WO2008026320A1

WO2008026320A1 - AGENT ANTIANGIOGENÈSE, INHIBITEUR DE SYNTHÈSE DE L'ADN, INHIBITEUR D'ACTIVITÉ DE PHOSPHORYLATION DE LA p44/p42 MAPK, ET KIT MÉDICAL

Info

Publication number: WO2008026320A1
Application number: PCT/JP2007/000936
Authority: WO
Inventors: Tadahisa Kagimoto; Atsushi Wada; Kaoru Azuma; Shigeyuki Yoneda
Original assignee: Aqumen Biopharmaceuticals K.K.
Priority date: 2006-09-01
Filing date: 2007-08-30
Publication date: 2008-03-06
Also published as: JP2009155205A; JP3970311B1

Description

明細書

新生血管阻害剤， D N A合成阻害剤， p 44Zp 42MAPKリン酸化活性阻害剤及び医療用キット

技術分野

[0001] 本発明は， E p h B4に対する抗体及びエフリン B 2の部分ペプチドを含む新生血管阻害剤及び医療用キットなどに関する。

背景技術

[0002] 新生血管は，加齢黄斑変性，糖尿病性網膜症，及び未熟児網膜症のような種々の眼病理症状の顕著な特徴である。したがって，新生血管を阻害し，これらの疾患を治療又は予防できる医薬が望まれる。一方で血管が新生されることは，生体が正常に機能する上でも重要である。そこで，網膜外に向かう病的な血管形成または血管新生を抑制し，かつ網膜中において血管網が形成されることや，血管が成熟することを増強するような医薬が望まれる。

[0003] 大野京子 "加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構一特に色素上皮由来因子の役割について—" 日本眼科学界雑誌（ J o u r n a I o f O p h t h a I mo I o g i c a I S o c i e t y) Vo l . 1 0 7, N o. 1 1 , p p. 657-673, 2003 (下記非特許文献 1 ) には，以下の内容が開示されている。 "加齢黄斑変性（AMD) は，先進諸国における 50代以上の失明原因の常に上位を占める重要な疾患であり，人口の高齢化に伴いますますその頻度は増加しつつある。しかしながら , AMDにおける脈絡膜新生血管（CNV) の分子機構は未だ完全には解明されていない。従来から網膜色素上皮（RP E) が産生する血管内皮増殖因子（VEG F) の発現上昇が CNV発生に重要であるとされてきたが，トランスジエニックマウスの結果などから V E G F単独では C N V発生には不十分であると考えられる。 CNVは無血管である網膜外層に新生血管が侵入していく現象であり，この場合には正常で血管侵入を抑制している抑制因子の発現低下の方が重要ではないかと我々は考えた。そして，近年明らかになつた最強の血管新生抑制因子，色素上皮由来因子（P E D F) に注目し，加齢や酸化ストレスによって生じる RP Eの分化状態の崩れが P E D Fの発現低下を惹起し，その結果生じる V EG Fと P E D Fのバランスの崩れが CN V 発現の引き金を引くのではないかというメカニズムを明らかにした。 "

[0004] T. Ko n d o e t a に， " P K C/M A P K S i g n a l i n g S u p p r e s s i o n b y R e t i n a l P e r i c y t e C o n d i t i o n e d M e d i um P r e v e n t s R e t i n a

E n d o t h e l i a l C e l l P r o l i f e r a t i o n , J o u r n a I o f e e l I u I a r p h y s i o l o g y, 203, p p.

378-386, 2005 (下記非特許文献 2) の F i g 6では， p 44/

42MA P Kの抑制が，細胞増殖及び脈絡膜の血管新生の抑制と強い相関性があることが示されている。

[0005] WO 2006/006079号公報（下記特許文献 1 ) には，エフリン Β 2力《，眼内における動脈及び静脈内皮細胞の D N Α合成の阻害作用を有すること；エフリン B 2力《，眼内における動脈及び静脈内皮細胞における p 44 /p 42 MA P K活性化の阻害作用を有すること；エフリン B 2力《，眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有することが示されている。同文献では，その実施例 3において， CNV (脈絡膜新生血管）モデルを用いてエフリン B 2が加齢黄斑変性（AMD) の治療に有効であることが示されている。しかしながら，本発明の抗体や本出願の配列番号 2〜配列番号 4で表されるぺプチドは開示されていない。

[0006] エフリン B 2に関して，さらに以下の文献が知られている。 W02002/ 26827号公報（特許文献 2) には，エフリン B 2が開示されている。そして，エフリンを目の血管新生の遺伝子治療剤として用いるとの記載がある ( 1頁 4行目〜 1 2行目）。しかし，特許文献 2は，エフリン B 2が新生血管の成長を抑圧するものであるのか，正常血管網の形成を促進するものであるかについては何らの示唆もない。また，特許文献 2は，エフリン B 2の実施例として，腫瘍細胞の阻害実験しかしていないので，エフリン B 2と新生血管との関係や，エフリン B 2と正常血管との関係などについては何ら実証されていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号 2〜配列番号 4で表されるぺプチドは開示されていない。

[0007] 特表平 1 0— 50281 0号公報（特許文献 3) の L ERK—5は，エフリン B 2に相当するものと考えられる。そして，特許文献 3の実施例 1では，ヒトエフリン B 2の c D N Aが単離され，実施例 7ではヒトエフリン B 2 ( 細胞外ドメイン）と F cの融合タンパク質がレセプターのリン酸化を刺激すこと ¾： i n

v i t r o (試験管内）実験で実証している。しかしながら，特許文献 3では , エフリン B 2を神経性疾病へ用いることのみが意図されており（21頁 2 3行目〜 22頁 2行目） , 新生血管関連疾患への用途は記載されていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号 2〜配列番号 4で表されるぺプチドは開示されていない。

[0008] 特表平 1 0— 501 701号公報（特許文献 4 ) の " H t kリガンド" は , エフリン B2に相当するものと推定される。特許文献 4では， H t kリガンドの用途として，神経変性の治療があげられているが（60頁 7行目〜 6 3頁 9行目） H t kリガンドを新生血管など抑制などに用いる点は記載も示唆もされていない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号 2〜配列番号 4で表されるぺプチドは開示されていない。

[0009] 特表 2002— 51 1 41 7号公報（特許文献 5) には，エフリン B 2が , 腫瘍による血管新生を増強等するとの記載がある（特許文献 5の段落 [00 62] )。よって，エフリン B2を，新生血管を阻害するために用いることについて動機付けとなるものはない。まして，本発明の抗体や本出願の配列番号 2〜配列番号 4で表されるぺプチドは開示されていない。

特許文献 1 ： WO2006/006079号公報

特許文献 2： WO 2002/26827号公報

特許文献 3：特表平 1 0— 50281 0号公報特許文献 4：特表平 1 0— 50 1 70 1号公報

特許文献 5：特表 2002— 5 1 1 4 1 7号公報

非特許文献 1 ：大野京子 "加齢黄斑変性における脈絡膜新生血管の分子機構一特に色素上皮由来因子の役割について—" 日本眼科学界雑誌 V o に 1 0 7, N o. 1 1 , p p. 657 -673, 2003

非特許文献 2： T. Ko n d o e t a に， "P KC/MA P K S i g n a l i n g S u p p r e s s i o n b y R e t i n a l P e r i c y t e C o n d i t i o n e d M e d i um P r e v e n t s R e t i n a l E n d o t h e l i a l C e l l P r o l i f e r a t i o n

, J o u r n a l o f e e l I u I a r p h y s i o l o g y, 20 3, p p. 378-386, 2005

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0010] 本発明は，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新生血管阻害剤，医療用キットなどを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

[0011] 本発明は，基本的には，エフリン B 2の受容体である E p h B4に対する抗体（又は当該抗体と配列番号 2などの低分子ポリベプチドをとあわせたもの）を投与することで，新生血管の発生を阻害できるという知見に基づくものである。さらに，本発明は，配列番号 2などの低分子ポリペプチドと E p h B 4に対する抗体を別々に投与すると，これらを同時に投与した場合に比ベて，新生血管阻害活性を著しく高めることができるという知見に基づくものである。

[0012] 本発明は，基本的には，配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 86番目〜385番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体とともに； "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する，新生血管阻害剤に関する。

[0013] 本発明の好ましい態様として，配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 8 6番目〜 385番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体；及び " 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， DNA 合成阻害剤があげられる。

[0014] 本発明の好ましい態様として，配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 8 6番目〜 385番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体；及び " 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， p 44 Zp 42MAPKリン酸化活性阻害剤があげられる。

[0015] たとえば，後述する実施例 3では，配列番号 1で表されるアミノ酸配列の

1 86番目〜 385番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体と，配列番号 2又は配列番号 3に係るぺプチドとを用いて，抗体の濃度によらず , 配列番号 2又は配列番号 3に係るペプチドを用いることで， MAP リン酸化活性を阻害することが示されている。そして，本発明の抗体及び低分子ぺプチドは， p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害能を有するので， D N A合成阻害剤として有効に機能する。特に，本発明の抗体及び低分子ぺプチドは，眼内における新生血管に関する DN A合成阻害剤として有効である発明の効果

[0016] たとえば，後述する実施例 3では，配列番号 1で表されるアミノ酸配列の

1 86番目〜 385番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体と，配列番号 2又は配列番号 3に係るぺプチドとを用いて，抗体の濃度によらず , 配列番号 2又は配列番号 3に係るペプチドを用いることで， MAP リン酸化活性を阻害することが示されている。そして，本発明の抗体及び低分子ぺプチドは， p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害能を有するので， D N A合成阻害剤として有効に機能する。特に，本発明の抗体及び低分子ぺプチドは，眼内における新生血管に関する DN A合成阻害剤として有効であるすなわち，後述する実施例により実証されたとおり，本発明によれば，新生血管が関連する疾患の治療に有効な新生血管阻害剤， D N A合成阻害剤， p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害剤及び医療用キットなどを提供でさる。

図面の簡単な説明

[0017] [図 1]図 1は，実施例 3における p 44/42 MA P Kリン酸化に対する配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むぺプチドに対するゥサギポリクローナル抗体 (S A N T A_C R U Z_B I OT ECHNO LOGY, I NC) , 配列番号 2のべプチド，配列番号 3のべプチド及びそれらの併用剤の結果を示す図面に替わるウェスタンプロッティングの写真である。

[図 2]図 2は，参考例 1における p 44/42 MAP Kリン酸化に対する E p h B 4の細胞外ドメインを構成するポリべプチドに対するモノクローナル抗体（R&Dシステムズ社：カタ口グ番号 I A P 02 ) , 配列番号 2のぺプチド，配列番号 5のペプチド，配列番号 6のペプチドを投与した結果を示すゥエスタンプロッティング解析した図面に替わる写真である。

[図 3A]図 3は，配列番号 9に係るぺプチドのアミノ酸配列及びこのべプチドをコードする遺伝子の塩基配列を示す図であり，図 3 Aは配列番号 9に示されるアミノ酸の一25番目〜 1 67番目までのアミノ酸を示す。

[図 3B]図 3 Bは，図 3 Aの続きを示す。

発明を実施するための最良の形態

[0018] 本発明の第一の側面は，配列番号 1 ( 「ヒト，マウスなどの高等哺乳動物の E p h B4の， N末端シグナル配列を除いた細胞外ドメイン（1 6番目〜 5 39番目までのアミノ酸残基からなるペプチド）」）で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体を含有する新生血管阻害剤に関する。すなわち，本発明の第一の側面は，有効量の発明の抗体を有効成分として含有する新生血管阻害剤に関する。有効量とは，新生血管の発生を阻害するために十分な量を意味し，患者によって適宜調整すればよい。

[0019] 本発明の抗体は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体；又は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体とともに，又は当該抗体に替えて；配列番号 1において， 1個， 2個又は 3個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体である。本発明の抗体は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又は配列番号 1において， 1個， 2 個又は 3個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド（以下，「本発明の細胞外領域ペプチド」ともよぶ。）を認識しうる抗体であれば，ポリクローナル抗体，モノクローナル抗体のいずれであってもよいし，キメラ抗体， CDR移植抗体，及びヒト抗体（完全ヒト抗体を含む）であってもよい。

