JPH07508763A - ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト - Google Patents
ヒトγインターフェロンのアンタゴニストInfo
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- JPH07508763A JPH07508763A JP6513217A JP51321794A JPH07508763A JP H07508763 A JPH07508763 A JP H07508763A JP 6513217 A JP6513217 A JP 6513217A JP 51321794 A JP51321794 A JP 51321794A JP H07508763 A JPH07508763 A JP H07508763A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト技術分野
本発明は、ヒトγインターフエロン受容体の臨界的部分に基づくヒトγインター
フェロンのアンタゴニストに関する。
発明の背景
γインターフェロン(IFN−γ)は、活性ヘルパーT細胞によって産生された
サイトカインであり、その最も特徴的な活性の一つは、マクロファージ、成熟B
細胞およびT細胞における主要組織適合遺伝子複合体(MHC)クラスII遺伝
子発現のアップレギュレーションである。クラスII抗原の発現は、抗原提示細
胞の特徴である。IFN−γは、更に、主要な抗原提示細胞ではない細胞、例え
ば、上皮細胞、繊維芽細胞、星状細胞、内皮および平滑筋細胞中においてクラス
II抗原の発現をアップレギュレートすることが知られている。これらの細胞種
におけるクラスII抗原のアップレギュレーションは、しばしば、慢性関節リウ
マチおよび多発性硬化症なとの自己免疫疾患の発症と相関している。
IFN−γが細胞に対してその作用を及ぼす機序は分かっていないが、それが特
定の細胞受容体に対して結合することは知られている[ランガー(Langer
) ら、Immunology Today 9:393 (1988)]。]
アギューAguet)ら[Ce1l 55:273 (1988)]は、IFN
−γ受容体の遺伝子をクローン化し且つ配列決定した。その配列から推定された
コード化タンパク質の分子量は、ヒト胎盤から単離されたIFN−γの分子量と
一致する[カルゾロン(Calderon)ら、Proc、Natl。
Acad、Sci、USA 85:4837 (1988)]。更に、ヒトIF
N−γ受容体は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において生物学的
に活性な形で発現された。高親和性IFN−γ受容体の細胞外ドメインは、配列
表において配列番号=1で定義されたアミノ酸配列を有する。
IFN−γは特定の細胞受容体に作用し且つ慢性関節リウマチおよび多発性硬化
症などの自己免疫疾患に関係しているので、細胞受容体に対するこのようなイン
ターフェロンの結合を阻害する薬剤が必要とされる。
発明の概要
本発明は、ヒトIFN−γの生物学的活性を阻害するIFN−γアンタゴニスト
、組成物および方法を提供することによってこの要求を満たす。
更に詳しくは、本発明は、ヒトIFN−γ受容体の一部分であって、配列番号:
2の配列によって定義されたアミノ酸配列を有する該部分のアミノ酸配列を模擬
する、を含むまたはに対して特異的に結合するヒトIFN−γアンタゴニストを
提供する。
本発明は、更に、ヒトIFN−γの生物学的活性を阻害する方法であって、ヒト
IFN−7受容体の一部分の、配列番号:2の配列によって定義されたアミノ酸
配列を有する該部分のアミノ酸配列を模擬する、を含むまたはに対して特異的に
結合するヒトIFN−γアンタゴニストと、ヒトIFN−γまたはヒトIFN−
γ受容体含有細胞を接触させることを含む上記方法を提供する。
本発明の一つの実施態様において、アンタゴニストは、配列番号=3で定義され
たコア配列を含み且つ配列番号:4で定義されたアミノ酸配列の約22〜48ア
ミノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここにおいて、両方の配列中の2位およ
び3位のXaaと表示された残基はそれぞれTyrまたはValおよびSerま
たはCysであることができ、そしてポリペプチド中のCys残基のスルフヒド
リル基は遊離しているかまたはスルフヒドリル保護基でブロックされていること
ができる。
もう一つの実施態様において、アンタゴニストは、配列番号=2の配yすの一部
分または全部によって定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトー
プに対しておよびヒトIFN−γ受容体に対して特異的に結合する抗体またはそ
れらのフラグメントである。
更にもう一つの実施態様において、アンタゴニストは、配列番号=2の配列の一
部分または全部によって定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピト
ープに対しておよびヒトIFN−γ受容体に対して特異的に結合する抗体または
そのフラグメントに対して産生された抗イデイオタイプ抗体またはそれらのフラ
グメントである。
図面の簡単な説明
本発明は、添付の図面を論及することによって一層容易に理解することができる
。
図1は、3位のシスティン残基のスルフヒドリル基がアセトアミドメチル基でブ
ロックされた配列番号:5によって定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドアンタゴニストによる、コロ(Colo)205細胞におけるIFN−γに誘
導されたHLA/DR抗原発現の阻害を示すグラフである。
図2は、3位のシスティン残基のスルフヒドリル基がアセトアミドメチル基でブ
ロックされた配列番号:5によって定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドアンタゴニストのヒトIFN−γに対する結合を示すグラフである。微量滴定
プレートのウェル上に塗布されたポリペプチドに対して結合したIFN−γの量
を、405nmでの吸光度の関数として示す。
発明の説明
本明細書中に引用された文献はいずれも、本明細書中に参考として完全に包含さ
れる。開示されたアミノ酸配列はいずれも通常の慣例に従い、左側がアミノ末端
で右側がカルボキシル末端である。配列中のアミノ酸残基には標準的な三文字略
語を用いる。
本明細書中で用いられるヒトrlFN−γ受容体」とは、(a)実質的に配列表
において配列番号=1で定義のアミノ酸配列を有する且つ(b)天然IFN−7
受容体に共通の生物学的活性を有する、しかもヒトIFN−γに対して結合する
タンパク質を意味する。
