CN102711793A - 伴侣蛋白10变异体 - Google Patents

Abstract

本发明总体上涉及伴侣蛋白10N端变异体。更具体地说，本发明涉及具有增强的免疫调节能力和/或对于病原体相关分子模式（PAMP）和/或损伤相关分子模式（DAMP）具有增强结合亲和力的伴侣蛋白10N端变异体。

Description

伴侣蛋白10变异体

通过交叉引用结合

本申请要求于2009年10月9日提交的澳大利亚临时申请号2009904956的优先权，其全部内容通过交叉引用结合在此。

技术领域

本发明总体上涉及伴侣蛋白10N端变异体。更具体地说，本发明涉及具有增强的免疫调节能力和/或对于病原体相关分子模式（PAMP）和/或损伤相关分子模式（DAMP）具有增强的结合亲和力的伴侣蛋白10N端变异体。

背景

伴侣蛋白10（Cpn10），也称为早孕因子（EPF）和热休克蛋白10（Hsp10;HSPEl），作为有助于细胞蛋白质折叠的分子伴侣起作用。特别地，在不同细胞类型的线粒体中Cpn10已经显示与伴侣蛋白60（Cpn60）形成一种复合体。这种复合体负责折叠输入到线粒体中的多肽，防止肽聚结，并且将变性蛋白复活。

除了Cpn10的蛋白质折叠方面的作用之外，Cpn10还被认为涉及众多其他细胞过程。例如，已建议Cpn10调节与模式识别受体（PRR）相关的生物活性。当识别从病原微生物得到的特异性配体（称为“PAMP”（病原体相关分子模式）（例如脂肽，糖脂，核酸））和/或宿主衍生的配体（称为“DAMP”（损伤相关的分子模式）（例如核苷酸，核苷，基因，蛋白质））时，PRRS负责引发和驱动免疫应答。例如，PAMP结合到吞噬细胞（如巨噬细胞）表达的PRR上已经显示促进细胞内吞作用和破坏病原体。PAMP/DAMP结合到PRR上还在各种免疫细胞（如巨噬细胞，B淋巴细胞和树突状细胞）中引发一种或多种细胞信号级联，最终生产和分泌炎症介质（如细胞因子，趋化因子，活性氧等）。

最近的数据表明，Cpn10下调通过PRR信号诱导的促炎症反应分子的产生和分泌。Cpn10还暗含对PRR介导的抗炎性分子的产生和分泌进行正向调节。Cpn10调节PRR信号的能力提供了治疗多种免疫系统）活化相关疾病和病症（如炎性疾病）的手段。例如，施用Cpn10可以用于隔离负责引发PRR-信号传导的配体。进而这抑制了炎症介质的产生和释放，并且因此抑制免疫活化和炎症。

虽然Cpn10鉴定为一种免疫活化的抑制剂，但是存在对于预防和/或治疗炎性疾病和病症改进剂的需要。理想情况下，这类试剂将能够以增强的亲和力结合到PRR配体上，由此抑制由PRR信号介导的炎性分子的产生和分泌。

总结

如在此展示的，已发现对Cpn10多肽N端结构域特异性的改变增强了与PAMP和DAMP的结合。这进而被认为增强了Cpn10变异体的免疫抑制能力，并且特别地是它对由PRR信号诱导的炎症介质的产生和释放的影响。

在一个第一方面中，本发明提供了一种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽，该多肽与野生型Cpn10多肽具有至少70％序列一致性，并且包括与所述野生型多肽相比较延长至少两个额外氨基酸残基的一个N端。

在该第一方面的一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有至少80％的序列一致性。

在该第一方面的另一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有90％的序列一致性。

在该第一方面的另一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有至少95%的序列一致性。在该第一方面的一个实施方案中，与这种野生型Cpn10多肽相比较，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽具有增加的免疫调节功能。

在该第一方面的一个实施方案中，与野生型Cpn10对于病原体相关分子模式（PAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽具有对于PAMP增加的结合亲和力。

在该第一方面的一个实施方案中，与野生型Cpn10对于损伤相关分子模式（DAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽具有对于DAMP增加的结合亲和力。

在该第一方面的另一个实施方案中，与Ala-Cpn10（SEQ ID NO：3）相比较，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽具有增加的免疫调节功能。

在该第一方面的一个实施方案中，与Ala-Cpn10（SEQ ID NO：3）对于病原体相关分子模式（PAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽具有对于PAMP增加的结合亲和力。

在该第一方面的一个实施方案中，与Ala-Cpn10（(SEQ ID NO：3）对于损伤相关分子模式（DAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽具有对于DAMP增加的结合亲和力。

在该第一方面的一个实施方案中，这种PAMP包括CpG基序。

在该第一方面的一个实施方案中，这种PAMP是细菌DNA。

在该第一方面的一个实施方案中，该细菌DNA包括CpG基序。

在该第一方面的一个实施方案中，该PAMP是一种包括CpG寡脱氧核苷酸基序（CpG ODN）的寡核苷酸。

在该第一方面的一个实施方案中，该CpG ODN基序是CPGA、CpGB和/或CpGC中任何一种或多种。

在该第一方面的一个实施方案中，该野生型Cpn10多肽是一种人野生型Cpn10多肽，这种多肽由SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列组成。

在该第一方面的一个实施方案中，这种分离的多肽的N端以一个甲硫氨酸残基开始。这个甲硫氨酸残基可以在选自下组的一个氨基酸残基前面，其构成为：精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸、以及缬氨酸。

在该第一方面的一个实施方案中，这种分离的多肽包括如SEQ ID NO：9、12、15、18、24、26、29、32、38、41、44、47、49、78、90或93的任一项中列出的一种氨基酸序列。

在该第一方面的另一个实施方案中，这种分离的多肽包括如SEQ ID NO：52、55、58、60、81、84、87、或96的任一项中列出的一种氨基酸序列。在一个第二个方面中，本发明提供了对该第一方面分离的多肽进行编码的一种分离的核酸。

在该第二方面的一个实施方案中，这种分离的核酸包括如SEQ ID NO：10、13、14、16、17、19、20、25、27、28、30、31、33、34、39、40、42、43、45、46、48、50、51、91、92、94、或95的任一项中列出的一种核苷酸序列。在该第二方面的一个实施方案中，这种分离的核酸包括如SEQ ID NO：53、54、56、57、59、61、62、82、83、85、86、88、89、97或98的任一项中列出的一种核苷酸序列。

在一个第三方面中，本发明提供了一种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽，这种多肽与一种野生型Cpn10多肽具有至少70％的序列一致性，并且与所述野生型多肽相比较包括延长了一个额外氨基酸残基的一个N端。

在该第三方面的一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有至少80％的序列一致性。

在该第三方面的另一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有至少90％的序列一致性。

在该第三方面的另一个实施方案中，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽与这种野生型Cpn10多肽具有至少95％的序列一致性。

在该第三方面的一个实施方案中，与这种野生型Cpn10多肽相比较，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽具有增加的免疫调节功能。

在该第三方面的一个实施方案中，与这种野生型Cpn10对于病原体相关分子模式（PAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽对于PAMP具有增加的结合亲和力。

在该第三方面的一个实施方案中，与这种野生型Cpn10对于损伤相关分子模式（DAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽对于DAMP具有增加的结合亲和力。

在该第三方面的另一个实施方案中，与Ala-Cpn10（SEQ ID NO：3）相比较，这种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽具有增加的免疫调节功能。

在该第三方面的一个实施方案中，与Ala-Cpn10（SEQ ID NO：3）对于病原体相关分子模式（PAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽对于PAMP具有增加的结合亲和力。

在该第三方面的一个实施方案中，与Ala-Cpn10（SEQ ID NO：3）对于损伤相关分子模式（DAMP）的结合亲和力相比较，这种变异体多肽对于DAMP具有增加的结合亲和力。

在该第三方面的一个实施方案中，这种PAMP包括CpG基序。

在该第三方面的一个实施方案中，这种PAMP是细菌DNA。

在该第三方面的一个实施方案中，这种细菌DNA包括CpG基序。

在该第三方面的一个实施方案中，这种PAMP是包括CpG寡脱氧核苷酸基序（CpG ODN）的一种寡核苷酸。

在该第三方面的一个实施方案中，这种CpG ODN基序是CPGA、CpGB和/或CpGC中任何一种或多种。在该第三方面的一个实施方案中，这种野生型Cpn10多肽是一种人野生型Cpn10多肽，这种多肽是由SSEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列组成。

在该第三方面的一个实施方案中，这种额外的氨基酸残基是一个甘氨酸、丝氨酸或脯氨酸残基。

在该第三方面的另一个实施方案中，这种额外的氨基酸残基是一个缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺残基。

在该第三方面的一个实施方案中，这种分离的多肽包括如SEQ ID NO：6、21或35中列出的一种氨基酸序列。

在该第三方面的另一个实施方案中，这种分离的多肽包括如SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、或75中列出的一种氨基酸序列。

在一个第四方面中，本发明提供了对该第三方面分离的多肽进行编码的一种分离的核酸。

在该第四方面的一个实施方案中，这种分离的核酸包括如SEQ ID NO：7、8、22、23、36、或37的任一项中列出的一种核苷酸序列。

在一个第五方面中，本发明提供了包括该第二或第四方面分离核酸的一种载体。

在一个第六方面中，本发明提供了包括该第五方面载体的一种宿主细胞。

在一个第七方面中，本发明提供了包括下面任何一项或多项一种组合物：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

c)该第五方面的载体。

在该第七方面的一个实施方案中，这种组合物进一步包括一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

在一个第八方面中，本发明提供了一种用于抑制受试者体内免疫活化的方法，所述方法包括向该受试者施用一个治疗有效量的下面各项：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

c)该第五方面的载体。

（d）该第七方面的组合物。

在一个第九方面中，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者体内炎性疾病的方法，所述方法包括向该受试者施用一个治疗有效量的下面各项：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

(b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

c)该第五方面的载体，

(d)该第七方面的组合物。

在该第九方面的一个实施方案中，这种炎性疾病是选自下组，其构成为：类风湿性关节炎，炎症性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎），I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，幼年型糖尿病），慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，格雷夫斯病，骨性关节炎，II型胶原关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢疾病，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性神经炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，自身免疫性葡萄膜炎，银屑病，斯耶格伦病，肉样瘤病，皮肌炎，白细胞分裂性血管炎，重症肌无力，变应性脑脊髓炎，甲状腺毒症，恶性贫血，风湿性多肌痛和多发性肌炎慢性阻塞性肺病（COPD），传染性疾病，肠漏症，心血管疾病（如充血性心脏病），变态反应（如过敏反应，药物反应，皮肤变态反应，湿疹，过敏性鼻炎，荨麻疹，特异性皮炎，过敏性接触性变态反应，食物变态反应，过敏性结膜炎，昆虫毒液过敏症），哮喘，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及动脉硬化和传染性疾病。

在一个第十方面，本发明提供了一种筛选免疫抑制剂的方法，所述方法包括：

a)在适合于在一种候选剂与该第二或第四方面的一种分离的核酸之间发生结合的条件下，使所述核酸与所述候选剂接触，并且

b)测量由所述核酸编码的一种多肽的生产。

在一个第十一方面，本发明提供了筛选免疫抑制剂的一种方法，所述方法包括在适合于在一种候选剂与所述多肽之间发生结合的条件下使一种混合物与所述候选剂接触，并且检测所述免疫细胞中由所述多肽诱导的PRR-介导的细胞信号的水平，该混合物包括：

a)表达一种模式识别受体（PRR）的一种免疫细胞，

b)所述PRR的一种配体；以及

c)该第一或第三方面的一种分离的多肽。

在该第十一方面的一个实施方案中，这种检测是通过下面任何一项或多项完成的：

a)测量由所述免疫细胞产生和/或分泌的细胞因子和/或趋化因子，

b)测量由所述免疫细胞表达的活化标志物，

c)检测所述免疫细胞中Toll样受体介导的NF-κΒ活化。

在一个第十二方面中，本发明提供了下面任何一项或多项在制备用于抑制受试者体内免疫活化药物中的用途：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

(b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

(c)该第五方面的载体，

(d)该第七方面的组合物。

在一个第十三方面中，本发明提供了下面任何一项或多项在制备用于预防或治疗受试者体内炎性疾病药物中的用途：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

(b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

(c)该第五方面的载体，

(d)该第七方面的组合物。

在一个第十四方面中，本发明提供了下面任何一项或多项：

a)该第一或第三方面的一种分离的多肽，

(b)该第二或第四方面的一种分离的核酸，

(c)该第五方面的载体，

(d)该第七方面的组合物，

用于预防或治疗受试者体内的炎性疾病。

在该第十三方面或第十四方面的一个实施方案中，这种炎性疾病是选自下组，其构成为：类风湿性关节炎，炎症性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎），I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，幼年型糖尿病），慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，格雷夫斯病，骨性关节炎，II型胶原关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢疾病，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性神经炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，自身免疫性葡萄膜炎，银屑病，斯耶格伦病，肉样瘤病，皮肌炎，白细胞分裂性血管炎，重症肌无力，变应性脑脊髓炎，甲状腺毒症，恶性贫血，风湿性多肌痛和多发性肌炎慢性阻塞性肺病（COPD），传染性疾病，肠漏症，心血管疾病（如充血性心脏病），变态反应（如过敏反应，药物反应，皮肤变态反应，湿疹，过敏性鼻炎，荨麻疹，特异性皮炎，过敏性接触性变态反应，食物变态反应，过敏性结膜炎，昆虫毒液过敏症），哮喘，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及动脉硬化和传染性疾病。

附图简要说明

现在参考附图仅通过举例对本发明的优选实施方案进行说明，其中：

图1显示了人Cpn10和大肠杆菌GroES氨基酸序列的比对以及相应的结构域边界。

图2A至2C是多个曲线图，它们显示各种Cpn10N端变异体与CpG ODN配体结合的程度。结果表示为丙氨酸Cpn10（Ala-Cpn10）结合到给定的CpG ODN配体（即CpG-A、CpG-B或CpG-C）上的百分比。

图3显示了展示所产生的重组Cpn10蛋白纯度的代表性SDS-PAGE电泳图。

定义

如在本申请中使用的，单数形式的“一个”、“一”和“该”包括复数引用，除非上下文中另有明确说明。例如，术语“一个细胞”也包括多个细胞。

如在此使用的，术语“包括”表示“包含”。词语“包括”的多种变体，例如“包括有”和“包括了”具有相应改变的含义。因此，例如“包括”对蛋白进行编码的一个序列的多核苷酸可以唯一地由这个序列组成，或者可以包括一个或多个额外序列。