[0020] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むぺプチド（より具体的にはヒト由来の E p h B4の細胞外ドメインに位置する 201番目〜 400番目のァミノ酸残基からなるぺプチド，すなわち配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 86番目〜 385番目のアミノ酸残基からなるペプチド）に対するゥサギポリクロ一ナル抗体は，サンタクルズバイオテクノロジ一社（SAN TA _C R U Z_B I OT ECHNO LOGY, I NC) の E p h B4 (H_2 00) ： s c— 5536として，販売されている。また， E p h B4の細胞外ドメインを構成するポリべプチドに対するモノクローナル抗体は，例えば , R&Dシステムズ社からカタログ番号 I A P 02として，販売されている。すなわち，本発明の抗体は，市販されているものを適宜用いてもよい。また，本発明の抗体は，公知の抗体の産生方法に従って，製造してもよい。本発明の細胞外領域べプチドを抗原として用い，公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。本発明の抗体単独で，又は下記に説明する本発明のぺプチドと合わさって， MA P Kリン酸化活性阻害能を有するので，公知の製剤化のための方法を適宜採用することで，本発明のペプチドを含有する新生血管阻害剤に用いることができる。

[0021] 本発明の細胞外領域ペプチドは，ヒトゃ哺乳動物の細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできる。また，本発明の細胞外領域べプチドをコ一ドする D N Aを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また，後述するタンパク質合成法またはこれに準じた公知の方法により製造することもできる。

[0022] 本発明の細胞外領域ペプチドを，ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合，ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後，酸などで抽出を行ない，得られた抽出液を逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより単離■精製することができる。

[0023] 目的の抗体を得るための抗原ェピトープは，たとえば，本発明の細胞外領域べプチドのアミノ酸配列において抗原性の高い領域，表在性がある領域，二次構造をとらない可能性のある領域，他の蛋白質とホモロジ一がないか又は低い領域から適宜選択されればよい。ここで抗原性の高い領域は， P a r k e rらの方法 [B i o c h e m i s t r y , 25巻， 5425— 5432 頁（1 986年） ] によって推定することができる。表在性がある領域や二次構造をとらない可能性のある領域は，すでに発表されている E p h B4の立体構造解析の結果 [ (S t r u c t u r e, 1 4巻， 32 1 —330頁（ 2006年） ] から同定することができる。さらに，表在性がある領域は，相同性の高い E p h B 2受容体の立体構造解析の結果 [ (N a t u r e, 4 1 4巻， 933— 938頁（200 1年） ] から推定することもできる。また，表在性がある領域は，例えばハイド口パシーインデックスを計算し，プロットすることによって推定することができる。二次構造をとらない可能性のある領域は，例えば， C h o uと F a sma nの方法 [A d v. E n z y mo に R e I a t . A r e a s, Mo に B i o l . , 47巻， 45— 1 4 8頁（1 978年） ] によって推定することができる。本発明の細胞外領域ペプチドのうち配列番号 1において， 1個， 2個又は 3個のアミノ酸が欠失 , 置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，上記の指針に基づき抗原性の高くない領域においてアミノ酸を欠失，置換，挿入若しくは付加すればよい。

[0024] 上記の手法で推定された本発明のポリべプチドのアミノ酸配列又はその部分ァミノ酸配列を基に，ぺプチド合成法を利用することによって該ァミノ酸配列からなるペプチドを合成することができる。目的のペプチドは，例えば , R. B. M e r r i f i e l d [S c i e n c e, 232巻， 34 1 — 347頁（1 986年） ] によって開発された固相ペプチド合成に基づいた市販のペプチド合成機を使用して合成し，保護基を脱離後，イオン交換クロマトグラフィ一，ゲル濾過クロマトグラフィー，逆相クロマトグラフィー等を単独もしくは組合わせた方法により精製すればよい。

[0025] ポリクローナル抗体の製造方法は公知であるので，ポリクローナル抗体は公知の製造方法に従って製造すればよい。すなわち，得られたポリペプチドを抗原として動物（ヒト又は非ヒト哺乳動物など。以下同様。）に免疫し，血清等を分離することにより目的とするポリクローナル抗体を製造できる。宿主細胞としては，原核生物（例えば大腸菌のような細菌）および真核生物 (例えば酵母， CHO細胞，昆虫細胞等）のいずれも使用され得る。宿主動物から得られた血清から，抗原に結合する画分を集め，精製することにより , ポリクローナル抗体を取得することができる。

[0026] モノクローナル抗体の製造方法は，公知であるので，モノクローナル抗体は公知の製造方法に従って製造すればよい。たとえば，得られたポリべプチドを抗原として動物に免疫し，その動物の脾臓細胞などの抗体産生細胞を分離し，ミエローマ細胞などの骨髄腫細胞と細胞融合させてハイプリドーマを作成した後，このハイプリドーマを培養することによりモノクローナル抗体を製造できる。また，ハイプリドーマ細胞を形成するために，ポリエチレングリコールのような適当な融合試薬を用いて，リンパ球を骨髄腫細胞と融合させることにより，モノクローナル抗体を作製することができる [G o d i n g, Mo n o c l o n a l A n t i b o d i e s : P r i n c i p a l s a n d P r a c t i c e, 59— 1 03頁， A c a d em i c p r e s s, ( 1 986年） ]。例えば本発明のモノクローナル抗体は，ハイプリドーマ法 [N a t u r e, 256巻， 495頁（1 975年） ] を用いても , 組換え D N A法（C a b i I I yら，米国特許第 48 1 6567号）を用いても作製することができる。モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては，抗原を免疫された温血動物，例えば，マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓またはリンパ節を採取し，それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより，モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は，例えば，後記の標識化レセプタータンパク質と抗血清とを反応させたのち，抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法，例えば，ケ一ラーとミルスタインの方法〔ネィチヤ一（N a t u r e) , 256巻， 495頁（ 1 975年）〕に従い実施することができる。融合促進剤としては，例えば，ポリエチレングリコール

(P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられ，好ましくは P EGが用いられる。骨髄腫細胞として，例えば， N S— 1 , P 3 U 1 , S P 2/0などが挙げられるが， P 3 U 1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1程度であり， P EG (好ましくは， P EG 1 000〜P EG 6000) 力《1 0〜80 %程度の濃度で添加され，約 20〜 40 °C, 好ましくは約 30〜 37 °Cで約 1〜1 0分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できるモノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが，例えば，レセプタータンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例，マイクロプレート）にハイブリド一マ培養上清を添加し，次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合，抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテイン Aを加え，固相に結合したモノクロ一ナル抗体を検出する方法，抗免疫グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し，放射性物質や酵素などで標識したレセプタ一タンパク質を加え，固相に結合したモノク口一ナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は，公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが，通常は HAT (ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては，ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば， 1〜20%, 好ましくは 1 0〜 20 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 640培地， 1〜 1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地（和光純薬工業（株） ) またはハイプリドーマ培養用無血清培地（S FM— 1 01 , 日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は，通常 20〜40°C, 好ましくは約 37 °Cである。培養時間は，通常 5日〜 3週間，好ましくは 1週間〜 2週間である。培養は，通常 5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイプリドーマ培養上清の抗体価は , 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。モノクローナル抗体の分離精製は，通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例，塩析法，アルコール沈殿法，等電点沈殿法，電気泳動法，イオン交換体（例， DEAE) による吸脱着法，超遠心法，ゲルろ過法，抗原結合固相またはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し，結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。

キメラ抗体とは，抗体のうち可変領域のみを非ヒト由来とし，定常領域をヒト由来とした抗体である。また，定常領域をヒトの定常領域に置き換えたキメラ抗体，例えばマウス -ヒトキメラ抗体は， Ca b i I I yら，米国特許 481 6567および Mo r r i s o nら， P r o c. N a t l . A c a d.

S c に USA, 89巻， 6851頁（ 1 984年））に開示される方法に従って製造すればよい。また，特許第 34401 04号公報に記載される「（1 ) ヒト抗体重鎖定常領域 Cr1をコードする c D N Aを動物細胞用発現ベクタ一に挿入することによりカセットベクタ一を構築し，該カセットべクターにヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードする c D N Aを挿入するためのクローニングサイトを設け，（2) ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコードする c D N Aを制限酵素を用いて切り出し，（3) ヒト抗体重鎖定常領域の 5' 末端側の塩基配列と，ヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域の 3' 末端側の塩基配列とからなり，制限酵素部位を両端に有する合成 D N Aと，上記（2) で得られたヒト以外の動物の抗体の重鎖可変領域をコ —ドする c D N Aとを該カセットベクターに揷入することにより，該合成 D N Aを介してヒト抗体重鎖定常領域 C 1をコードする c D N Aとヒト以外の動物の抗体重鎖可変領域をコードする c D N Aとが結合されたヒト型キメラ抗体重鎖発現ベクターを構築し，（4) ヒト抗体軽鎖定常領域 C/iをコードする c D N Aを動物細胞用発現ベクターに挿入することによりカセットべクターを構築し，該カセットベクターにヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードする c D N Aを揷入するためのクローニングサイトを設け，（5) ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードする c D N Aを制限酵素を用いて切り出し，（6) ヒト抗体軽鎖定常領域の 5' 末端側の塩基配列と，ヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域の 3 ' 末端側の塩基配列とからなり，制限酵素部位を両端に有する合成 D N Aと，上記（5) で得られたヒト以外の動物の抗体の軽鎖可変領域をコードする c D N Aとを該カセットベクターに挿入することにより，該合成 D N Aを介してヒト抗体軽鎖定常領域 C Kをコ —ドする c D N Aとヒト以外の動物の抗体軽鎖可変領域をコ一ドする c D N Aとが結合されたヒト型キメラ抗体軽鎖発現ベクターを構築し，（7) 上記

(3) で得られたヒト型キメラ抗体重鎖発現ベクターおよび上記（6) で得られたヒト型キメラ抗体軽鎖発現ベクターを動物培養細胞に導入し，（8) 上記（7) で得られた動物培養細胞を培地中に培養し，培養物中にヒト型キメラ抗体を生成蓄積させ，該培養物からヒト型キメラ抗体を採取することを特徴とするヒト型キメラ抗体の製造法。」や，特許第 2 6 243 1 4号公報に開示される相同組換えによるキメラ抗体の製造方法，すなわち「修飾抗体分子を発現する細胞系を製造する方法であって，（a) 抗体生産リンパ細胞系を，（ i ) リンパ細胞系の免疫グロプリン遺伝子のゲノム配列の一部分を修飾する置換遺伝子，および（ i i )変換される免疫グロブリン配列に隣接する第 2 D N A配列に相同性の標的配列，を含む標的ベクターで，置換遺伝子が生体内でゲノム染色体 D N Aと共に部位特異性相同組換えにより免疫グロブリン配列を修飾するようにトランスフエクトし，（b) 修飾抗体分子を生産するトランスフエクタントを選択する，ことを含む方法」によって製造してもよい。

[0029] C D R移植抗体とは，抗体の定常領域のうち抗原との結合に関与する領域のみを非ヒト由来とした抗体である。定常領域および超可変領域（または， C o m p I e m e n t a r y-D e t e r m i n ι n g R e g ι o n ； C D R) を除く全ての可変領域をヒトの配列に置き換えたヒト化抗体は， C a r t e rら， P r o c. N a t l . A c a d . S c に U S A, 8 9巻， 42 8 5ページ（1 9 9 2年）又は C a r t e rら， B i o T e c h n o l o g y , 1 0巻， 1 6 3頁，（1 9 9 2年） ]に開示される方法に従って製造すればよい。これら抗体をヒトに投与した場合，異種抗原に対する抗体，たとえばヒト抗マウス抗体（ H A M A)などの出現が起こらないようにするために，キメラ抗体やモザイク抗体もしくはヒト化抗体の使用が好ましぐ最も好ましくは完全ヒト抗体である。