本発明のアンタゴニストは、自己免疫疾患のようなIFN−γによって引き起こ
される何等かの医学的症状を治療するのに用いることができる。更に、それらは
、IFN−γの作用機序を説明するのに用いることができるし、IFN−γのア
ゴニストおよび/または他のアンタゴニストを識別するためのスクリーニングシ
ステムの一部分として用いることができる。
本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」という用語は、細胞受容体に対する
ヒトIFN−γの結合を阻止するまたは阻害し、それによってIFN−γの1種
類またはそれ以上の既知の生物学的活性を阻害する物質として定義される。特定
のアンタゴニストに応じて、このような阻害は、IFN−γに対するまたは■F
N−γ受容体に対するアンタゴニストの結合を必要とするらしい。
意外にも、IFN−γ/受容体相互作用に明らかに関与しているヒトIFN−γ
受容体の臨界的部分が存在することが分かった。この臨界的部分のサブEFIを
模擬するまたは含む原因物質および該部分に対する抗体またはこのような抗体に
対する抗イデイオタイプ抗体は、IFN−γとその受容体との相互作用を阻害す
ることができる。
ヒト1FN−γ受容体の臨界的部分は、配列番号:1の残基120〜167の配
列によって定義されたアミノ酸配列を有する。意外にも、配列番号:1の残基1
20〜141の配列に基づくコア配列を含むポリペプチドは、IFN−7の有効
なアンタゴニストである。本発明は、このようなポリペプチド、更には、このよ
うなポリペプチドを模擬することができる化合物を提供する。
前記のことから、配列番号=1の残基120〜141の配列によって定義された
コア配列(配列番号:3で定義された配列でもある)を含む任意のポリペプチド
が、細胞受容体に対するIFN−γの結合を阻害し、したがって生物学的活性を
阻害することは明らかであるべきである。したがって、本発明は、上述のポリペ
プチドのみならず、中間の長さくすなわち、配列番号=3の22残基コア配列に
加えて、配列番号:4で示された1個またはそれ以上の他のアミノ酸残基を含む
もの)であり且つIFN−γの結合および生物学的活性を阻害する他のものをも
包含する。
配列番号:3および配列番号:4の配列中に若干の変化が存在するということは
留意されるべきである。両方の配列中の2位および3位のXaaと表示された残
基は、それぞれTyrまたはValおよびSerまたはCysでありうる。ポリ
ペプチド中のシスティン残基のスルフヒドリル基のいずれかまたは全部は、遊離
しているかまたはアセトアミノメチル基などの既知のスルフヒドリル保護基のい
ずれかで共有によってブロックされていることができる。スルフヒドリル基をブ
ロックするのに用いることができるの試薬としては、例えば、アルキル化剤、例
えば、ヨードアセテートまたはヨードアセトアミド;無水物、例えば、無水マレ
イン酸または無水コハク酸;およびDTNB [5,5’−ジチオビス(2−ニ
トロ安息香酸)コがある。
典型的なアンタゴニストの阻害作用はC0LO−205細胞を用いて以下に実証
されるが、本発明のアンタゴニストは、IFN−γ受容体を有する任意の細胞、
例えば、B細胞、T細胞、好酸球、平滑筋細胞、前骨髄球、マクロファージ、赤
血球系細胞、単球および顆粒球に対するIFN−γの結合を阻害する。例えば、
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(AmericanType
Cu1ture Co11ection)から受託番号CCL 213として入
手可能である、バーキットリンパ腫患者に由来する十分に特徴化されたBリンパ
芽球細胞系であるダウディ(Daudi)細胞を用いることもできる。アンタゴ
ニストの作用は、前記細胞上の細胞受容体に対する125I−で標識されたIF
N−γの結合の阻害を測定することによって観察することができる。
U−937ヒトリンパ腫系(ATCCCRL 1593)などの他の細胞系もこ
の目的に用いることができる。放射性標識されたIFN−γは、標準法によって
製造することができる。
本発明のポリペプチドアンタゴニストは、適当な方法によって、例えば、排他的
固相合成、部分固相法、フラグメント縮合または古典的溶液合成によって合成す
ることができる。ポリペプチドは、好ましくは、例えば、メリフィールドIRL
プレス(Press)、オックスフォード)によって記載されたような固相ペプ
チド合成によって製造される。合成は、αアミノ末端が保護されているア、ミノ
酸を用いて行なわれる。不安定な側鎖を有する三官能性アミノ酸も、ポリペプチ
ドの組立の際に生じる望ましくない化学反応を防止するように適当な基で保護さ
れる。αアミノ保護基は、アミノ末端において引続きの反応を生じさせるように
選択的に除去される。αアミノ保護基を除去するための条件は、側鎖保護基を除
去しない。
αアミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の技術上有用であることが知られて
いるものである。包含されるものとしては、アシル型保護基(例えば、ホルミル
、トリフルオロアセチル、アセチル)、芳香族ウレタン型保護基[例えば、ベン
ジルオキシカルボニル(CbzL置換ベンジルオキシカルボニルおよび9−フル
オレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)] 、脂肪族ウレタン保護基(例
えば、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、イソプロピルオキシカルボニル
、シクロへキシルオキシカルボニル)およびアルキル型保護基(例えば、ベンジ
ル、トリフェニルメチル)がある。好ましい保護基はBocである。Tyrのた
めの側鎖保護基としては、テトラヒドロピラニル、t−ブチル、トリチル、ベン
ジル、Cbz、4−Br−Cbzおよび2,6−ジクロロベンジルがある。Ty
rのための好ましい側鎖保護基は2.6−ジクロロベンジルである。Aspのた
めの側鎖保護基としては、ベンジル、2.6−ジクロロベンジル、メチル、エチ
ルおよびシクロヘキシルがある。Aspのための好ましい側鎖保護基はシクロヘ
キシルである。ThrおよびSerのための側鎖保護基としては、アセチル、ベ
ンゾイル、トリチル、テトラヒドロピラニル、ベンジル、2.6−ジクロロベン
ジルおよびCbzがある。ThrおよびSerのための好ましい保護基はベンジ
ルである。Argのための側鎖保護基としては、ニトロ、TosSCbz、アダ
マンチルオキシカルボニルおよびBocがある。Argのための好ましい保護基
はTosである。Lysの側鎖アミノ基は、Cbz、2−CI−Cbz、T。
SまたはBoaで保護しつる。基2−CI−CbzはLysのための好ましい保
護基である。