如在此使用的，“试剂”包括在其范围内的任何天然或制造的元素或化合物。因此，该术语包括但不限于任何化学元素以及化合物、核酸、氨基酸、多肽、蛋白、抗体和抗体片段，以及在本发明的上下文中可以是适当的其他物质。

如在此使用的术语“施用”以及该术语的变体（包括“给药”和“施药”）包括通过任何适当手段将一种化合物（如核酸、多肽或抗体）或本发明的组合物接触、应用、递送或提供给一个生物体。

如在此使用的，术语“一个抗体”和“多个抗体”包括IgG（包括IgG1、IgG2、IgG3以及IgG4）、IgA（包括IgA1和IgA2）、IgD、IgE、或IgM、以及IgY，全抗体，包括单链全抗体，以及它们的抗原结合片段。抗原结合的抗体片段包括，但不限于，Fab、Fab'和FF(ab')2、Fd、单链Fvs（scFv），单链抗体，二硫键连接的Fvs（sdFv）以及包括VL亦或VH结构域的片段。这些抗体可以是来自任何动物来源。抗原结合的抗体片段，包括单链抗体，可以单独地或者与下面各项全部或部分相结合包括一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2以及CH3结构域。.还包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2以及CH3结构域的任何组合。抗体可以是单克隆、多克隆、嵌合体、多特异性、人性化、以及人单克隆和多克隆抗体，它们特异性地结合生物分子。

如在此使用的，术语“核酸”是指处于单链亦或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另有限制，包括天然核苷酸的已知类似物，它们以类似于天然发生核苷酸的方式杂交到核酸上。

如在此使用的，术语“多肽”是指由肽键连接到一起的氨基酸组成的聚合物。为了本发明的目的，“多肽”可以由全长蛋白或全长蛋白的一部分组成。

如在此使用的，术语“治疗”是指无论以任何方式治疗疾病状态或症状、或另外地防止、阻碍、延缓、或逆转疾病或其他不希望症状的进展的任何一种或全部用途。

如在此所用的，术语“有效量”和“治疗有效量”在它们的含义中包括一种无毒的但足够数量的试剂或化合物用来提供希望的治疗效果。所需要的准确数量受试者间将是不同的，这取决于多种因素，例如所治疗的人种、受试者的年龄和身体状况、所治疗病症的严重性、所施用的具体试剂以及给药方式等等。因此，指定一个确切的“有效量”是不可能的。然而，对于任何给定的情况，仅使用常规实验本领域普通技术人员可以确定一个适当的“有效量”。

如在此使用的人“野生型Cpn10多肽序列”不以一个甲硫氨酸残基开始，并且可以由SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列来定义。

如在此使用的，术语“丙氨酸-Cpn10”和“Ala-Cpn10”具有相同含义，并且包括与另外的完全相同的野生型Cpn10多肽或它的一个片段相比较以一个单个额外的N端丙氨酸残基开始的任何多肽。例如，如在此所述的人Ala-Cpn10在N端以氨基酸序列Ala-Ala-Gly-Gln-Ala开始，并且可以具有SEQ ID NO：3中列出的序列。

如在此使用的，术语“基本上”是指大多数但不必是全部。

在此处现有技术文件的任何说明、或在此处从这些文件中衍生的或者基于这些文件的陈述不是承认该文件或衍生的陈述是相关技术公共常识的一部分。

为了说明的目的，除非另外说明，在此提及的所有文件都通过引用结合在此。

详细说明

本发明诸位发明人解出了包含一个额外N端丙氨酸残基（Ala-Cpn10；SEQID NO：3）并且缺少柔性移动环的人Cpn10变异体的X-射线晶体结构（以2埃的分辨率）。这些研究表明Cpn10单体包括侧翼为一个β-发夹“顶环”区域和一个“移动环”区域的一个核心反平行β–桶区域。人Cpn10的N端结构域从该β-桶形成并且在形成一个良好序列的线性延伸构象之前最初地经历一个β发夹转角，该构象放置横过该Cpn10圆顶样结构的顶部紧邻这些顶环的特异性区域。在一些晶体结构中，观察到该Cpn10七聚体中某些亚基的N端结构域经历较大构象改变，表明该附属物是相当柔性的并且有可能实现重要的生理功能例如调节核酸结合。

不受特定作用机理或模式的束缚，诸位发明人完成的分子模型表明Ala-Cpn10的柔性N端可以通过在N端丙氨酸残基(Ala-1)与顶环上一个小结构口袋之间相互作用而对接到该顶环上。该结构口袋被认为是由残基Ser52至Gly57形成的。顶环开始的两个主要残基，Lys53和Lys55，被较小残基（Ser52、Gly54、Gly56以及Gly57）围绕，并且由于它们延伸的侧链CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-NH₂被认为形成该口袋，由Gly54间隔开。Ala-1的CH₃侧链被认为与这些赖氨酸侧链相互作用并且与其形成一个较大的显著的簇（以及一个第二较小的簇）。Ala-1有效地结合到Lys53-Lys55的顶环结构口袋中被认为锚定了该柔性N端，提供了与包括基于PAMP或DAMP核酸的分子更紧密地结合。这种更紧密结合进而被认为增强了蛋白的免疫抑制能力。

本发明提供了包括对N端结构域中一个或多个残基进行修饰的Cpn10变异体。总体上，与野生型Cpn10相比较，本发明的Cpn10N端结构域变异体具有对于包括病原体相关分子模式（PAMP）的分子和/或包括损伤相关分子模式（DAMP）的宿主分子增加的结合亲和力。因此，本发明的Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用总体上强于野生型Cpn10与这些相同分子之间的结合相互作用。优选地，本发明的Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用强于Ala-Cpn10与这些相同的分子之间的结合相互作用。

包括PAMP或DAMP的配体结合到模式识别受体（PRR）上引发了对于建立有效先天免疫应答很重要的一系列事件。不受具体作用机理或模式的限制，可以假定的是通过本发明的Cpn10N端结构域变异体紧密结合这些配体改变或阻止这些配体与它们目标PRR之间的相互作用。这进而被认为抑制了由PRR信号（像例如通过生产和分泌炎性分子所诱导的那些）引起的免疫应答的启动。

因此包括PAMP或DAMP分子的结合可以影响一种或多种免疫应答的性质和/或强度。由于结合包括PAMP或DAMP的分子强于Ala-Cpn10结合到这些相同分子上，与Ala-Cpn10相比较，本发明的Cpn10N端结构域变异体可以产生增加的免疫调节功能。

本发明的Cpn10N端结构域变异体可以被施用用来抑制免疫应答。因此，可以施用这些变异体用来预防和/或治疗与免疫活化相关联的多种疾病（例如，慢性炎性疾病）。

本发明的Cpn10N端结构域变异体还可以用于筛选测定用来针对其活性对促效剂进行鉴别。由于增强了对由本发明变异体介导的PRR信号传导的抑制作用，这些促效剂通常可以是PRR信号的拮抗剂。

Cpn10N端结构域变异体

本发明提供了对N端结构域上一个或多个残基进行修饰的Cpn10变异体（“本发明的一种或多种Cpn10多肽”）。还提供了对这些Cpn10变异体进行编码的核酸（“本发明的一种或多种Cpn10核酸”）。

典型地，本发明的Cpn10多肽是一种分离的多肽。应当理解的是，在本发明上下文中术语“分离的”是指该多肽已经从它以其天然状态发现与其在一起的一些或全部其他组分中取出或不与之结合。例如，一种“分离的”多肽可以从一个较大的多肽序列内其他氨基酸序列中取出，或者可以从天然组分例如不相关蛋白中取出。为了清楚的目的，一种“分离的”多肽还包括未从自然界中取得的，而是从头制备（例如化学合成的）的和/或通过重组方法制备的一种多肽。如在此所述的本发明的一种分离的Cpn10多肽可以作为一种较长的多肽或融合蛋白的一个组成部分而包括在内。

典型地，本发明的Cpn10核酸是一种分离的核酸。应当理解的是，在本发明上下文中术语“分离的”是指该核酸已经从它以其天然状态发现与之在一起的一些或全部其他组分中取出或不与之结合。例如，一种“分离的”核酸可以从一个较大的核酸序列内其他核酸序列中取出，或者可以从天然组分（例如无关核酸）中取出。为了清楚的目的，一种“分离的”核酸还包括未从自然界中取得的，而是从头制备的（例如化学合成的）和/或通过重组方法制备的一种核酸。

本发明的Cpn10多肽与一种野生型Cpn10多肽序列的区别可以是在N端结构域中取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基。

有经验的读者应当理解的是在正常生理条件下，许多哺乳动物野生型Cpn10多肽（例如人野生型Cpn10多肽）的起始甲硫氨酸总体上在第二个残基是丙氨酸情况下被切割（即“N端法则”）。因此，如在此考虑的人“野生型Cpn10多肽序列”将不以甲硫氨酸残基开始，并且可以通过在SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列来定义。

如在此考虑的，Cpn10的“N端结构域”包括在形成Cpn10单体中β-桶的第一β折叠的那些残基之前该多肽序列中全部氨基酸残基。因此，人野生型Cpn10序列的“N端结构域”可以是由SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列的残基1-7来定义。

应当理解的是除了N端结构域中的修饰之外，另外地本发明的Cpn10多肽可以与一种野生型Cpn10多肽、一种野生型Cpn10多肽的变异体、或者一种野生型Cpn10多肽的片段完全相同或者基本上相同。

野生型Cpn10多肽可以从任何来源得到，其非限制性实例包括植物类（如拟南芥）、细菌类（如结核分枝杆菌，大肠杆菌）、酵母（如酿酒酵母）、线虫类（如秀丽隐杆线虫）、以及动物类，如哺乳动物类，蛙类（如非洲爪蟾）、果蝇类（例如黑腹果蝇）、鸡、鱼（如斑马鱼）以及其他海洋动物类（如海鞘，如萨氏海鞘）。可替代地，这种野生型Cpn10多肽可以是古生菌（如甲烷八叠球菌）。

优选地，这种野生型Cpn10多肽是从哺乳动物得到的。例如，这种野生型Cpn10多肽可以是一种灵长类、绵羊、牛、马、猪、猫、犬或鼠类的Cpn10多肽。

更优选地，这种野生型Cpn10多肽是一种人野生型Cpn10多肽。这种人野生型Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：1中列出的氨基酸序列。

因此本发明的Cpn10多肽可以通过在一种野生型Cpn10多肽序列、或者这种多肽序列的一种变异体或者一个片段（即其一个变异体或一个片段）的N端结构域中取代或缺失任何一个或多个氨基酸残基来产生。可以将N端结构域中任何数目的一个或多个氨基酸取代或缺失用来产生本发明的一种Cpn10多肽，对于缺失或取代的特定的一个或多个氨基酸没有任何限制。

另外地或者可替代地，可以通过将一个或多个额外的氨基酸残基结合到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的N端结构域中来产生本发明的Cpn10多肽。应该理解的是将一个或多个额外的氨基酸残基“结合”到N端结构域中包括将一个氨基酸残基或包括两个或更多个氨基酸残基的一个序列插入该N端结构域中任何位置。可以将任何数量的一种或多种额外氨基酸结合到该N端结构域中，对于所结合的一种或多种氨基酸的个性特征没有任何限制。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括附加到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的N端残基（即第一残基）上的一个或多个额外氨基酸残基。附加的一个或多个残基可以是带正电荷、负电荷、或者中性的残基。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或ALA-Cpn10对这些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这种多肽可以具有对PAMP和/或DAMP增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

可以通过将一个或多个中性氨基酸残基附加到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。这种额外的一个或多个中性氨基酸可以是选自下组，其构成为：丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。

可以通将一个或多个带正电荷的氨基酸残基到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。这种带正电荷的一个或多个氨基酸可以是选自下组，其构成为：精氨酸、组氨酸和赖氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽可以具有对PAMP和/或DAMP增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：66中列出的氨基酸序列或者其片段。该片段包括由SEQ ID NO：66定义的N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

因此，本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：66中列出的氨基酸序列或其片段的多肽具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、或95％的序列一致性。该片段包括由SEQ ID NO：66定义的一个N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

可以通过将一个或多个带负电荷的氨基酸残基附加到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。该一个或多个带负电荷的氨基酸可以是选自下组，其构成为：天冬氨酸和谷氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽可以具有对PAMP和/或DAMP增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：72或74中列出的氨基酸序列或其片段。该片段包括由SEQ ID NO：72或74定义的N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

因此，本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：72或74中列出的氨基酸序列或其片段的多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段包括由SEQ ID NO：72或74定义的一个N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

在一些实施方案中，通过将包括两个或更多个氨基酸残基的一个序列附加到一种野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

这些氨基酸残基的附加序列可以包括带不同电荷氨基酸的一种组合。例如，该序列可以包括一个或多个中性氨基酸残基和一个或多个带正电荷残基的一个组合，或一个或多个中性氨基酸残基和一个或多个带负电荷残基的一个组合。

熟练的读者应当理解的是用于蛋白翻译的生物系统通过翻译产生甲硫氨酸残基的ATG起始密码子开始。在Cpn10的情况下，已经确定的是可以从最终（野生型）多肽上切割起始甲硫氨酸，这取决于邻近残基的个性特征。更确切地说，已确定的是当邻近氨基酸是丙氨酸，甘氨酸，脯氨酸或丝氨酸时将起始甲硫氨酸切割离开野生型Cpn10。例如，如上所述，在生物学条件下（即起始甲硫氨酸被切割）人野生型Cpn10通常以一个丙氨酸残基开始，而大肠杆菌的同系物GroES以一个甲硫氨酸开始紧接着是一个天冬酰胺（即起始甲硫氨酸不被切割）。

尽管在一些情况下生物系统倾向于切割Cpn10多肽的起始甲硫氨酸，应当理解的是本发明的Cpn10多肽可以使用替代手段（如通过化学合成）来合成和/或进行修饰以便维持或去除一个起始甲硫氨酸。因此，本发明的Cpn10多肽可以或不可以用一个起始甲硫氨酸残基开始。