[0030] 「キメラ抗体」や「ヒト化抗体」はマウス抗体断片を依然含み，「H AM A (h u m a n a n t ι —m o u s e a n t ι b o d y) / H A C A 、 h u m a n a n t i — c h i m e r i c a n t i b o d y)反応」を 5lき起こすことがある。このような反応を惹き起こさない抗体を産生するためには， G r e e n , L . L . e t

a に， N a t u r e G e n e t . , 7 ： 1 3— 2 1 , 1 9 94.に記載される方法に従って，マウスの液性免疫系をヒ卜に置き換えたトランスジエニックマウスを創成すればよい。具体的には， 1 ) ィムノグロブリン（ I g)重鎖（ I g H)遺伝子不活性化マウスを創成する。 2) I g$5tl( l & κ)Λ 伝子不活性化マウスを創成する。 3) ヒト I g Η遺伝子導入マウスを創成する。 4) ヒト I g K遺伝子導入マウスを創成する。 5) これらマウスの交配により， "マウス由来 I g遺伝子不活性化及びヒト由来 I g遺伝子導入マウス" を創成する。 I g Hおよび I g Kの不活性化マウスの創成にはジーンタ —ゲティング法，ヒト I g Hおよび I g Kの導入マウスの創成にはヒトゲノムを組み込んだ酵母人工染色体（Y AC)ライブラリ一からクロ一ニングされたヒト I g Hおよび I g K遺伝子を用いればよい。ヒト I g Hおよび I g K 遺伝子を含む Y AC (H P RT+)を保持する酵母を H P RT_の ES細胞とスフエ口プラスト融合し， HAT選択し，ジーンタ一ゲティング法と同様な方法で生殖系列を得ればよい。「抗体」は，マウスまたは他の適した宿主動物 (たとえばゥサギ，ゥシ，ゥマ，ヒッジ，ブタ，げっ歯類など）を免疫に用いられた蛋白質に特異的に結合するであろう抗体を産生するか，産生するであろうリンパ球を引き出すために，皮下，腹腔内，または筋肉内の経路によつて，抗原あるいは抗原発現細胞により免疫化することによって得ることができる。さらに宿主動物としてはヒト抗体遺伝子のレバ一トリーを有するトランスジエニック動物に抗原または抗原発現細胞を投与し，所望のヒト化抗体を取得してもよい [P r o c. N a t l . A c a d. S c に U S A, 97巻， 722— 727頁（2000年），国際公開 WO 96/33 735号パンフレット，国際公開 WO 97/0767 1号パンフレット，国際公開 WO 97/1 3852号パンフレツト，国際公開 WO 98/3775 7号パンフレット参照] 。また，リンパ球をインビトロで免疫化してもよい本発明の抗体の発現量および抗原結合活性は酵素免疫抗体法（E L I SA ； A n t i b o d i e s : A L a b o r a t o r y

Ma n u a l , し o l d s p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ， C h a p t e r 1 4 (1 988) , Mo n o c l o n a l A n t i b o a n d P r a c t i c e, A c a d em i c P r e s s L i m i t e d ( 1 996) ) により測定できる。具体的には，本発明の細胞外領域ペプチドを合成し，これとゥシ血清アルブミンなどのキャリア一蛋白質とを化学的に結合させたコンジュゲートを作製する。このコンジュゲートを E L I S Aプレートに固相化し，本発明の抗体を反応させ，さらにペルォキシダーゼ，ビォチンなどの酵素標識などを施した抗ィムノグ口ブリン抗体あるいは結合断片を反応させた後，発色色素を吸光光度計で測定することにより，本発明の抗体の結合活性を測定することができる。公知の方法により測定できる。また，本発明の抗体の抗原との結合性は免疫酵素抗体法，蛍光抗体法（C a n c e r

I mm u n o l . I mm u n o t h e r . , 36, 37 ( π 99 ) , B I A c o r e ^TM等を用いた表面プラズモン共鳴等によっても測定できる。

[0032] 本発明の抗体を蛍光性物質（ローダミン，フルォレサミンなど）で直接標識することにより，または本抗体を認識する蛍光標識された二次抗体を用いることにより，さらには本抗体をビォチン標識し蛍光標識ストレプトァビジンを用いることにより，周知の F ACSを用いて本発明のぺプチドを細胞表面に発現する目的の細胞を検出■分離することができる。また本抗体を固相（たとえばポリスチレンビーズ，マイクロタイタ一ゥエル表面，ラテックスビーズなど）に結合して不均一系で，あるいは均一系で，免疫学的反応を行って相同な膜分子を検出，定量（蛍光抗体法， E L I SA, ラジオィムノアッセィなどの方法使用）することができる。この場合，免疫学的反応は競合反応であってもよいし非競合反応であってもよい。また 2つ以上の抗体（モノク口 —ンまたはポリクローン）を用いるサンドィツチ法による反応も使用できる。上記における検出，定量のためには，当業界で公知のいずれの免疫学的手法も用いることができる。

[0033] [本発明のモノクローナル抗体]

本発明のモノクローナル抗体は，ヒト由来 E p h B 4タンパク質と特異的に反応し得るすべてのモノクローナル抗体を包含する。その中でも，ヒト由来 E p h B 4タンパク質の細胞外領域と特異的に反応するモノクローナル抗体が好ましぐ後述するハイプリドーマが産生するモノクローナル抗体がより好ましい。

[0034] [本発明のモノクローナル抗体の作成]

本発明のヒト由来 E p h B4タンパク質に特異的に反応するモノクロ一ナル抗体は，例えば，次の各工程を経て製造することができる。すなわち，（ 1 )

抗原の調製，（2) 免疫及び抗体産生細胞の採取，（3) 細胞融合，（4 ) ハイプリドーマの選択及びクローニング，及び (5) モノクローナル抗体の採取である。以下，各工程について説明する。

[0035] [抗原の調整]

抗原とするヒト由来 E p h B4タンパク質の調製は，公知の方法を適宜採用でき，特定の方法には限定されないが，ヒト由来 E p h B4タンパク質をコ一ドする c D N Aが既に公知であるので [NM— 004444], この c D N Aを利用して抗原とするヒト由来 E p h B 4タンパク質を調製する方法が好ましい。ヒト由来 E p h B4タンパク質をコードする c DNAは，例えば , 前記した公知の c D N Aを利用できる。上記 c D N Aからヒト由来 E p h B 4タンパク質を調製するためには，例えば，ヒト由来 E p h B4タンパク質をコードする c DN Aを含む組換えベクターを作製し，このベクターを用いて適当な宿主細胞を形質転換し，その形質転換体を適当な培地で培養し，得られる培養物を精製することにより行うことができる。

[0036] ここで，使用する c DNAは，ヒト由来 E p h B4タンパク質をコードする c D N Aの全領域であってもよいが，配列番号 1に示すヒト由来 E p h B 4タンパク質の細胞外領域（ァミノ末端側から 25〜 521番目のアミノ酸残基）をコードする DN Aが好ましい。ヒト由来 E p h B4タンパク質の細胞外領域をコードする c DN Aを使用する際，ヒト由来 E p h B4タンパク質の細胞外領域の一部（例えば，ァミノ末端側から 1 6〜538番目のアミノ酸残基）をコードする c DN Aを使用してもよい。組換えベクター及び宿主細胞としては，特に限定されず公知のいかなるものを使用してもよいが，特に， C M Vプロモータ発現プラスミド及び霊長類培養細胞，または，組換えバキュロウィルス及び昆虫培養細胞を使用するのが好ましい。形質転換体の培養及び培養物の精製は，常法に従って行うことができる。

[0037] [免疫及び抗体産生細胞の採取]

上記のようにして得られたヒト由来 E p h B 4タンパク質を免疫原として , アジュバンドとともに哺乳類，鳥類等に投与する。ここで，アジュバンドとしては，市販のフロイント完全アジュバンド，フロイント不完全アジュバンド， B C G , ハンターズ，タイタ一マックス，キーホールリンペットへモシァニン含有オイル等が挙げられ，これらを単独で用いてもよいし，これらの 2種以上を混合して用いてもよい。

[0038] 哺乳類としては，ゥマ，サル，ィヌ，ブタ，ャギ，ヒッジ，ゥサギ，モルモット，ハムスター，マウス等を用いることができ，鳥類としては，ハト，ニヮトリ等を用いることができるが，特にマウス，ラット等を用いることが好ましい。投与の方法としては，公知の何れの方法をも用いることができる力《，静脈内投与，皮下投与，又は腹腔内投与が好ましい。

[0039] 抗原の免疫量は 1回にマウス 1匹当たり，通常 1 0〜2 0 0 ;U g , 好ましくは 2 5〜 1 0 0 gである。免疫の間隔は，通常 1〜4週，好ましくは 2 週であり，免疫の回数は，通常 2〜 5回，好ましくは 3〜 4回である。

[0040] 最終免疫日から 1〜5日後，好ましくは 3日後に，抗体産生細胞を採集する。採取する抗体産生細胞としては，リンパ節細胞，脾臓細胞等が挙げられるが，好ましくは足リンパ節細胞である。

[0041 ] [細胞融合]

抗体産生細胞と細胞融合させるミエローマ細胞としては，マウス，ラット , ヒト等の種々の動物に由来し，当業者が一般に入手可能である株化細胞を使用できる。使用する細胞株としては，薬剤抵抗性を有し，未融合の状態では選択培地 (例えば H A T培地）で生存できず，抗体産生細胞と融合した状態でのみ選択培地で生存できる性質を有するものが好ましい。好ましくは， 8 —ァザグァニン耐性株を用いることができる。この細胞株は，ヒポキサンチン一グァニンホスフオリポシルトランスフェラ一ゼを欠損し（HG P RT-), HAT培地で生育できない。

[0042] このようなミエ口一マ細胞としては， P 3/X 63 _ A g 8 _ U I等のマウスミエ口一マ細胞株， 21 0. RCY. A g 1. 2. 3等のラットミエロ —マ細胞株， S KO— 007等のヒトミエロ一マ細胞株等を使用することができる。細胞融合は，例えば，ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを混合比 1 ： 5〜1 ： 1 0の割合で， RPM I 1 640培地等の培地中で融合促進剤存在下，室温で 2〜5分間細胞同士を接触させることによって行うことができる。この際，融合促進剤として，平均分子量 1 500〜4000のポリェチレングリコール，ポリビニールアルコール等を用いることができる。また，融合促進剤として，センダイウィルス等の融合ウィルスを用いることもできる。

[0043] [ハイプリドーマの選択及びクローニング]

細胞融合後，目的とするハイプリドーマを選別する。選別方法は，通常の方法に従えばよぐ特に限定されない。選別方法としては，例えば，次の方法を用いることができる。すなわち，マイクロプレートの各ゥエルにヒト由来 E p h B4タンパク質を吸着させた後，ブロックエース（大日本製薬)等でブロックする。該マイクロプレートの各ゥエルにハイプリドーマの培養上清を加え， 37°〇で1時間放置し，ヒト由来 E p h B4タンパク質とヒト由来 E p h B 4タンパク質に特異的に反応するモノクローナル抗体とを反応させる。これを生理的食塩水で洗浄した後，適当に希釈したアルカリフォスファターゼ結合ャギ抗ィムノグロブリンを加える。生理的食塩水で洗浄した後， A L Pローゼ（シノテスト社）を用いてアル力リフォスファタ一ゼの活性を測定し，アル力リフォスファタ一ゼの呈色を有するゥエルをヒト由来 E p h B 4タンパク質に特異的な抗体を産生する細胞を含むゥエルとする。このゥェルから目的とするハイプリドーマをクローニングする方法は，通常の方法に従えば良ぐ特に限定されない。ハイプリドーマのクローニングは，例えば , 限界希釈法，軟寒天法，フイブリンゲル法，蛍光励起セルソーター法等により行なうことができる。