選択された側鎖保護基は、カップリングの際にそのままの状態であるべきであり
、しかもアミノ末端保護基の脱保護の際にまたはカップリング条件の際に除去さ
れるべきでない。側鎖保護基は、更に、合成完了の際に、完成ポリペプチドを変
化させない反応条件を用いて除去しうるべきである。
固相合或は、通常、αアミノが保護された(側鎖が保護された)アミノ酸を適当
な固体支持体に対してカップリングさせることによってカルボキシ末端から行な
われる。結合がクロロメチル樹脂またはヒドロキシメチル樹脂に対して行なわれ
る場合、エステル結合が生成され、得られたポリペプチドはC末端に遊離カルボ
キシル基を有する。或いは、ベンズヒドリルアミン樹脂またはp−メチルベンズ
ヒドリルアミン樹脂を用いる場合、アミド結合が生成され、得られたポリペプチ
ドはC末端にカルボキサミド基を有する。これらの樹脂は商業的に入手可能でル
・カンパ=−(Pierce Chemical Co、)、Oyyクフォード
、IL、、1984年に記載されている。
必要ならば側鎖をおよびαアミノ基を保護したC末端アミノ酸を、ジシクロへキ
シルカルボジイミド(DCC) 、N、N’ −ジイソプロピルカルボジイミド
およびカルボニルジイミダゾールを含む種々の活性剤を用いてベンズヒドリルア
ミン樹脂に対してカップリングさせる。樹脂支持体に対する結合後、トリフルオ
ロ酢酸(T F A)またはHCIをジオキサン中において0℃〜25℃で用い
てαアミノ保護基を除去する。メチオニン(Met)導入後にジメチルスルフィ
ドをTFAに対して加えて、起こりうるS−アルキル化を抑制する。αアミノ保
護基の除去後、残りの保護されたアミノ酸を、望ましい配列を得るのに必要な順
序で段階的にカップリングさせる。
カップリング反応には、DCC,N、N’ −ジイソプロピルカルボジイミド、
ヘキサフルオロリン酸ベンゾトリアゾル−1−イル−オキシ−トリス−(ジメチ
ルアミノ)ホスホニウム(B OP)およびDCC−ヒドロキシベンゾトリアゾ
ール(HOBt)を含む種々の活性剤を用いることができる。保護されたアミノ
酸はそれぞれ過剰に(>2. 0当量)用いられ、そしてカップリングは、通常
、N−メチルピロリドン(NMP)中においてまたはDMF1CH2C12若し
くはそれらの混合物中において行なわれる。カップリング反応の完了の程度は、
例えば、カイザー(Kaiser)ら、Anal、Biochem、、34:5
95(1970)によって記載のニンヒドリン反応により、各段階ごとに監視さ
れる。不完全なカップリングが見られた場合、カップリング反応を繰り返す。カ
ップリング反応は、商業的入手可能な機器を用いて自動的に行なうことができる
。
所望のポリペプチドが完全に組立てられた後、液体HFなどの試薬を0℃で1〜
2時間用いてポリペプチド−樹脂を開裂させて、ポリペプチドを樹脂から開裂さ
せ且つ側鎖保護基全部を除去する。通常、アニソールなどの掃去剤を液体HFと
一緒に用いて、開裂の際に生成される陽イオンが、ポリペプチド中に存在するア
ミノ酸残基をアルキル化することがないようにする。ポリペプチド−樹脂は、所
望ならば開裂の前にTFA/ジチオエタンを用いて脱保護してよい。
固体支持体上の側鎖−側鎖環化は、典型的に、酸性アミノ酸(例えば、Asp)
および塩基性アミノ酸(例えば、Lys)の側鎖官能基の選択的開裂を可能にす
る直交保護スキームの使用を必要とする。Aspの側鎖の9−フルオレニルメチ
ル(Fm)保護基およびLysの側鎖の9−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ル(Fmoc)保護基は、この目的に用いることができる。これらの場合、BO
Cで保護されたポリペプチド−樹脂の側鎖保護基は、DMF中のピペリジンによ
って選択的に除去される。環化は、DCCSDCC/HOBtまたはBOPを含
む種々の活性剤を用いて固体支持体上で達成される。HF反応は、前記のように
環化されたポリペプチド−樹脂上で行なわれる。
組換えDNA方法論を用いてポリペプチドアンタゴニストを製造することもでき
る。例えば、サムプルツク(Sambrook)ら、MolecularClo
ning:A Laboratory Manual、1989. コールド・
スプリング+1ハーバ−・プレス(Cold Spring HarborPr
ess)、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨークを参照されたい。あ
る与えられた宿主生物における一層有効な発現のための、所望ならば製造された
既知の遺伝コードを用いて、所望のアミノ酸配列をコードしているオリゴヌクレ
オチドを合成することができる。マシューシ(Ma t t eucc i)ら
[J、Am、Chem、Soc、103:3185 (1981)コのホスホル
アミダイト固体支持体法1.:L−(YOO)ら[I Biol、Chem、7
64:17078 (1,989)]の方法または他の周知の方法をこのような
合成に用いることができる。
得られたオリゴヌクレオチドは、適当なベクター中に挿入することができ且つ適
合した宿主生物中において発現させることができる。或いは、標準的な分子生物
学技法を用いて、後期開裂およびプロセッシングに好都合なプロテアーゼ部位を
有するタンデム反復セグメントを含む有効な発現に適当な遺伝子の工学技術を可
能にする。
ポリペプチドは、高速液体クロマトグラフィー、ゲル濾過、イオン交換および分
配クロマトグラフィー、向流分配または他の既知の方法を用いて精製することが
できる。
本発明は、更に、ポリペプチド類似体および模擬体、並びに前記に定義の配列と
は僅かに異なるアミノ酸配列を含む他のポリペプチドを包含する。例え(i、本
発明は、同類アミノ酸置換、欠失およびまたは付加を受けたポリペプチドアンタ
ゴニストの修飾をも、その修飾されたポリペプチドがIFN−γに対して結合す
る能力を保持し、それによってIFNゴの生物学的活性を阻害する限り(こお0
て包含する。最も頻繁に観察されるアミノ酸置換の例は、A l a/S e
r、 Va1/I 1 eSAsp/Glu、Thr/Se rSAla/Gl
y、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/GlySTy
r/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/I
le、Leu/VaLAla/GluおよびAsp/Gly並びに逆の場合であ
る。原核生物発現系において生産されたポリペプチドアンタゴニストは、当該技
術分野にお0て周知のように、追加のN末端メチオニン残基を含むこともある。
本明細書中で用いられる「模擬体」および「類似体」と(1つ用語は、ポリペプ
チドアンタゴニストと同様の特徴が選択されているポリペプチド、有機イし合物
またはペプチド模擬体を包含する。包含されるのは、ポリペプチドアンタゴニス