本发明诸位发明人已经确定的是将一个甲硫氨酸残基添加到Cpn10的N端上有助于更紧密地结合到包括PAMP或DAMP的分子上。不受具体的作用机理或方式的限制，提出甲硫氨酸较大的侧链（CH₂-CH₂-S-CH₃）与定位在由诸位发明人鉴别的假定的结合口袋外面Cpn10分子（如SEQ ID NO：1的异亮氨酸59（Ile59）和/或缬氨酸62（Val62）的顶环中的残基经历多重相互作用。

因此，在某些实施方案中，通过将包括两个或更多个氨基酸残基的一个序列附加到一种野生型Cpn10的多肽序列（或其一种变异体或片段）的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽，其中该附加序列的一个或多个残基是甲硫氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

在一些实施方案中，该序列包括附加到野生型Cpn10多肽序列（或其变异体或片段）的N端残基上的一个甲硫氨酸残基。

在其他实施方案中，该序列包括附加到野生型Cpn10多肽序列（或其变异体或片段）的N端残基上的一个替代残基（即除甲硫氨酸以外的一种残基）。附加到N端残基上的序列的附加氨基酸可以是选自下组，其构成为：精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸、色氨酸，酪氨酸或缬氨酸。

优选地，附加的序列包括位于一个或多个额外氨基酸残基之前的至少一个甲硫氨酸残基。该序列最终的氨基酸残基被附加到该野生型Cpn10多肽序列（或其变异体或片段）的N端残基上。最终的氨基酸残基可以是一个中性氨基酸残基，或一个带电荷的氨基酸残基。一个或多个额外残基可能将甲硫氨酸残基和附加该N端的残基分开。

优选地，附加的序列包括位于一个第二氨基酸残基之前的一个第一甲硫氨酸残基。该序列的第二氨基酸残基被附加到该野生型Cpn10多肽序列（或其变异体或片段）的N端残基上。该第二氨基酸残基可以是一个中性氨基酸残基，或一个带电荷的氨基酸残基。

在某些实施方案中，通过将一个中性氨基酸残基附加到一种人野生型多肽序列的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。与Ala-Cpn10（例如与SEQID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：6、21、35、63、64、65、67、68、69、70、71、73或75中列出的氨基酸序列，或其片段。该片段包括由SEQ ID NO：6、21或35定义的N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

因此，本发明的Cpn10多肽与包括SEQ ID NO：6、21、35、63、64、65、67、68、69、70、71、73或75中列出的氨基酸序列的一种多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段包括由SEQ ID NO：6、21或35定义的一个N端结构域序列的至少第一氨基酸残基。

本发明的Cpn10核酸序列可以包括SEQ ID NO：7、8、22、23、36或37的任一项中列出的核苷酸序列，或其片段。该片段对由上述SEQ ID NO的任一项编码的N端结构域序列的至少第一氨基酸残基进行编码。

本发明的Cpn10核酸序列可以与包括SEQ ID NO：7、8、22、23、36或37的任一项中列出的核苷酸序列或其片段的一种核酸具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%序列一致性。该片段对由上述SEQ ID NO的任一项编码的N端结构域序列的至少第一氨基酸残基进行编码。

在其他实施方案中，通过将包括两个中性氨基酸残基的一个序列附加到一种人野生型多肽序列的第一N端残留上来产生本发明的Cpn10多肽。附加序列的第一氨基酸残基可以是一个甲硫氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对那些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：9、12、15、24、26、29、32、38、44、49、52、55、76、78、84或96的任一项中列出的氨基酸序列，或其片段。该片段包括由上述SEQ ID NO中任一项定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：9、12、15、24、26、29、32、38、44、49、52、55、76、78、84、或96的任一项中列出的氨基酸序列的一种多肽或者其片段具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的序列一致性。该片段包括由上述SEQ ID NO中任一项定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10核酸序列可以包括SEQ ID NO：10、13、14、16、17、25、27、28、30、31、33、34、39、40、45、46、50、51、53、54、56、57、85、86、97、或98的任一项中列出的核苷酸序列，或其片段。该片段对由上述SEQID NO中任一项编码的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基进行编码。

本发明的Cpn10核酸序列可以与包括SEQ ID NO：10、13、14、16、17、25、27、28、30、31、33、34、39、40、45、46、50、51、53、54、56、57、85、86、97、或98的任一项中列出的核苷酸序列或其片段的一种核酸具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段对由上述SEQ ID NO中任一项编码的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基进行编码。

在其他实施方案中，通过将包括三个或更多个中性氨基酸残基的一个序列附加到一种人野生型多肽序列的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。该附加的序列可以包括一个或多个甲硫氨酸残基。该附加序列的第一氨基酸残基可以是一个甲硫氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对这些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可能是细菌DNA。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：58、60、77、81、87、90、或93的任一项中列出的氨基酸序列，或其片段。该片段包括由上述SEQ ID NO中任一项定义的一种N端结构域序列的至少前三个氨基酸残基。

本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：58、60、77、81、87、90、或93的任一项中列出的氨基酸序列或其片段的一种多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的序列一致性。该片段包括由上述SEQ ID NO中任一项定义的一个N端结构域序列的至少前三个氨基酸残基。

本发明的Cpn10核酸序列可以包括SEQ ID NO：59、61、62、82、83、88、89、91、92、94、或95的任一项中列出的核苷酸序列，或其片段。该片段对由上述SEQ ID NO中任一项编码的N端结构域序列的至少前三个氨基酸残基进行编码。

本发明的Cpn10核酸序列可以与包括SEQ ID NO：59、61、62、82、83、88、89、91、92、94、或95的任一项中列出的核苷酸序列或其片段的一种核酸具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段对由上述SEQ ID NO中任一项编码的N端结构域序列的至少前三个氨基酸残基进行编码。

在其他实施方案中，通过将包括一个或多个中性氨基酸残基和一个或多个带正电荷的残基的一个组合的序列附加到一种人野生型多肽序列的第一N端残基上来产生的本发明的Cpn10多肽。该附加序列的第一氨基酸残基可以是一个甲硫氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对这些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

因此，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列，或其片段。该片段包括由SEQ ID NO：18定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：18中列出的氨基酸序列或其片段的一种多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段包括由SEQ ID NO：18定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10核酸序列可以包括SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20中列出的核苷酸序列。该片段对由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20编码的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基进行编码。

本发明的Cpn10核酸序列可以与包括SEQ ID号：19或SEQ ID NO：20中列出的核苷酸序列的一种核酸具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段对由SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20编码的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基进行编码。

在其他实施方案中，通过将包括一个或多个中性氨基酸残基和一个或多个带负电荷残基的一种组合的序列附加到一种人野生型多肽序列的第一N端残基上来产生本发明的Cpn10多肽。该附加序列的第一氨基酸残基可以是一个甲硫氨酸。与Ala-Cpn10（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较）和/或野生型Cpn10（例如与SEQ ID NO：1中列出的人野生型Cpn10相比较）相比较，这些多肽可以具有增加的免疫调节功能。与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对这些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，这些多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。这种PAMP可以包括CpG基序。例如，这种PAMP可以是细菌DNA。

因此，在某些实施方案中，本发明的Cpn10多肽可以包括SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47中列出的氨基酸序列或其片段。该片段包括由SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47中列出的氨基酸序列或其片段的一种多肽具有至少约40%。45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。该片段包括由SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：47定义的N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基。

本发明的Cpn10核酸序列可以包括SEQ ID NO：42、43或48的任一项中列出的核苷酸序列。该片段对由SEQ ID NO：42、43或48中任一项编码的一个N端结构域序列的至少前两个氨基酸残基进行编码。

本发明的Cpn10核酸序列可以与包括SEQ ID NO：42、43或48的任一项中列出的核苷酸序列的一种核酸具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。在定位在该N端结构域外部的一个或多个区域中本发明的Cpn10多肽可以进一步包括一个或多个额外氨基酸残基取代、缺失和/或插入(与野生型Cpn10多肽序列相比较)。

例如，在顶部β发夹结构域、β桶结构域和/或移动环结构域中本发明的Cpn10多肽可以另外地包括一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。因此，仅通过举例，在SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列的位置7-101的任何一项或多项中本发明的Cpn10多肽可以进一步包括一个或多个额外取代、缺失和/或插入。

在某些实施方案中，本发明的Cpn10多肽与人野生型Cpn10多肽序列（或其一种变异体或片段）的差异在于在N端结构域中取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基以及在顶部β-发夹结构域（由SEQ ID NO:1的残基52-62定义）中进行一个或多个氨基酸插入、缺失或取代。

可以通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列来确定两个序列之间序列一致性百分比。比较窗口中序列的一部分（例如本发明的Cpn10多肽或Cpn10核酸）例如可以包括将多个缺失或添加（例如间隙）与不包括缺失或添加的一个参考序列进行比较（例如从另一个物种得到的序列）从而对这两个序列进行最佳比对，或反之亦然。然后通过下面各项可以对序列一致性百分比进行计算：确定完全相同的氨基酸残基（或核苷酸）出现在两个序列中这些位置处的数量从而产生匹配的位置数量，将匹配的位置数量除以比较窗口中位置总数量，并且将结果乘以100从而产生序列一致性百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，序列一致性百分比是指当在比较窗口上针对最大对应性进行比较和比对时在一个特定区域上（或当非特定时，在整个序列上），或当使用下面序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查进行测量时在指定区域上，相同的氨基酸残基或核苷酸的特定百分比。

为了序列比较，典型地一个序列作为测试序列与其进行比较的一个参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可以使用缺省的程序参数，或者可以指定替代的参数。然后该序列比较算法基于这些程序参数相对于参考序列针对该一个或多个测试序列计算出序列一致性百分比。

用于比较的序列比对方法是本领域已知的。常规地可以使用已知的计算机程序（包括但不限于PC/Gene程序(可从Intelligenetics,Mountain View，California得到)中的CLUSTAL，GCG威斯康辛遗传学软件包（GCG WisconsinGenetics Software Package）版本10(可从Accelrys Inc.,9685Scranton Road,SanDiego,California,USA得到)中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、以及TFASTA）实现用于确定序列一致性的序列最佳比对。

在此例举说明的本发明的Cpn10多肽可以进一步包括一个或多个额外氨基酸。在一些实施方案中，这些额外氨基酸可以相应于该举例说明的多肽可以从中衍生的蛋白或较大多肽紧接上游和/或下游的氨基酸。有技术的读者应当理解的是如在此举例说明的本发明Cpn10多肽的一个或多个氨基酸可以缺失而不失去活性。

例如可以用乙酰基团，脂类，碳水化合物类和/或磷酸基团来修饰本发明的Cpn10多肽用来提高免疫原性，稳定性和/或溶解度。多肽末端加帽可以用来增强对抗细胞蛋白酶的稳定性。

如在此例举说明的本发明Cpn10核酸可以进一步包括一个或多个额外核苷酸。在一些实施方案中，这些额外的核苷酸可以相应于从中得到该核酸的基因组序列中紧接上游和/或下游的核苷酸。有技术的读者应当理解的是如在此例举说明的本发明Cpn10核酸的一个或多个核苷酸可能缺失而不损失活性。

应当理解的是“本发明的一种或多种Cpn10多肽”包括这些多肽的多种变异体。类似地，应当理解的是“本发明的一种或多种Cpn10核酸”包括这些核酸的多种变异体。

如在此使用的术语“变异体”是指一种基本上相似的序列。通常地，如果两个序列在指定区域上，或当未指定时在整个序列上，具有相同的指定百分比的氨基酸残基或核苷酸（“序列一致性”百分比），这两个序列是“基本上相似的”。因此，本发明的Cpn10核酸或本发明的Cpn10多肽的“变异体”可能与参考序列具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。

通常地，这些多肽变异体具有与它们从中衍生的多肽共同的定性生物活性。核酸变异体总体上编码通常具有与它们从中衍生多肽共同的定性生物活性的多肽。.术语“变异体”的含义中还包括本发明Cpn10核酸和本发明Cpn10多肽的同系物。核酸同系物典型地是来自不同物种但是具有与相应的本发明Cpn10核酸基本上相同的生物功能或活性。多肽同系物典型地是来自不同物种但是具有与相应的本发明Cpn10多肽基本上相同的生物功能或活性。

另外，术语“变异体”还包括本发明Cpn10多肽的类似物。多肽“类似物”是一种多肽，该多肽是本发明Cpn10多肽的一种衍生物，该衍生物包括添加、缺失、取代一个或多个氨基酸，使得该多肽保留基本上相同的功能。术语“保守氨基酸取代”是指在一个多肽链中（蛋白一级序列）将一个氨基酸取代或替换为具有类似性质的另一个氨基酸。例如，将带电荷的氨基酸谷氨酸(Glu)取代为类似电荷的氨基酸天冬氨酸(Asp)将是一种保守氨基酸取代。

应当理解的是“本发明的一种或多种Cpn10多肽”包括这些多肽的片段。类似地，应当理解的是“本发明的一种或多种Cpn10核酸”包括这些核酸的片段。

本发明Cpn10多肽的“片段”是编码一个组分的一种多肽，或是本发明Cpn10多肽的一个组分或其变异体。典型地该片段具有与它作为其中一种组分多肽共同的定性的生物活性。典型地，该多肽片段长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或大于100个氨基酸残基。

本发明Cpn10核酸的“片段”是编码一个组分的一种核酸或是本发明Cpn10核酸的一个组分或其变异体。核酸片段不必需要编码保持生物活性的多肽。该片段例如可以用作杂交探针或PCR引物。典型地，该核酸片段长度可以是至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3250或3400个核苷酸。

通常地，与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10相比较本发明的Cpn10多肽对于包括病原体相关分子模式（PAMP）的分子和/或包括损伤相关分子模式（DAMP）的宿主分子具有增加的结合亲和力。因此，本发明的Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用通常强于野生型Cpn10与这些相同分子之间的结合相互作用。优选地，本发明Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用强于Ala-Cpn10与这些相同分子之间的结合相互作用。

包括PAMP或DAMP分子的结合可以影响该一种或多种免疫应答的性质和/或强度。由于包括PAMP或DAMP分子的结合强于野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10与这些相同分子的结合，与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10相比较本发明的Cpn10多肽可以产生增加的免疫调节功能。

因此，在某些实施方案中，与Ala-Cpn10相比较（例如与SEQ ID NO：3中列出的人Ala-Cpn10相比较），本发明的Cpn10多肽可以具有增加的免疫调节功能。

