JP3970311B1

JP3970311B1 - 新生血管阻害剤，ＤＮＡ合成阻害剤，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤及び医療用キット

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Publication number: JP3970311B1
Application number: JP2006237080A
Authority: JP
Inventors: 忠尚鍵本; 淳和田; 芳東; 茂之米田
Original assignee: アキュメンバイオファーマ株式会社
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2006-09-01
Publication date: 2007-09-05
Anticipated expiration: 2026-09-01
Also published as: JP2009155205A; WO2008026320A1

Abstract

【課題】新生血管が関連する疾患の治療に有効な新規ペプチド又はその薬理学的に許容される塩，血管新生阻害補助剤，血管新生阻害剤，医療用組成物，及び医療用キットを提供する。
【解決手段】ＥｐｈＢ４に対する抗体又はその薬理学的に許容される塩と；(i)特定のアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)この特定のアミノ酸配列において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩と；を含有する医薬用組成物又は医療用キット。
【選択図】図１

Description

本発明は，ＥｐｈＢ４に対する抗体及びエフリンＢ２の部分ペプチドを含む新生血管阻害剤及び医療用キットなどに関する。

新生血管は，加齢黄斑変性，糖尿病性網膜症，及び未熟児網膜症のような種々の眼病理症状の顕著な特徴である。したがって，新生血管を阻害し，これらの疾患を治療又は予防できる医薬が望まれる。一方で血管が新生されることは，生体が正常に機能する上でも重要である。そこで，網膜外に向かう病的な血管形成または血管新生を抑制し，かつ網膜中において血管網が形成されることや，血管が成熟することを増強するような医薬が望まれる。

大野京子“加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構−特に色素上皮由来因子の役割について−”日本眼科学界雑誌（Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆＯｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌＳｏｃｉｅｔｙ）Ｖｏｌ．１０７, Ｎｏ．１１，ｐｐ．６５７−６７３，２００３（下記非特許文献１）には，以下の内容が開示されている。“加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は，先進諸国における５０代以上の失明原因の常に上位を占める重要な疾患であり，人口の高齢化に伴いますますその頻度は増加しつつある。しかしながら，ＡＭＤにおける脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）の分子機構は未だ完全には解明されていない。従来から網膜色素上皮（ＲＰＥ）が産生する血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現上昇がＣＮＶ発生に重要であるとされてきたが，トランスジェニックマウスの結果などからＶＥＧＦ単独ではＣＮＶ発生には不十分であると考えられる。ＣＮＶは無血管である網膜外層に新生血管が侵入していく現象であり，この場合には正常で血管侵入を抑制している抑制因子の発現低下の方が重要ではないかと我々は考えた。そして，近年明らかになった最強の血管新生抑制因子，色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）に注目し，加齢や酸化ストレスによって生じるＲＰＥの分化状態の崩れがＰＥＤＦの発現低下を惹起し，その結果生じるＶＥＧＦとＰＥＤＦのバランスの崩れがＣＮＶ発現の引き金を引くのではないかというメカニズムを明らかにした。”

Ｔ．Ｋｏｎｄｏｅｔａｌ．，“ＰＫＣ／ＭＡＰＫＳｉｇｎａｌｉｎｇＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＲｅｔｉｎａｌＰｅｒｉｃｙｔｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍＰｒｅｖｅｎｔｓＲｅｔｉｎａｌ
ＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０３，ｐｐ．３７８−３８６，２００５（下記非特許文献２）のＦｉｇ６では，ｐ４４／４２ＭＡＰＫの抑制が，細胞増殖及び脈絡膜の血管新生の抑制と強い相関性があることが示されている。

ＷＯ２００６／００６０７９号公報（下記特許文献１）には，エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞のＤＮＡ合成の阻害作用を有すること；エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫ活性化の阻害作用を有すること；エフリンＢ２が，眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有することが示されている。同文献では，その実施例３において，ＣＮＶ（脈絡膜新生血管）モデルを用いてエフリンＢ２が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の治療に有効であることが示されている。しかしながら，本発明の抗体や本出願の配列番号２〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。

エフリンＢ２に関して，さらに以下の文献が知られている。ＷＯ２００２/２６８２７号公報（特許文献２）には，エフリンＢ２が開示されている。そして，エフリンを目の血管新生の遺伝子治療剤として用いるとの記載がある（１頁４行目〜１２行目）。しかし，特許文献２は，エフリンＢ２が新生血管の成長を抑圧するものであるのか，正常血管網の形成を促進するものであるかについては何らの示唆もない。また，特許文献２は，エフリンＢ２の実施例として，腫瘍細胞の阻害実験しかしていないので，エフリンＢ２と新生血管との関係や，エフリンＢ２と正常血管との関係などについては何ら実証されていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号２〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。

特表平１０-５０２８１０号公報（特許文献３）のＬＥＲＫ-５は，エフリンＢ２に相当するものと考えられる。そして，特許文献３の実施例１では，ヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡが単離され，実施例７ではヒトエフリンＢ２（細胞外ドメイン）とＦｃの融合タンパク質がレセプターのリン酸化を刺激することをｉｎ
ｖｉｔｒｏ(試験管内)実験で実証している。しかしながら，特許文献３では，エフリンＢ２を神経性疾病へ用いることのみが意図されており（２１頁２３行目〜２２頁２行目），新生血管関連疾患への用途は記載されていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号２〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。

特表平１０-５０１７０１号公報（特許文献４）の“Ｈｔｋリガンド”は，エフリンＢ２に相当するものと推定される。特許文献４では，Ｈｔｋリガンドの用途として，神経変性の治療があげられているが（６０頁７行目〜６３頁９行目），Ｈｔｋリガンドを新生血管など抑制などに用いる点は記載も示唆もされていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号２〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。

特表２００２-５１１４１７号公報（特許文献５）には，エフリンＢ２が，腫瘍による血管新生を増強等するとの記載がある(特許文献５の段落［００６２］)。よって，エフリンＢ２を，新生血管を阻害するために用いることについて動機付けとなるものはない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号２〜配列番号４で表されるペプチドは開示されていない。
ＷＯ２００６／００６０７９号公報ＷＯ２００２／２６８２７号公報特表平１０−５０２８１０号公報特表平１０−５０１７０１号公報特表２００２−５１１４１７号公報大野京子"加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構−特に色素上皮由来因子の役割について−"日本眼科学界雑誌Ｖｏｌ．１０７，Ｎｏ．１１，ｐｐ．６５７−６７３，２００３Ｔ．Ｋｏｎｄｏｅｔａｌ．，"ＰＫＣ/ＭＡＰＫＳｉｇｎａｌｉｎｇＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙＲｅｔｉｎａｌＰｅｒｉｃｙｔｅＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄＭｅｄｉｕｍＰｒｅｖｅｎｔｓＲｅｔｉｎａｌＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ"，Ｊｏｕｒｎａｌｏｆｃｅｌｌｕｌａｒｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０３，ｐｐ．３７８−３８６，２００５

本発明は，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新生血管阻害剤，医療用キットなどを提供することを目的とする。

本発明は，基本的には，エフリンＢ２の受容体であるＥｐｈＢ４に対する抗体（又は当該抗体と配列番号２などの低分子ポリペプチドをとあわせたもの）を投与することで，新生血管の発生を阻害できるという知見に基づくものである。さらに，本発明は，配列番号２などの低分子ポリペプチドとＥｐｈＢ４に対する抗体を別々に投与すると，これらを同時に投与した場合に比べて，新生血管阻害活性を著しく高めることができるという知見に基づくものである。

すなわち，本発明の第１の側面は，ＥｐｈＢ４に対する抗体（又は当該抗体とエフリンＢ２の部分ペプチド）を含有する新生血管阻害剤に関する。後述の実施例により実証されたとおり，これらはｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性を示し，したがって，新生血管阻害剤，特に眼内の新生血管阻害剤として有用である。より具体的には，本発明の第１の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含有する新生血管阻害剤に関する。そして，本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記抗体が，ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体である上記に記載の新生血管阻害剤に関する。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，配列番号１において，１個，２個又は３個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含有する新生血管阻害剤に関する。実施例においては，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の活性を実測したが，配列番号１において，１個，２個又は３個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体も実質的に同様な機能を有し，実施例で実証された抗体と同様，新生血管阻害剤，特に眼内の新生血管阻害剤として有用であるといえる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する新生血管阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり，前記抗体とともにペプチドを投与すると新生血管の阻害活性が高まるので，この実施態様にかかる新生血管阻害剤は，有用な新生血管阻害剤であるといえる。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，又は配列番号３において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩のいずれか又は両方を含有する上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩を含有する，上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号５において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，及び“配列番号６において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下（好ましくは２０以下）であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩を含有する，上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。後述する実施例により実証されたとおり，前記抗体とともにペプチドを投与すると新生血管の阻害活性が高まるので，これらの実施態様にかかる新生血管阻害剤は，有用な新生血管阻害剤であるといえる。なお，配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドには，配列番号７で表されるアミノ酸配列，及び配列番号８で表されるアミノ酸配列の両方のアミノ酸配列を具備するペプチドも含まれる。配列番号７及び配列番号８は，それぞれ配列番号５で表されるアミノ酸配列において４位−９位，及び１３位―１６位に位置するアミノ酸配列であるから，その双方を含む配列は配列番号７部分と配列番号８部分との間に，１個以上６個以下，好ましくは２個，３個又は４個のアミノ酸残基が挿入されたものが好ましい。その場合のペプチドはアミノ酸残基の数が１４以上，１００以下（好ましくは２０以下）であることが好ましい。配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに；配列番号７で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，及び配列番号８で表されるアミノ酸配列からなるペプチドのいずれか又は両方が含まれていてもよい。

本発明の第１の側面の好ましい態様は，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療剤又は予防剤である上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療剤又は予防剤である上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。本発明の第１の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療剤である上記いずれかに記載の新生血管阻害剤に関する。すなわち，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び低分子ペプチドは，新生血管の阻害能を有するので，各種疾患の治療又は予防に有効である。

本発明の第２の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ＤＮＡ合成阻害剤に関する。また，本発明の第２の側面の別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び“配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ＤＮＡ合成阻害剤に関する。