[0044] [モノクローナル抗体の採取]

取得したハイプリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては , 通常の細胞培養法や腹水形成法等を用いることができる。細胞培養法においては，例えば，ハイプリドーマを 1 0〜2 0 %仔ゥシ血清含有 R Ρ Μ I 1 6 4 0培地， Μ Ε Μ培地， Ε - R D F培地又は無血清培地等の動物細胞培地中で，通常の培養条件 (例えば， 3 7 °C, 5 % C 0 ₂濃度）で 3〜7日間培養し , その培養上清から目的とするモノクローナル抗体を取得できる。

[0045] 腹水形成法においては，例えば，ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にプリスタン（2 , 6 , 1 0 , 1 4—テトラメチルペンタデカン )等の鉱物油を投与し，その後，ハイプリドーマ 1 X 1 0 ⁶〜 1 X 1 0 7個，好ましくは 5 x I 0 ⁶個を腹腔内に投与する。投与した哺乳動物を 1〜4週間，好ましくは 2週間，飼育した後，腹水又は血清を採取することにより目的とするモノクローナル抗体を取得できる。

[0046] 上記抗体の採取方法において，抗体の精製が必要とされる場合には，硫酸塩分析法， D E A E _セルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー，プロテイン Aセファロ一ス等を用いるァフィ二ティ一クロマトグラフィー，分子量や構造によってふるい分ける分子ふるいクロマトグラフィ一等の公知の方法を適宜に選択し，これらを単独で又は組み合わせて使用することにより精製を行うことができる。

[0047] 本発明の好ましい態様は，上記した本発明の抗体と以下説明する本発明のペプチドとを併用することである。すなわち，本発明のペプチドは， "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド" , "配列番号 2において , 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン B 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 3において , 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン Β 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ，又は "配列番号 4で表されるアミノ酸配列を具備するぺプチドであって，当該べプチドに含まれるアミノ酸残基の数が 9以上， 1 0 0以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなるペプチド" , "配列番号 5において， 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン Β 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はそれらの薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 6において， 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン Β 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ， "配列番号 7で表されるアミノ酸配列を具備するぺプチドであって，当該べプチドに含まれるアミノ酸残基の数が 9以上 , 1 0 0以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" ，又は " 配列番号 8で表されるアミノ酸配列を具備するべプチドであって，当該ぺプチドに含まれるアミノ酸残基の数が 9以上， 1 0 0以下であるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" に関する。以下，これらをまとめて "本発明のペプチド" ともよぶ。本発明のペプチドは，自ら新生血管の阻害能を有するほか，本発明の抗体，又はエフリン Β 2の新生血管阻害活性を高める働きを有する補助剤としても機能する。そして，本発明の抗体，又はエフリン Β 2は，新生血管の発生を阻害するので，本発明のペプチドは，新生血管が関与する疾患の治療又は予防用に有用である。

本発明のぺプチドのうち，配列番号 2において 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドは，配列番号 2で表されるぺプチドと同様の活性を有するものである。このようなぺプチドは，容易に製造できるし，また，その活性も本明細書における実施例と同様にして行うことで容易に確かめることができる。配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 2位から 1 0位の部分（配列番号 4 ) が G _ Hループを構成する部位であると考えられ，しかもこの部位が作用部位であると推測される。従って， "配列番号 2において 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド" として，配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 2位から 1 0位の部分以外の部位におけるアミノ酸が 1又は 2個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであることが好ましい。また， "配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" の有効性は，後述する実施例において実証されたとおりである。そして， "配列番号 3において， 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン B 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" についても，配列番号 4で示されるアミノ酸残基が保存され，それ以外の部位について 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましし、。なお，配列番号 2で表されるアミノ酸配列において 2位から 1 0位の部分（配列番号 4 ) を含めば，適宜公知のアミノ酸配列が付加されてもよぐ例えば 5から 1 0 0個のアミノ酸残基からなるものであっても， 1 0から 2 0個のアミノ酸残基からなるものであってもよい。

また，配列番号 5において 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるぺプチドは，配列番号 5で表されるぺプチドと同様の活性を有するものである。このようなペプチドは，容易に製造できるし，また，その活性も本明細書における実施例と同様にして行うことで容易に確かめることができる。配列番号 5で表されるァミノ酸配列において 8位を除く 4位から 9位の部分（配列番号 7 ) がストランド Α _ Α ' を構成する部位であると考えられ， 1 3位から 1 6位の部分（配列番号 8 ) 力《 A ' _ Βループを構成する部位であると考えられ，しかもこの部位が作用部位であると推測される。従って， "配列番号 5において 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチド" として，配列番号 5で表されるアミノ酸配列において 8位を除く 4位から 9 位の部分以外の部位におけるアミノ酸が 1又は 2個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるぺプチドであることが好ましぐ配列番号 5で表されるアミノ酸配列において 1 3位から 1 6位の部分以外の部位におけるアミノ酸が 1又は 2個欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるぺプチドであることが好ましい。

また， "配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" の有効性は，後述する実施例において実証されたとおりである。そして， "配列番号 6において， 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，エフリン B 2の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" についても，配列番号 7または配列番号 8で示されるァミノ酸残基が保存され , それ以外の部位について 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるものが好ましい。なお，配列番号 5で表されるアミノ酸配列において 8位を除く 4位から 9位の部分（配列番号 7 ) , または， 1 3位から 1 6位の部分（配列番号 8 ) を含めば，適宜公知のァミノ酸配列が付加されてもよぐ例えば 5から 1 0 0個のアミノ酸残基からなるものであっても， 1 0から 2 0個のアミノ酸残基からなるものであってもよい。なお，このようなペプチドは，例えば，配列番号 9で表されるエフリン B 2のアミノ酸配列から前記した部位を含む部分べプチド（例えば 5から 1 0 0個のアミノ酸残基，好ましくは 1 0から 3 0個のアミノ酸残基，より好ましくは 1 0から 2 0個のアミノ酸残基）を取り出すことによって得ることもできる。さらに，そのようにして取り出したエフリン B 2の部分ぺプチドから， 1又は数個（具体的には， 2 , 3 , 4 ,又は 5個）のアミノ酸が欠失 , 置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであって，本発明のぺプチドと同様の活性を有するものであってもよい。「本発明のぺプチドと同様の活性」とは，例えば，眼内の新生血管の抑制能を有するものを意味する。なお，配列番号 1 0で示される塩基配列は，配列番号 9で示されるエフリン B 2をコ一ドする D N Aの塩基配列である。

[0051 ] 本発明のペプチド（ポリペプチド）は，左端が N末端（ァミノ末端） , 右端が C末端（力ルポキシル末端）として表記される。本発明のペプチドは， C末端が力ルポキシル基（- C O O H ) , カルポキシレート（- C O O-) , ァミド（- C O N H ₂ ) 又はエステル（- C O O R ) のいずれであってもよい。ここでエステルにおける Rとして，例えば，メチル，ェチル， n—プロピル，イソプロピル， n _ブチルなどの C ^ ₆アルキル基などがあげられる。本発明のペプチドが， C末端以外に力ルポキシル基（またはカルポキシレート）を有している場合，その力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されていてもよい。さらに，本発明のペプチドは， N末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば，ホルミル基，ァセチル基などの C ^ ₆アルカノィルなどの C _ ₆ァシル基など）で保護されているものなどであってもよい。

[0052] 本発明のペプチドにおける "薬理学的に許容される塩" として，無機酸（例えば，塩酸，リン酸，臭化水素酸，硫酸）との塩，又は有機酸（例えば，酢酸，ギ酸，プロピオン酸，フマル酸，マレイン酸，コハク酸，酒石酸，クェン酸，リンゴ酸，蓚酸，安息香酸，メタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸）との塩などがあげられる。

[0053] 本発明のペプチド，本発明の細胞外領域ペプチド，またはそれらの塩は，ヒトゃ哺乳動物などの細胞または組織から公知のタンパク質の精製方法によつて製造することができる。また，ペプチドをコードする D N Aを含有する形質転換体を培養することによつても製造できる。また，ペプチド合成法に準じて製造することもできる。ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から本発明のペプチドを製造する場合，例えば，組織または細胞をホモジナイズした後 , 酸などで抽出を行ない，該抽出液を逆相クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより，本発明のぺプチドまたはその塩を，単離精製することができる。

[0054] ペプチドの合成法として，例えば，固相合成法，液相合成法（泉屋信夫，加藤哲夫，青柳東彦，脇道典，「ペプチド合成の基礎と実験」 1 9 8 5 , 丸善（株））があげられる。また，反応後は通常の精製法，例えば，溶媒抽出 ■蒸留■カラムクロマトグラフィ一■液体クロマトグラフィ一■再結晶などを組み合わせることで，本発明のペプチドを単離精製できる。上記方法で得られるべプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換することができるし，逆に塩で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

[0055] 本発明のポリべプチドのうち配列番号 2で表されるぺプチドを固相合成法で製造する場合，例えば，アミノ酸配列の 2 0位の残基の，保護アミノ酸残基の力ルポキシル基を直接（又は場合によりスぺーサーを介して，）クロロメチル基あるいはォキシメチル基を有する不溶性樹脂に結合させる。その後 , アミノ酸配列の 1 9位から 1位までの各保護アミノ酸を固相合成法に従つて順次結合させる。その後，不溶性樹脂およびアミノ酸の保護基を脱離させる。このようにして，本発明のポリペプチドを得ることができる。前記不溶性樹脂，スぺーサー，及び N—保護アミノ酸を不溶性樹脂に結合した N—保護アミノ酸樹脂などは，公知の方法で調製でき，また市販されるものを適宜用いてもよい。また，配列番号 2で表されるペプチド以外を合成する場合も , 配列番号 2で表されるぺプチドと同様にして合成できる。

[0056] 不溶性樹脂は， C末端の N—保護ァミノ酸の力ルポキシル基と直接結合できるか，又はスぺーサーを介して結合でき，前記力ルポキシル基から脱離できるものであれば特に限定されず，公知のものを適宜用いることができる。このような不溶性樹脂として，例えば， B o c (t-ブチルォキシカルポニル ) ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，クロロメチル樹脂（クロロメチル化スチレン- ジビニルベンゼン共重合体），ォキシメチル樹脂，又はスぺ一サ一を導入した 4 _ォキシメチル _ P a m (フエ二ルァセタミドメチル）樹脂が好ましい。一方， F m o c ( 9 _フルォレニルメチルォキシカルポニル）ストラテジーによりペプチドを合成する場合は，ォキシメチルフエノキシメチル（W a n g ) 樹脂が好ましい。