トのものと同様の物理的構造の一部分か選択されている、同様のエピトープの一
部分を有する、または同様の二次構造および結合コンホメーション力(選択され
て0る分子である。
模擬体および類似体としては、例えば、システィン結合およびグルタメート−リ
シン結合[マークシー(Marqusee)ら、Proc、Nat l。
(Olivera) ら、J、Biol、Chem、266:22067 (1
991)コによって得られるような、有機γおよびβターン模擬体[サトーLe
tters 30:2317(1989’)コ、αヘリックスおよびβシート模
擬体[シーガン(Regan)ら、5cience 241:974(1988
)]およびコンホメーションによって制限された類似体[ケスシー(Kessl
er) ら、Intl、J、Pe 、Protein Res、32183 (
1988);デュタ(Dutta)ら、Biochem。
Biophys、Res、Commun、159:1114 (1989)]が
ある。更に、非天然アミノ酸、例えば、D−メチル、N−メチルおよびαメチル
誘導体(デュタら、上言己)並びに非ペプチド構造要素[シージャシエカー(R
a jashekhar) ら、J、Biol、Chem、261+13617
(1986)]の包含もまた本発明によって考えられる。
本発明のアンタゴニストは、好ましくは、IFN−γ受容体を有する細胞におけ
るIFN−γの生物学的活性を少な(とも約25%阻害すべきである。更に好ま
しくは、阻害の程度は少なくとも約75%、最も好ましくは少なくとも約95%
である。
本発明のIFN−γアンタゴニストは、更に、ポリペプチドに対しておよびヒト
IFN−γ受容体に対して特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを
包含する。受容体に対する結合により、これらの抗体および抗体フラグメントも
またヒトIFN−γの結合を阻害し、したがってヒトIFN−γの生物学的活性
を阻害する。
このような抗体およびフラグメントを産生するための抗原として用いることがで
きるポリペプチドアンタゴニストは、抗体の産生を引き起こすことができる一つ
またはそれ以上の抗原決定基(エピトープ)を含む。当該技術分野において周知
のように、このようなエピトープは、概して、少なくとも5個のアミノ酸残基を
有する[オーツ(Ohno)ら、Proc、Natl、Acad、Sci、US
A 82:2945(1985)]。ポポリペプチドアンタボニスを抗原として
用いて産生された抗体は、ポリペプチド上のエピトープに対しても、ヒトIFN
−γ受容体に対しても特異的に結合する。
抗体のフラグメント、例えば、Fabフラグメント[テユツセン(Tijsse
n)、Practice and Theory ofEnzyme Immu
noassays(エルセピア、アムステルダム、1985年)]、Fvフラグ
メント[ホフマン(Hochman)ら、Biochemistry 12:1
130 (1973);シャロン(Sharon) ら、Biochemist
r 15:1591 (1976);工−リッヒ(Eh r 1 i ch)ら
、米国特許第4.355,023号明細書]および抗体半分子(オーディドア(
Auditore)−ハーグレイヴス(Hargreaves)、米国特許第4
,470.925号明細書)の使用および生成は周知である。
多クローン性抗体は、宿主動物、例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、マウ
ス等をポリペプチドの1種類で免疫感作することによって製造することができる
。好ましくは、最初の注射後に1回またはそれ以上のブースター注射をして抗体
力価を増加させる。次に、被験動物から血液を採取し、血清を調製し、そして酵
素結合イムノソルベント検定法(エリザ(ELI SA) )などの標準法によ
りポリペプチドを抗原として用いてスクリーニングする。しかしながら、単クロ
ーン性抗体の使用が好適である。
ハイブリドーマおよび単クローン性抗体は、標準法[コーラ−(Kohler)
ら、Nature 256+495 (1975):コーラーら、Eur、J。
Immunol、6:511 (1976)]により、ポポリペプチドアンタボ
ニスの1種類を抗原として用いて製造することができる。好ましくは、ポリペプ
チドの免疫原性を、アジュバントとの組合せによっておよび/または適当な宿主
動物を免疫感作する前により大きい形に変換することによって増加させる。
広範囲の適当なアジュバントが当該技術分野において周知である。ポリペプチド
の免疫原性は、更に、標準法を用いることによって増大されて、ポリペプチドを
架橋することができるし或いはそれらを免疫原性担体分子、例えば、スカシガイ
のヘモシアニンまたは哺乳動物血清、例えば、ヒト若しくはウシγグロブリンま
たはヒト、ウシ若しくはウサギ血清アルブミンに対してカップリングすることが
できる。好ましくは、不可欠ではないが、タンパク質担体は、ポリペプチドに対
する抗体が引き出される宿主動物にとって異種である。
本発明は、更に、上述の抗体または抗体フラグメントに対して向けられた抗イデ
イオタイプ抗体またはそれらのフラグメントを提供する。このような抗イデイオ
タイプ抗体は、元のポリペプチドアンタゴニスト抗原を模擬するかまたは同様に
作用する(例えば、レーガンらによる米国特許第4.731.237号明細書を
参照されたい)。IFN−γ受容体自体と同様、これらの抗体は、IFN−γに
対して特異的に且つ直接的に結合すると考えられる。
このような抗イデイオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドに対する抗体(多ク
ローン性抗体または単クローン性抗体)を動物にワクチン注射することによって
製造される。それらは、全多クローン性抗血清としてまたはそのIgG若しくは
その他の画分として、或いはクローン化ハイブリドーマによって産生された単ク
ローン性抗体として回収することができる。
所望の単クローン性抗体を産生ずるハイブリドーマが得られたら、上述の抗体フ
ラグメントを製造することができる。
或いは、抗体をコードしているDNAをクローン化または配列決定することがで
き、そして技術を用いて、一つの種の結合部分が別の種の抗体の非結合部分と組
合わされている種間率クローン性抗体を生じることができる[リウ(L i u
)ら、Proc、Natl、Acad、Sci、USA 84:3439 (1
987)コ。例えば、舊歯類動物単クローン性抗体からのCDRをヒト抗体に付
は足して、それによって鰯歯類動物抗体を「人間化」させることができる[リー
チマン(R4echmann) ら、Nature 332:323 (198
8)’l。
更に詳しくは、CDRは、ヒト不変部と一緒にまたはを伴うことなく、ヒト抗体