後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び低分子ペプチドは，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害能を有するので，ＤＮＡ合成阻害剤として有効に機能する。特に，本発明の抗体及び低分子ペプチドは，眼内における新生血管に関するＤＮＡ合成阻害剤として有効である。

本発明の第３の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤に関する。また，本発明の第３の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び“配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤に関する。

後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び低分子ペプチドは，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害能を有する。特に，本発明の抗体及び低分子ペプチドは，眼内における新生血管に関する疾患を治療又は予防するためのｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤として有効である。

本発明の第４の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号３において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有し，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチドであって，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号５において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号６において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有し，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチドであって，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物とを含有する医療用キットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療用キットである上記いずれかに記載のキットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，“加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療又は予防用キットである上記いずれかに記載のキットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用キットである上記いずれかに記載のキットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療用キットである上記いずれかに記載のキットに関する。

本発明の第４の側面の上記と別の態様は，前記第１の組成物が投与された後に，前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。

後述する実施例により実証されたとおり，本発明によれば，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新生血管阻害剤，ＤＮＡ合成阻害剤，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤及び医療用キットなどを提供できる。

本発明の第一の側面は，配列番号１（「ヒト，マウスなどの高等哺乳動物のＥｐｈＢ４の，Ｎ末端シグナル配列を除いた細胞外ドメイン（１６番目から５３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド）」）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体を含有する新生血管阻害剤に関する。すなわち，本発明の第一の側面は，有効量の発明の抗体を有効成分として含有する新生血管阻害剤に関する。有効量とは，新生血管の発生を阻害するために十分な量を意味し，患者によって適宜調整すればよい。

本発明の抗体は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；又は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体とともに，又は当該抗体に替えて；配列番号１において，１個，２個又は３個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体である。本発明の抗体は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又は配列番号１において，１個，２個又は３個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下，「本発明の細胞外領域ペプチド」ともよぶ。）を認識しうる抗体であれば，ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体のいずれであってもよいし，キメラ抗体，ＣＤＲ移植抗体，及びヒト抗体（完全ヒト抗体を含む）であってもよい。

配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチド（より具体的にはヒト由来のＥｐｈＢ４の細胞外ドメインに位置する２０１番目〜４００番目のアミノ酸残基からなるペプチド）に対するウサギポリクローナル抗体は，サンタクルズバイオテクノロジー社（ＳＡＮＴＡ＿ＣＲＵＺ＿ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ）のＥｐｈＢ４（Ｈ−２００）：ｓｃ−５５３６として，販売されている。また，ＥｐｈＢ４の細胞外ドメインを構成するポリペプチドに対するモノクローナル抗体は，例えば，Ｒ＆Ｄシステムズ社からカタログ番号ＩＡＰ０２として，販売されている。すなわち，本発明の抗体は，市販されているものを適宜用いてもよい。また，本発明の抗体は，公知の抗体の産生方法に従って，製造してもよい。本発明の細胞外領域ペプチドを抗原として用い，公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。本発明の抗体単独で，又は下記に説明する本発明のペプチドと合わさって，ＭＡＰＫリン酸化活性阻害能を有するので，公知の製剤化のための方法を適宜採用することで，本発明のペプチドを含有する新生血管阻害剤に用いることができる。

本発明の細胞外領域ペプチドは，ヒトや哺乳動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできる。また，本発明の細胞外領域ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また，後述するタンパク質合成法またはこれに準じた公知の方法により製造することもできる。

本発明の細胞外領域ペプチドを，ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合，ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後，酸などで抽出を行ない，得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより単離・精製することができる。

目的の抗体を得るための抗原エピトープは，たとえば，本発明の細胞外領域ペプチドのアミノ酸配列において抗原性の高い領域，表在性がある領域，二次構造をとらない可能性のある領域，他の蛋白質とホモロジーがないか又は低い領域から適宜選択されればよい。ここで抗原性の高い領域は，Ｐａｒｋｅｒらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５巻，５４２５−５４３２頁（１９８６年）］によって推定することができる。表在性がある領域や二次構造をとらない可能性のある領域は，すでに発表されているＥｐｈＢ４の立体構造解析の結果［（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１４巻，３２１−３３０頁（２００６年）］から同定することができる。さらに，表在性がある領域は，相同性の高いＥｐｈＢ２受容体の立体構造解析の結果［（Ｎａｔｕｒｅ，４１４巻，９３３−９３８頁（２００１年）］から推定することもできる。また，表在性がある領域は，例えばハイドロパシーインデックスを計算し，プロットすることによって推定することができる。二次構造をとらない可能性のある領域は，例えば，ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎの方法［Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，４７巻，４５−１４８頁（１９７８年）］によって推定することができる。本発明の細胞外領域ペプチドのうち配列番号１において，１個，２個又は３個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，上記の指針に基づき抗原性の高くない領域においてアミノ酸を欠失，置換，挿入若しくは付加すればよい。

上記の手法で推定された本発明のポリペプチドのアミノ酸配列又はその部分アミノ酸配列を基に，ペプチド合成法を利用することによって該アミノ酸配列からなるペプチドを合成することができる。目的のペプチドは，例えば，Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ［Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２巻，３４１−３４７頁（１９８６年）］によって開発された固相ペプチド合成に基づいた市販のペプチド合成機を使用して合成し，保護基を脱離後，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製すればよい。

ポリクローナル抗体の製造方法は公知であるので，ポリクローナル抗体は公知の製造方法に従って製造すればよい。すなわち，得られたポリペプチドを抗原として動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物など。以下同様。）に免疫し，血清等を分離することにより目的とするポリクローナル抗体を製造できる。宿主細胞としては，原核生物（例えば大腸菌のような細菌）および真核生物（例えば酵母，CHO細胞，昆虫細胞等）のいずれも使用され得る。宿主動物から得られた血清から，抗原に結合する画分を集め，精製することにより，ポリクローナル抗体を取得することができる。

モノクローナル抗体の製造方法は，公知であるので，モノクローナル抗体は公知の製造方法に従って製造すればよい。たとえば，得られたポリペプチドを抗原として動物に免疫し，その動物の脾臓細胞などの抗体産生細胞を分離し，ミエローマ細胞などの骨髄腫細胞と細胞融合させてハイブリドーマを作成した後，このハイブリドーマを培養することによりモノクローナル抗体を製造できる。また，ハイブリドーマ細胞を形成するために，ポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いて，リンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより，モノクローナル抗体を作製することができる[Ｇｏｄｉｎｇ，ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＰｒｉｎｃｉｐａｌｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁，Ａｃａｄｅｍｉｃｐｒｅｓｓ，（１９８６年）]。例えば本発明のモノクローナル抗体は，ハイブリドーマ法［Ｎａｔｕｒｅ，２５６巻，４９５頁（１９７５年）］を用いても，組換えＤＮＡ法（Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４８１６５６７号）を用いても作製することができる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては，抗原を免疫された温血動物，例えば，マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し，それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより，モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は，例えば，後記の標識化レセプタータンパク質と抗血清とを反応させたのち，抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法，例えば，ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），２５６巻，４９５頁（１９７５年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては，例えば，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられ，好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞として，例えば，ＮＳ−１，Ｐ３Ｕ１，ＳＰ２／０などが挙げられるが，Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり，ＰＥＧ（好ましくは，ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され，約２０〜４０℃，好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。

モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが，例えば，レセプタータンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例，マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し，次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合，抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え，固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法，抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し，放射性物質や酵素などで標識したレセプタータンパク質を加え，固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は，公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが，通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては，ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば，１〜２０％，好ましくは１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地，１〜１０％の牛胎児血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１，日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は，通常２０〜４０℃，好ましくは約３７℃である。培養時間は，通常５日〜３週間，好ましくは１週間〜２週間である。培養は，通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は，上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は，通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例，塩析法，アルコール沈殿法，等電点沈殿法，電気泳動法，イオン交換体（例，ＤＥＡＥ）による吸脱着法，超遠心法，ゲルろ過法，抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し，結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。

キメラ抗体とは，抗体のうち可変領域のみを非ヒト由来とし，定常領域をヒト由来とした抗体である。また，定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体，例えばマウス-ヒトキメラ抗体は，Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許４８１６５６７およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ，８９巻，６８５１頁（１９８４年））に開示される方法に従って製造すればよい。また，特許第３４４０１０４号公報に記載される「（１）ヒト抗体重鎖定常領域Ｃγ1をコードするｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入することによりカセットベクターを構築し，該カセットベクターにヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け，（２）ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを制限酵素を用いて切り出し，（３）ヒト抗体重鎖定常領域の５’末端側の塩基配列と，ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域の３’末端側の塩基配列とからなり，制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡと，上記（２）で得られたヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡとを該カセットベクターに挿入することにより，該合成ＤＮＡを介してヒト抗体重鎖定常領域Ｃγ1をコードするｃＤＮＡとヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域をコードするｃＤＮＡとが結合されたヒト型キメラ抗体重鎖発現ベクターを構築し，（４）ヒト抗体軽鎖定常領域ＣκをコードするｃＤＮＡを動物細胞用発現ベクターに挿入することによりカセットベクターを構築し，該カセットベクターにヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを挿入するためのクローニングサイトを設け，（５）ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを制限酵素を用いて切り出し，（６）ヒト抗体軽鎖定常領域の５’末端側の塩基配列と，ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域の３’末端側の塩基配列とからなり，制限酵素部位を両端に有する合成ＤＮＡと，上記（５）で得られたヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡとを該カセットベクターに挿入することにより，該合成ＤＮＡを介してヒト抗体軽鎖定常領域ＣκをコードするｃＤＮＡとヒト以外の動物の抗体軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡとが結合されたヒト型キメラ抗体軽鎖発現ベクターを構築し，（７）上記（３）で得られたヒト型キメラ抗体重鎖発現ベクターおよび上記（６）で得られたヒト型キメラ抗体軽鎖発現ベクターを動物培養細胞に導入し，（８）上記（７）で得られた動物培養細胞を培地中に培養し，培養物中にヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ，該培養物からヒト型キメラ抗体を採取することを特徴とするヒト型キメラ抗体の製造法。」や，特許第２６２４３１４号公報に開示される相同組換えによるキメラ抗体の製造方法，すなわち「修飾抗体分子を発現する細胞系を製造する方法であって，（ａ）抗体生産リンパ細胞系を，（ｉ）リンパ細胞系の免疫グロブリン遺伝子のゲノム配列の一部分を修飾する置換遺伝子，および(ｉｉ)変換される免疫グロブリン配列に隣接する第２ＤＮＡ配列に相同性の標的配列，を含む標的ベクターで，置換遺伝子が生体内でゲノム染色体ＤＮＡと共に部位特異性相同組換えにより免疫グロブリン配列を修飾するようにトランスフェクトし，（ｂ）修飾抗体分子を生産するトランスフェクタントを選択する，ことを含む方法」によって製造してもよい。