[0057] 保護ァミノ酸とは，官能基を公知の方法により保護基で保護したァミノ酸を意味する。保護アミノ酸として，市販される公知の保護アミノ酸を適宜用いることができる。本発明のポリペプチドを合成する場合には，以下に示す保護基のいずれかを選択するのが好ましい。すなわち，アミノ酸のひ一アミノ基の保護基として， Bo c (t-ブチルォキシ力ルポニル）又は F mo c ( 9 _フルォレニルメチルォキシカルポニル）が好ましい。アルギニン（A r g) のグァニジノ基の保護基として， T o s (トシル）， N0₂ (ニトロ）， M t r (4—メトキシ一 2, 3, 6 _トリメチルベンゼンスルホニル）又は Pm c (2, 2, 5, 7, 8 - ペンタメチルクロマン一 6 _スルホニル）力《好ましい。リジン（L y s) のど一アミノ基の保護基として， Z (ベンジルォキシ力ルポニル）， CI ■ Z (2 _クロ口ベンジルォキシカルポニル） , Bo c, 又は N p y s (3—ニトロ _ 2 _ピリジンスルフエニル）が好ましい。ヒスチジン（H i s) のイミダゾリル基の保護基として， T o s, Z, P a c (フエナシル）， Bom (ベンジルォキシメチル）， D n p (ジニト口フエニル）又は T r t (トリチル）が好ましい。システィン（Cy s) のメルカプト基の保護基として， B z I (ベンジル）， MB z I (4—メトキシベンジル） 4—Me B z I ( 4 _メチルベンジル） A cm (ァセタミドメチル）， T r t , N p y s, t_B u (t-ブチル）， t_B u S (t-ブチルチォ）があげられ，これらの中では， MB z l , 4 -Me B z I , T r t , A cm, 又は N p y sが好ましい。チロシン（T y r ) の水酸基の保護基として， B z l , C I ₂ ■ B z I (2, 6—ジクロロべンジル）， t- B uがあげられる。一方，チロシン（T y r) の水酸基は，特に保護基を導入しなくてもよい。トリブトファン（T r p) のインドール基の保護基として， CHO (フオルミル基）があげられる。一方，トリブトファン（T r p) のインド —ル基は，特に保護基を導入しなくてもよい。メチォニン（Me t ) のチォメチル基の保護基として，メチルスルホキシド基があげられるが，特に保護基を導入しなくてもよい。セリン（S e r ) およびトレォニン（T h r) の水酸基の保護基として， B z I又は t _B u基があげられる。ァスパラギン酸（A s p) およびグルタミン酸（G I u) の力ルポキシル基の保護基として， OB z I (ベンジルエステル）， O t B u ( t _ブチルエステル）， Ο c H e x (シクロへキシルエステル），又は OP a c (フエナシルエステル ) が好ましい。ァスパラギン（A s n) およびグルタミン（G i n) のカルバミド基の保護基として， T r t又は X a n (キサンチル基）が好ましい。

[0058] 保護アミノ酸の結合は，通常の縮合法，例えば， DCC (ジシクロへキシルカルポジイミド）法， D I PCD I (ジイソプロピルカルポジイミド）法 [T a r t a r. Aら； J. O r g. C h e m. , 44, 5000 (1 97 9) ] , 活性エステル法，混合又は対称酸無水物法，力ルポニルジイミダゾ —ル法， DCC- HOBt(1—ヒドロキシベンゾトリアゾ一ル）法 [Ke o n i g , Wら； C h em. B e 1 03, 788 , p p. 2024-20 34 ( 1 970) ] , ジフエニルホスホリルアジド法， ΒΟΡ試薬（ベンゾトリアゾリル一Ν—ヒドロキシトリスジメチルァミノホスホニゥムへキサフルォロリン化物塩）を用いる BOP— HOB t法（H u d s o n, D. ,

J . O r g. C h em. , 53, 61 7 (1 988) ), HBTU (2 — ( 1 H) —ベンゾトリァゾ一ル一 1—ィル）一 1 , 1 , 3, 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフエ一ト） —HOB t法（Kn o r r, R . ら， T e t r a h e d r o n L e t t . , 30, 1 927 (1 9 89) ) TBTU (2 - ( 1 H) —ベンゾトリアゾ一ル _1_ィル） - 1 1 , 3, 3—テトラメチルゥロニゥムテトラフルォロポレイト）一HOB t 法 (Kn o r r, R. , T e t r a h e d r o n L e t t . , 30, 1 927 ( 1 989) ) 等に従って行なうことができる。これらのうち， DC C法， DCC_HOBt 法， ΒΟΡ— HOB t法， HBTU— HOB t法，又は対称酸無水物法が好ましい。

[0059] これらの縮合反応は，たとえば，ジクロロメタン，ジメチルホルムアミド

(DMF) , N—メチルピロリドン（NMP) 等の有機溶媒又はそれらの混合溶媒中で行なわれる。ひ- アミノ基の保護基の脱離試薬としては，トリフルォロ酢酸/ジクロロメタン， HCI /ジォキサン，ピぺリジン/ DM F又はピぺリジン/ N M P等が用いられ，該保護基の種類により適宜選択する。また，合成の各段階における縮合反応の進行の程度は E. カイザーらの方法 [A n a に B i o c h em. , 34, 595 ( 1 970) ] (ニンヒドリン反応法）によって検査されればよい。以上のようにして，所望のァミノ酸配列を有する保護べプチド樹脂を得ることができる。

[0060] 保護べプチド樹脂は，フッ化水素， T FMS A (トリフルォロメタンスルホン酸) [A a d em i c P r e s s 発仃， E . G r o s s編， H Y a j i maら； " T h e P e p t i d e s " 5 , 65 ( 1 983 ) ] , TMSOTf (トリメチルシリルトリフラ一ト）， TMS Br (トリメチゾレシリゾレブ口ミド） [F u j i i , Ν ら； C h em. Ρ h a r m. B u i I . , 35, 3880 ( 1 987) ] , またはトリフルォロ酢酸などで処理することにより，該樹脂および保護基を同時に脱離させることができる。上記の脱離試薬は，該ストラテジー（8_{0 £};又は「 0 _£ , 該樹脂，該保護基の種類により適宜選択する。

[0061] このようにして得られたペプチドは，公知の方法，例えば，抽出，再結晶 , 各種クロマトグラフィー（ゲルろ過，イオン交換，分配，吸着，逆相），電気泳動，向流分配等により単離精製することができる。これらの中では，逆相高速液体クロマトグラフィーを用いて精製する方法が好ましい。上記方法で得られるぺプチドが遊離体である場合は，公知の方法によって適当な塩に変換できる。また，ペプチドが塩の形態で得られた場合は，公知の方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。

[0062] エフリン B 2は，内皮細胞（EC) の D NA合成； ECにおける細胞外シグナル制御キナーゼ（E RK) リン酸化； V EG Fおよび b FG Fの両方で誘導される P 44/p 42MA Pキナーゼ活性化； E C脈管形成； b FG F で誘導された角膜血管形成；及び網膜から硝子体腔内に伸びる病的な新生血管を阻害する。

[0063] 本発明の抗体及び本発明のぺプチドのいずれか又は両方は，新生血管阻害活性を有するほか，エフリン B 2の新生血管阻害活性を高める作用をも有するものである。 [0064] そして，本発明のぺプチドは，それ自体 M A P Kリン酸化活性阻害能を有するので，公知の製剤化のための方法を適宜採用することで，本発明のぺプチドを含有する新生血管阻害剤に用いることができる。この新生血管阻害剤は，例えば，本発明の抗体及び本発明のペプチドと薬理学的に許容される担体などを含有する剤であり，眼内の新生血管阻害剤であることが好ましく，眼内の新生血管に関連する疾患の治療剤又は予防剤が好ましい。本発明のぺプチドは，エフリン B 2に比べて短いので，容易に製造できる。よって，本発明のペプチドを含む新生血管阻害剤は，安定であり，比較的安価に製造することができるという利点もある。

[0065] また，本発明のペプチドは，エフリン B 2の活性を高めるので，本発明の抗体及び本発明のぺプチドを含有する剤は，特に眼内の新生血管阻害補助剤 , 眼内の静脈内皮細胞における D N A合成阻害用補助剤及び眼内の静脈内皮細胞における p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害用補助剤として有用である。これらの補助剤の好ましい態様は，主剤としてエフリン B 2を含有する剤を用いるものである。

[0066] 血管内皮細胞を V E G Fで刺激すると受容体下流のシグナル伝達系により MAPKが活性化され，リン酸化された MA P Kの上昇が認められる（A b e d i , H . a n d a c h a r y, I . , J . B i o l . C h e m. , 272, 1 5442- 1 5451 (1 997) ) 。 MAP Kの活性化は血管新生における血管内皮細胞の増殖に重要な役割を担うことが知られている（ Me r e nm i e s, J . e t a I . , し e l I G r ow t h &.

D i f f e r. , 83- 1 0 (1 997) ； F e r r a r a, N . a n d D a v i s— Smy t h, T . E n d o c r. Re v. , 1 8, 4— 25 (1 997) ) 。本発明の抗体及び本発明のぺプチドのいずれか又は両方は， MAP Kの阻害活性を有することが後述する実施例により実証された。従って，本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，血管新生抑制作用又はエフリン B 2により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として , 腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，ァテローム性動脈硬化症，力ポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（F o r kma n,

J . N a t u r e M e d. 1 ： 27 -3 1 ( 1 995) , B i c k n e l l , R . , H a r r i s, A. L. C u r r . O p i n O n c o に 8 ： 60— 65 ( 1 996) ) 。従って，本発明の抗体及び本発明のペプチドのいずれか又は両方は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，ァテローム性動脈硬化症，力ポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移，その他の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療に用いることができ，本発明はそのような治療剤をも提供しうる。

新生血管阻害剤や補助剤は，本発明の抗体（及び本発明のぺプチド）を有効量含有するものがあげられる。「有効量」とは，所望の目的を達成するために十分な量を意味する。眼内の新生血管阻害剤における「有効量」とは，例えば，眼内の新生血管を阻害するために十分な量を意味する。また，新生血管阻害用補助剤における「有効量」とは，例えば，エフリン B 2などの眼内の新生血管阻害剤の新生血管阻害作用を高めるために十分な量を意味する。具体的な，本発明の抗体及び本発明のぺプチドの投与量は，対象疾患，投与対象，投与ルートなどにより適宜調整すればよい。本発明の抗体の投与量として，例えば，目に硝子体注射投与する場合，一般的に成人（体重 6 O k gとして）においては，一眼あたり l X l 0² n g〜 1 m g , 好ましくは 1 X 1 0² n g〜1 ;U g, より好ま L<Oil x l 0² n g〜7 x l 0² n gがあげられる。投与回数は適宜調整すればよい。また，本発明の抗体を含有する剤を経口投与する場合，一般的に成人（体重 6 O k gとして）においては，一回にっき 2 g〜 1 X 1 0²m g, 好ましくは 2 g〜 1 m g, より好ましくは 2 g〜 1 X 1 0²;U gがあげられる。本発明のペプチドの投与量として，例えば，目に硝子体注射投与する場合，一般的に成人（体重 6 O k gとして）においては，一眼あたり 1 X 1 0² n g〜 1 m g, 好ましくは 1 X 1 0² n g 〜 1 g, ょり好まし<は1 x 1 0² n g〜7 x 1 0² n gがあげられる。投与回数は適宜調整すればよぐ例えば，一日一回本発明の抗体を含有する剤とともに投与するものなどがあげられる。また，本発明のペプチドを含有する剤を経口投与する場合，一般的に成人（体重 6 0 k gとして）においては , —回につき 2 g〜 1 X 1 0 ² m g , 好ましくは 2 g〜 1 m g , より好ましくは 2 g〜 1 X 1 0 ² gがあげられる。これらの量は，患者の体重，性別などを適宜考慮して，調整すればよい。ヒト以外の哺乳動物に上記の新生血管阻害剤又は補助剤を投与する場合も，体重 6 0 k g当たりに換算した量を適宜投与すればよい。

[0068] 本発明の抗体（及び本発明のペプチド）は，それ自体，又は医薬組成物として投与することができる。本発明の抗体（及び本発明のペプチド）は，たとえば薬理学的に許容され得る担体，希釈剤又は賦形剤を含むものがあげられる。本発明の抗体（及び本発明のぺプチド）を含有する補助剤は，投与形態に適する剤形として調整されればよい。

[0069] たとえば，本発明の抗体又は新生血管阻害剤を点眼剤又は注射剤として用いる場合，有効量の本発明の抗体（及び本発明のペプチド）と，公知の希釈剤（希釈剤は，薬理学的に許容され得る担体に含まれる）とを含む点眼剤又は注射剤であればよい。希釈剤として，滅菌水，純水，蒸留水などの水；生理食塩水；ブドウ糖溶液；エタノールなどのアルコール；グリセロール，プロピレングリコール，ポリエチレングリコールなどのポリアルコール；滅菌有機溶媒；又は水性デンプン； P B Sのいずれか 1種又は 2種以上の混合物などがあげられる。