可変顔中に付は足すことができる。このような方法論は、例えば、ヒトインター
ロイキン−2受容体のp55 (Tac)サブユニットに対するマウス単クロー
ン性抗体を人間化するのに用いられた[クイーン(Queen)ら、P r o
c。
Nat 1.Acad、Sci、USA 86:10029 (1989)]。
このような人間化された抗体の7ラグメントを製造することもできる。
単クローン性抗体のH鎖およびL鎖のCDRがいったん識別されたら、このよう
な配列情報を用いて、抗体の機能性を模擬する非ペプチド模擬化合物を設計する
ことができる。このような模擬化合物の製造法は、例えば、サラゴビ(Sara
govi) ら、 [5cience 253ニア92 (1991)] によ
って記載された。更に、CDR配列情報を用いて、バード(Bird)ら[5c
ience 242:423 (1988)]によって記載されたように、L鎖
および/またはH鎖可変部からの結合したCDRを含む一重鎖結合タンパク質、
またはヒユーストン(Huston)ら[Proc、Nat I、Acad。
Sci、USA 85:5879 (1988)]によって記載されたように、
生合成抗体結合部位(BABS)を製造することができる。単離されたげ鎖可変
ドメインを含む単ドメイン抗体[ワード(Ward)ら、Nature 341
:544 (1989)] も、配配列相を用いて製造することができる。
それらの一層小さい寸法および低下した免疫原性のために、本発明において用い
られる抗体基剤IFN−γアンタゴニストは、好ましくは、抗体フラグメント、
BABS、模擬化合物または単ドメイン抗体である。人間化された抗体配列の使
用も好適である。
薬剤組成物は、1種類またはそれ以上のIFN−γアンタゴニストを用いて製造
することができる。このような組成物は、IFN−γに関係したいずれの疾患を
治療するのにも用いることができ、有効量の1種類またはそれ以上のアンタゴニ
ストおよび生理学的に許容しうる担体を混合することによって製造することがで
きる。
有用な薬剤担体は、本発明の組成物を患者に対して供給するのに適当な任意の相
溶性無毒性物質でありうる。滅菌水、アルコール、脂肪、ロウおよび不活性固体
は担体中に含まれることができる。薬学的に許容しうるアジュバント(緩衝剤、
分散助剤)も薬剤組成物中に包含されることができる。概して、このような薬剤
の非経口投与に有用な組成物は周知である。例えば、Rem1n ton’ s
Pharmaceutical 5cience、第15版(マッグ・/<ブリ
ッジング・カンパ=−(Mack Publishing Company)、
イーストン、PA、1980年)。例えば、滅菌状態の1回用量個装がしばしば
好適である。
或いは、本発明の組成物は、植込み可能な薬剤供給システムによって患者体内に
導入することができる[アーカート(Urquhart)ら、Ann。
Rev、PharmacoL、Toxicol、24+199 (1984)]
。
このような担体は当業者に周知である。アンタゴニストは、更に、リポソーム中
に包含することができるし、または組織中への直接DNA注射、組換え体ウィル
スベクターの使用およびトランスフェクトされた細胞の植込みなどを含む標準的
な遺伝子療法技術によって供給することができる。例えば、ローゼンバーグ(R
osenberg)、J、Cl1n、0nco1.10:180 (1992)
を参照されたい。
特定の場合に適切なアンタゴニスト投薬量の決定は、当該技術の範囲内である。
概して、治療は、最適未満のより少ない投薬量で開始される。したがって、投薬
量は、その状況下において最適効果が達成されるまで少量ずつ増加される。便宜
上、所望ならば全日用量を分割し且つ当日中に少量ずつ投与してよい。
アンタゴニストおよび薬学的に許容しつるその塩の投与量および回数は、担当医
師の判断にしたがって、患者の年齢、状態および体格並びに治療される1種類ま
たは複数の症状などの因子を考慮して調節される。
実施例
本発明は、以下の非制限実施例によって例証することができる。特に断らない限
り、固体混合物中の固体、液体中の液体および液体中の固体について以下に与え
られた百分率は、それぞれ重量/重量、容量/容量および重量/容量基準である
。
試薬および細胞
組換えヒトIFN−γAおよびD[Jt活性約5x106単位/mg;ゼーリグ
(Seeljg) ら、Biochemistry 27:1981 (198
8)コを、本質的には米国特許第4,751,078号明細書に記載のように、
形質転換された大腸菌(E、coli)から製造し且つ精製した。
C0LO−205細胞(ATCCCLL 222)を用いて、クラスII主要組
織適合性抗原(HLA−DR)のインターフェロンによる誘導を測定した。
細胞上の抗原の存在は、酵素結合イムノソルベント検定法(エリザ)によって、
ペルオキシデート標識ヤギ抗マウスIgGと結合したマウス単りローン性抗HL
A−DR抗体(ベンクトン・ディキンソン(Becton−Dickinson
)カタログ番号7360)を用いて検出された。2,2′−アジノービス(3−
エチルベンズチアゾリン−6−スルホン!!2)(ABTS;キルケガード・ア
ンド・ベリー・ラブズーインコーポレーテッド(Kirkegaard &Pe
rry Labs、、Inc、)、ゲイサーズバーグ、MD)を用いて生じた色
を、分光光度測定によって405nmで測定した。
いて行なった。ポリペプチド濃度は、気相HCIおよび150℃で1時間のイン
キュベーションを用いるアミノ酸分析によって決定された。
ウサギまたはマウス抗体は、室温で直接固相エリザを用いて抗原の特異的結合に
ついてスクリーニングされた。96ウ工ル微量滴定プレー) (NUNC,イン
タームド(Intermed)、デンマーク)を、抗原100μl/ウエルによ
って室温で1時間被覆した。プレートを、0.05%トウイーン(TWEEN)
20(ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート)含有トリス緩衝塩類溶液
(TBS) 、pH7,5で5回洗浄した。続いて、プレートを1%ウシ血清ア
ルブミン(BSA)で1時間ブロックし、TBSで5回洗浄し、そして西洋ワサ
ビ大根のペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスIgGまたはヤギ抗マウスIgGの
2.5ngで被覆した。
1時間のインキュベーション後、プレートをTBSで5回洗浄し、そして2゜2
′−アジノービス[3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸] (ABT
S)かまたは3. 3’ 、5. 5’−テトラメチルベンジジン(TMB)お
よび過酸化水素を各ウェルに加えることによって発色させた。20分後に、TM
B用にスルフリック(sulfuric)含有溶液またはABTS用にドデシル
