해 제조된 인터페론 타우를 포함하며, 상기 인터페론 타우는 주 당 적어도 수 회의 정규적인 토대로 1 개월 이상의 기간 동안 피험자의 혈중 OAS 레벨 변화와 독립적으로 상기 유효량으로 환자의 장관에 투여하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 타우는 서열 번호 2 또는 서열 번호 3으로서 동정되는 서열을 가진 양 인터페론 타우인 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 인터페론 타우는 1 개월 이상의 기간 동안 1일 기준으로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 피험자의 다발성 경화증 치료를 위하여, 상기 인터페론 타우는 피험자의 징후의 존재에 해당하는 기간 중에 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 피험자의 C형 간염 감염 치료를 위하여, 상기 인터페론 타우는 바이러스 감염이 환자에게서 감출되지 않는 시점을 지나 수 개월의 기간 동안 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 피험자의 암 치료를 위하여, 항암제가 인터페론 타우 투여의 기간 중에 피험자에게 추가로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 피험자의 혈중 OAS 레벨은 OAS 레벨이 증가하는 지 확인하기 위하여 인터페론 타우의 투여 중에 모니터하는 것을 특징으로 하는 조성물.
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