[0070] 本発明の抗体を含有する点眼剤又は注射剤は，ェピネフリン，塩酸ェピネフリン，塩酸エフェドリン，などの充血除去成分；チル硫酸ネオスチグミン , トロピカミドなどの眼調節薬成分；硫酸亜鉛，乳酸亜鉛，アラントイン，ィプシロン一アミノカプロン酸，インドメタシン，塩化リゾチームなどの抗炎症薬成分；ァシタザノラスト，アンレキサノクス，イブジラスト，トラニラスト，塩酸ジフェンヒドラミンなどの抗ヒスタミン薬成分又は抗アレルギ —薬成分；アミノ酸類；塩酸ォキシブプロ力イン，塩酸コカイン，塩酸コルネカイン，塩酸ジブ力インなどの局所麻酔薬成分；などを適宜含有してもよし、。コンドロイチン硫酸ナトリウム，ヒアルロン酸ナトリウムなどの增粘剤；塩化ベンザルコニゥムなどの界面活性剤；安息香酸ナトリウム，エタノール，塩化ベンザルコニゥムなどの防腐剤，殺菌剤又は抗菌剤；塩酸，ホウ酸

, 水酸化ナトリウム，炭酸水素ナトリウムなどの p H調節剤；亜硫酸水素ナトリゥム，亜硫酸ナトリゥム，塩化力リゥムなどの等張化剤；メント一ル , カンフル，ハツ力油，ペパーミント油などの香料または清涼化剤；クェン酸緩衝剤などの緩衝剤などを適宜含有するものであつてもよい。

[0071 ] 本発明の抗体を含む新生血管阻害剤は，錠剤，カプセル剤，顆粒剤，散剤，シロップ剤などの経口投与剤であってもよい。この場合，薬理学的に許容される担体として，賦形剤，希釈剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，及び矯味矯臭剤から適宜選択されるものがあげられる。

[0072] 本発明の抗体を含む新生血管阻害剤は，公知の方法に従って製造できる。点眼剤又は注射剤は，例えば，希釈剤などに本発明の抗体（及び本発明のぺプチド）を添加し，アンプルなどの容器に入れることにより製造できる。錠剤は，例えば，本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を公知の担体と混合した医薬組成物を打錠機により打錠することにより製造できる。力プセル剤は , 例えば，カプセルなどの形態をしている担体中に，本発明の抗体（及び本発明のペプチド）を封入することにより製造できる。

[0073] また，本発明のペプチドは，エフリン B 2の活性を高めるので，後述するようにエフリン B 2を含む医療用組成物，又はキットなどに適宜利用されうる。

[0074] WO 2 0 0 6 / 0 0 6 0 7 9号公報（特許文献 1 ) に開示されるとおり，エフリン B 2は，眼内における動脈及び静脈内皮細胞の D N A合成の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞における p 4 4 / p 4 2 M A P K活性化の阻害作用；眼内における動脈及び静脈内皮細胞における管形成の阻害作用を有する。そして，同文献における生体内実験で実証されたように，ェフリン B 2は，眼内の脈絡膜における新生血管を抑制し，加齢黄斑変性（A M D ) など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に有効である。 [0075] —方，本発明のペプチドは，エフリン B 2と併用することでエフリン B 2 の MAP Kリン酸化阻害能を飛躍的に高める作用を有する。このことは，ェフリン B 2が有する，眼内の静脈（動脈）内皮細胞における新生血管の抑制能を高めることを意味する。よって，本発明の抗体及び本発明のペプチドの他にエフリン B 2を含有する新生血管阻害剤は，特に眼内の新生血管の抑制など，眼内の新生血管に関連する疾患の治療に特に有効であると考えられる。本発明の新生血管阻害剤の好ましい態様は，有効量のエフリン B 2を含有すればよい。

[0076] 本発明の新生血管阻害剤に用いられるエフリン B 2は，アナログおよび改変体を含む任意のエフリン B 2であってもよい。なお，エフリン B 2は，可溶性エフリン B2 (通常，細胞外ドメインを含むが，細胞質ドメインを含まない）であってもよい。エフリン B2は，天然に存在するタンパク質を単離精製したものであっても，遺伝子組換えにより微生物などから生成されたものであってもよい。例えば，米国特許第 6, 303, 769号明細書又は M o I I mmu n o に 1 995 N o v ; 32 (1 6) : 1 1 97-20 5に記載されるヒトェフリン Β 2の c DN Αの配列を参照して，慣用の技術を用いて，全長タンパク質，細胞外ドメインを含むタンパク質などを作製してもよい。当業者が通常用いる技術を用いることにより，天然のエフリン B 2を好ましく改変することもできる。また，エフリン B 2は，医薬品や試薬として市販されているいずれを用いてもよい。

[0077] エフリン B 2は，全長であってもよい。エフリン B 2の好ましい態様は，天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものである。天然のエフリン B 2の細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まない領域が， E p h B 4のファーマコフォアに作用する部位であると考えられるので，そのような部位を含むエフリン B 2であれば，全長でなくても新生血管の抑制能を有すると考えられる。そのようなエフリン B 2として , 配列番号 9のうち— 25〜308位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号 9のうち 1〜 308位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号 9のうち一 2 5〜 1 9 9位のアミノ酸残基からなるもの，配列番号 9のうち 1〜 1 9 9 位のアミノ酸残基からなるもの，及びそれらと 9 0 %以上の相同性を有するもの（好ましくは 9 5 %以上相同性を有するもの，又は配列番号 4で示される部位を含みつつ 9 0 %以上の相同性を有するもの）であって，エフリン B 2と同様の活性を有するものがあげられる。なお，相同性は，例えば適宜パラメ一タを最適化した G A Pコンピュータプログラムのバージョン 6を用いて求めればよい。なお，配列番号 9で示されるペプチドは，エフリン B 2の N末端シグナルペプチド（配列番号 9のアミノ酸— 2 5から— 1 ) 細胞外ドメイン（アミノ酸 1から 1 9 9 ) , 膜貫通領域（アミノ酸 2 0 0から 2 2 5 ) , および細胞質ドメイン（アミノ酸 2 2 6から 3 0 8 ) からなるぺプチドである（なお，配列番号 9に示されるアミノ酸の番号については配列番号 9に係るぺプチドのアミノ酸配列及びこのべプチドをコ一ドする遺伝子の塩基配列を図 3に示す。）。

[0078] また，エフリン B 2力《，ヒト F cとエフリン B 2の融合タンパク質であつてもよい。エフリン B 2が新生血管の抑制能を発揮するためには，エフリン B 2が二量体化していることが望ましいと考えられ，そのためヒト F cとェフリン B 2との融合タンパク質であれば，エフリン B 2が二量化し，高い新生血管の抑制能を発揮しうる。この融合タンパク質に用いられるエフリン B 2は，エフリン B 2の細胞外ドメイン，又は細胞外ドメインを含み，細胞質ドメインを含まないものが好ましい。 N末端シグナルべプチド及び膜貫通領域については，それら全てが含まれてもよいし含まれなくてもよぐまたそれらのうち一部のみが含まれていてもよい。エフリン B 2とヒト F cの融合タンパク質は，たとえば，特表平 1 0 - 5 0 2 8 1 0号公報（特許文献 3 ) [：記載される方法により作出できる。

[0079] なお，後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び本発明のぺプチドをあわせたものは，高い p 4 4 / p 4 2 M A P Kリン酸化活性阻害活性を有する。したがって，本発明は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3 で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， p 44/p 42MA P Kリン酸化活性阻害剤をも提供する。また， MA P Kリン酸化活性が阻害されれば， D NA 合成が阻害されるので，本発明は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， D N A合成阻害剤をも提供する。

[0080] 本発明の第 2の側面は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるァミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， D N A合成阻害剤に関する。また，本発明の第 2の側面の別の態様は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， D N A合成阻害剤に関する。

[0081 ] 後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び低分子べプチドは， p 44/p 42MA P Kリン酸化活性阻害能を有するので， D N A合成阻害剤として有効に機能する。特に，本発明の抗体及び低分子ペプチドは , 眼内における新生血管に関する D N A合成阻害剤として有効である。

[0082] 本発明の第 3の側面は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるァミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， p 44/p 42MA P Kリン酸化活性阻害剤に関する。また，本発明の第 3の側面は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体；及び "配列番号 5で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 6で表されるァミノ酸配列からなるペプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害剤に関する。

[0083] 後述する実施例により実証されたとおり，本発明の抗体及び低分子べプチドは， p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害能を有する。特に，本発明の抗体及び低分子べプチドは，眼内における新生血管に関する疾患を治療又は予防するための p 44/p 42MAPKリン酸化活性阻害剤として有効で

[0084] [医療用キット]

本発明の第 4の側面は，基本的には，本発明の抗体を有する第 1の組成物と，本発明のぺプチドを有する第 2の組成物とを有する医療用キッ卜に関する。すなわち，本発明の第 2の側面は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と；（ i ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるぺプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は（ii)配列番号 2において， 1又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたァミノ酸配列からなり，前記配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キット；配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と；（ i ) 配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は（ i i ) 配列番号 3において， 1又は 2 個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，前記配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キット；及び配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と；配列番号 4で表されるアミノ酸配列を含有し，当該べプチドに含まれるアミノ酸残基の数が 9以上， 1 0 0以下であるべプチドであって，配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなるペプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるペプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キッ卜などに関する。

本発明の第 4の側面の別の態様は，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と；（ i ) 配列番号 5で表されるァミノ酸配列からなるぺプチド

, もしくはその薬理学的に許容される塩，又は（i i )配列番号 5において， 1 又は 2個のアミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり，前記配列番号 1で表されるァミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キット；配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と； ( i ) 配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるペプチド，もしくはその薬理学的に許容される塩，又は（ i i ) 配列番号 6において， 1又は 2個のァミノ酸が欠失，置換，挿入若しくは付加されたァミノ酸配列からなり，前記配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キット；及び配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 1の組成物と；配列番号 7または配列番号 8で表されるァミノ酸配列を含有し，当該べプチドに含まれるアミノ酸残基の数が 9以上， 1 0 0以下であるペプチドであつて，配列番号 1で表されるアミノ酸配列からなるぺプチドに対する抗体の新生血管の阻害活性を高めるぺプチド，もしくはそれらの薬理学的に許容される塩，及び薬理学的に許容される担体を含有する第 2の組成物と；を含有する医療用キットなどに関する。

[0086] 上記の医療用キットは，後述する実施例によって実証されたとおり，第 1 の組成物を投与した後に第 2の組成物を投与すると M A P Kの活性を著しく阻害することが示された。よって，本発明のキットは，特にそのような投与方法に有効に利用されうる。

[0087] 本発明の医療用キットに含まれる本発明の抗体，及び本発明のペプチドは , 先に説明したものを適宜用いることができる。

[0088] 本発明の医療用キットの好ましい態様は，新生血管阻害用，特に眼内の新生血管阻害用に用いられるものであり，さらに好ましい態様は，眼内の脈絡膜における新生血管阻害用に用いられるものである。本発明の第 2の側面の好ましい態様は，眼内の新生血管に関連する疾患の治療又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキッ卜に関する。本発明の第 2の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性，虚血性網膜症，眼内血管新生，角膜血管新生，網膜血管新生，脈絡膜血管新生，糖尿病性黄斑浮腫，糖尿病性網膜虚血，糖尿病性網膜浮腫，糖尿病性網膜症" からなる群から選択される， 1又は 2種以上の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキッ卜に関する。本発明の第 2の側面の好ましい態様は，加齢黄斑変性及び糖尿病性網膜症のいずれか又は両方の疾患の治療用又は予防用に用いられる上記いずれかに記載のキッ卜に関する。