硫酸ナトリウムを加えることによって発色を停止し、そして試料を、モレキュラ
ー・デバイス(Molecular Device)zリザリーダーを用いて、
ABTSおよびTMBについてそれぞれ405nmおよび450nmで読取った
。
イムノソルベント検定法は、以下のようにピン上に固定されたポリペプチドで行
なわれた。ピンは、標準的な96ウ工ル微量滴定プレート上にピンを逆さにし且
つ1%BSAおよび1%オボアルブミン含有リン酸緩衝溶液(P B S)中で
インキュベートすることによって1時間ブロックされた。次に、ピンを、上記P
BS溶液中で希釈された一次抗体中において4℃で一晩中インキユベートした後
、0.05%トウィーン20含有PBSで洗浄した。次に、ピンを適当な西洋ワ
サビ大根のペルオキシダーゼで標識された複合体と一緒にインキュベートし、洗
浄し、そして前記のように比色分析検出によって発色させた。
IFN−γ受容体の臨界的部分の識別
抗イデイオタイプ抗体を用いて、ヒトIFN−γ受容体の臨界的部分を[1する
ための分析を行なった。この抗体は、アミノ酸配列がヒトIFN−γの一部分の
それに対応しているポリペプチドに特異的なIgG抗体部分に対して製造されて
おり、IFN−γ自体を模擬することによってIFN−γ受容体に対して特異的
に結合する。抗イデイオタイプ抗体についての完全な説明は、国際出願公開第W
0 92106115号明細書に見出される。
分析は、最初に、ヒトIFN−γ受容体の連続的に重複する部分に対応するポリ
ペプチド八量体を合成した後、標準的なエリザによって、抗イデイオタイプ抗体
に結合したのがその六量体の内のどれかを決定することによって行なわれた。
重複する六量体ポリペプチドは、ゲイセン(Geysen)ら[P r o c
。
コの方法を用いて、96ビンフオーマツト中のポリエチレンピン上で合成された
。ポリペプチドは、Fmoc/l−ブチル保護基を用いて合成さね、カップリン
グされたアミノ酸は極めて活性なペンタフルオロフェニルおよびオキソ−ベンゾ
トリアジンエステルであった。約20〜50ピコモルのペプチドが各ピン上で合
成されたと推定された。
前記分析に基づいて、アミノ酸配列がヒトIFN−γ受容体の臨界的部分のそれ
に対応する多数のポリペプチドが合成された。
ポリペプチド
配列番号:5〜8で定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを、メリフィ
ールドCJ、Am、Chem、Soc、85 :2149 (1963)]の固
相法を用いて合成した。アライド・バイオシステムズ(AppliedBios
ysems)(フォスター・シティ−1CA)430A型固相ペプチド合成機を
t−ブチルオキシカルボニル化学と一緒に用い、ポリペプチドをPAM樹脂樹脂
組立てた。フッ化水素を用いてポリペプチドを樹脂から開裂させた後、TFA/
アセトニトリルの逆相クロマトグラフィー溶媒系によって20m1 Pep/R
PCカラムを用いるファーマシア(PHARMACIA)FPLC1’ポリペプ
チドを精製した。
配列番号:5で定義されたポリペプチドのいくつかのシスティン基は、標準法に
より、除去されないアセトアミドメチル保護基で修飾された。以下に記載のデー
タのいくつかは、このスルフヒドリルでブロックされたポリペプチドを用いて得
られた。
自動エドマン(Edman)分解によるアミノ酸配列決定は、ポリペプチドの配
列を確証した。FAB質量スペクトル分析は、8kVの加速電圧で操作するVG
ZAB−3E二重焦点質量分析計で行なわれた。円二色性測定は、室温におい
てタンパク質濃度1.0mg/mlに1.0cm路長セルを用いるIBM共通の
ジャスコ(Jasco)500C分光偏光計で行なわれた。
抗ポリペプチド抗体
配列番号:5(スルフヒドリルブロックを伴うおよび伴わない)および配列番号
二6〜8で定義された配列を有するポリペプチドに対する抗体は、ニューシーラ
ントホワイト(New Zealand White)ウサギ(ベーゼルトン・
ラブダ(Hazelton Labs)において、等量の完全フロインドアジュ
バントで乳化された各種ポリペプチド0.5〜1.0mgを含むpH7,1水溶
液500μl容量による皮内免疫感作(注射部位当たり0.1m1)によって生
産された。不完全フロインドアジュバント巾約0.25〜0.5mgのポリペプ
チドを含むブースター注射は、ポリペプチドに対するおよびIFN−γ受容体に
対するエリザ応答によって判定されるように、必要に応じて約4週間間隔で投与
された。
このように製造された抗血清のエリザは、試験された抗体全部が、抗体産生を引
き起こすのに用いられたポリペプチド抗原に対して反応性であったことを示した
。更に、配列番号=5(ブロックされたスルフヒドリル基を伴う)および配列番
号:8で定義された配列を有するポリペプチドに対する抗体は、IFN−γ受容
体に対して結合した。おそらく、他のポリペプチドに対する抗体も受容体に対し
て結合するが、これは実験的に確認されなかった。
HLA−DR誘導の阻害
IFN−γによるHLA−DR抗原発現の誘導に対するポリペプチドアンタゴニ
ストの効果の決定は、本質的にはギプソン(G i b s o n)ら[J。
Immuno 1.Me th、125 :103 (1989)]によって記
載されたように定量された。簡単にいうと、対照培地および配列番号:5(Cy
sスルフヒドリル基にブロックされた)で定義されたポリペプチドの種々の培地
中希釈を、微量滴定プレートウェル中の0.1ml容量中の一定濃度(150p
M)のインターフェロン存在下において37℃で1時間インキュベートした。
インキュベージシン後、各ウェルから培地を除去し、ウェルを培地で3回洗浄し
た。培地のアリコート(0,1m1)をウェルに加え、そしてプレートを37℃
で48時間インキュベートして、IFN−γにょるHLA−DR抗原発現を誘導
させた。
ウェルをリン酸緩衝溶液(PBS;0.02Mリン酸ナトリウム、0.15MN
aCL pH7,4)0.2mgで洗浄した後、水冷無水エチルアルコールによ
って2分間固定した。アルコールを除去し、ウェルをPBS 0.2mgで1回
洗浄した。次に、0.5%ウシ血清アルブミン含有PBS中1=50希釈のマウ
ス単りローン性抗HLA−DR抗体50マイクロリットルを各ウェルに加え、そ
してプレートを室温で1時間インキュベートした。
ウェルをPBS 0.2mgで3回洗浄することによって過剰の試薬を除去した
後、1:5,000希釈のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgGO,1mg
を各ウェルに加えた。プレートを室温で1時間インキュベートした。各ウェルを
前記のようにPBSで3回洗浄した後、ABTSを加えることによって室温で5
〜10分間発色させた。吸光度は、エリザプレートリーダーを用いて405nm