与野生型多肽相比较，这些多肽的N端可以延长至少一个、两个、或三个额外的氨基酸残基。该N端可以用甲硫氨酸残基开始。

与Ala-Cpn10相比较具有增加的免疫调节功能的本发明Cpn10多肽可以包括例如SEQ ID NO:9、12、15、18、21、24、26、29、32、35、38、41、44、52、55、58、60、81、84、87、90或93的任一项中列出的氨基酸序列或其包括该序列N端结构域的片段。

与Ala-Cpn10相比较具有增加的免疫调节功能的本发明Cpn10多肽可以与包括SEQ ID NO:9、12、15、18、21、24、26、29、32、35、38、41、44、52、55、58、60、81、84、87、90或93的任一项中列出的氨基酸序列或其包括该序列N端结构域的片段的多肽具有至少约40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%的序列一致性。

可以使用本领域已知的任何适当方法来测量本发明Cpn10多肽的免疫调节功能水平（即免疫调节能力）。例如，可以通过多肽与PAMP和DAMP(例如，细菌CpGs的)结合相互作用的倾向和/或强度（这可以进而使用本说明书实例中说明的方法来测量）来测量免疫调节功能水平。.另外地或可替代地，可以通过测量由这些多肽引起的模式识别受体（PRR）信号传导程度对本发明Cpn10多肽的免疫调节功能进行评估。例如，多肽通过PRR（例如Toll样受体）抑制聚(I：C)-诱导的NFκB生产的能力可以使用美国专利申请号12/934980（于2009年12月30日公开）中说明的技术来测量，通过交叉引用将其全部内容结合在此。另外地或可替代地，可以通过测量在这些多肽和这些PRR的一种或多种配体存在下表达PRR的细胞的细胞因子生产和/或细胞因子分泌的水平对本发明Cpn10多肽的免疫调节功能进行评估（也参见下面名称为“免疫抑制”的章节）。有技术的读者应当理解的是上述技术是示例性的，并且对于用于测量本发明Cpn10多肽的免疫调节功能水平（即免疫调节能力）的一种或多种具体方法不存在具体限制。

在某些实施方案中，与野生型Cpn10和/或Ala-Cpn10对这些PAMP和/或DAMP的结合亲和力相比较，本发明Cpn10多肽对PAMP和/或DAMP可以具有增加的结合亲和力。

该PAMP可以包括CpG基序。例如，该PAMP可以是细菌DNA。该PAMP可以是包括CpG寡脱氧核苷酸基序（CpG ODN）的一种寡核苷酸。在某些实施方案中，该CpG ODN基序是CPGA、CpGB以及CpGC中任何一项或多项。

在一些实施方案中，某些Cpn10N端变异体可以从本发明范围中排除。例如，人Cpn10N端变异体Cpn10Ala-Cpn10(SEQ ID NO:3)、GSM-Cpn10(SEQ ID NO:57)、Gly-Cpn10(SEQ ID NO:6)、

可以使用本领域已知方法来制造本发明的Cpn10多肽。例如，可以通过肽化学合成中使用的常规方法（例如固相肽合成、液相肽合成以及重组基因技术）来制造本发明的Cpn10多肽。应当理解的是本发明Cpn10多肽的氨基酸残基包括它们同分异构体（例如D型、L型和DL型）以及亚型中任何一项或全部。

可以通过固相化学技术（参见例如Steward et al.,(1963),in“Solid PhasePeptide Synthesis”,H.Freeman Co.,San Francisco;Meienhofer,(1973),in“Hormonal Proteins and Peptides”,volume 2,46）或通过经典的溶液合成（参见，例如Schroder et al.,(1965),in“The Peptides”,volume 1,72-75,Academic Press(New York)）来合成本发明的Cpn10多肽。通常地，这类方法包括将一个或多个氨基酸或适当保护的氨基酸添加到聚合物上逐渐增长的连续多肽链上。典型地，该第一氨基酸的氨基亦或羧基基团被适当的保护基团保护。然后，通过将下一个氨基酸添加到具有适当保护的互补（氨基或羧基）基团的序列中并且在适合形成酰胺键的条件下将保护的和/或衍生的氨基酸附连到惰性固体载体上亦或用于溶液中。然后可以将保护基团从新添加的氨基酸残基中移开并且再添加下一个氨基酸（适当保护的）用来形成逐渐增加的多肽链。

例如，可以通过用一种或多种蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C以及葡萄球菌V8-蛋白酶消化蛋白质或较大的多肽来生产本发明的Cpn10多肽。例如，可以通过高效液相色谱（HPLC）技术来纯化这些消化的肽片段。

另外地或可替代地，可以使用重组多肽生产技术来生产本发明的Cpn10多肽。重组多肽生产技术典型地可以涉及将对本发明Cpn10多肽进行编码的核酸克隆到质粒中用于随后在适当的微生物中过表达。用于构建表达载体或质粒的适当方法在例如标准文本（例如Sambrook etal.,(1989),“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,(2nd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York;以及,Ausubel etal.,(Eds),(2007),“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wileyand Sons,Inc）中进行详细说明。

适合于生产本发明Cpn10多肽的重组方法在例如标准文本（例如Coligan etal.,(Eds)(2007),“Current Protocols in Protein Science”,(Chapter 5),John Wileyand Sons,Inc.;以及Pharmacia Biotech.,(1994),“The Recombinant ProteinHandbook”,Pharmacia Biotech.）中进行详细说明。

可以用于生产本发明Cpn10多肽的常用表达系统包括例如细菌(例如，大肠杆菌)、酵母(例如，酿酒酵母、曲霉、巴斯德毕赤酵母)、病毒(例如，杆状病毒和牛痘苗)、细胞(例如，哺乳动物和昆虫)以及无细胞系统。可以使用的适当的无细胞系统包括但不限于真核的兔网织红细胞、麦胚提取系统、以及原核的大肠杆菌无细胞系统(参见例如，Madin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97:559-564(2000),Pelham and Jackson,Eur.J.Biochem.,67:247-256(1976);Roberts and Paterson,Proc.Natl.Acad.Sci.,70:2330-2334(1973);Zubay，Ann.Rev.Genet.,7:267(1973);Gold and Schweiger,Meth.Enzymol.,20:537(1971);Lesleyet al.,J.Biol.Chem.,266(4):2632-2638(1991);Baranov et al.,Gene,84:463-466(1989);以及Kudlicki et al.,Analyt.Biochem.,206:389-393(1992))。

使用本领域标准技术可以实现针对本发明Cpn10多肽的氨基酸序列的改变（例如生产出与本发明Cpn10多肽具有特定百分比序列一致性的多肽）。例如，通过使用核苷酸替换技术（这些技术包括在保持适当阅读框的前体条件下添加、缺失或取代核苷酸（保守的和/或非保守的））可以实现氨基酸改变。示例性技术包括随机诱变、定点诱变、寡核苷酸介导的或多核苷酸介导的诱变、通过使用现存的或工程化的限制性酶切位点缺失选择的一个或多个区域、以及聚合酶链式反应。为了本发明的目的测试修饰多肽的活性可以是通过本领域普通技术人员已知的多种技术中任何一项。

本发明Cpn10多肽的纯化可以使用本领域标准技术来实现，例如在Coliganet al.,(2007),“Current Protocols in Protein Science”,(Chapter 6),John Wiley andSons,Inc中说明的那些。例如，如果该多肽处于可溶状态，可以使用标准方法例如柱层析法将它分离。Cpn10polypeptides of the invention may be geneticallyengineered to contain various affinity tags or carrier proteins that aid purification.可以将本发明的Cpn10多肽基因工程化以便包含帮助纯化的各种亲和标签或载体蛋白。例如，使用工程化到包含对本发明多肽进行编码的核酸的一种表达载体中的组氨酸和蛋白标签可以有助于在天然亦或变性条件下通过例如金属螯合亲和层析(MCAC)进行纯化。为了大规模生产的目的，可以将纯化按比例放大。

可以使用本领域已知的标准技术来制造本发明的Cpn10核酸，像例如Sambrook et al.,(1989)“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,(2nd ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Plainview，New York;Itakura K.et al.,(1984),“Synthesis and use of synthetic oligonucleotides”,Annu.Rev.Biochem.53:323;Innis et al.,(Eds),(1990),“PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications”,Academic Press,New York;Innis and Gelfand,(Eds),(1995),“PCR Strategies”,Academic Press,New York;以及Innis and Gelfand,(Eds),(1999),“PCR MethodsManual”,Academic Press,New York中说明的那些。

例如，可以通过化学合成技术来制造本发明的Cpn10核酸，这些技术包括磷酸二酯和磷酸三酯方法（参见例如Narang et al.,(1979),“Improvedphosphotriester method for the synthesis of gene fragments”,Meth.Enzymol.68:90;Brown et al.,(1979),“Chemical Synthesis and Cloning of a Tyrosine tRNA Gene”,Meth.Enzymol.68:109-151;以及美国专利号4356270)或二乙基亚磷酰胺法(参见Beaucage and Caruthers,(1981),“Deoxynucleotide phosphoramidite”,Tetrahedron Letters,22:1859-1862）。用于在修饰的固体载体上合成寡核苷酸的方法在美国专利号4458066中进行说明。

本发明的Cpn10核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或互补脱氧核糖核酸(cDNA)。.可以从RNA聚合酶催化转录DNA序列得到RNA。该RNA可以是从转录对应的DNA序列得到的初级转录本。RNA还可以经历转录后加工。例如，初级RNA转录本可以经历转录后加工用来形成成熟RNA。信使RNA(mRNA)是指从可以由细胞翻译成蛋白的相应开放阅读框得到的RNA。cDNA是指与mRNA互补或从中得到的一种双链DNA。正义RNA是指RNA转录本，该转录本包括该mRNA并且从而可以被细胞翻译成蛋白。反义RNA是指一种RNA转录本，该转录本与目标初级转录本或mRNA的全部或部分互补，并且可以用于阻断目标基因的表达。

本领域普通技术人员应当理解的是可以使用遗传密码得到由给定的Cpn10DNA序列编码的RNA和cDNA序列。可以通过产生与特定DNA序列互补的一个序列从给定的DNA序列得到RNA序列。可以通过将DNA序列中每个胞嘧啶(‘C’)碱基转化成鸟嘌呤(‘G’)碱基，将DNA序列中每个鸟嘌呤(‘G’)碱基转化成胞嘧啶(‘C’)碱基，将DNA序列中每个胸腺嘧啶(‘T’)碱基转化成腺嘌呤(‘A’)碱基，并且将DNA序列中每个腺嘌呤(‘A’)碱基转化成尿嘧啶(‘U’)碱基来产生互补序列。

可以通过如上从DNA序列得到RNA序列，然后将该RNA序列转化成一个cDNA序列从而从该DNA序列得到互补DNA(cDNA)序列。可以通过将RNA序列中每个胞嘧啶(‘C’)碱基转化成鸟嘌呤(‘G’)碱基，将RNA序列中每个鸟嘌呤(‘G’)碱基转化成胞嘧啶(‘C’)碱基，将RNA序列中每个尿嘧啶(‘U’)碱基转化成腺嘌呤(‘A’)碱基，并且将RNA序列中每个腺嘌呤(‘A’)碱基转化成胸腺嘧啶(‘T’)碱基，而将RNA序列转化成cDNA序列。

在某些实施方案中，可以将本发明的Cpn10核酸克隆到载体中。该载体可以包括例如DNA、RNA或互补DNA(cDNA)序列。该载体可以是一种质粒载体、一种病毒载体、或适合插入外来序列、将它们引入细胞中并且表达引入序列的任何其他适当的载体。典型地，该载体是一种表达载体并且可以包括表达控制和处理序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、聚腺苷酸化信号以及转录终止序列。

本发明还考虑了被这类载体转化的宿主细胞。例如，可以将本发明的Cpn10核酸克隆到载体中，该载体被转化到细菌宿主细胞中像例如大肠杆菌。用于构建载体以及将它们转化到宿主细胞中的方法总体上是本领域已知的，并且在例如Sambrook et al.,(1989),“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York;以及,Ausubel et al.,(Eds)(2007),“Current Protocols inMolecular Biology”,John Wiley and Sons,Inc.中进行说明。

抗体

本发明还提供了“特异性地结合”到本发明Cpn10多肽上的抗体（“本发明的一种或多种抗体”）。

“特异性地结合”到本发明Cpn10多肽上的抗体是与它结合到不相关分子上（例如非靶向多肽）相比较能够以显著地更高的亲和力结合到该多肽上的一种抗体。因此，特异性地结合到本发明Cpn10多肽上的抗体是能够在该多肽与任何其他数量的潜在替代结合配偶子之间进行区别的一种抗体。因此，当暴露于多种不同的但是同等地可接近的作为潜在结合配偶体的分子时，对本发明Cpn10多肽具有特异性的抗体将选择性地结合到该多肽上并且其他替代的潜在结合配偶体将保持基本上不被该抗体结合。通常地，与不是目标多肽的其他潜在结合配偶体相比较，对本发明Cpn10多肽具有特异性的抗体将优选地至少10倍、优选50倍、更优选100倍、并且最优选大于100倍更频繁地结合到该多肽上。对本发明Cpn10多肽具有特异性的抗体有可能能够以微弱的但是可检出的水平结合到其他非靶向分子上。这通常称为背景结合并且例如通过使用适当的对照易于从多肽特异性结合中分辨出来。

有助于抗体结合到本发明Cpn10多肽上的反应条件(例如，抗体浓度，孵化时间，pH，温度等)将主要取决于所使用的抗体以及该特异性目标多肽，并且使用本领域已知的方法可以容易地确定(参见，例如,Ausubel et al.,(1994),“Current Protocols in Molecular Biology”,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork;Coligan et al.,(Eds),(2008),“Current protocols in Immunology”,John Wileyand Sons,Inc.;以及Bonifacino et al.,(Eds)(2007),“Current protocols in CellBiology”,John Wiley and Sons,Inc.)。

使用本领域已知的方法可以产生特异性结合到本发明Cpn10多肽上的抗体。

例如，使用Harlow and Lane(eds.),(1988),“Antibodies-A LaboratoryManual”,Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.中说明的杂交瘤技术，可以制备对本发明Cpn10多肽具有特异性的单克隆抗体（典型地包含Fab部分）。