[0089] 先に説明したとおり，本発明のペプチドは，血管新生抑制作用又はエフリン B 2により血管新生抑制作用の補助活性を有するといえる。病態部位における血管新生は，眼内以外では主として，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，ァテローム性動脈硬化症，力ポジ肉腫のような疾患，並びに固形癌の転移と深く結びついている（Fo r kma n, J . N a t u r e Me d. 1 ： 27-31 (1 995) ； B i c k n e l l , R. , H a r r i s, A. L . C u r r . O p i n. O n c o l . 8 ： 60— 6 5 (1 996) ) 。従って，本発明の第 2の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬，ァテローム性動脈硬化症，力ポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療に用いられる上記いずれかに記載のキッ卜に関する。すなわち，本発明の第 2の側面の好ましい態様は，腫瘍，慢性関節リウマチ，乾癬 , ァテローム性動脈硬化症，力ポジ肉腫，又は固形癌の転移の治療用キットに関する。

[0090] そして，これらに含まれる本発明の抗体や本発明のペプチドの量も上記したものを適宜用いることができる。

[0091] 後述する実施例によって実証されたとおり，本発明の抗体と本発明のぺプチドを同時に投与した場合に比べ，本発明の抗体を投与した後に，本発明のぺプチドを投与した場合のほう力《， MA P K活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第 2の側面の好ましい態様は，前記第 1の組成物が投与された後に，前記第 2の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。前記第 1の組成物が投与された後， 30秒後〜 24時間後，好ましくは 1分後〜 1 2時間後，より好ましくは 1分後〜 1 0分後に前記第 2の組成物が投与される上記いずれかに記載のキットに関する。また，本発明のぺプチドを投与した後に本発明の抗体を投与しても，本発明の抗体と本発明のべプチドを同時に投与した場合に比べ M A P K活性化を抑えることができる。したがって，本発明の第 2の側面の好ましい態様は，前記第 2の組成物が投与された後に，前記第 1の組成物が投与される上記いずれかに記載のキッ卜に関する。前記第 2の組成物が投与された後， 30秒後〜 24時間後，好ましくは 1分後〜 1 2時間後，より好ましくは 1分後〜 1 0分後に前記第 1の組成物が投与される上記いずれかに記載のキッ卜に関する。

[0092] [マウス角膜法における本発明のぺプチド及び本発明の抗体の評価] 塩基性 FG F (b FG F) は，強力な血管形成因子であることが知られている。 b FG Fによって誘導されたマウス角膜の血管新生を，本発明のぺプチド及び本発明の抗体が抑制し得るかどうかを検討するには，例えば，以下のようにすればよい。

[0093] マウスにおける角膜ポケットアツセィおよび角膜血管新生の定量は，基本的に K e n y o n, B. M. ら，（1 996) O p h t h a l mo に V i s. S c に， 37巻， 8号， 1 625— 1 632頁に基づいて行う。簡単に言えば， 90 n gのヒト b FG Fを含む 0. 3 Lの H y d r o nぺレット ( i i" N S c i e n c e s, N e w B r u n s w i c k, N e w J e r s e y, U SA) を調製し，雄 B A L B/ cマウスの角膜に移植する。本発明の抗体とぺプチドを， b FG F/H y d r o n溶液に直接添加する。ペレットを，角膜縁から 1. Ommに配置する。移植後，オフ口キサシン/点眼剤を各眼に適用する。 6日後，動物を屠殺し，そして角膜血管を写真撮影する。マウス角膜における血管新生の定量分析を，ソフトゥェァパッケージ N I H I ma g eを用いて行う。このようにすれば，マウス角膜における本発明のぺプチド及び本発明の抗体の同時投与による b FG F で誘導した血管形成の阻害について検証できる。

[0094] [C N Vモデルに対する本発明のぺプチド及び本発明の抗体の評価]

本発明のペプチド及び本発明の抗体が， AMDなど，眼内の血管形成または血管新生に関連する疾患または障害の治療剤として有効であることは，たとえば，レーザー誘導性脈絡膜血管新生（CNV) モデルを用いて実証できる。レーザ一誘導性 CNVモデルは， AMDの生態モデルと考えられる。以下， CNVモデルのプロトコル例について説明する。

[0095] —マウスの実験的脈絡膜血管新生（CNV) の誘導一

マウスの眼の眼底後極部をグリーンレーザー（グリーンレーザー光凝固装置 N o v u s V e r d i , コヒ一レント社，スリットランプ 30 S L -M, Z E I S) で光凝固する。レーザ一光の強度はたとえば，約 200m Wとする。その際，凝固サイズを 75 m, 凝固時間を 0. 1秒とし， 1眼あたり 4発の凝固を行えばよい。このようにすれば C N Vモデルを得ることができる。

[0096] —マウス眼への本発明のぺプチド及び本発明の抗体の投与方法—

本発明の抗体及び本発明のぺプチドの投与方法は，対象にレーザー照射直後と照射後 5日の合計 2回，下記の硝子体内濃度の P B S , 本発明の抗体，及び本発明のぺプチドを硝子体内に投与する。 1投与あたり 0. 0 0 2 m Lずつ， 3 3 G針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射する。ネガティブコントロールとして， 0. 0 0 2 m Lの P B Sを注射する。ポジティブコント口一ルとして， 1 . 6 6 n Mのエフリン B 2を用いる。動物番号 3〜5は， 3分差で投与を行う。例えば，動物番号 3 (右眼）は，エフリン B 2 ( 2 μ L) を投与した 3分後に配列番号 2のペプチド（2 1_) を投与するので， 2種類の被験物質を各 2 Lの計 4 L投与することになる。

[0097] —マウス C N Vの評価一

C N Vモデル実験は，例えば，以下のようにして評価する。レーザ一照射後 7日目に脈絡膜フラットマウント法を行って，脈絡膜新生血管を評価する。 2 0%ネンブタールをマウス腹腔内に 0. 2 m L投与して麻酔をしたのち開腹し， 5 O mG/mLフルォレセイン-デキストラン（S I GMA, 0. 5 m L/匹）を心臓左心室に注射して灌流させる。その後眼球を摘出し 4%パラホルムアルデヒドで固定をする。眼球組織固定後に前眼部と網膜を除去して脈絡膜フラットマウントを作製したのち，封入剤（B e c k a m n c o u

A q u e o u s e m o u n t ι n t g m e d i u m p e r m a f I u o r ) を用いてスライドガラスに封入して試料を作製する。

[0098] その後，蛍光顕微鏡を用いて作製した試料を観察する。レーザー照射部位の写真を C C Dカメラで撮影し，イメージ画像化する。脈絡膜新生血管である管腔構造部位の面積をソフトウエアパッケージ M a c S c o p eで測定する。

[0099] また， C N Vモデルは， 6匹の力二クイザル（ォス 3〜6kg) 由来の 1 2 眼を用いてもよい。これらの動物は全て，苦痛のないように無病原状態で収容する。そのため，力二クイザルを用いた C N Vモデル実験は，塩酸ケタミンで全身麻酔を施した状態で行う。

[0100] —力二クイザルの実験的脈絡膜血管新生（CNV) の誘導一

上記サルの眼の眼底部の後部極において，眼科レーザー用レンズ（3_M I η τ a n t L a s e r O G 3 M I A , O c u l a r I n s t r um e n t s, I n c. ) を使用し，眼底後極部をクリプトンレーザ一（マルチカラ一レーザ一光凝固装置 MC—300, 株式会社ニデック，スリットランプ 900 BQ, H a a g S t r e i t ) で光凝固する。レーザ一光の強度はたとえば，約 700mWとする。その際，凝固サイズを 1 O O m, 凝固時間を 0. 1秒とし， 1眼あたり 8発の凝固を行えばよい。

[0101] —力二クイザル眼への本発明のぺプチド及び本発明の抗体の投与方法—

本発明の抗体及び本発明のぺプチドの投与方法は，レーザー照射直後と照射後 5日の合計 2回，下記の硝子体内濃度の P BS, E p h B4に対する抗体 , 本発明のペプチドを力二クイザルの硝子体内に投与する。 1投与あたり 0 . 1 m Lずつ， 30 G針を用いて毛様体扁平部から眼内に注射する。ネガテイブコントロールとして， 0. 1 m Lの P BSを注射する。ポジティブコントロールとして， 1. 66 n Mのエフリン B 2を用いる。動物番号 3〜5は , 3分差で投与を行う。例えば，動物番号 3 (右眼）は，エフリン B 2 ( 1 00

U L) を投与した 3分後に配列番号 2のペプチド（1 00 1_) を投与するので， 2種類の被験物質を各 1 00 1_の計 200 L投与することになる

[0102] —力二クイザル C N Vの評価一

力二クイザルを用いた CNVモデル実験は，例えば，以下のようにして評価する。レーザー照射後 1 0日目に蛍光眼底造影検査を行って，脈絡膜新生血管を評価する。検査は両眼で時間をずらして実施する。両眼ともにフルォレセイン（蛍光眼底造影剤フルォレサイト（登録商標）注射液 1号，日本アルコン株式会社， 0. 1 m L/k g) 投与後 5分及び 1 0分に，それぞれ右，左の順に連続して 2枚ずつ撮影を行う。撮影された写真に基づいて，眼科専門医が評価を行う。

[0103] その後，ペントバルビタールナトリウム（東京化成工業株式会社）水溶液

(64. 8 mg/m L, 0. 4 m L / k g ) の静脈内投与により試験動物に麻酔を行い，体重を測定後，放血安楽死させ，外表，内部器官及び組織を肉眼的に観察する。左右眼球（視神経を含む）について，摘出後 3%グルタールアルデヒド■ 2%パラホルムアルデヒド混合固定液で浸漬固定する。固定後の眼球のレーザー照射部位（8部位）を細切し，パラフィン包埋を行し、，パラフィン切片（1 0切片）を作製した後， H. E.染色（1切片のみ）を施す。

[0104] 配列表の説明

配列番号 1 ヒト E p h B 4において N末端シグナル配列を除いた細胞外ドメイン（1 6番目から 539番目までのアミノ酸残基からなるぺプチド）のアミノ酸配列を示す。

配列番号 2 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 3 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 4 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 5 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 6 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 7 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 8 ヒトエフリン B 2の部分べプチドのァミノ酸配列を示す。配列番号 9 ヒトエフリン B 2のアミノ酸配列を示す。

配列番号 1 0 配列番号 9で示されるエフリン B 2をコードする D N Aの塩基配列を示す。

以下，実施例に基づいて本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，以下の実施例によって限定されない。

実施例 1

[0105] —配列番号 2で表されるポリべプチドの合成—

配列番号 2 (E FS P N LWG L E FQKN KDYY I I ) で表されるポリペプチドを以下のようにして合成した。すなわち，マルチシンテック（M u l t i S y n t e c h) 社の自動べプチド合成装置 "シロ I I (S y r o I I ) " を用い， Fmo c (9 _フルォレニルメチルォキシカルポニル）ストラテジ一による固相合成法により調整した。合成には， H BT U (2- ( 1 H) —ベンゾトリァゾ一ル一 1 —ィル）一 1 , 1 , 3, 3—テトラメチルゥロニゥムへキサフルォロホスフヱ一ト） _ H O B t ( 1—ヒドロキシベンゾトリァゾ一ル）法 (K n o r r , R.ら， T e t r a h e d r o n L e t t . , 1 927 ( 1 989) ) を用いた。合成スケールは， 25マイクロモルであつた。なお，用いたレジン及びアミノ酸は，それぞれ表 2と表 3とに示すとおりであった。

[0106] ( 1 ) Fmo c _アミノ酸樹脂を反応ベッセル及び Fmo cアミノ酸用力一トリッジにとり，そのベッセル及びカートリッジを，上記した自動ペプチド合成装置に装着し， F a s t Mo cプログラムにより自動合成操作を行った

(2) ペプチドの自動合成に際し，まず DCM (ジクロロメタン）にて 5分間樹脂を潤滑させた。その後， N M P (N—メチル一 2 _ピロリドン）にて 5 分間処理し，洗浄した。その後，以下のプロトコルを繰返し行った。 1サイクルの合成反応は，下表 1のとおりである。