ＣＤＲ移植抗体とは，抗体の定常領域のうち抗原との結合に関与する領域のみを非ヒト由来とした抗体である。定常領域および超可変領域（または，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ-ＤｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＲｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒト化抗体は，Ｃａｒｔｅｒら, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ，８９巻，４２８５ページ（１９９２年）又はＣａｒｔｅｒら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０巻，１６３頁，（１９９２年）]に開示される方法に従って製造すればよい。これら抗体をヒトに投与した場合，異種抗原に対する抗体，たとえばヒト抗マウス抗体(ＨＡＭＡ)などの出現が起こらないようにするために，キメラ抗体やモザイク抗体もしくはヒト化抗体の使用が好ましく，最も好ましくは完全ヒト抗体である。

「キメラ抗体」や「ヒト化抗体」はマウス抗体断片を依然含み，「ＨＡＭＡ (ｈｕｍａｎａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ) / ＨＡＣＡ (ｈｕｍａｎ anti−ｃｈｉｍｅｒｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ)反応」を引き起こすことがある。このような反応を惹き起こさない抗体を産生するためには，Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔａｌ., ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔ．, ７：１３−２１，１９９４.に記載される方法に従って，マウスの液性免疫系をヒトに置き換えたトランスジェニックマウスを創成すればよい。具体的には，１）イムノグロブリン(Ｉｇ)重鎖(ＩｇＨ)遺伝子不活性化マウスを創成する。２）Ｉｇ軽鎖(ＩｇＫ)遺伝子不活性化マウスを創成する。３）ヒトＩｇＨ遺伝子導入マウスを創成する。４）ヒトＩｇＫ遺伝子導入マウスを創成する。５）これらマウスの交配により，“マウス由来Ｉｇ遺伝子不活性化及びヒト由来Ｉｇ遺伝子導入マウス”を創成する。ＩｇＨおよびＩｇＫの不活性化マウスの創成にはジーンターゲテイング法，ヒトＩｇＨおよびＩｇＫの導入マウスの創成にはヒトゲノムを組み込んだ酵母人工染色体(ＹＡＣ)ライブラリーからクローニングされたヒトＩｇＨおよびＩｇＫ遺伝子を用いればよい。ヒトＩｇＨおよびＩｇＫ遺伝子を含むＹＡＣ(ＨＰＲＴ+)を保持する酵母をＨＰＲＴ-のＥＳ細胞とスフェロプラスト融合し，ＨＡＴ選択し，ジーンターゲテイング法と同様な方法で生殖系列を得ればよい。「抗体」は，マウスまたは他の適した宿主動物（たとえばウサギ，ウシ，ウマ，ヒツジ，ブタ，げっ歯類など）を免疫に用いられた蛋白質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか，産生するであろうリンパ球を引き出すために，皮下，腹腔内，または筋肉内の経路によって，抗原あるいは抗原発現細胞により免疫化することによって得ることができる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し，所望のヒト化抗体を取得してもよい［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７巻，７２２−７２７頁（２０００年），国際公開ＷＯ９６／３３７３５号パンフレット，国際公開ＷＯ９７／０７６７１号パンフレット，国際公開ＷＯ９７／１３８５２号パンフレット，国際公開ＷＯ９８／３７７５７号パンフレット参照］。また，リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。

本発明の抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（ＥＬＩＳＡ；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１４（１９８８），ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９９６））により測定できる。具体的には，本発明の細胞外領域ペプチドを合成し，これとウシ血清アルブミンなどのキャリアー蛋白質とを化学的に結合させたコンジュゲートを作製する。このコンジュゲートをＥＬＩＳＡプレートに固相化し，本発明の抗体を反応させ，さらにペルオキシダーゼ，ビオチンなどの酵素標識などを施した抗イムノグロブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後，発色色素を吸光光度計で測定することにより，本発明の抗体の結合活性を測定することができる。公知の方法により測定できる。また，本発明の抗体の抗原との結合性は免疫酵素抗体法，蛍光抗体法（Ｃａｎｃｅｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３６，３７３（１９９３）），ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ等を用いた表面プラズモン共鳴等によっても測定できる。

本発明の抗体を蛍光性物質（ローダミン，フルオレサミンなど）で直接標識することにより，または本抗体を認識する蛍光標識された二次抗体を用いることにより，さらには本抗体をビオチン標識し蛍光標識ストレプトアビジンを用いることにより，周知のＦＡＣＳを用いて本発明のペプチドを細胞表面に発現する目的の細胞を検出・分離することができる。また本抗体を固相(たとえばポリスチレンビーズ，マイクロタイターウエル表面，ラテックスビーズなど)に結合して不均一系で，あるいは均一系で，免疫学的反応を行って相同な膜分子を検出，定量（蛍光抗体法，ＥＬＩＳＡ，ラジオイムノアッセイなどの方法使用）することができる。この場合，免疫学的反応は競合反応であってもよいし非競合反応であってもよい。また２つ以上の抗体(モノクローンまたはポリクローン)を用いるサンドイッチ法による反応も使用できる。上記における検出，定量のためには，当業界で公知のいずれの免疫学的手法も用いることができる。

[本発明のモノクローナル抗体]
本発明のモノクローナル抗体は，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質と特異的に反応し得るすべてのモノクローナル抗体を包含する。その中でも，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外領域と特異的に反応するモノクローナル抗体が好ましく，後述するハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体がより好ましい。

[本発明のモノクローナル抗体の作成]
本発明のヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体は，例えば，次の各工程を経て製造することができる。すなわち，(1) 抗原の調製，(2) 免疫及び抗体産生細胞の採取，(3) 細胞融合，(4) ハイブリドーマの選択及びクローニング，及び(5) モノクローナル抗体の採取である。以下，各工程について説明する。

[抗原の調整]
抗原とするヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質の調製は，公知の方法を適宜採用でき，特定の方法には限定されないが，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質をコードするｃＤＮＡが既に公知であるので[ＮＭ＿００４４４４]，このｃＤＮＡを利用して抗原とするヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質を調製する方法が好ましい。ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質をコードするｃＤＮＡは，例えば，前記した公知のｃＤＮＡを利用できる。上記ｃＤＮＡからヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質を調製するためには，例えば，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む組換えべクターを作製し，このべクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換し，その形質転換体を適当な培地で培養し，得られる培養物を精製することにより行うことができる。

ここで，使用するｃＤＮＡは，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質をコードするｃＤＮＡの全領域であってもよいが，配列番号１に示すヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外領域（アミノ末端側から２５〜５２１番目のアミノ酸残基）をコードするＤＮＡが好ましい。ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外領域をコードするｃＤＮＡを使用する際，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質の細胞外領域の一部（例えば，アミノ末端側から１６〜５３８番目のアミノ酸残基）をコードするｃＤＮＡを使用してもよい。組換べクター及び宿主細胞としては，特に限定されず公知のいかなるものを使用してもよいが，特に，ＣＭＶプロモータ発現プラスミド及び霊長類培養細胞，または，組換えバキュロウイルス及び昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。形質転換体の培養及び培養物の精製は，常法に従って行うことができる。

[免疫及び抗体産生細胞の採取]
上記のようにして得られたヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質を免疫原として，アジュバンドとともに哺乳類，鳥類等に投与する。ここで，アジュバンドとしては，市販のフロイント完全アジュバンド，フロイント不完全アジュバンド，ＢＣＧ，ハンターズ，タイターマックス，キーホールリンペットヘモシアニン含有オイル等が挙げられ，これらを単独で用いてもよいし，これらの２種以上を混合して用いてもよい。

哺乳類としては，ウマ，サル，イヌ，ブタ，ヤギ，ヒツジ，ウサギ，モルモット，ハムスター，マウス等を用いることができ，鳥類としては，ハト，ニワトリ等を用いることができるが，特にマウス，ラット等を用いることが好ましい。投与の方法としては，公知の何れの方法をも用いることができるが，静脈内投与，皮下投与，又は腹腔内投与が好ましい。

抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり，通常１０〜２００μｇ，好ましくは２５〜１００μｇである。免疫の間隔は，通常１〜４週，好ましくは２週であり，免疫の回数は，通常２〜５回，好ましくは３〜４回である。

最終免疫日から１〜５日後，好ましくは３日後に，抗体産生細胞を採集する。採取する抗体産生細胞としては，リンパ節細胞，脾臓細胞等が挙げられるが，好ましくは足リンパ節細胞である。

[細胞融合]
抗体産生細胞と細胞融合させるミエローマ細胞としては，マウス，ラット，ヒト等の種々の動物に由来し，当業者が一般に入手可能である株化細胞を使用できる。使用する細胞株としては，薬剤抵抗性を有し，未融合の状態では選択培地(例えばＨＡＴ培地)で生存できず，抗体産生細胞と融合した状態でのみ選択培地で生存できる性質を有するものが好ましい。好ましくは，８−アザグアニン耐性株を用いることができる。この細胞株は，ヒポキサンチン−グアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼを欠損し(ＨＧＰＲＴ⁻)，ＨＡＴ培地で生育できない。

このようなミエローマ細胞としては，Ｐ３／Ｘ６３−Ａｇ８−ＵＩ等のマウスミエローマ細胞株，２１０．ＲＣＹ．Ａｇ１．２．３等のラットミエローマ細胞株，ＳＫＯ−００７等のヒトミエローマ細胞株等を使用することができる。細胞融合は，例えば，ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを混合比１：５〜１：１０の割合で，ＲＰＭＩ１６４０培地等の培地中で融合促進剤存在下，室温で２〜５分間細胞同士を接触させることによって行うことができる。この際，融合促進剤として，平均分子量１５００〜４０００のポリエチレングリコール，ポリビニールアルコール等を用いることができる。また，融合促進剤として，センダイウィルス等の融合ウイルスを用いることもできる。