实质地，在制备针对本发明Cpn10多肽的单克隆抗体中，可以使用任何技术，这些技术提供了通过连续细胞系生产抗体。这些包括最初由Kohler和同事开发的杂交瘤技术(参见Kohler et al.,(1975),“Continuous cultures of fused cellssecreting antibody of predefined specificity”,Nature,256:495-497)以及三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor et al.,(1983),“The Production ofMonoclonal Antibodies From Human Lymphocytes”,Immunology Today，4:72-79)、以及用于生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(参见Cole et al.,(1985),in“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”,77-96,Alan R.Liss,Inc.)。可以通过除了融合之外的技术例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用爱泼斯坦-巴尔病毒转染来产生无限增殖的生产抗体的细胞系（参见例如Schreier et al.,(1980),“Hybridoma Techniques”,Cold Spring Harbor Laboratory;Hammerling etal.,(1981),“Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas”,Elsevier/North-Holland Biochemical Press,Amsterdam;以及Kennett et al.,(1980),“Monoclonal Antibodies”,Plenum Press）。

总之，产生从中生产单克隆抗体的杂交瘤典型地涉及将骨髓瘤或其他自身延续细胞系与从哺乳动物脾脏中得到的淋巴细胞融合，该哺乳动物用其识别因子结合部分、或识别因子、或其来源特异性DNA结合部分进行超免疫。.通过它们与多肽中存在的抗原进行免疫反应的能力来鉴别生产对本发明多肽具有特异性的单克隆抗体的杂交瘤。

可以通过启动包括营养培养基的单克隆杂交瘤培养物来生产特异性地结合到本发明Cpn10多肽上的单克隆抗体，该营养培养基包括分泌具有适当抗原特异性抗体的杂交瘤。将培养物保持在多种条件下并且持续足以使杂交瘤将抗体分子分泌到培养基中的时间期间。然后收集包含抗体的培养基。然后可以使用已知技术进一步分离这些抗体分子。

类似地，存在可以用于生产多克隆抗体的本领域已知的多种操作。为了生产抗本发明Cpn10多肽的多克隆抗体，可以通过注射该多肽将多种宿主动物（包括但不限于兔、鸡、小鼠、大鼠、绵羊、山羊等）免疫。另外，可以将该多肽结合到免疫原性载体上（例如牛血清白蛋白(BSA)或钥孔戚血蓝蛋白(KLH)）。而且，可以使用多种佐剂（包括但不限于弗氏佐剂（完全的和不完全的）、无机凝胶类例如氢氧化铝，表面活性剂类例如溶血卵磷脂、复合多元醇类、聚阴离子类、肽类、油乳液类、钥孔戚血蓝蛋白类、二硝基苯酚、以及潜在有用的人类佐剂例如BCG（卡介苗）和短小棒状杆菌）来增加免疫应答。

还可以通过本领域已知的多种技术来实现对希望的抗体进行筛选。抗体免疫特异性结合适当的测定法包括但不限于放射性免疫测定、ELISA（酶联免疫吸附测定）、夹层免疫测定、免疫放射量测定、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、原位免疫测定、蛋白质印记、沉淀反应、凝集测定、补体结合测定、免疫荧光测定、蛋白A测定、免疫电泳测定等(参见，例如Ausubel et al.,(1994),“Current Protocols in Molecular Biology”,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork)。通过一抗上可检出标记可以检测抗体结合。可替代地，可以通过它与二抗或适当标记的试剂结合对抗体进行检测。用于检测免疫测定中结合事件的多种方法是本领域已知的，并且包括在本发明的范围内。

就得到适当数量的本发明抗体而言，人们可以用无血清培养基分配发酵来制造抗体。在发酵之后，可以通过多步骤操作（结合了层析法以及病毒失活/去除步骤）对抗体进行纯化。例如，首先可以通过蛋白A亲和层析法将抗体分离，并且然后用溶剂/洗涤剂进行处理从而将任何有脂类包膜的病毒失活。可以使用进一步纯化（典型地通过阴离子和阳离子交换层析法）来去除残留的蛋白、溶剂/洗涤剂以及核酸。纯化的抗体可以被进一步纯化并且使用凝胶过滤柱配制到0.9%盐水中。配制的批量制剂然后可以进行灭菌以及病毒过滤并且进行分配。

免疫抑制

本发明提供了用于抑制受试者体内免疫活化的方法。在某些实施方案中，这些方法包括向该受试者施用本发明的Cpn10多肽（或包括它的组合物）。在其他实施方案中，这些方法包括向该受试者施用本发明的Cpn10核酸（或包括它的组合物）。还提供了本发明的Cpn10多肽或者本发明的Cpn10核酸在制备用于抑制受试者体内免疫活化药物中的用途。

可以通过任何适当途径（包括但不限于胃肠外（例如静脉内、皮内、皮下或肌内）、粘膜（例如口腔或鼻内）或局部给药途径）将本发明的Cpn10多肽和本发明的Cpn10核酸施用到受试者体（例如人类受试者）内。

不受具体作用机理或方式的限制，应当理解的是与野生型Cpn10相比较，对野生型Cpn10多肽的N端结构域中一个或多个残基进行修饰为包括病原体相关分子模式（PAMP）的分子和/或包括损伤相关分子模式（DAMP）的宿主分子提供了增加的结合亲和力。因此，本发明Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用通常强于野生型Cpn10与相同分子之间的结合相互作用。优选地，本发明Cpn10多肽与包括PAMP或DAMP的分子之间的结合相互作用强于Ala-Cpn10与相同分子之间的结合相互作用。将包括PAMP或DAM的配体结合到模式识别受体(PRR)上引发了对于建立有效的先天免疫应答很重要的一系列事件。可以假定的是通过本发明的Cpn10多肽紧密地结合这些配体改变或防止了这些配体与它们的靶PRR之间的相互作用。这进而被认为抑制了由PRR信号传导（例如产生和分泌炎性分子）诱导的免疫活化的启动。

本发明的Cpn10多肽可以结合到从任何微生物得到的PAMP上。这类微生物的非限制性实例包括细菌、病毒、真菌、线虫、分支杆菌以及原生动物。

优选地，本发明的Cpn10多肽以高亲和力结合到基于核酸的PAMP上。

本发明Cpn10多肽可以结合到其上的基于核酸PAMP的非限制性实例包括含有未甲基化胞嘧啶磷酸鸟嘌呤(CgG)基序和从包括双链RNA，5'三磷酸盐ssRNA以及其他复制中间体的病毒中得到的PAMP的细菌DNA。

在优选实施方案中，本发明的Cpn10多肽以高亲和力结合到含有CpG基序的寡核苷酸上(CpG ODN)。

通常地，与野生型Cpn10结合到CpG ODN上相比较，本发明的Cpn10多肽以更高的亲和力结合到CpG ODN上。优选地，与Ala-Cpn10结合到CpGODN上相比较，本发明的Cpn10多肽以更高的亲和力结合到CpG ODN上。

在某些实施方案中，本发明的Cpn10多肽结合到与从微生物中得到的一个或多个PAMP具有结构、构象和/或序列同源性的宿主分子上（例如宿主蛋白、核酸或脂类）。

因此，本发明的Cpn10多肽可以结合到DAMP上。

优选地，本发明的Cpn10多肽以高亲和力结合到基于核酸的DAMP上，其非限制性实例包括细胞DNA和RNA以及免疫复合物。另外地或可替代地，本发明的Cpn10多肽以高亲和力结合到核苷酸和/或核苷DAMP上。

在优选实施方案中，本发明的Cpn10多肽以高亲和力结合到DNA DAMP上。

通常地，与野生型Cpn10结合到DNA DAMP上相比较，本发明的Cpn10多肽以更高的亲和力结合到DNA DAMP上。优选地，与Ala-Cpn10结合到DNA DAMP上相比较，本发明的Cpn10多肽以更高的亲和力结合到DNADAMP上。

通常本发明Cpn10多肽结合的PAMP或DAMP可以是模式识别受体(PRR)的配体。这类受体结合的PRR的非限制性实例包括toll样受体(TLR)、视黄酸可诱导的基因I样受体(RLRs)、核苷酸结合的寡聚结构域样受体(NLRs)、以及IFN调节因子的DNA依赖型活化剂(DAI)。

PRR可以表达在一个或多个免疫细胞类型上，其非限制性实例包括巨噬细胞、单核细胞、B淋巴细胞、肥大细胞、自然杀伤细胞、以及树突细胞(例如，骨髓树突细胞、类浆细胞树突细胞)。

在某些实施方案中，本发明Cpn10多肽结合的PAMP或DAMP是RLR受体的配体，其非限制性实例包括RIG-1和MDA5。

在其他实施方案中，本发明Cpn10多肽结合的PAMP或DAMP是NLR的配体，其非限制性实例包括NALP3炎性体和AIM2-炎性体。

在另外的实施方案中，本发明Cpn10多肽结合的PAMP或DAMP是Toll样受体的配体。该Toll样受体可以是选自下组，其构成为：TLR3、TLR7、TLR8或TLR9。在一个实施方案中，该TLR受体是TLR9。

根据在此提供的方法，可以施用本发明的Cpn10多肽和本发明的Cpn10核酸用来抑制受试者体内的免疫活化。

该受试者可以是任何动物种类的个体，包括但不限于以下属类的成员：羊（例如绵羊）、牛、马、猪、猫、犬、灵长类（如人类），以及啮齿动物。优选地，该受试者是一个人。

在某些实施方案中，这些方法进一步包括将一种免疫抑制剂施用到受试者体内。免疫抑制剂的非限制性实例包括抗炎性化合物类，支气管扩张药物化合物类，环孢霉素类，他克莫司，西罗莫司，吗替麦考酚酯，甲氨蝶呤，色甘酸酯类，茶碱，白细胞三烯拮抗剂，和抗组织胺剂，以及它们的组合。该免疫抑制剂还可以是一种免疫抑制药物或定向在B或T淋巴细胞上的特异性抗体、或介导它们活化的表面受体。例如，免疫抑制药物可以是环孢霉素，他克莫司，西罗莫司，吗替麦考酚酯，甲氨蝶呤，色甘酸酯，茶碱，白细胞三烯拮抗剂，以及抗组织胺剂，或它们的组合。

如上讨论的，应当理解的是本发明的Cpn10多肽结合到PRR的PAMP和DAMP（即配体）上改变了配体和受体之间的相互作用。

因此，将本发明的Cpn10多肽结合到作为PRR的促效剂的一种配体上可以降低该促效剂结合PRR的能力，并且因此阻碍了负责免疫活化的细胞信号级联的启动。

通过配体结合到吞噬细胞（例如巨噬细胞）上的细胞PRR上所引发的细胞信号级联可以诱导内吞作用和摧毁病原体。

通过配体结合到细胞PRR上所引发的细胞信号级联可以诱导产生和分泌炎性介质或抗炎性介质（例如细胞因子和趋化因子）。这些介质进而调节各种免疫细胞的活化和功能。

通常地，本发明的Cpn10多肽（和/或对其进行编码的本发明Cpn10核酸）抑制了它们施用于其中的受试者体内的免疫活化。

可以使用本领域已知的标准技术来确定本发明Cpn10多肽（和/或对其进行编码的本发明Cpn10核酸）抑制给定受试者体内免疫活化的能力。

例如，可以将从表达PRR的受试者体内得到的免疫细胞暴露于Cpn10多肽在体外与一种给定的PRR配体结合，并且产生和/或分泌炎性介质（例如细胞因子和趋化因子），然后使用标准测定法（例如ELISA）进行测量。

该炎性介质可以是一种促炎性细胞因子或趋化因子（如TNFα，IL-1，IL-4，IL-6，IL-8，IL-12，IL-17，IL-23，IFNα，IFNβ，IFNγ，RANTES等），化学介质（如白细胞三烯，组胺，血清素，前列腺素，CGRP，一氧化氮，缓激肽，溶酶体酶类，促凝血素，血小板活化因子（PAF），活性氧，一氧化氮），神经肽，生长因子或神经递质。该炎性介质可以是一种抗炎性细胞因子（如IL-4、IL-10、TGFβ）。

另外地或可替代地，在将免疫细胞暴露于本发明Cpn10多肽与给定的PRR配体结合之后，可以针对炎性介质和/或活化的细胞表面标志物体外确定（例如通过流式细胞术）细胞表面受体的表达。

使用本领域已知的标准测定法通过检测细胞信号（如TLR介导的NF-κΒ活化，1型干扰素的产生，酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸磷酸化，ADP核糖基化等）或补体的活化也可以测量细胞活化的程度。

有技能的读者应当理解的是上面提到的用于检测免疫活化的方法仅为了举例说明的目的来提供并且本领域已知的其他适当方法也在本发明的范围内。

治疗方法

本发明提供了用于治疗和/或预防与免疫活化相关的疾病和病症的方法，并且具体地是过度炎症和/或慢性炎症。这些方法包括施用本发明的Cpn10多肽和/或本发明的Cpn10核酸。这种多肽和/或核酸能够以一种组合物的形式（例如包括适当载体，稀释剂和/或载体的一种药物组合物）来施用。

不受具体作用机理或方式的限制，施用本发明的Cpn10多肽和/或本发明的Cpn10核酸（或包括它的组合物）被认为提供了抑制PRR介导的信号传导的手段，并且因此可以用来抑制受试者体内炎性介质的产生/分泌。许多疾病和病症与免疫系统的慢性炎症相关，并且因此施用本发明的Cpn10多肽和/或本发明的Cpn10核酸提供了预防和/或治疗这类疾病的一种手段。

在某些实施方案中，该方法进一步包括向受试者施用免疫抑制剂。免疫抑制剂的非限制性实例包括抗炎性化合物类，支气管扩张药物化合物类，环孢霉素类，他克莫司，西罗莫司，吗替麦考酚酯，甲氨蝶呤，色甘酸酯，茶碱，白细胞三烯拮抗剂，和抗组织胺剂，以及它们的组合。免疫抑制剂还可以是一种免疫抑制药物或定向在B或T淋巴细胞上的特异性抗体或介导它们活化的表面受体。例如，免疫抑制药物可以是环孢霉素，他克莫司，西罗莫司，吗替麦考酚酯，甲氨蝶呤，色甘酸酯类，茶碱，白细胞三烯拮抗剂，以及抗组织胺剂，或它们的组合。

根据本发明的方法所治疗的疾病可以是一种自身免疫性炎性疾病。这类疾病的非限制性实例包括类风湿性关节炎，炎症性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎），I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，幼年型糖尿病），慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，格雷夫斯病，骨性关节炎，II型胶原关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢疾病，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性神经炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，自身免疫性葡萄膜炎，银屑病，斯耶格伦病，肉样瘤病，皮肌炎，白细胞分裂性血管炎，重症肌无力，变应性脑脊髓炎，甲状腺毒症，恶性贫血，风湿性多肌痛以及多发性肌炎。