で測定された。
配列番号:5(Cysスルフヒドリル基にブロックされた)で定義されたポリペ
プチドによって得られた結果を図1に示すが、そこにおいて、ポリペプチドアン
タゴニスト濃度の約10〜100μMまでの増加は、HLA−DR抗原発現の阻
害を漸進的に増加させたことが分かる。高濃度でのアンタゴニストは本質的に完
全な阻害を生じた。
実際には試験されなかったが、配列番号:2.5(非ブロツクスルフヒドリル基
)、配列番号6.7および8で定義された配列を有するポリペプチドは、同様の
活性を有すると考えられる。
図1で観察された阻害が、IFN−γに対するポリペプチドアンタゴニストの結
合の結果であったかどうかを決定するために、ポリペプチドの1100p溶液の
O,1mlアリコートを微量滴定プレートのウェル上に被覆し、そしてプレート
を1%BSAでブロックした。次に、種々の量のIFN−γをウェルに加え、そ
してプレートをインキュベートし且つ前記のようにエリザによって分析した。
特異的に結合したIFN−γは、中和ウサギ抗ヒトIFN−γ抗体を用いて比色
分析によって405 nmで検出された。
結果を図2に示すが、そこにおいて、飽和プラトーに達するまでは、固定された
ポリペプチドに対するヒトIFN−γの用量依存結合が存在していたことが分か
る(黒画角)。無関係のポリペプチドを代わりにプレートのウェル上に最初に被
覆した場合(白画角)、IFN−γ結合は観察されなかった。
ヒトIFN−γに対するポリペプチドの特異的結合は、核磁気共鳴(NMR)分
析によっても確証された。20mMリン酸塩、pH7,0中、5℃においてポリ
ペプチド濃度7.0mg/ml (2,66mM)で採取された遊離ポリペプチ
ドのNMRスペクトルは、ポリペプチドのみが極めて小さい二次構造を有するこ
とを示した。対照的に、同様の緩衝液中、5℃における組換え体ヒトIFN−γ
E存在下(6,7mg/ml ; 0.20mM)のポリペプチド(1,0mg
/ml ;o、38mM)のNMR分析は、IFN−γに対するポリペプチドの
特異的結合を示す核オーバーハウザー効果スペクトルを生じた。
本発明の多数の修正および変更は、その精神および範囲から逸脱することなく、
当業者に明らかになるように行なうことができる。本明細書中に記載された具体
的な実施態様は、単に例として与えられており、本発明は、請求の範囲の用語に
よってのみ制限されるべきである。
配列表
(2)81番号=1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)長さ:489アミノ酸
(B)種類二アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(i i)分子種類:タンパク質
(xi)配列種類:配列番号=1:
Mat Ala Leu L@u Phe L@u L@u Pro Leu
Val M@t C1n Gly Val Ear 入r9人1a C1u M
et にGly Thr Ala Asp L@u G11y Pro sar
Sur Val Pro Thr P秩B
20 25 ’ 30
Thr Asn Val Thr Xi@にlu Sir T’yr Asn
M@C^sn Pro X1* Val Tyr TrpC1u Tyr C1
n Ilo HaCPro C1n Val Pro Val Phe 1’h
r Val C1u Val L、y■
So 55 60
Asn Tyr Gly Val Lys Asn 5er にlu Trp
11@ Asp Ala Cys II@ 入sn IL彎Ser )lit
HLs Tyr Cym 入sn Ila s@r Asp His Val
C11y Asp Pro Sat 入Rn
as 90 95
Ser Leu Trp Val Arg Val Lys Ala Arg
Val C1!、T Oln Lys Glu 5@r λPa
”Pyr Ala Lys sar C1u C1u PhII Ala Va
l Cys Arg Asp にGly Lys IIs fly
Pro Pro しys Leu Asp Ile Arg L、ys にlu
Glu Lys Gin II@ H@t Il@ As■
11@ Pha )lis Pro Ser Val Ph@ Val Asn
cly Asp Glu C1n Asp Val As■
Tンr Asp Pro C1u Thr Thr Cys Tyr 工1@
入rg Val Tyr Ain Val ”r’yr V≠P
165 170 1’+5
Arg MeC^in C1y Ser C1u lie にin Tyr L
ys lie Leu Thr Gin Lys C1u180 1E15 ’
190
AspAspC’/SAMPGluIIsGinCysGinLau入1aII
sProValSar5*rL@u Asn S@r Gin Tyr Cys
Val S@r Ala C1u Gly Val Leu His Val
Trp210 、215 220
(i i)分子種類:ペプチド
(xi)配列種類:配ツリ番号:4:
入1a Xaa Xaa 入rg 入mp C1y Lys Ile C11y
Pro Pro Lys Lau Asp Ile 入xX
1 S 10 15
Lys Glu C1u Lym Gin H@ Mac Ile Asp I
l@Ph@)Iii Pro S@r Val PheVal 入sn Gly
Asp Glu Gin Asp Val Asp Tyr Asp Pro
C1u Thr Thr Cys(2)配列番号;5の情報・
(i)配列の特徴:
(A)長さ=22アミノ酸
(B)種類二アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)分子種類:ペプチド
(Xl)配列種類:配列番号 5:
入1a Tyr Cys 入rg 入ip Gly Lyi IleGly P
ro Pro Lym Lsu 入sp Iii 入r9Lym C1u C1
u Lys Gin l1e(2)配列番号=6の情報
(])配列の特徴:
(A)長さ・22アミノ酸
(B)種類、アミノ酸
(D)トポロジー、直鎖状
(i i)分子種類:ペプチド
(xl)配列種類、配列番号=6=
λla Val Cys λrg 入xp C1y Lym Iii C1y
Pro Pro Lym Lau λ1p 工1・ 入r91 S 10 1s
Lys Glu Glu Lys Gin Ile(2)翫ノリ番号=7の情報
:
(1)配列の特徴:
(A)長さ:22アミノ酸
(B)種類二アミノ酸
(D)トポロジー・直鎖状
(11)分子種類:ペプチド
(xi)配列種類:配列番号ニア:
λla Val S@r 入r9 人sp C1y Lyg Ile C11y
Pro Pro L、ys Lau Asp Ile A窒■
i S 10 、1s