[ハイブリドーマの選択及びクローニング]
細胞融合後，目的とするハイブリドーマを選別する。選別方法は，通常の方法に従えばよく，特に限定されない。選別方法としては，例えば，次の方法を用いることができる。すなわち，マイクロプレートの各ウェルにヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質を吸着させた後，ブロックエース(大日本製薬)等でブロックする。該マイクロプレートの各ウェルにハイブリドーマの培養上清を加え，３７℃で１時間放置し，ヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質とヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体とを反応させる。これを生理的食塩水で洗浄した後，適当に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗イムノグロブリンを加える。生理的食塩水で洗浄した後，ＡＬＰローゼ(シノテスト社)を用いてアルカリフォスファターゼの活性を測定し，アルカリフォスファターゼの呈色を有するウェルをヒト由来ＥｐｈＢ４タンパク質に特異的な抗体を産生する細胞を含むウェルとする。このウェルから目的とするハイブリドーマをクローニングする方法は，通常の方法に従えば良く，特に限定されない。ハイブリドーマのクローニングは，例えば，限界希釈法，軟寒天法，フィブリンゲル法，蛍光励起セルソーター法等により行なうことができる。

[モノクローナル抗体の採取]
取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては，通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。細胞培養法においては，例えば，ハイブリドーマを１０〜２０％仔ウシ血清含有ＲＰＭＩ１６４０培地，ＭＥＭ培地，Ｅ‐ＲＤＦ培地又は無血清培地等の動物細胞培地中で，通常の培養条件(例えば，３７℃，５％Ｃ０_２濃度)で３〜７日間培養し，その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を取得できる。

腹水形成法においては，例えば，ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン(２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン)等の鉱物油を投与し，その後，ハイブリドーマ１×１０^６〜１×１０^７個，好ましくは５×ｌ０^６個を腹腔内に投与する。投与した哺乳動物を１〜４週間，好ましくは２週間，飼育した後，腹水又は血清を採取することにより目的とするモノクローナル抗体を取得できる。

上記抗体の採取方法において，抗体の精製が必要とされる場合には，硫酸塩分析法，ＤＥＡＥ−セルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー，プロテインＡセファロース等を用いるアフィニティークロマトグラフィー，分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィー等の公知の方法を適宜に選択し，これらを単独で又は組み合わせて使用することにより精製を行うことができる。

本発明の好ましい態様は，上記した本発明の抗体と以下説明する本発明のペプチドとを併用することである。すなわち，本発明のペプチドは，“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド”，“配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩”，“配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，“配列番号３において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，又は“配列番号４で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，“配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド”，“配列番号５において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩”，“配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，“配列番号６において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，“配列番号７で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”，又は“配列番号８で表されるアミノ酸配列を具備するペプチドであって，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”に関する。以下，これらをまとめて“本発明のペプチド”ともよぶ。本発明のペプチドは，自ら新生血管の阻害能を有するほか，本発明の抗体，又はエフリンＢ２の新生血管阻害活性を高める働きを有する補助剤としても機能する。そして，本発明の抗体，又はエフリンＢ２は，新生血管の発生を阻害するので，本発明のペプチドは，新生血管が関与する疾患の治療又は予防用に有用である。

本発明のペプチドのうち，配列番号２において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，配列番号２で表されるペプチドと同様の活性を有するものである。このようなペプチドは，容易に製造できるし，また，その活性も本明細書における実施例と同様にして行うことで容易に確かめることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列において２位から１０位の部分（配列番号４）がＧ−Ｈループを構成する部位であると考えられ，しかもこの部位が作用部位であると推測される。従って，“配列番号２において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド”として，配列番号２で表されるアミノ酸配列において２位から１０位の部分以外の部位におけるアミノ酸が１又は２個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。また，“配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”の有効性は，後述する実施例において実証されたとおりである。そして，“配列番号３において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”についても，配列番号４で示されるアミノ酸残基が保存され，それ以外の部位について１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましい。なお，配列番号２で表されるアミノ酸配列において２位から１０位の部分（配列番号４）を含めば，適宜公知のアミノ酸配列が付加されてもよく，例えば５から１００個のアミノ酸残基からなるものであっても，１０から２０個のアミノ酸残基からなるものであってもよい。

また，配列番号５において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，配列番号５で表されるペプチドと同様の活性を有するものである。このようなペプチドは，容易に製造できるし，また，その活性も本明細書における実施例と同様にして行うことで容易に確かめることができる。配列番号５で表されるアミノ酸配列において８位を除く４位から９位の部分（配列番号７）がストランドＡ−Ａ’を構成する部位であると考えられ，１３位から１６位の部分（配列番号８）がＡ’−Ｂループを構成する部位であると考えられ，しかもこの部位が作用部位であると推測される。従って，“配列番号５において１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド”として，配列番号５で表されるアミノ酸配列において８位を除く４位から９位の部分以外の部位におけるアミノ酸が１又は２個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましく，配列番号５で表されるアミノ酸配列において１３位から１６位の部分以外の部位におけるアミノ酸が１又は２個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。

また，“配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”の有効性は，後述する実施例において実証されたとおりである。そして，“配列番号６において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,エフリンＢ２の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”についても，配列番号７または配列番号８で示されるアミノ酸残基が保存され，それ以外の部位について１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましい。なお，配列番号５で表されるアミノ酸配列において８位を除く４位から９位の部分（配列番号７），または，１３位から１６位の部分（配列番号８）を含めば，適宜公知のアミノ酸配列が付加されてもよく，例えば５から１００個のアミノ酸残基からなるものであっても，１０から２０個のアミノ酸残基からなるものであってもよい。なお，このようなペプチドは，例えば，配列番号９で表されるエフリンＢ２のアミノ酸配列から前記した部位を含む部分ペプチド（例えば５から１００個のアミノ酸残基，好ましくは１０から３０個のアミノ酸残基，より好ましくは１０から２０個のアミノ酸残基）を取り出すことによって得ることもできる。さらに，そのようにして取り出したエフリンＢ２の部分ペプチドから，１又は数個（具体的には，２,３,４,又は５個）のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって，本発明のペプチドと同様の活性を有するものであってもよい。「本発明のペプチドと同様の活性」とは，例えば，眼内の新生血管の抑制能を有するものを意味する。なお，配列番号１０で示される塩基配列は，配列番号９で示されるエフリンＢ２をコードするＤＮＡの塩基配列である。

本発明のペプチド（ポリペプチド）は，左端がＮ末端（アミノ末端），右端がＣ末端（カルボキシル末端）として表記される。本発明のペプチドは，Ｃ末端がカルボキシル基（-ＣＯＯＨ），カルボキシレート（-ＣＯＯ-），アミド（-ＣＯＮＨ_２）又はエステル（-ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。ここでエステルにおけるＲとして，例えば，メチル，エチル，ｎ−プロピル，イソプロピル，ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基などがあげられる。本発明のペプチドが，Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合，そのカルボキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。さらに，本発明のペプチドは，Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば，ホルミル基，アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものなどであってもよい。

本発明のペプチドにおける“薬理学的に許容される塩”として，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩，又は有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クエン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などがあげられる。

本発明のペプチド，本発明の細胞外領域ペプチド，またはそれらの塩は，ヒトや哺乳動物などの細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。また，ペプチドをコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造できる。また，ペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトや哺乳動物の組織または細胞から本発明のペプチドを製造する場合，例えば，組織または細胞をホモジナイズした後，酸などで抽出を行ない，該抽出液を逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより，本発明のペプチドまたはその塩を，単離精製することができる。

ペプチドの合成法として，例えば，固相合成法，液相合成法（泉屋信夫，加藤哲夫，青柳東彦，脇道典，「ペプチド合成の基礎と実験」１９８５，丸善（株））があげられる。また，反応後は通常の精製法，例えば，溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせることで，本発明のペプチドを単離精製できる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換することができるし，逆に塩で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

本発明のポリペプチドのうち配列番号２で表されるペプチドを固相合成法で製造する場合，例えば，アミノ酸配列の２０位の残基の，保護アミノ酸残基のカルボキシル基を直接（又は場合によりスペーサーを介して，）クロロメチル基あるいはオキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させる。その後，アミノ酸配列の１９位から１位までの各保護アミノ酸を固相合成法に従って順次結合させる。その後，不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させる。このようにして，本発明のポリペプチドを得ることができる。前記不溶性樹脂，スペーサー，及びＮ−保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合したＮ−保護アミノ酸樹脂などは，公知の方法で調製でき，また市販されるものを適宜用いてもよい。また，配列番号２で表されるペプチド以外を合成する場合も，配列番号２で表されるペプチドと同様にして合成できる。

不溶性樹脂は，Ｃ末端のＮ−保護アミノ酸のカルボキシル基と直接結合できるか，又はスペーサーを介して結合でき，前記カルボキシル基から脱離できるものであれば特に限定されず，公知のものを適宜用いることができる。このような不溶性樹脂として，例えば，Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン- ジビニルベンゼン共重合体），オキシメチル樹脂，又はスペーサーを導入した４−オキシメチル−Ｐａｍ（フェニルアセタミドメチル）樹脂が好ましい。一方，Ｆｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，オキシメチルフェノキシメチル（Ｗａｎｇ）樹脂が好ましい。