根据本发明的方法所治疗的疾病可以是一种非自身免疫性炎性疾病。这类疾病的非限制性实例包括慢性阻塞性肺病（COPD），肠漏症，心血管疾病（如充血性心脏病），变态反应（如过敏反应，药物反应，皮肤变态反应，湿疹，过敏性鼻炎，荨麻疹，特异性皮炎，过敏性接触性变态反应，食物变态反应，过敏性结膜炎，昆虫毒液过敏症），哮喘，急性呼吸窘迫综合征（ARDS），动脉硬化以及传染性疾病。

另外地或可替代地，根据本发明的方法所治疗的疾病可以是移植物抗宿主疾病（GVHD）。

根据本发明的方法所治疗的受试者可以是任何哺乳动物物种的个体，包括但不限于下面属类的成员：羊（如绵羊）、牛、马、猪、猫、犬、灵长类（如人类）、以及啮齿动物。优选地，该受试者是一个人。

该受试者可以患有或怀疑患有一种疾病（如炎性疾病）。可替代地，该受试者可以具有或怀疑具有发展一种疾病（如炎性疾病）的易感性。

可以通过任何适当途径（包括但不限于胃肠外（如静脉，皮内，皮下或肌内注射），粘膜（如口腔或鼻内）或局部给药路径）将该多肽或核酸施用到受试者体内（例如，一个人类受试者）。

在某些实施方案中，本发明提供了本发明Cpn10多肽和/或本发明Cpn10核酸在制备用于治疗疾病药品中的用途。

这种疾病可以是一种自身免疫性炎性疾病。这类疾病的非限制性实例包括类风湿性关节炎，炎症性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎），I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，幼年型糖尿病），慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，格雷夫斯病，骨性关节炎，II型胶原关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢疾病，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性神经炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，自身免疫性葡萄膜炎，银屑病，斯耶格伦病，肉样瘤病，皮肌炎，白细胞分裂性血管炎，重症肌无力，变应性脑脊髓炎，甲状腺毒症，恶性贫血，风湿性多肌痛以及多发性肌炎。

这种疾病可以是一种非自身免疫性炎性疾病。这类疾病的非限制性实例包括慢性阻塞性肺病（COPD），传染性疾病，肠漏症，心血管疾病（如充血性心脏病），变态反应（如过敏反应，药物反应，皮肤变态反应，湿疹，过敏性鼻炎，荨麻疹，特异性皮炎，过敏性接触性变态反应，食物变态反应，过敏性结膜炎，昆虫毒液过敏症），哮喘，急性呼吸窘迫综合征（ARDS），以及动脉硬化和传染性疾病。

另外地或可替代地，根据本发明的方法所治疗的疾病可以是移植物性抗宿主疾病（GVHD）。

本发明的cpn10多肽能够以组合物的形式施用到一名受试者体内。通常地，根据本发明的方法适合使用的组合物可以根据本领域普通技术人员已知的方法来制备，并且可以包括药学上可接受的载体，稀释剂和/或佐剂。本发明的组合物可以制备成包括本发明的Cpn10多肽，或两种或更多种不同的本发明Cpn10多肽的组合。这类组合物可以包括在药用组合物中，这些组合物包括一种药学上可接受的载体、佐剂和/或稀释剂。本发明的组合物可以包括一种免疫抑制剂。

本发明的实施方案还考虑了施用本发明的Cpn10核酸。.在这类情况下，本发明的Cpn10核酸（例如DNA和cDNA）典型地可操作地连接到一个启动子上从而在将该核酸施用到受试者体内之后产生适当的多肽序列。可以将该核酸以载体形式施用到受试者体内。该载体可以是一种质粒载体、一种病毒载体、或适合插入外来序列，将它们引入真核细胞中并且表达这些引入序列的任何其他适当的运载体。有待施用的核酸构建体可以包括裸DNA或cDNA或可以处于组合物形式，连同一种或多种药学上可接受的载体一起。

典型地，该载体是一种真核表达载体并且可以包括表达控制和处理序列例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号和转录终止序列。使用本领域已知的多种基因递送方法可以增加受试者免疫细胞中对本发明Cpn10多肽进行编码的核酸表达。例如可以将可操作地连接到一个表达控制序列（例如一个可诱导的启动子）上包括对本发明Cpn10多肽进行编码的核酸序列的表达载体施用到受试者体内用来增加该多肽的生产。可替代地，可以将包括对本发明Cpn10多肽进行编码的核酸序列的病毒载体（例如逆转录病毒载体和腺病毒载体）施用到受试者体内用来引起所述蛋白的生产。

递送对本发明Cpn10多肽进行编码的核酸还可以通过下面各项来实现：从受试者体内提取细胞，施用包含感兴趣核酸的载体，并且然后将这些细胞再引入到受试者体内。

在此提供的用于预防或治疗疾病方法的疗效可以使用标准技术来确定。

为了治疗应用，这种确定通常将依赖于建立该疾病是否在所治疗的受试者体内被治愈或至少部分地被阻止。

对于预防性应用，这种确定通常将依赖于建立在治疗后相关时间期间内该受试者是否发展了该疾病。

通过针对所讨论疾病的症状和表现对受试者进行临床检查来建立这些因素。另外地或可替代地，可以进行诊断测定来检测疾病的指示物，或发展所讨论疾病的可能性。

筛选免疫抑制剂

本发明的Cpn10N端结构域变异体还可以用于筛选测定，用来针对其活性对促效剂进行鉴别。由于增强了对本发明变异体介导的PRR信号传导的抑制作用，这些促效剂通常可以是PRR信号的拮抗剂。

结合到本发明Cpn10多肽上的化合物有可能能够增强它们的活性。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了针对结合到本发明Cpn10多肽上的试剂进行筛选的多种方法。该方法包括在适合于一种候选剂与多肽之间发生结合的条件下使这种多肽与该候选剂接触，并且确定该试剂是否结合到这种多肽上。

结合到本发明Cpn10核酸上的化合物有可能能够增强它们的活性。

因此，在某些实施方案中，本发明提供了针对结合到本发明Cpn10核酸上的试剂进行筛选的多种方法。该方法包括在适合于一种候选剂与核酸之间发生结合的条件下使该核酸与该候选剂接触，并且确定该试剂是否结合到该核酸上。

应该理解的是将一种候选剂“结合”到本发明的Cpn10多肽或本发明的Cpn10核酸上包括直接结合、间接结合（例如，通过一个或多个中间分子）、部分结合、完全结合、瞬时/暂时结合以及稳定/持久结合。

特别地，希望的试剂是能够结合到本发明Cpn10多肽和/或本发明Cpn10核酸上并且增强它们活性的候选剂。

用于本发明筛选方法中的候选剂可以从任何来源得到。

例如，该候选剂可以是自然发生的或合成的。

通过本领域普通技术人员已知的多种技术可以产生潜在的候选剂用于本发明多种方法中进行筛选。例如可以使用多种方法如X射线晶体学和核磁共振光谱学来对本发明Cpn10多肽以及本发明Cpn10核酸的结构建模，因此有助于使用基于计算机的建模方法来设计潜在的免疫抑制剂。还可以使用不同形式的组合化学来产生推定的候选剂。

候选剂可以具有任何分子量，例如，至少约100、200、300、400、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、7000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或100000道尔顿。

候选剂可以是任何化合物，其非限制性实例包括氨基酸类、核酸类、肽核酸类、脂类、多肽类、糖类、以及核苷类。其他的非限制性实例包括模拟肽类（如类肽类）、氨基酸类似物类、多核苷酸类、多核苷酸类似物类、核苷酸类、核苷酸类似物类、代谢物类、代谢类似物类、以及有机或无机化合物类（包括异质有机化合物和有机金属化合物类）。

在某些实施方案中，使用高通量方法来筛选化学品的大型文库。可以产生或从商业来源购买候选化合物的这类文库。例如，一个文库可以包括10,000、50,000、或100,000或更多独特的化合物。仅通过举例，一个文库可以由包括下面各项的杂环来构建：苯并咪唑类、苯并噻唑类、苯并恶唑类、呋喃类、咪唑类、吲哚类、吗啉类、萘类、哌啶类、吡唑类、吡啶类、嘧啶类、吡咯烷类、吡咯类、喹啉类、噻唑类、噻吩类、以及三嗪类。文库可以包括一个或多个种类的化学品，例如Carrell et al.,(1994),Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2059;Carell et al.,(1994),Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33:2061;Cho et al.,(1993),Science 261:1303-1305;DeWitt et al.,(1993),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:6909-6913;Erb et al.,(1994),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11422-11426;Gallop et al.,(1994),J.Med.Chem.37:1233-1251;以及Zuckermann et al.,(1994),J.Med.Chem.37:2678-2685中说明的那些。

本发明的筛选方法涉及使该候选剂与本发明的Cpn10多肽或本发明的Cpn10核酸接触。

可以通过多种适当的方法来确定与本发明Cpn10多肽和/或本发明Cpn10核酸结合或者另外地相互作用的试剂，并且具体地是增强它们活性的试剂。非限制性方法包括双杂交方法、共免疫沉淀、亲和纯化、质谱、串联亲和纯化、噬菌体展示、标签转移、DNA微阵列/基因共表达以及蛋白质微阵列。

例如，可以使用双杂交测定法来确定候选剂是否与本发明Cpn10多肽相互作用或结合。酵母双杂交测定系统是典型地用于检测蛋白-蛋白相互作用的一种基于酵母的遗传测定（参见，例如Fields and Song,(1989),Nature,340:245-246）。这种测定法使用转录激活剂的多重结构域性质。例如，可以将已知转录活化剂的DNA结合域融合到本发明的Cpn10多肽上并且将该转录活化剂的活化域融合到该候选剂上。候选剂与多肽之间的相互作用将使转录活化剂的DNA结合和活化域紧密接近。随后通过转录活化剂活化特定报告基因的转录允许对相互作用进行检测。

在上述技术的一个改进中，可以通过将本发明的Cpn10多肽融合到一个可检测出的标记（如碱性磷酸酶）上并且使用如Flanagan和Leder (Flanagan andLeder,(1990),Cell,63:185–194)说明的免疫沉淀的一种改进形式来构建一种融合蛋白。

另外地或可替代地，可以使用共免疫沉淀来确定候选剂是否与本发明Cpn10多肽相互作用或结合。使用这种技术，可以在适合用于保存蛋白-蛋白相互作用的非变性条件下将外周血单核细胞样品溶解。然后可以将得到的溶液与对本发明Cpn10多肽具有特异性的一种抗体一起孵化并且例如通过用附连到固体载体上的抗体结合蛋白进行捕获而从总体溶液中免疫沉淀。通过这种方法将多肽免疫沉淀有助于试剂连同该多肽共免疫沉淀。可以使用本领域已知的多种方法来建立对相关试剂的鉴别，包括但不限于SDS-PAGE、蛋白质印迹法、以及质谱法。

另外地或者可替代地，可以使用噬菌体展示法来确定候选剂是否与本发明的Cpn10多肽相互接触或结合。噬菌体展示是通过将来自基因库的多个基因结合到噬菌体中来针对蛋白质相互作用进行筛选的一种测试。在这种方法下，使用重组DNA技术以与噬菌体外壳蛋白融合的形式来表达多种基因从而使得每个基因的多肽产物都展示在病毒颗粒表面上。这样可以产生感兴趣的噬菌体展示多肽产物的全文库。然后可以针对结合到本发明Cpn10多肽上的能力对得到的噬菌体展示多肽产物的文库进行筛选。从相互作用的噬菌体中提取的DNA包含相互作用多肽的序列。

另外地或可替代地，可以使用亲和层析来确定候选剂是否与本发明Cpn10多肽相互作用或结合。例如，可以将本发明的Cpn10多肽固定在载体上（例如琼脂糖）并且将细胞裂解液通过该柱子。然后可以将结合到固定的本发明Cpn10多肽上的蛋白从柱上洗脱下来并且例如通过N端氨基酸测序进行鉴别。

可以通过本领域已知的多种方法来鉴别与本发明Cpn10核酸结合或另外地相互作用的试剂，并且具体地是调节它们活性的试剂，这些方法的非限制性实例包括电泳、凝胶迁移测定、表面等离子共振ATP酶测定、圆二色、质谱、以及核磁共振。在美国专利号5726014中对用于检测DNA结合分子的筛选测定的一个特定实例进行了说明。

本发明的Cpn10多肽和本发明的Cpn 10核酸可以用于高通量筛选用来针对结合到其上或另外地与其相互作用的能力对候选剂进行测定。可以针对功能性多肽和核酸对这些候选化合物进行进一步筛选用来确定试剂对活性的影响。

本发明还考虑了通过改变多肽表达可以增强本发明Cpn10多肽活性的多种化合物的鉴别。在这种情况下，通过将存在候选化合物时多肽的表达水平与不存在候选化合物时的表达说明进行比较，可以鉴别这类化合物。

例如，可以通过使免疫细胞的样品（如外周血单核细胞）与多肽和试剂在PRR配体存在下相接触，可以对鉴别为被特定候选剂结合的本发明Cpn10多肽的活性进行评估。然后，可以使用本领域已知的方法对细胞中诱导的PRR介导信号的程度进行评估。适当的方法包括但不限于在上述名称为“免疫抑制”的章节中说明的那些。例如，可以通过测量炎性介质（如细胞因子和趋化因子）的生产和/或分泌，测量炎症介质细胞表面受体或活化的其他细胞表面标志的表达、检测指示活化的细胞信号（如TLR介导的NF-κΒ活化，1型干扰素产生，酪氨酸或丝氨酸/苏氨酸磷酸化，ADP的核糖基化等），和/或检测补体系统的活化来评估细胞中诱导的PRR介导信号的程度。

例如，通过测量当暴露于特定候选剂时编码多肽的生产，可以对鉴别为被该候选剂结合的本发明Cpn10核酸的活性进行评估。例如，这可以使用能够检测和/或定量蛋白质的任何技术来实现。适当的方法是本领域已知的，并且包括，例如，免疫组织化学、SDS-PAGE、免疫测定、蛋白质组学等。另外地或可替代地，可以使用多种技术来测量在所鉴别试剂存在下核酸的转录水平，包括，例如转录定量聚合酶链式反应（RT-PCR）。