[0107] [表 1]

a 1 ベプチドの合成サィクル

l 巾， DIEAは， Ν,Ν' -ジィソプロピルェチルァミンを意味する。

(3) 脱保護基及び脱樹脂操作

上記のようにして得られた合成ペプチドを T F Α (トリフルォロ酢酸） /水 /トリェチルシラン（T r i e t h y l s i l a n) [90 : 5 : 5] を用い , 室温にて 2時間反応させた。反応混合液から樹脂をろ別し，トリフルォロ酢酸 1 m I にて 2回洗浄し，ろ液及び洗液をあわせたものに氷冷下エーテル 1 0 Om l を加え，生じた沈殿物を遠心分離し，残渣をデカンテ一シヨンにより上清から分離した。

[0109] (4) 精製

得られた残渣を，氷冷下エーテルにて洗浄した後，遠心分離し，上清を逆相高速液体ク口マトグラフィ一により精製した。逆相高速液体ク口マトグラフィ一は，島津社製 H P LC "LC 1 0AD" を用い，カラムはクロマシル

(K r oma s i I ) KR "1 00— 1 0

C 1 8" の 250 x 3 Ommのものを用いた。逆相高速液体クロマトグラフィ一の条件は，溶離液として， 0. 1 %T F A水溶液（A液）及び 80%ァセトニトリルを含む 0. 1 % T F A水溶液（ B液）の 2液グラジェン卜で，当初 B液 5%, 30分後に B液 80%, 検出波長 21 0 n mであった。精製されたぺプチドを含む画分を回収後，凍結乾燥した。

[0110] (5) ポリべプチドの分析

最終的に精製されたペプチドを，島津社製 H P LC "LC 1 0AD" 及び , クロマシル（K r oma s i I ) KR "1 00— 1 0C 1 8" の 250 x 4 (又は 6) mmのカラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより確認した。また，最終的に精製されたべプチドを，ブルカー (B r u k e r ) 社製 MA LD I— TO F質量分析装置 "リフレックス（Re f l e x) I I " によっても確認した。

[0111] ほ 2]

表 2 F m o c

[0112] [表 3]

Fmoc ァミノ酸を示す

実施例 2

[0113] 一細胞培養一

本実施例は， HUVEC (人臍帯静脈内皮細胞）を用いて行った。細胞株は 37 °Cの恒温槽で解凍し， 1 0m lの血管内皮細胞培地（ H u m e d i a, EG-2キット，クラポゥ製）に溶解後，タイプ Iコラーゲンコート 1 0 c m 培養皿（ IWAK I製） 1枚に全量をプレーティングした。その後， 37 °C, C0₂/a i r =6%/94%で HUVECを 24時間培養した。 DMS Oを除去するため， EG— 2培地 1 Om I に培地の交換を行った。 80 9 0%コンフルェント（c o n f I u e n t ) の状態になったら継代培養を行つた。この時の細胞濃度は，およそ 5 X 1 0⁶個/0 i s h程度であった。 7 2時間程でコンフルェントになった。

[0114] コラーゲンコート 6ゥエルプレート（ IWAK I製）に 5 X 1 0⁵個/ we

I I程度でプレーティングを行った。培養を続け，コンフルェントになったら血管内皮細胞培地（H ume d i a, EG- 2キット，クラボウ製）から細胞増殖因子（hEG F,hFG F-B) を除いた培地（6 we I Iの場合は 2 m

I ) に培地交換して 24時間培養した（s t _{a r v a} t i ₀ n) 。培地を除き，血管内皮細胞培地（H ume d i a, EG-2キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にぺプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン (最終濃度 1 00マイクロ g/m I )を加えたものをコントロールとして加えた。他の処理群は，このトンコロール培地でぺプチド及び E p h B 4の部分べプチドに対する抗体を希釈して細胞に加え， 1 0分後（もしくは適当な時間を設定 ) に P BSで 2回洗浄した後，ライシスバッファ（L y s i s B u f f e r ) (6 we I Iの場合は 0. 2m I /w e I I ) を用いて細胞の全細胞ライセ一トを回収した。

実施例 3

[0115] - p 44/42MA P Kリン酸化に対する配列番号 2で表されるアミノ酸配列を有するぺプチドの効果一

p 44/42MA P Kリン酸化に対する配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むぺプチドに対するゥサギポリクロ一ナル抗体（S AN TA_CRU Z_B I OT ECHNO LOGY, I NC) , 実施例 1で得られたぺプチド (配列番号 2で表されるペプチドである。以下，「配列番号 2のペプチド」とも呼ぶ），また実施例 1 と同類の方法で得られたペプチド（配列番号 3で表されるペプチドである。以下，「配列番号 3のペプチド」とも呼ぶ），及びそれらの併用剤の効果を以下のように実証した。

血管内皮細胞を，血管内皮細胞培地（H ume d i a EG_2キット，クラボウ製）から細胞増殖因子を除いた培地にぺプチド分解酵素の阻害剤バシトラシン（最終濃度 1 00 g/m I ) を加えたものをコントロールとし，実施例 1で得られた配列番号 2のべプチドとゥサギポリクローナル抗体を混合したものなどを用いて 1 0分間処理した。ドデシル硫酸ナトリゥム一ポリァクリルアミド電気泳動（S DS-PAGE) は 1 0%のアクリルアミドを用い , 200ポルトにて 40分間の条件で分離し，ゥエツト方式で 1 00ポルトの条件下一時間 PVD F膜に転写した。 3%スキムミルクで 1時間ブロッキングした後，膜を一次抗体としてリン酸化 p 44/42MAP Kに対する抗体

( C e I I S i g n a l i n g t e c h n o l o g y社， D a n v e r s, MA, USA) を用い，これとともに 4°Cにて一晚インキュベートした

(1 ： 2, 000) 。 TBS_tで 1 0分間 X 4回の洗浄後，膜を西洋ヮサビペルォキシダ一ゼ標識 2次抗体（B i o_Ra d, R i c hmo n d, C A , USA) (1 ： 20, 000)と共に室温にて 40分間インキュベートした。可視化を製造業者の指示に従ってアマシャム社製増強化学発光（EC L) 検出システムを用いて行った。

図 1は，実施例 3における p 44/42 MA P Kリン酸化に対する配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むぺプチドに対するゥサギポリクローナル抗体 (S A N T A— C R U Z_B I OT ECHNO LOGY, I NC) , 酉己列番号 2および配列番号 3のべプチド，及びそれらの併用剤の結果を示すゥエスタンブロッテイングの写真である。図 1中，第 1 レーンはコントロールを示し；第 2レーンは，配列番号 2の 1 00 n Mのぺプチドで処理したものを示し；第 3レーンは，配列番号 3の 1 00 n Mのぺプチドで処理したものを示し；第 4レーンは， 1 00 n Mのゥサギポリクロ一ナル抗体で処理したものを示し；第 5レーンは， 1 0 n Mのゥサギポリクロ一ナル抗体で処理したものを示し，；第 6レーンは， 200 n Mのゥサギポリクロ一ナル抗体で処理し， 3分後に 200 n Mの配列番号 2のぺプチドで処理したものを示し

；第 7レーンは， 200 n Mのゥサギポリクロ一ナル抗体で処理し， 3分後に 200 n Mの配列番号 3のぺプチドで処理したものを示し；第 8レーンは , 20 n Mのゥサギポリクロ一ナル抗体で処理し， 3分後に 200 nMの配列番号 2のぺプチドで処理したものを示し；第 9レーンは， 20 η Μのゥサギポリク口一ナル抗体で処理し， 3分後に 200 η Μの配列番号 3のぺプチドで処理したものを示す。第 1 レーンから第 9レーンは，処理開始から 1 3 分後に撮影を行った。なお，処理開始から 1 3分後の全細胞ライセート回収時における第 6, 第 7における最終濃度は，それぞれ配列番号 2および配列番号 3のぺプチドが 1 00 η Μ, ゥサギポリク口一ナル抗体が 1 00 η Μであった。また，処理開始から 1 3分後の全細胞ライセ一ト回収時における第

8, 及び第 9レーンにおける最終濃度は，それぞれ配列番号 2および配列番号 3のペプチドが 1 00 η Μ , ゥサギポリク口一ナル抗体が 1 0 η Μであつた。

[0117] また，図 1に，一次抗体としてリン酸化■脱リン酸化型を問わずすべての ρ 44/42ΜΑ Ρ Κを認識する抗体，または，ひ一チューブリンを認識する抗体を用いてウェスタンプロッティング解析した写真を示す。

[0118] 第 1 レーンと，第 2, 第 3, 及び第 4レーンを比較すると，ほとんど ΜΑ ΡΚリン酸化活性を阻害することができないことがわかる。しかし，第 1 レ —ンと第 5レーンを比較すると， 1 0 η Μの抗体が MA Ρ Kリン酸化活性を阻害することが分かる。また，第 1 レーンと，第 6レーン及び第 7レーンを比較すると 200 η Μの抗体と 200 η Μの配列番号 2, 3それぞれのぺプチドの併用で MAP Κリン酸化活性を阻害することが分かる。さらに，第 1 レーンと，第 8レーン及び第 9レーンを比較すると， 20 nMの抗体と 20 0 n Mの配列番号 2 , 3それぞれのぺプチドの併用で M A P Kリン酸化活性を阻害することが分かる。

[0119] [参考例 1 ]

配列番号 1で表されるアミノ酸配列を含むぺプチドに対するゥサギポリクロ —ナル抗体を E p h B 4の細胞外ドメインを構成するポリべプチドに対するモノクローナル抗体（R&Dシステムズ社：カタログ番号 I A P 02) に変えて，配列番号 2および配列番号 3のべプチドを配列番号 2と配列番号 5と配列番号 6のべプチドに変えた以外は，実施例 3と同様にしてウェスタンブロットを行った。図 2は，実施例 4における p 44/42 MA P Kリン酸化に対するエフリン B 2を投与した結果を示すウェスタンブロッテイング解析した写真である。図 2中，第 1 レーンはコントロールを示し；第 2レーンは 20 η Μのモノク口一ナル抗体で処理し， 3分後に 2 Ο Ο η Μの配列番号 5 のぺプチドで処理したものを示し；第 3レーンは 20 η Μのモノク口一ナル抗体で処理し， 3分後に 200 η Μの配列番号 6のぺプチドで処理したものを示し；第 4レーンは 20 η Μのモノク口一ナル抗体で処理し， 3分後に 2 00 η Μの配列番号 2で処理したものを示す。なお，処理開始から 1 3分後の撮影時における第 2レーンから第 4レーンの最終濃度は，それぞれモノク口一ナル抗体が 1 0 η Μ, ぺプチドの濃度が 1 00 η Μであった。

また，図 2に，上記と同じ全細胞ライセ一トを，リン酸化■脱リン酸化型を問わず ρ 44/42 MA Ρ Κを認識する抗体，または，ひ一チューブリンを認識する抗体を用いてウェスタンプロッティング解析した写真を示す。第 1 レーンと，第 2, 第 3, 及び第 4レーンを比較すると， 1 0 ηΜの抗体と 1 Ο Ο ηΜの配列番号 2, 5, 6それぞれのペプチドの併用で MA Ρ Κリン酸化活性を阻害することが分かる。

産業上の利用可能性

本発明の新生血管阻害剤及び医療用キットは，医薬産業などにおいて利用されうる。

Claims

請求の範囲

[1 ] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 8 6番目〜 3 8 5番目のアミノ酸残基からなるペプチドに対する抗体とともに；

"配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する，新生血管阻害剤。

[2] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 8 6番目〜 3 8 5番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体；及び

"配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， D N A合成阻害剤。

[3] 配列番号 1で表されるアミノ酸配列の 1 8 6番目〜 3 8 5番目のアミノ酸残基からなるぺプチドに対する抗体；及び

"配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩，及び配列番号 3で表されるアミノ酸配列からなるぺプチド，又はその薬理学的に許容される塩" のいずれか又は両方を含有する， p 4 4 / p 4 2 M A P Kリン酸化活性阻害剤。