保護アミノ酸とは，官能基を公知の方法により保護基で保護したアミノ酸を意味する。保護アミノ酸として，市販される公知の保護アミノ酸を適宜用いることができる。本発明のポリペプチドを合成する場合には，以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。すなわち，アミノ酸のα−アミノ基の保護基として，Ｂｏｃ（t-ブチルオキシカルボニル）又はＦｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）が好ましい。アルギニン（Ａｒｇ）のグアニジノ基の保護基として，Ｔｏｓ（トシル），ＮＯ_２（ニトロ），Ｍｔｒ（４−メトキシ−２, ３, ６−トリメチルベンゼンスルホニル）又はＰｍｃ（２, ２, ５, ７, ８- ペンタメチルクロマン−６−スルホニル）が好ましい。リジン（Ｌｙｓ）のε−アミノ基の保護基として，Ｚ（ベンジルオキシカルボニル），Ｃl ・Ｚ（２−クロロベンジルオキシカルボニル），Ｂｏｃ，又はＮｐｙｓ（３−ニトロ−２−ピリジンスルフエニル）が好ましい。ヒスチジン（Ｈｉｓ）のイミダゾリル基の保護基として，Ｔｏｓ，Ｚ，Ｐａｃ（フェナシル），Ｂｏｍ（ベンジルオキシメチル），Ｄｎｐ（ジニトロフェニル）又はＴｒｔ（トリチル）が好ましい。システイン（Ｃｙｓ）のメルカプト基の保護基として，Ｂｚｌ (ベンジル），ＭＢｚｌ (４−メトキシベンジル），４−Ｍe Ｂｚｌ（４−メチルベンジル），Ａｃｍ（アセタミドメチル），Ｔｒｔ，Ｎｐｙｓ，t-Ｂｕ (t-ブチル），t-ＢｕＳ（t-ブチルチオ）があげられ，これらの中では，ＭＢｚｌ，４−Ｍe Ｂｚｌ，Ｔｒｔ，Ａｃｍ，又はＮｐｙｓが好ましい。チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基の保護基として，Ｂｚｌ，Ｃl2・Ｂｚｌ（２, ６−ジクロロベンジル），t-Ｂｕがあげられる。一方，チロシン（Ｔｙｒ）の水酸基は，特に保護基を導入しなくてもよい。トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基の保護基として，ＣＨＯ（フォルミル基）があげられる。一方，トリプトファン（Ｔｒｐ）のインドール基は，特に保護基を導入しなくてもよい。メチオニン（Ｍｅｔ）のチオメチル基の保護基として，メチルスルホキシド基があげられるが，特に保護基を導入しなくてもよい。セリン（Ｓｅｒ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）の水酸基の保護基として，Ｂｚｌ又はｔ−Ｂｕ基があげられる。アスパラギン酸（Ａｓｐ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ）のカルボキシル基の保護基として，ＯＢｚｌ（ベンジルエステル），ＯｔＢｕ（ｔ−ブチルエステル），ＯｃＨｅｘ（シクロヘキシルエステル），又はＯＰａｃ（フェナシルエステル）が好ましい。アスパラギン（Ａｓｎ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）のカルバミド基の保護基として，Ｔｒｔ又はＸａｎ（キサンチル基）が好ましい。

保護アミノ酸の結合は，通常の縮合法，例えば，ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）法，ＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド）法［Ｔａｒｔａｒ．Ａら；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，４４，５０００（１９７９）］，活性エステル法，混合又は対称酸無水物法，カルボニルジイミダゾール法，ＤＣＣ- ＨＯＢt(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）法［Ｋｅｏｎｉｇ，Ｗら；Ｃｈｅｍ.Ｂｅｒ.,１０３，７８８，ｐｐ．２０２４-２０３４（１９７０）］，ジフエニルホスホリルアジド法，ＢＯＰ試薬（ベンゾトリアゾリル−Ｎ−ヒドロキシトリスジメチルアミノホスホニウムヘキサフルオロリン化物塩）を用いるＢＯＰ−ＨＯＢｔ法（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．，Ｊ．Ｏｒｇ. Ｃｈｅｍ．，５３，６１７（１９８８）)，ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．, ３０，１９２７（１９８９）），ＴＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾール−1−イル)−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレイト）−ＨＯＢｔ法（Ｋｎｏｒｒ，Ｒ．ら, ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，３０，１９２７（１９８９））等に従って行なうことができる。これらのうち，ＤＣＣ法，ＤＣＣ−ＨＯＢt 法，ＢＯＰ−ＨＯＢｔ法，ＨＢＴＵ−ＨＯＢｔ法，又は対称酸無水物法が好ましい。

これらの縮合反応は，たとえば，ジクロロメタン，ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ），Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。α- アミノ基の保護基の脱離試薬としては，トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン，ＨＣl ／ジオキサン，ピペリジン／ＤＭＦ又はピペリジン／ＮＭＰ等が用いられ，該保護基の種類により適宜選択する。また，合成の各段階における縮合反応の進行の程度はＥ．カイサーらの方法 [Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３４，５９５（１９７０）］（ニンヒドリン反応法）によって検査されればよい。以上のようにして，所望のアミノ酸配列を有する保護ペプチド樹脂を得ることができる。

保護ペプチド樹脂は，フッ化水素，ＴＦＭＳＡ（トリフルオロメタンスルホン酸）［ＡａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ発行，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ編集，Ｈ．Ｙａｊｉｍａら; “ ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅｓ ”５，６５（１９８３）］，ＴＭＳＯＴf （トリメチルシリルトリフラート），ＴＭＳＢr(トリメチルシリルブロミド）[Ｆｕｊｉｉ，Ｎら；Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．,３５，３８８０（１９８７）］，またはトリフルオロ酢酸などで処理することにより，該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は，該ストラテジー（Ｂｏｃ又はＦｍｏｃ)，該樹脂，該保護基の種類により適宜選択する。

このようにして得られたペプチドは，公知の方法，例えば，抽出，再結晶，各種クロマトグラフィー（ゲルろ過，イオン交換，分配，吸着，逆相），電気泳動，向流分配等により単離精製することができる。これらの中では，逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製する方法が好ましい。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換できる。また，ペプチドが塩の形態で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

エフリンＢ２は，内皮細胞（ＥＣ）のＤＮＡ合成；ＥＣにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）リン酸化；ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの両方で誘導されるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰキナーゼ活性化；ＥＣ脈管形成；ｂＦＧＦで誘導された角膜血管形成；及び網膜から硝子体腔内に伸びる病的な新生血管を阻害する。

本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，新生血管阻害活性を有するほか，エフリンＢ２の新生血管阻害活性を高める作用をも有するものである。

そして，本発明のペプチドは，それ自体ＭＡＰＫリン酸化活性阻害能を有するので，公知の製剤化のための方法を適宜採用することで，本発明のペプチドを含有する新生血管阻害剤に用いることができる。この新生血管阻害剤は，例えば，本発明の抗体及び本発明のペプチドと薬理学的に許容される担体などを含有する剤であり，眼内の新生血管阻害剤であることが好ましく，眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤又は予防剤が好ましい。本発明のペプチドは，エフリンＢ２に比べて短いので，容易に製造できる。よって，本発明のペプチドを含む新生血管阻害剤は，安定であり，比較的安価に製造することができるという利点もある。

また，本発明のペプチドは，エフリンＢ２の活性を高めるので，本発明の抗体及び本発明のペプチドを含有する剤は，特に眼内の新生血管阻害補助剤，眼内の静脈内皮細胞におけるＤＮＡ合成阻害用補助剤及び眼内の静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害用補助剤として有用である。これらの補助剤の好ましい態様は，主剤としてエフリンＢ２を含有する剤を用いるものである。

血管内皮細胞をＶＥＧＦで刺激すると受容体下流のシグナル伝達系によりＭＡＰＫが活性化され，リン酸化されたＭＡＰＫの上昇が認められる（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．ａｎｄＺａｃｈａｒｙ，Ｉ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１５４４２−１５４５１（１９９７））。ＭＡＰＫの活性化は血管新生における血管内皮細胞の増殖に重要な役割を担うことが知られている（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．ｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＧｒｏｗｔｈ＆Ｄｉｆｆｅｒ．，８３−１０（１９９７）；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ａｎｄＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，Ｔ．Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１８，４−２５（１９９７））。本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，ＭＡＰＫの阻害活性を有することが後述する実施例により実証された。従って，本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，血管新生抑制作用又はエフリンＢ２により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｊ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．１：２７−３１（１９９５），Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，Ｒ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：６０−６５（１９９６））。従って，本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移，その他の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療に用いることができ，本発明はそのような治療剤をも提供しうる。

新生血管阻害剤や補助剤は，本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を有効量含有するものがあげられる。「有効量」とは，所望の目的を達成するために十分な量を意味する。眼内の新生血管阻害剤における「有効量」とは，例えば，眼内の新生血管を阻害するために十分な量を意味する。また，新生血管阻害用補助剤における「有効量」とは，例えば，エフリンＢ２などの眼内の新生血管阻害剤の新生血管阻害作用を高めるために十分な量を意味する。具体的な，本発明の抗体及び本発明のペプチドの投与量は，対象疾患，投与対象，投与ルートなどにより適宜調整すればよい。本発明の抗体の投与量として，例えば，目に硝子体注射投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一眼あたり１×１０^２ｎｇ〜１ｍｇ，好ましくは１×１０^２ｎｇ〜１μｇ，より好ましくは１×１０^２ｎｇ〜７×１０^２ｎｇがあげられる。投与回数は適宜調整すればよい。また，本発明の抗体を含有する剤を経口投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一回につき２μｇ〜１×１０^２ｍｇ，好ましくは２μｇ〜１ｍｇ，より好ましくは２μｇ〜１×１０^２μｇがあげられる。本発明のペプチドの投与量として，例えば，目に硝子体注射投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一眼あたり１×１０^２ｎｇ〜１ｍｇ，好ましくは１×１０^２ｎｇ〜１μｇ，より好ましくは１×１０^２ｎｇ〜７×１０^２ｎｇがあげられる。投与回数は適宜調整すればよく，例えば，一日一回本発明の抗体を含有する剤とともに投与するものなどがあげられる。また，本発明のペプチドを含有する剤を経口投与する場合，一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては，一回につき２μｇ〜１×１０^２ｍｇ，好ましくは２μｇ〜１ｍｇ，より好ましくは２μｇ〜１×１０^２μｇがあげられる。これらの量は，患者の体重，性別などを適宜考慮して，調整すればよい。ヒト以外の哺乳動物に上記の新生血管阻害剤又は補助剤を投与する場合も，体重６０ｋｇ当たりに換算した量を適宜投与すればよい。