应该理解的是上述技术仅仅是可以用来鉴别能够与本发明Cpn10多肽和/或本发明Cpn10核酸相互作用或增强其活性的多种试剂的方法类型的实例。其他适合的方法应是本领域普通技术人员已知的，并且在本发明范围内。

使用上述方法，可以鉴别一种试剂是本发明Cpn10多肽或本发明Cpn10核酸的促效剂。作为促效剂的试剂增强了多肽或核酸的一种或多种生物活性。优选地，通过促效剂增强的生物活性将该多肽结合到PRR配体上。

用于产生抗体的方法是本领域已知的，并且在上述名称为“抗体”的章节中进行说明。

组合物

本发明提供了多种组合物，这些组合物包括本发明的一种或多种Cpn10多肽和/或本发明的一种或多种Cpn10核酸。本发明的组合物可以包括本发明的一种或多种抗体。

本发明的组合物可以包括一种药学上可接受的载体，佐剂和/或稀释剂。就与该组合物其他成分相容而言，这些载体、稀释剂和佐剂必须是“可接受的”，并且对其受体是无害的。药学上可接受的载体或稀释剂的非限制性实例是去脱矿质水或蒸馏水；盐水溶液；基于植物的油类，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油；麻油，如花生油、红花油、橄榄油、棉籽油、玉米油、麻油，花生油或椰子油；硅油类，包括聚硅氧烷类，如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷和甲基苯基聚硅氧烷；挥发性有机硅类；矿物油类，如液体石蜡、软石蜡或角鲨烷；纤维素衍生物类，如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素；低级链烷醇类，例如乙醇或异丙醇；低级芳烷醇类；低级聚亚烷基乙二醇类或低级烷撑二醇类，例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇或甘油；脂肪酸脂类，例如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯；聚乙烯吡咯烷酮；琼脂；黄蓍树胶或阿拉伯树胶以及矿脂。典型地，该一种或多种载体可以由按重量计10%至99.9%的这些组合物形成。

另外地或可替代地，本发明的组合物可以包括一种免疫抑制剂，其非限制性实例包括抗炎性化合物类、支气管扩张药化合物类、环孢霉菌类、他克莫司、西罗莫司、吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤、色甘酸酯类、茶碱、白细胞三烯拮抗剂、和抗组织胺剂、以及它们的组合。这种免疫抑制剂还可以是一种免疫抑制药物或定向在B或T淋巴细胞上的特异性抗体、或介导它们活化的表面受体。例如，该免疫抑制药物可以是环孢霉素、他克莫司、西罗莫司、吗替麦考酚酯、甲氨蝶呤、色甘酸酯类、茶碱、白细胞三烯拮抗剂、以及抗组织胺剂，或者它们的组合。

另外地或可替代地，本发明的组合物可以包括一种佐剂。任何适合的佐剂可以包括在本发明的疫苗中。例如，可以利用铝基佐剂。适当的铝基佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝以及它们的组合。在欧洲专利号1216053和美国专利号6372223中对可以利用的铝基佐剂的其他具体实例进行说明。

可以将水包油乳液作为佐剂用于本发明的组合物和疫苗中。水包油乳液是本领域中熟知的。通常地，该水包油组合物可以包括一种可代谢的油，例如鱼油、植物油、或合成油。适合的水包油乳液的实例包括在欧洲专利号0399843、美国专利号7029678和PCT公开号WO 2007/006939中说明的那些。这种水包油乳液可以与其他佐剂和/或免疫兴奋剂一起使用。

其他适合佐剂的非限制性实例包括免疫兴奋剂类，如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），单磷酰脂质A（MPL），霍乱毒素（CT）或它的组成亚基，不耐热肠毒素（LT）或它的组成亚基，toll样受体配体佐剂类如脂多糖（LPS）及其衍生物类（如单磷酰脂质A和3-脱酰的单磷酰脂质），胞壁酰二肽（MDP）以及呼吸道合胞病毒的F蛋白（RSV）。

另外地或者可替代地，本发明的组合物可以包括一种类固醇，例如皮质类固醇。

本发明的组合物可以处于适合注射给药的形式、适合口服吞咽配制品的形式（像例如胶囊、片剂、胶囊形片剂、酏剂）、适合局部给药的软膏、乳膏或洗液的形式、适合作为滴眼液递送的形式、适合吸入给药的气溶胶形式（例如通过鼻内吸入或口部吸入）、或适合肠胃外给药的形式（即皮下注射，肌内注射或静脉注射）。

对于以可注射的溶液或悬浮液形式给药而言，无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载体可以包括林格式溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇以及1,2-丙二醇。

用于口服使用的适当载体、稀释剂、赋形剂以及佐剂的一些实例包括花生油、液体石蜡、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、海藻酸钠、阿拉伯树胶、黄芪胶、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、明胶以及卵磷脂。此外，这些口服配制品可以包括适当的调味剂和着色剂。当以胶囊形式使用时，这些胶囊可以涂覆有多种化合物，例如延缓崩解的单硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯。

佐剂典型地包括软化剂、乳化剂、增稠剂、防腐剂、杀细菌剂以及缓冲剂。

用于口服给药的固体形式可以包含人类以及兽医药物实践中可接受的粘合剂、增甜剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、涂层剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。适当的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄芪胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。适当的增甜剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。适当的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、藻酸或琼脂。适当的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。适当的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、桔子或覆盆子调味料。适当的包衣剂包括下面各项的聚合物或共聚物：丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或它们的酯类、蜡类、脂肪醇类、玉米素、虫胶或面筋。适当的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、抗坏血酸、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、或亚硫酸氢钠。适当的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石。适当的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。

用于口服给药的液体形式除了上述试剂之外可以包括一种液体载体。适当的液体载体包括水，油类例如橄榄油、花生油、麻油、向日葵油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇类、甘油三酯类或它们的混合物。

用于口服给药的悬浮液可以进一步包括分散剂和/或悬浮剂。适当的悬浮剂包括羧基甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰基醇。适当的分散剂包括卵磷脂、脂肪酸例如硬脂酸的聚氧乙烯酯类、聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等。

用于口服给药的乳液可以进一步包括一种或多种乳化剂。适当的乳化剂包括如上举例说明的分散剂或天然胶质例如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。

用于制备可胃肠外给药组合物的方法对于本领域普通技术人员是清楚的并且在例如Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack PublishingCompany，Easton,Pa中进行更详细说明。

本发明局部配制品可以包括一种活性成分连同一种或多种可接受的载体，以及任选地任何其他治疗性成分一起。适合于局部给药的配制品包括适合穿透皮肤达到需要治疗位点的液体或半液体制剂，例如擦剂、洗液、乳膏、软膏或糊剂，以及适合对眼、耳或鼻给药的液滴。

根据本发明的液滴可以包括无菌水性或油性溶液或悬浮液。可以通过将活性成分溶于包括下面各项的水溶液中来制备这些：杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他适当的防腐剂，并且任选地包括一种表面活性剂。然后得到的溶液可以通过过滤来澄清，转移到一个适当容器中，并且进行灭菌。通过高压处理或在90°C-100°C下维持半小时，或通过过滤可以实现灭菌，紧接着通过无菌技术转移到一个容器中。适合用于包括在液滴中的杀细菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或乙酸苯汞(0.002%)、氯化苄烷铵(0.01%)以及氯己啶乙酸盐(0.01%)。用于制备油性溶液的适当溶剂包括甘油、稀醇、以及丙二醇。

根据本发明的洗液包括适合应用到皮肤或眼睛上的那些。洗眼液可以包括任选地含有杀细菌剂的无菌水溶液并且可以通过类似于上述与制备液滴相关的那些的方法来制备。应用到皮肤上的洗液或擦剂还可以包括用于快速干燥以及用于冷却皮肤的一种试剂（例如醇或丙酮），和/或一种保湿剂（例如甘油），或油（例如蓖麻油或花生油）。

根据本发明的乳膏、软膏或糊剂是用于外部使用的活性成分的半固体配制品。可以通过将处于精细分散的或粉末形式的单独地或处于一种水性或非水性流体中溶液或悬浮液中的活性成分与一种脂样或非脂样基底混合中来制造它们。这种基底可以包括多种烃类例如硬、软或液体石蜡、甘油、蜂蜡、一种金属皂；一种粘液；一种天然来源的油例如杏仁、玉米、花生、蓖麻或橄榄油，羊毛脂或它的衍生物，或一种脂肪酸例如硬脂酸或油酸，连同一种醇例如丙二醇或聚乙二醇一起。

本发明的组合物可以结合任何适当的表面活性剂例如阴离子型、阳离子型或非离子型表面活性剂例如脱水山梨醇酯或它的聚氧乙烯衍生物。还可以包括多种悬浮剂例如天然胶质类，纤维素衍生物类或无机材料类例如硅质硅酸盐类，以及其他成分例如羊毛脂。

本发明的组合物能够以脂质体形式给药。脂质体通常是从磷脂类或其他脂类物质中得到，并且通过分散在水性介质中单层或多层水合液晶而形成。可以使用能够形成脂质体的任何无毒的，生理学可接受的并且可代谢的脂类。处于脂质体形式的组合物可以包含多种稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是磷脂类以及磷脂酰胆碱类(卵磷脂)（天然的和合成的两者）。用于形成脂质体的方法是本领域已知的，并且与此相关联具体参考Prescott,(Ed),(1976),“MethodsinCell Biology”,Volume XIV，Academic Press,New York,N.Y.p.33et seq。

可以将这些组合物结合到聚乙二醇(PEG)衍生物的一个阵列上。将PEG添加到蛋白上(聚乙二醇化)是用于降低蛋白血浆清除率的一种良好建立的方法，由此增加了它们的疗效(Nucci et al.,1991,Adv.Drug Del.Rev.6:133)。.聚乙二醇化作用另外的益处可以包括蛋白质更高的稳定性，降低的免疫原性，增强的溶解性，以及降低的对蛋白水解的敏感性(Sheffield W.2001,Curr Drug TargetsCardiovasc Haematol Disord.1：1-22)。.PEG分子包含基本的重复结构-(OCH3CH2)n-OH并且根据它们的分子量分类成多个组。将PEG衍生物结合到蛋白上用来增加它们的流体动力学半径并且通常地它们半衰期的增加直接地与附连的PEG链的大小相关联(Sheffield W.2001,Curr Drug TargetsCardiovasc Haematol Disord.1:1-22)。

这些组合物还能够以微颗粒形式给药。由聚丙交酯(PLA)、聚丙交酯-共聚-乙交酯(PLGA)、以及ε-己内酯(ε-己内酯)形成的生物可降解的微颗粒已经广泛地用作药物载体用来增加血浆半衰期并且由此延长疗效(R.Kumar,M.,2000,J Pharm Pharmaceut Sci.3(2)234-258)。已经配制了多种微颗粒用于递送一定范围的药物候选物包括疫苗类、抗生素类、以及DNA。此外，这些配制品已经开发出多种给药途径，包括胃肠外皮下注射、静脉注射以及吸入。

这些组合物可以结合一种控制释放的基质，该基质由乙酸异丁酸蔗糖酯(SAIB)和有机溶剂或有机溶剂混合物组成。可以将聚合物添加剂作为释放修饰剂添加到运载体中用于进一步增加粘度以及降低释放速率。SAIB是一种熟知的食品添加剂。它是一种非常疏水性的完全酯化的蔗糖衍生物（标称比率为6个异丁酸酯对2个乙酸酯基团）。作为一种混合酯，SAIB不结晶但是以清洁的粘性液体形式存在。将SAIB与一种药学上接受的有机溶剂例如乙醇或苄醇混合充分降低了混合物粘度以便允许注射。可以将活性药物成分添加到该SAIB递送运载体中从而形成SAIB溶液或悬浮液配制品。当将该配制品皮下注射时，该溶剂从基质中扩散，这允许SAIB-药物或SAIB-药物-聚合物混合物作为原位形成的仓库得以建立。

为了本发明的目的，可以将这些分子和试剂作为组合物治疗地亦或预防地施用到受试者体内。例如，本发明的组合物可以作为疫苗（例如预防性疫苗或治疗性疫苗）来施用。在治疗应用中，将这些组合物以足以治疗或至少部分阻止该疾病或其并发症的数量施用到已经患有疾病的病人体内。该组合物可以提供足以有效治疗该病人的大量分子或试剂。

本发明的实施方案还考虑了施用本发明的Cpn10核酸。在这类情况下，该核酸典型地可操作地连接到一个启动子上从而在将该核酸施用到受试者体内之后产生了适当的多肽序列。可以将核酸以载体形式施用到受试者体内。该载体可以是质粒载体、病毒载体，或者适合插入外来序列，将它们引入真核细胞中并且表达所引入序列的任何其他适当的运载体。典型地，该载体是一种真核表达载体，并可以包括表达控制和处理序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、多腺苷酸化信号以及转录终止序列。有待施用的核酸构建体可以包括裸DNA或者可以处于组合物的形式，连同一种或多种药学上可接受的载体一起。

给药途径

可以通过任何适当途径（包括但不限于胃肠外（例如静脉内、皮内、皮下或肌内）粘膜（例如口腔或鼻内）或局部给药途径）来实现将本发明Cpn10多肽、本发明Cpn10核酸、本发明组合物、或本发明抗体施用到受试者体内。

因此，能够以下面各项来施用该多肽、核酸、抗体或组合物：以适合注射给药的方式、以适合口服吞咽配制品的方（像例如，胶囊、片剂、胶囊形化片剂、酏剂）式、以适合局部给药的软膏、乳膏、洗液的形式、以适合作为滴眼剂给药的形式、以适合吸入给药的气溶胶形式（例如通过鼻内吸入或口腔吸入）、或以适合胃肠外给药的形式（即皮下、肌内或静脉注射）。

用于鼻内给药的配制品能够以下面各项的形式提供：冷冻干燥的粉末形式、作为滴鼻剂、喷雾剂、或适合吸入的液体形式、粉末形式、乳膏形式、或乳液形式。

在一个实施方案中，根据本发明的方法以口服形式提供该多肽、核酸、抗体或组合物用于施用到受试者体内。口服给药可以辅助多种治疗方法，这些方法被设计成反复诱导对存在于与一种或多种致病菌蛋白具有序列同源性的自身蛋白中一种或多种抗原的耐受性。