Lys Glu C1u Lys Gin 1ie(2)翫lり番号:8の情報
・
(i)配列の特徴:
(A)長さ一16アミノ酸
(B)種類二アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(11)分子種類:ペプチド
(xi)配列種類:Uす番号:8・
入rg 入sp Gly Lys Ile C1y Pro Pro Lys
L@−八Hp 工1・ 入rg Lym C1u C1ul S 10 is
・1oi’l[−′4 (x 10−2)1丁;+;tri (405nm)
手続補正書
平成 7年タ月λλ−赦
0λ′[庁長官 高 島 章 殿
1、事件の表示
PCT/US93/111.10
2、発明の名称
ヒトγインターフェロンのアンタゴニスト3、補11をする晶
事件との関係 特許出願人
住所
名 称 シエリング・コーポレーション4、代理人
住 所 東車都千代m区大丁町二丁目2番1号新人手町ビル 2、特許
請求の範囲を以下の通り補正する。
「1. ヒトIFN−γ受容体の一部分であって、配列番号:2の配列によって
一定義されたアミノ酸配列を有する該部分のアミノ酸配列を模擬する、を含む
またはに対して特異的に結合するヒトIFN−γのアンタゴニスト。
2、 配列番号=3で定義されたコア配列を含み且つ配列番号=4で定義された
アミノ酸配列の約22〜48アミノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここにお
いて、2位および3位のXaaと表示された残基はそれぞれTyrまたはVal
およびSerまたはCysであることができ、そのCys残基のスルフヒドリル
基は遊離しているかまたはスルフヒドリル保護基でブロックされていることがで
きる請求項1に記載のアンタゴニスト。
3、 配列番号=2.5.6または7で定義されたアミノ酸配列を有する請求項
2に記載のポリペプチド。」
以上
PCT/LIS 93/11110
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT、BE、、CH,DE。
DK、ES、FR,GB、GR,IE、IT、LU、MC,NL、PT、SE)
、0A(BF、BJ、CF、CG、 CI、 CM、 GA、 GN、 LiL
、 MR,NE、SN。
TD、 TG)、 AU、 BB、 BG、 BR,BY、 CA。
CZ、FI、HU、JP、KR,KZ、LK、LV、MG、 MN、 MW、
No、 NZ、 PL、 R○、RU、SD、SK、UA、US、UV、VN
Claims (12)
- 1.ヒトIFN−γ受容体の一部分であって、配列番号:2の配列によって定義 されたアミノ酸配列を有する該部分のアミノ酸配列を模擬する、を含むまたはに 対して特異的に結合するヒトIFN−γのアンタゴニスト。
- 2.配列番号:3で定義されたコア配列を含み且つ配列番号:4で定義されたア ミノ酸配列の約22〜48アミノ酸残基を含むポリペプチドであり、ここにおい て、2位および3位のXaaと表示された残基はそれぞれTyrまたはValお よびSerまたはCysであることができ、そのCys残基のスルフヒドリル基 は遊離しているかまたはスルフヒドリル保護基でブロックされていることができ る請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 3.配列番号:2、5、6または7で定義されたアミノ酸配列を有する請求項2 に記載のポリペプチド。
- 4.配列番号:2の配列の一部分または全部によって定義されたアミノ酸配列を 有するポリペプチドのエピトープに対しておよびヒトIFN−γ受容体に対して 特異的に結合する抗体またはそのフラグメントである請求項1に記載のアンタゴ ニスト。
- 5.配列番号:2、5、6、7または8で定義されたアミノ酸配列を有するポリ ペプチドに対して特異的に結合する請求項4に記載のアンタゴニスト。
- 6.配列番号:2の配列の一部分または全部によって定義されたアミノ酸配列を 有するポリペプチドのエピトープに対しておよびヒトIFN−γ受容体に対して 特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに対して産生された抗イディオタ イプ抗体またはそのフラグメントである請求項1に記載のアンタゴニスト。
- 7.ヒトIFN−7の生物学的活性を阻害する方法であって、ヒトIFN−γ受 容体の一部分の、配列番号:2の配列で定義されたアミノ酸配列を有する該部分 のアミノ酸配列を模擬する、を含むまたはに対して特異的に結合するヒトIFN −γのアンタゴニストと、ヒトIFN−アまたはヒトIFN−γ受容体含有細胞 を接触させることを含む上記方法。
- 8.前記アンタゴニストが、配列番号:3で定義されたコア配列を含み且つ配列 番号:4で定義されたアミノ酸配列の約22〜48アミノ酸残基を含むポリペプ チドであり、ここにおいて、2位および3位のXaaと表示された残基はそれぞ れTyrまたはValおよびSerまたはCysであることができ、そのCyS 残基のスルフヒドリル基は遊離しているかまたはスルフヒドリル保護基でブロッ クされていることができる請求項7に記載の方法。
- 9.前記ポリペプチドが、配列番号:2、5、6または7で定義されたアミノ酸 配列を有する請求項8に記載の方法。
- 10.前記アンタゴニストが、配列番号:2、5、6または7で定義された配列 の一部分または全部によって定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのエ ピトープに対しておよびヒトIFN−γ受容体に対して特異的に結合する抗体ま たはそのフラグメントである請求項7に記載の方法。
- 11.前記ポリペプチドが、配列番号:2、5、6、7または8で定義されたア ミノ酸配列を有する請求項10に記載の方法。
- 12.前記アンタゴニストが、配列番号:2の配列の一部分または全部によって 定義されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのエピトープに対しておよびヒト IFN−γ受容体に対して特異的に結合する抗体またはそのフラグメントに対し て産生された抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである請求項7に記 載の方法。
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US980,527 | 1992-11-20 | ||
PCT/US1993/011110 WO1994012531A1 (en) | 1992-11-20 | 1993-11-19 | Antagonists of human gamma interferon |
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