本発明の抗体（及び本発明のペプチド）は，それ自体，又は医薬組成物として投与することができる。本発明の抗体（及び本発明のペプチド）は，たとえば薬理学的に許容され得る担体，希釈剤又は賦形剤を含むものがあげられる。本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を含有する補助剤は，投与形態に適する剤形として調整されればよい。

たとえば，本発明の抗体又は新生血管阻害剤を点眼剤又は注射剤として用いる場合，有効量の本発明の抗体（及び本発明のペプチド）と，公知の希釈剤（希釈剤は，薬理学的に許容され得る担体に含まれる）とを含む点眼剤又は注射剤であればよい。希釈剤として，滅菌水，純水，蒸留水などの水；生理食塩水；ブドウ糖溶液；エタノールなどのアルコール；グリセロール，プロピレングリコール，ポリエチレングリコールなどのポリアルコール；滅菌有機溶媒；又は水性デンプン；ＰＢＳのいずれか１種又は２種以上の混合物などがあげられる。

本発明の抗体を含有する点眼剤又は注射剤は，エピネフリン，塩酸エピネフリン，塩酸エフェドリン，などの充血除去成分；チル硫酸ネオスチグミン，トロピカミドなどの眼調節薬成分；硫酸亜鉛，乳酸亜鉛，アラントイン，イプシロン−アミノカプロン酸，インドメタシン，塩化リゾチームなどの抗炎症薬成分；アシタザノラスト，アンレキサノクス，イブジラスト，トラニラスト，塩酸ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン薬成分又は抗アレルギー薬成分；アミノ酸類；塩酸オキシブプロカイン，塩酸コカイン，塩酸コルネカイン，塩酸ジブカインなどの局所麻酔薬成分；などを適宜含有してもよい。コンドロイチン硫酸ナトリウム，ヒアルロン酸ナトリウムなどの増粘剤；塩化ベンザルコニウムなどの界面活性剤；安息香酸ナトリウム，エタノール，塩化ベンザルコニウムなどの防腐剤，殺菌剤又は抗菌剤；塩酸，ホウ酸，水酸化ナトリウム，炭酸水素ナトリウムなどのｐＨ調節剤；亜硫酸水素ナトリウム，亜硫酸ナトリウム，塩化カリウムなどの等張化剤；メントール
，カンフル，ハッカ油，ペパーミント油などの香料または清涼化剤；クエン酸緩衝剤などの緩衝剤などを適宜含有するものであってもよい。

本発明の抗体を含む新生血管阻害剤は，錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，シロップ剤などの経口投与剤であってもよい。この場合，薬理学的に許容される担体として，賦形剤，希釈剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，及び矯味矯臭剤から適宜選択されるものがあげられる。

本発明の抗体を含む新生血管阻害剤は，公知の方法に従って製造できる。点眼剤又は注射剤は，例えば，希釈剤などに本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を添加し，アンプルなどの容器に入れることにより製造できる。錠剤は，例えば，本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を公知の担体と混合した医薬組成物を打錠機により打錠することにより製造できる。カプセル剤は，例えば，カプセルなどの形態をしている担体中に，本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を封入することにより製造できる。

また，本発明のペプチドは，エフリンＢ２の活性を高めるので，後述するようにエフリンＢ２を含む医療用組成物，又はキットなどに適宜利用されうる。

ＷＯ２００６／００６０７９号公報（特許文献１）に開示されるとおり，エフリンＢ２は，眼内における動脈及び静脈内皮細胞のＤＮＡ合成の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞におけるｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫ活性化の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有する。そして，同文献における生体内実験で実証されたように，エフリンＢ２は，眼内の脈絡膜における新生血管を抑制し，加齢黄斑変性（ＡＭＤ）など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に有効である。

一方，本発明のペプチドは，エフリンＢ２と併用することでエフリンＢ２のＭＡＰＫリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，エフリンＢ２が有する，眼内の静脈（動脈）内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。よって，本発明の抗体及び本発明のペプチドの他にエフリンＢ２を含有する新生血管阻害剤は，特に眼内の新生血管の抑制など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に特に有効であると考えられる。本発明の新生血管阻害剤の好ましい態様は，有効量のエフリンＢ２を含有すればよい。

本発明の新生血管阻害剤に用いられるエフリンＢ２は，アナログおよび改変体を含む任意のエフリンＢ２であってもよい。なお，エフリンＢ２は，可溶性エフリンＢ２（通常，細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない）であってもよい。エフリンＢ２は，天然に存在するタンパク質を単離精製したものであっても，遺伝子組換えにより微生物などから生成されたものであってもよい。例えば，米国特許第６，３０３，７６９号明細書又はＭｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９９５Ｎｏｖ；３２（１６）：１１９７−２０５に記載されるヒトエフリンＢ２のｃＤＮＡの配列を参照して，慣用の技術を用いて，全長タンパク質，細胞外ドメインを含むタンパク質などを作製してもよい。当業者が通常用いる技術を用いることにより，天然のエフリンＢ２を好ましく改変することもできる。また，エフリンＢ２は，医薬品や試薬として市販されているいずれを用いてもよい。

エフリンＢ２は，全長であってもよい。エフリンＢ２の好ましい態様は，天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものである。天然のエフリンＢ２の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない領域が，ＥｐｈＢ４のファーマコフォアに作用する部位であると考えられるので，そのような部位を含むエフリンＢ２であれば，全長でなくても新生血管の抑制能を有すると考えられる。そのようなエフリンＢ２として，配列番号９のうち−２５〜３０８位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号９のうち１〜３０８位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号９のうち−２５〜１９９位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号９のうち１〜１９９位のアミノ酸残基からなるもの，及びそれらと９０％以上の相同性を有するもの（好ましくは９５％以上相同性を有するもの，又は配列番号４で示される部位を含みつつ９０％以上の相同性を有するもの）であって，エフリンＢ２と同様の活性を有するものがあげられる。なお，相同性は，例えば適宜パラメータを最適化したＧＡＰコンピュータプログラムのバージョン６を用いて求めればよい。なお，配列番号９で示されるペプチドは，エフリンＢ２のＮ末端シグナルペプチド（配列番号９のアミノ酸−２５から−１），細胞外ドメイン（アミノ酸１から１９９），膜貫通領域（アミノ酸２００から２２５），および細胞質ドメイン（アミノ酸２２６から３０８）からなるペプチドである（なお，配列番号９に示されるアミノ酸の番号については配列番号９に係るペプチドのアミノ酸配列及びこのペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を図３に示す。）。

また，エフリンＢ２が，ヒトＦｃとエフリンＢ２の融合タンパク質であってもよい。エフリンＢ２が新生血管の抑制能を発揮するためには，エフリンＢ２が二量体化していることが望ましいと考えられ，そのためヒトＦｃとエフリンＢ２との融合タンパク質であれば，エフリンＢ２が二量化し，高い新生血管の抑制能を発揮しうる。この融合タンパク質に用いられるエフリンＢ２は，エフリンＢ２の細胞外ドメイン，又は細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものが好ましい。Ｎ末端シグナルペプチド及び膜貫通領域については，それら全てが含まれてもよいし含まれなくてもよく，またそれらのうち一部のみが含まれていてもよい。エフリンＢ２とヒトＦｃの融合タンパク質は，たとえば，特表平１０-５０２８１０号公報（特許文献３）に記載される方法により作出できる。

なお，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び本発明のペプチドをあわせたものは，高いｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害活性を有する。したがって，本発明は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び “配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤をも提供する。また，ＭＡＰＫリン酸化活性が阻害されれば，ＤＮＡ合成が阻害されるので，本発明は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；及び “配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ＤＮＡ合成阻害剤をも提供する。

［医療用キット］
本発明の第４の側面は，基本的には，本発明の抗体を有する第１の組成物と，本発明のペプチドを有する第２の組成物とを有する医療用キットに関する。すなわち，本発明の第２の側面は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号２において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キット；配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号３において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キット；及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；配列番号４で表されるアミノ酸配列を含有し，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチドであって，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットなどに関する。

本発明の第４の側面の別の態様は，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号５において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キット；配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；(i)配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は(ii)配列番号６において，１又は２個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり,前記配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キット；及び配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第１の組成物と；配列番号７または配列番号８で表されるアミノ酸配列を含有し，当該ペプチドに含まれるアミノ酸残基の数が９以上，１００以下であるペプチドであって，配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第２の組成物と；を含有する医療用キットなどに関する。

上記の医療用キットは，後述する実施例によって実証されたとおり，第１の組成物を投与した後に第２の組成物を投与するとＭＡＰＫの活性を著しく阻害することが示された。よって，本発明のキットは，特にそのような投与方法に有効に利用されうる。

本発明の医療用キットに含まれる本発明の抗体，及び本発明のペプチドは，先に説明したものを適宜用いることができる。

本発明の医療用キットの好ましい態様は，新生血管阻害用，特に眼内の新生血管阻害用に用いられるものであり，さらに好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害用に用いられるものである。本発明の第２の側面の好ましい態様は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第２の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症”からなる群から選択される，１又は２種以上の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。本発明の第２の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。

先に説明したとおり，本発明のペプチドは，血管新生抑制作用又はエフリンＢ２により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Ｆｏｒｋｍａｎ，Ｊ．ＮａｔｕｒｅＭｅｄ．１：２７−３１（１９９５）；Ｂｉｃｋｎｅｌｌ，Ｒ．，Ｈａｒｒｉｓ，Ａ．Ｌ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．８：６０−６５（１９９６））。従って，本発明の第２の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療に用いられる上記いずれかに記載のキットに関する。すなわち，本発明の第２の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，アテローム性動脈硬化症，カポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療用キットに関する。

そして，これらに含まれる本発明の抗体や本発明のペプチドの量も上記したものを適宜用いることができる。

後述する実施例によって実証されたとおり，本発明の抗体と本発明のペプチドを同時に投与した場合に比べ，本発明の抗体を投与した後に，本発明のペプチドを投与した場合のほうが，ＭＡＰＫ活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記第１の組成物が投与された後に，前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。前記第１の組成物が投与された後，３０秒後〜２４時間後，好ましくは１分後〜１２時間後，より好ましくは１分後〜１０分後に前記第２の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。また，本発明のペプチドを投与した後に本発明の抗体を投与しても，本発明の抗体と本発明のペプチドを同時に投与した場合に比べＭＡＰＫ活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第２の側面の好ましい態様は，前記第２の組成物が投与された後に，前記第１の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。前記第２の組成物が投与された後，３０秒後〜２４時間後，好ましくは１分後〜１２時間後，より好ましくは１分後〜１０分後に前記第１の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。

［マウス角膜法における本発明のペプチド及び本発明の抗体の評価］
塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）は，強力な血管形成因子であることが知られている。ｂＦＧＦによって誘導されたマウス角膜の血管新生を，本発明のペプチド及び本発明の抗体が抑制し得るかどうかを検討するには，例えば，以下のようにすればよい。

マウスにおける角膜ポケットアッセイおよび角膜血管新生の定量は，基本的にKenyon, B.M.ら，（1996）Ophthalmol.
Vis. Sci.，37巻，8号，1625-1632頁に基づいて行う。簡単に言えば，90ngのヒトｂＦＧＦを含む0.3μLのHydronペレット（IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA）を調製し，雄BALB/cマウスの角膜に移植する。本発明の抗体とペプチドを，ｂＦＧＦ／Hydron溶液に直接添加する。ペレットを，角膜縁から1.0mmに配置する。移植後，オフロキサシン／点眼剤を各眼に適用する。６日後，動物を屠殺し，そして角膜血管を写真撮影する。マウス角膜における血管新生の定量分析を，ソフトウエアパッケージNIH Imageを用いて行う。このようにすれば，マウス角膜における本発明のペプチド及び本発明の抗体の同時投与によるｂＦＧＦで誘導した血管形成の阻害について検証できる。

[ＣＮＶモデルに対する本発明のペプチド及び本発明の抗体の評価]
本発明のペプチド及び本発明の抗体が，ＡＭＤなど，眼内の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤として有効であることは，たとえば，レーザー誘導性脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）モデルを用いて実証できる。レーザー誘導性ＣＮＶモデルは，ＡＭＤの生態モデルと考えられる。以下，ＣＮＶモデルのプロトコル例について説明する。

−マウスの実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘導―
マウスの眼の眼底後極部をグリーンレーザー（グリーンレーザー光凝固装置 Novus Verdi，コヒーレント社，スリットランプ３０SL-M，ZEIS）で光凝固する。レーザー光の強度はたとえば，約２００ｍＷとする。その際，凝固サイズを７５μｍ，凝固時間を０．１秒とし，１眼あたり４発の凝固を行えばよい。このようにすればＣＮＶモデルを得ることができる。

−マウス眼への本発明のペプチド及び本発明の抗体の投与方法−
本発明の抗体及び本発明のペプチドの投与方法は，対象にレーザー照射直後と照射後５日の合計２回，下記の硝子体内濃度のＰＢＳ，本発明の抗体，及び本発明のペプチドを硝子体内に投与する。１投与あたり０.００２ｍＬずつ，３３Ｇ針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射する。ネガティブコントロールとして，０．００２ｍＬのＰＢＳを注射する。ポジティブコントロールとして，１．６６ｎＭのエフリンＢ２を用いる。動物番号３〜５は，３分差で投与を行う。例えば，動物番号３（右眼）は，エフリンＢ２（２μＬ）を投与した３分後に配列番号２のペプチド（２μＬ）を投与するので，２種類の被験物質を各２μＬの計４μＬ投与することになる。

−マウスＣＮＶの評価−
ＣＮＶモデル実験は，例えば，以下のようにして評価する。レーザー照射後７日目に脈絡膜フラットマウント法を行って，脈絡膜新生血管を評価する。２０％ネンブタールをマウス腹腔内に０．２ｍL投与して麻酔をしたのち開腹し，５０ｍG/ｍLフルオレセイン-デキストラン（SIGMA，０．５ｍL/匹）を心臓左心室に注射して灌流させる。その後眼球を摘出し４％パラホルムアルデヒドで固定をする。眼球組織固定後に前眼部と網膜を除去して脈絡膜フラットマウントを作製したのち，封入剤（Beckamn coulter, Aqueouse mountintg medium
permafluor）を用いてスライドガラスに封入して試料を作製する。

その後，蛍光顕微鏡を用いて作製した試料を観察する。レーザー照射部位の写真をCCDカメラで撮影し，イメージ画像化する。脈絡膜新生血管である管腔構造部位の面積をソフトウエアパッケージMacScopeで測定する。

また，ＣＮＶモデルは，６匹のカニクイザル（オス３〜６kg）由来の１２眼を用いてもよい。これらの動物は全て，苦痛のないように無病原状態で収容する。そのため，カニクイザルを用いたＣＮＶモデル実験は，塩酸ケタミンで全身麻酔を施した状態で行う。

−カニクイザルの実験的脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）の誘導―
上記サルの眼の眼底部の後部極において，眼科レーザー用レンズ（３−Ｍ
ＩｎｆａｎｔＬａｓｅｒＯＧ３ＭＩＡ，ＯｃｕｌａｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用し，眼底後極部をクリプトンレーザー（マルチカラーレーザー光凝固装置ＭＣ−３００，株式会社ニデック，スリットランプ９００ＢＱ，ＨａａｇＳｔｒｅｉｔ）で光凝固する。レーザー光の強度はたとえば，約７００ｍＷとする。その際，凝固サイズを１００μｍ，凝固時間を０．１秒とし，１眼あたり８発の凝固を行えばよい。

−カニクイザル眼への本発明のペプチド及び本発明の抗体の投与方法−
本発明の抗体及び本発明のペプチドの投与方法は，レーザー照射直後と照射後５日の合計２回，下記の硝子体内濃度のＰＢＳ，ＥｐｈＢ４に対する抗体，本発明のペプチドをカニクイザルの硝子体内に投与する。１投与あたり０．１ｍＬずつ，３０Ｇ針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射する。ネガティブコントロールとして，０．１ｍＬのＰＢＳを注射する。ポジティブコントロールとして，１．６６ｎＭのエフリンＢ２を用いる。動物番号３〜５は，３分差で投与を行う。例えば，動物番号３（右眼）は，エフリンＢ２（１００
μＬ）を投与した３分後に配列番号２のペプチド（１００μＬ）を投与するので，２種類の被験物質を各１００μＬの計２００μＬ投与することになる。

−カニクイザルＣＮＶの評価−
カニクイザルを用いたＣＮＶモデル実験は，例えば，以下のようにして評価する。レーザー照射後１０日目に蛍光眼底造影検査を行って，脈絡膜新生血管を評価する。検査は両眼で時間をずらして実施する。両眼ともにフルオレセイン（蛍光眼底造影剤フルオレサイト®注射液1号，日本アルコン株式会社，０．１ｍＬ／ｋｇ）投与後５分及び１０分に，それぞれ右，左の順に連続して2枚ずつ撮影を行う。撮影された写真に基づいて，眼科専門医が評価を行う。

その後，ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社）水溶液（６４．８ｍｇ／ｍＬ，０．４ｍＬ／ｋｇ）の静脈内投与により試験動物に麻酔を行い，体重を測定後，放血安楽死させ，外表，内部器官及び組織を肉眼的に観察する。左右眼球（視神経を含む）について，摘出後３％グルタールアルデヒド・２％パラホルムアルデヒド混合固定液で浸漬固定する。固定後の眼球のレーザー照射部位（８部位）を細切し，パラフィン包埋を行い，パラフィン切片（１０切片）を作製した後，Ｈ．Ｅ.染色（1切片のみ）を施す。

配列表の説明
配列番号１ヒトＥｐｈＢ４においてＮ末端シグナル配列を除いた細胞外ドメイン（１６番目から５３９番目までのアミノ酸残基からなるペプチド）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号３ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号４ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号８ヒトエフリンＢ２の部分ペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号９ヒトエフリンＢ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号１０配列番号９で示されるエフリンＢ２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
以下，実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，以下の実施例によって限定されない。

−配列番号２で表されるポリペプチドの合成−
配列番号２（ＥＦＳＰＮＬＷＧＬＥＦＱＫＮＫＤＹＹＩＩ）で表されるポリペプチドを以下のようにして合成した。すなわち，マルチシンテック（ＭｕｌｔｉＳｙｎｔｅｃｈ）社の自動ペプチド合成装置“シロＩＩ（ＳｙｒｏＩＩ）” を用い，Ｆｍｏｃ (９−フルオレニルメチルオキシカルボニル)ストラテジーによる固相合成法により調整した。合成には，ＨＢＴＵ（２−（１Ｈ）−ベンゾトリアゾ−ル−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）−ＨＯＢｔ(１−ヒドロキシベンゾトリアゾール)法（Ｋｎｏｒｒ,Ｒ.ら, ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ., １９２７（１９８９））を用いた。合成スケールは，２５マイクロモルであった。なお，用いたレジン及びアミノ酸は，それぞれ表２と表３とに示すとおりであった。

（１）Ｆｍｏｃ−アミノ酸樹脂を反応ベッセル及びＦｍｏｃアミノ酸用カートリッジにとり，そのベッセル及びカートリッジを，上記した自動ペプチド合成装置に装着し，ＦａｓｔＭｏｃプログラムにより自動合成操作を行った。
（２）ペプチドの自動合成に際し，まずＤＣＭ（ジクロロメタン）にて５分間樹脂を潤滑させた。その後，ＮＭＰ(Ｎ−メチル−２−ピロリドン)にて５分間処理し，洗浄した。その後，以下のプロトコルを繰返し行った。１サイクルの合成反応は，下表１のとおりである。

（３）脱保護基及び脱樹脂操作
上記のようにして得られた合成ペプチドをＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）／水／トリエチルシラン（Ｔｒｉｅｔｈｙｌｓｉｌａｎ）［９０:５:５］を用い，室温にて２時間反応させた。反応混合液から樹脂をろ別し，トリフルオロ酢酸１ｍｌにて２回洗浄し，ろ液及び洗液をあわせたものに氷冷下エーテル１００ｍｌを加え，生じた沈殿物を遠心分離し，残渣をデカンテーションにより上清から分離した。

（４）精製
得られた残渣を，氷冷下エーテルにて洗浄した後，遠心分離し，上清を逆相高速液体クロマトグラフィーにより精製した。逆相高速液体クロマトグラフィーは，島津社製ＨＰＬＣ“ＬＣ１０ＡＤ”を用い，カラムはクロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）ＫＲ“１００−１０
Ｃ１８”の２５０ｘ３０ｍｍのものを用いた。逆相高速液体クロマトグラフィーの条件は，溶離液として，０．１％ＴＦＡ水溶液（Ａ液）及び８０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ水溶液（Ｂ液）の２液グラジエントで，当初Ｂ液５％，３０分後にＢ液８０％，検出波長２１０ｎｍであった。精製されたペプチドを含む画分を回収後，凍結乾燥した。

（５）ポリペプチドの分析
最終的に精製されたペプチドを，島津社製ＨＰＬＣ“ＬＣ１０ＡＤ”及び，クロマシル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ）ＫＲ“１００−１０Ｃ１８”の２５０ｘ４（又は６）ｍｍのカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより確認した。また，最終的に精製されたペプチドを，ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）社製ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置“リフレックス（Ｒｅｆｌｅｘ）ＩＩ”によっても確認した。

−細胞培養−
本実施例は，ＨＵＶＥＣ（人臍帯静脈内皮細胞）を用いて行った。細胞株は３７℃の恒温槽で解凍し，１０ｍｌの血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）に溶解後，タイプＩコラーゲンコート１０ｃｍ培養皿（ＩＷＡＫＩ製）１枚に全量をプレーティングした。その後，３７℃，ＣＯ_２／ａｉｒ＝６％／９４％でＨＵＶＥＣを２４時間培養した。ＤＭＳＯを除去するため，ＥＧ−２培地１０ｍｌに培地の交換を行った。８０〜９０％コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の状態になったら継代培養を行った。この時の細胞濃度は，およそ５×１０^６個／Ｄｉｓｈ程度であった。７２時間程でコンフルエントになった。

コラーゲンコート６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ製）に５×１０^５個／ｗｅｌｌ程度でプレーティングを行った。培養を続け，コンフルエントになったら血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子（hＥＧＦ,hＦＧＦ-Ｂ）を除いた培地（６ｗｅｌｌの場合は２ｍｌ）に培地交換して２４時間培養した（ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）。培地を除き，血管内皮細胞培地（Ｈｕｍｅｄｉａ，ＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にペプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン(最終濃度１００マイクロｇ／ｍｌ)を加えたものをコントロールとして加えた。他の処理群は，このトンコロール培地でペプチド及びＥｐｈＢ４の部分ペプチドに対する抗体を希釈して細胞に加え，１０分後（もしくは適当な時間を設定）にＰＢＳで２回洗浄した後，ライシスバッファ（ＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ）（６ｗｅｌｌの場合は０．２ｍｌ／ｗｅｌｌ）を用いて細胞の全細胞ライセートを回収した。

−ｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対する配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するペプチドの効果−
ｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対する配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドに対するウサギポリクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ＿ＣＲＵＺ＿ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ），実施例１で得られたペプチド（配列番号２で表されるペプチドである。以下，「配列番号２のペプチド」とも呼ぶ），また実施例１と同類の方法で得られたペプチド（配列番号３で表されるペプチドである。以下，「配列番号３のペプチド」とも呼ぶ），及びそれらの併用剤の効果を以下のように実証した。
血管内皮細胞を，血管内皮細胞培地（ＨｕｍｅｄｉａＥＧ-２キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にペプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン（最終濃度１００μｇ／ｍｌ）を加えたものをコントロールとし，実施例１で得られた配列番号２のペプチドとウサギポリクローナル抗体を混合したものなどを用いて１０分間処理した。ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ-ＰＡＧＥ）は１０％のアクリルアミドを用い，２００ボルトにて４０分間の条件で分離し，ウェット方式で１００ボルトの条件下一時間ＰＶＤＦ膜に転写した。３％スキムミルクで１時間ブロッキングした後，膜を一次抗体としてリン酸化ｐ４４/４２ＭＡＰＫに対する抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，Ｄａｎｖｅｒｓ, ＭＡ, ＵＳＡ）を用い，これとともに４℃にて一晩インキュベートした（１ : ２，０００）。ＴＢＳ-ｔで１０分間×４回の洗浄後，膜を西洋ワサビペルオキシダーゼ標識２次抗体（Ｂｉｏ-Ｒａｄ, Ｒｉｃｈｍｏｎｄ, ＣＡ, ＵＳＡ）(１ : ２０，０００)と共に室温にて４０分間インキュベートした。可視化を製造業者の指示に従ってアマシャム社製増強化学発光（ＥＣＬ）検出システムを用いて行った。

図１は，実施例３におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対する配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドに対するウサギポリクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ＿ＣＲＵＺ＿ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ），配列番号２および配列番号３のペプチド，及びそれらの併用剤の結果を示すウェスタンブロッティングの写真である。図１中，第１レーンはコントロールを示し；第２レーンは，配列番号２の１００ｎＭのペプチドで処理したものを示し；第３レーンは，配列番号３の１００ｎＭのペプチドで処理したものを示し；第４レーンは，１００ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理したものを示し；第５レーンは，１０ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理したものを示し，；第６レーンは，２００ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号２のペプチドで処理したものを示し；第７レーンは，２００ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号３のペプチドで処理したものを示し；第８レーンは，２０ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号２のペプチドで処理したものを示し；第９レーンは，２０ｎＭのウサギポリクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号３のペプチドで処理したものを示す。第１レーンから第９レーンは，処理開始から１３分後に撮影を行った。なお，処理開始から１３分後の全細胞ライセート回収時における第６，第７における最終濃度は，それぞれ配列番号２および配列番号３のペプチドが１００ｎＭ，ウサギポリクローナル抗体が１００ｎＭであった。また，処理開始から１３分後の全細胞ライセート回収時における第８，及び第９レーンにおける最終濃度は，それぞれ配列番号２および配列番号３のペプチドが１００ｎＭ，ウサギポリクローナル抗体が１０ｎＭであった。

また，図１に，一次抗体としてリン酸化・脱リン酸化型を問わずすべてのｐ４４／４２ＭＡＰＫを認識する抗体，または，α−チューブリンを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング解析した写真を示す。

第１レーンと，第２，第３，及び第４レーンを比較すると，ほとんどＭＡＰＫリン酸化活性を阻害することができないことがわかる。しかし，第１レーンと第５レーンを比較すると，１０ｎＭの抗体がＭＡＰＫリン酸化活性を阻害することが分かる。また，第１レーンと，第６レーン及び第７レーンを比較すると２００ｎＭの抗体と２００ｎＭの配列番号２，３それぞれのペプチドの併用でＭＡＰＫリン酸化活性を阻害することが分かる。さらに，第１レーンと，第８レーン及び第９レーンを比較すると，２０ｎＭの抗体と２００ｎＭの配列番号２，３それぞれのペプチドの併用でＭＡＰＫリン酸化活性を阻害することが分かる。

［参考例１］
配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドに対するウサギポリクローナル抗体をＥｐｈＢ４の細胞外ドメインを構成するポリペプチドに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社：カタログ番号ＩＡＰ０２）に変えて，配列番号２および配列番号３のペプチドを配列番号２と配列番号５と配列番号６のペプチドに変えた以外は，実施例３と同様にしてウェスタンブロットを行った。図２は，実施例４におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対するエフリンＢ２を投与した結果を示すウェスタンブロッティング解析した写真である。図２中，第１レーンはコントロールを示し；第２レーンは２０ｎＭのモノクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号５のペプチドで処理したものを示し；第３レーンは２０ｎＭのモノクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号６のペプチドで処理したものを示し；第４レーンは２０ｎＭのモノクローナル抗体で処理し，３分後に２００ｎＭの配列番号２で処理したものを示す。なお，処理開始から１３分後の撮影時における第２レーンから第４レーンの最終濃度は，それぞれモノクローナル抗体が１０ｎＭ，ペプチドの濃度が１００ｎＭであった。
また，図２に，上記と同じ全細胞ライセートを，リン酸化・脱リン酸化型を問わずｐ４４／４２ＭＡＰＫを認識する抗体，または，α−チューブリンを認識する抗体を用いてウェスタンブロッティング解析した写真を示す。第１レーンと，第２，第３，及び第４レーンを比較すると，１０ｎＭの抗体と１００ｎＭの配列番号２，５，６それぞれのペプチドの併用でＭＡＰＫリン酸化活性を阻害することが分かる。

本発明の新生血管阻害剤及び医療用キットは，医薬産業などにおいて利用されうる。

図１は，実施例３におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対する配列番号１で表されるアミノ酸配列を含むペプチドに対するウサギポリクローナル抗体（ＳＡＮＴＡ＿ＣＲＵＺ＿ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＩＮＣ），配列番号２のペプチド，配列番号３のペプチド及びそれらの併用剤の結果を示す図面に替わるウェスタンブロッティングの写真である。図２は，参考例１におけるｐ４４／４２ＭＡＰＫリン酸化に対するＥｐｈＢ４の細胞外ドメインを構成するポリペプチドに対するモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄシステムズ社：カタログ番号ＩＡＰ０２），配列番号２のペプチド，配列番号５のペプチド，配列番号６のペプチドを投与した結果を示すウェスタンブロッティング解析した図面に替わる写真である。図３は，配列番号９に係るペプチドのアミノ酸配列及びこのペプチドをコードする遺伝子の塩基配列を示す図であり，図３Ａは配列番号９に示されるアミノ酸の−２５番目から１６７番目までのアミノ酸を示す。図３Ｂは，図３Ａの続きを示す。

Claims

配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目〜３８５番目のアミノ酸残基からなるペプチドに対する抗体とともに；
“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，
新生血管阻害剤。
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目〜３８５番目のアミノ酸残基からなるペプチドに対する抗体；及び
“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ＤＮＡ合成阻害剤。
配列番号１で表されるアミノ酸配列の１８６番目〜３８５番目のアミノ酸残基からなるペプチドに対する抗体；及び
“配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩”のいずれか又は両方を含有する，ｐ４４／ｐ４２ＭＡＰＫリン酸化活性阻害剤。