可以治疗地或预防地将该多肽、核酸、抗体或组合物施用到受试者体内。

在治疗应用中，将该多肽、核酸、抗体或组合物以足以治疗或至少部分地阻止该疾病及其并发症的数量施用到已经患有疾病（例如一种炎性疾病）的受试者体内。典型地，在治疗应用中，该治疗可以是用于该疾病状态或病症的期间。

在预防性应用中，将该多肽、核酸、抗体或组合物施用到在给药时未患有疾病的受试者体内。

针对任何特定受试者的治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括：所治疗的疾病和该疾病的严重性；所使用的化合物或试剂的活性；所使用的组合物；受试者的年龄、体重、身体状况、性别、以及饮食；给药时间；给药途径；该多肽、核酸、抗体或组合物的固持速率；治疗的持续时间；与该治疗联合或同时使用的药物，连同本领域已知的其他相关因子一起。

另外，本领域普通技术人员应当理解的是可以通过所治疗疾病的性质和程度、给药的形式、途径以及位点、以及所治疗的具体受试者的本性来确定单独剂量的最佳数量和间隔。

本领域普通技术人员通过常规实验将能够确定有效地预防或治疗可适用的自身免疫疾病所需要的该多肽、核酸、抗体或组合物的有效的无毒的数量。

例如，与适当的测试步骤相结合可以从施用连续稀释的制剂来得到最佳剂量，该制剂包括该多肽、核酸、抗体或组合物。

另外地或可替代地，可以设计出包括各种不同剂量和剂量频率的基质并且用于实验受试者的一个或多个组上用来确定最佳剂量。

通常地，有效剂量预期在下面各项的范围内：约0.0001mg至约1000mg活性剂/kg体重/24小时；典型地，约0.001mg至约750mg活性剂/kg体重/24小时；约0.0lmg至约500mg活性剂/kg体重/24小时；约0.lmg至约500mg活性剂/kg体重/24小时；约0.lmg至约250mg活性剂/kg体重/24小时；或约1.0mg至约250mg活性剂/kg体重/24小时。

更具体地，有效剂量范围预期在下面各项范围内：约1.0mg至约200mg活性剂/kg体重/24小时；约1.0mg至约100mg活性剂/kg体重/24小时；约1.0mg至约50mg活性剂/kg体重/24小时；约l.0mg至约25mg活性剂/kg体重/24小时；约5.0mg至约50mg活性剂/kg体重/24小时；约5.0mg至约20mg活性剂/kg体重/24小时；或约5.0mg至约15mg活性剂/kg体重/24小时。

可替代地，有效剂量可以是在每周两次约0.1mg活性成分/kg体重至约2mg活性成分/kg体重的范围内。

可替代地，有效剂量可以是高达约500mg/m²。通常地，有效剂量预期在下面各项的范围内：约25至约500mg/m²、优选地约25至约350mg/m²、更优选地约25至约300mg/m²、又更优选地约25至约250mg/m²、甚至更优选地约50至约250mg/m²、并且还甚至更优选地约75至约150mg/m²。

本领域普通技术人员应当理解的是可以如具体实施方案中所示对本发明进行多种改变和/或变更而不偏离如广义说明的本发明的精神或范围。因此在所有方面本发明的实施方案应当认为是说明性的并且不是限制性的。

实例

现在参考具体实例将对本发明进行说明，这些实例不应解释为以任何形式进行限制

实例1Cpn10多肽的生产

为了进一步限定本发明Cpn10多肽的生产过程，提供下面这些非限制性实例。

用转化到大肠杆菌株XL1-Blue(Stratagene)中的热诱导型表达质粒亦或转化到大肠杆菌株BL21(DE3)(Invitrogen)中的IPTG诱导型表达质粒pET30KanR以及pET23AmpR(Novagen)来实现具有或不具有修饰的人Cpn10的表达。

利用热诱导型表达质粒，生产出Cpn10并且通过一次通过在pH8下平衡的一个Macro-Prep High Q(BioRad)柱纯化到>90%纯度（基本上如Ryan等人(1995,J Biol Chem 270:22037-22043)中所述）。然后通过S-Sepharose并且随后进行凝胶过滤(Superdex 200,Amersham Biosciences)层析对包含Cpn10的未结合物质进行进一步纯化。按照生产厂家的说明书(Pall Corporation,AnnArbor,MI.Cat No.MSTG5E3)将处于50mM Tris-HCl(pH 7.6)和150mM NaCl中纯化的Cpn10过滤通过具有0.2mm Mustang E薄膜的Acrodisc用来去除残留的内毒素并且保存在-80°C下。

利用IPTG诱导型表达质粒，使细胞生长在含有适当抗生素(100μg/ml Amp和50μg/ml Kan)的LB中直至OD600nm达到0.5，然后用1mM IPTG诱导Cpn10生产持续5hr。在4°C下通过离心(6,000xg)10分钟将细胞悬下，再悬浮于25mMTris(pH 7.5)中并且在8,000psi下均化四次。在4°C下通过在15,000xg下离心30分钟去除不溶性物质。用0.1%(w/v)PEI来涡旋含有Cpn10的上清液，在冰上孵化5分钟，然后在4°C下在15,000xg下离心30分钟用来去除核酸和众多大肠杆菌蛋白。使富含Cpn10的上清液通过一个0.45μm过滤注射器并且加载到在25mM Tris(pH 7.5)中预平衡的一个大珠粒磺丙基-Sepharose阳离子交换柱上，用0至0.5M NaCl梯度进行洗脱。将含有Cpn10的馏分合并并且以10分之1稀释到25mM Tris(pH 7.5)+2M硫酸铵中并且加载到一个丁基-S-Sepharose疏水作用层析(HIC)柱上，用0%至60%梯度的25mM Tris(pH 7.5)进行洗脱。将包含Cpn10的馏分透析于25mM Tris(pH 8)+1mM EDTA中并且浓缩到约10mg/ml。为了去除残留的内毒素和核酸，最后将Cpn10通过在25mM Tris(pH 7.5)+1mM EDTA中预平衡的一个Capto-Q-Sepharose柱。将纯化的Cpn10透析于50mM Tris-HCl pH 7.6+150mM NaCl中并且稀释到约5mg/ml以便保存在-80°C下。

通过SDS-PAGE上考马斯亮蓝染色确定Cpn10的纯度，例如图2中所示的多种Cpn10变异体多肽，为>99%。每当使用之前将等分部分融化。

实例2Cpn10结合到CpG寡核苷酸(ODN)上的定量分析

为了确定Cpn10变异体结合到ODN上的数量，以PBS pH7.2(Invitrogen)中10μg/μl配制这些变异体，并且在4°C下将50μg吸附到96孔板的三重孔中，持续16小时。在倾析未结合的蛋白之后，在23°C下用PBS pH7.2中1%BSA和5%蔗糖对板进行封闭持续2小时。将以PBS pH 7.2中0.01μg/μl配制的50μl3’或5’-生物素标记的人ODN-2216类别-A、人ODN-2006类别-B、或人ODN-M362类别-C(TLR9促进剂)(Proligo/Sigma)添加到各孔中并且在23°C下孵化2小时。用五次PBS(pH7.2)+0.05%吐温20洗涤去除未结合的配体。在A450nm下用抗生蛋白链菌素-HRP和TMB检测系统对结合的CpG-ODN进行分析。

在图1中，在生理盐浓度下(约150mM)的定量分析突出显示了与Ala-Cpn10相比较CpG-ODN与多种Cpn10N端变异体更强的相互作用。

例如，与Ala-Cpn10相比较，变异体MV-Cpn10、ML-Cpn10、MI-Cpn10、MH-Cpn10、Pro-Cpn10、MF-Cpn10、MY-Cpn10、MW-Cpn10、MC-Cpn10、Ser-Cpn10、MT-Cpn10、MD-Cpn10、MN-Cpn10、MQ-Cpn10、AA-Cpn10、AAA-Cpn10、SG-Cpn10、STG-Cpn10、PG-Cpn10、PTG-Cpn10、MQS-Cpn10以及MQSN-Cpn10各自显示与至少一种CpG类别(即，CpG-类别A、B和/或C)更强的相互作用。

实例3分子模型

为了具有生物活性，蛋白质必须采取特异性折叠的三维结构，并且通过蛋白的氨基酸序列来确定该结构。氨基酸侧链的独特结构和特性确定了蛋白的特异性生物功能。许多非共价相互作用例如氢键、离子相互作用、范德华力以及疏水性填装有助于蛋白折叠的稳定性和柔性。

在分辨率下得到了人Ala-Cpn10(缺少柔性移动环)的X-射线晶体结构。该Cpn10单体包括侧翼为一个β–发夹“顶环”区域和一个“移动环”区域的一个核心反平行β–桶区域。该晶体结构显示Ala-Cpn10的N端形成一个β-发夹并且位于横过该Cpn10圆顶样结构的顶部紧邻这些顶环特定区域的一个良好序列的线性延伸的构象中。在少数X-射线晶体结构中，观察到该Cpn10七聚物中某些亚基的N端经历较大构象改变，表明该附属部分是相当柔性的并且实现一种重要的生物功能，例如调节核酸结合。分子模型提供了指示，即Ala-Cpn10的柔性N端可以通过将丙氨酸（在氨基酸位置1处，此后称为Ala-1）相互作用到由残基Ser52至Gly57形成的顶环上小结构性口袋中(类似于锁和钥匙)而对接到顶环上。该顶环开始的两个关键残基，Lys53和Lys55，被较小残基(Ser52、Gly54、Gly56和Gly57)环绕，并且由于它们延伸的侧链CH2-CH2-CH2-CH2-NH2被认为能够形成这个口袋，而被Gly54分开。氨基酸侧链相互作用和填装几何形状的分析（使用the Thornton and Singh Atlas ofProtein Side-Chain Interactions;Singh J&Thornton J M(1992).Atlas of ProteinSide-Chain Interactions,Vols.I&II，IRL press,Oxford）表明Ala-1的CH3侧链能够与这些Lys侧链相互作用并且形成一个较大显著的簇（以及一个第二较小簇）。Ala-1结合进入Lys53-Lys55的顶环结构性口袋中可以有效地锚定该柔性N端，这提供了紧密的核酸结合。

《蛋白侧链相互作用图集》（The Atlas of Protein Side-Chain Interactions）(Thornton和Singh)说明了20种不同类型氨基酸侧链之间全部400种可能配对相互作用并且被视为用来确定氨基酸侧链如何针对彼此相互作用和填装（簇集）的主要文献。参考填装几何形状和范德华力对侧链接触中任何簇集的显著性进行评估。通过针对随机分布的Chi²检验对显著性进行评估。用于分析这些相互作用的数据库和软件是由作为EMBL欧洲生物信息学协会一部分的Thornton集团服务和数据库(Thornton Group Services and Databases)下的伦敦大学学院（University College London）提供主机服务，见http:∥www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/sidechains/index.html)。使用这个数据库对Ala-Cpn10的N端突变对于连接到核酸配体上以及免疫调节功能的作用进行建模。

干扰Ala-1结合到Lys53Lys55上可以改变Ala-Cpn10的结构构象并且损害结合到核酸(例如，CpG-ODN)上的能力。去除该分子的全部N端(Ala-Cpn10-ΔNterm)，或顶环(Ala-Cpn10-ΔRoof)防止Ala-1结合到该口袋中，并且严重地损害了Cpn10结合到CpG-ODN上的能力(参见图1)。同样地，观察到Lys53和Lys55突变成不同氨基酸破坏了结合口袋并且严重地损害了与CpG-ODN结合（参见图1）。

还观察到通过去除位置-1处Ala(Ala-1)缩短N端损害了与CpG-ODN结合（如通过变异体X-Cpn10所示）（参见图1）。

在尺寸和结构两者上甘氨酸是丙氨酸的一种类似氨基酸，并且差异在于与丙氨酸的–CH₃侧链相比较甘氨酸仅具有一个–H侧链。Ala-1取代为甘氨酸还导致免疫调节功能损害（假定地因为它不能正确地配合到该口袋中(类似于将一个非常类似的，但不正确的钥匙放置到该锁中)）。甘氨酸与Lys53Lys5侧链相互作用的模型提供了指示，即在这些侧链之间可以形成六个大的并且显著的簇。这些簇与由Ala-Cpn10形成的那些不同并且因此导致分子不同的结构构象，并且损害与CpG-ODN结合。

因此，N端Ala-1正确地结合到顶环的结构口袋中被认为对于CpG-ODN的结合以及Ala-Cpn10作为PRR信号调节剂起作用是必要的。

蛋白翻译从起始甲硫氨酸开始。根据“N端法则”，在一些蛋白中将起始甲硫氨酸去除，这依赖于后面氨基酸的个性特征。使用质谱法确定的是如果邻近氨基酸是丙氨酸（如对于Ala-Cpn10的情况）、甘氨酸（如对于Gly-Cpn10的情况）、脯氨酸、或丝氨酸，将起始甲硫氨酸切除离开Cpn10。对于所有其他氨基酸，甲硫氨酸保持不变。.与丙氨酸相比较脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)以及甲硫氨酸(Met)都是较大的氨基酸。

关于如何要求Ala-Cpn10的结构构象结合到CpG-ODN上的假设，可以假定如果Ala-1氨基酸被一个更大的、体积更庞大的氨基酸替换，则它有可能不能正确地配合到顶环的口袋中并且相对于Ala-Cpn10具有损害作用（类似于Cpn10-Δ-Nterm或Ala-Cpn10-Δroof，Gly-Cpn10或X-Cpn10(参见图1)）。出人意料地是，情况并非如此。事实地，取代N端上更大的体积更庞大的氨基酸Pro、Ser或Met实际上导致CpG-ODN的结合改进，并且因此可以预期增强对PRR信号的抑制。

丝氨酸是一种小氨基酸，在侧链CH₂-OH（代替–CH₃）中与丙氨酸相差一个单个的氧分子。在N端放置丝氨酸是结构上最类似于Ala-Cpn10，并且可以预期具有适当尺寸以便以类似于Gly-Cpn10的方式不正确地配合到该口袋中并且损害与CpG-ODN结合。然而，情况可能并非如此，并且Thornton数据库预测Ser不能结合到Lys53Lys55侧链上并且根本不能形成任何显著的簇。然而它被预测能够在顶环至Lys53Lys55的另一端与Gly57、Glu58、Ile59、Gln60、Pro61以及Val62任一项结合并且形成显著的簇集几何形状。

脯氨酸是不常见的，因为它具有侧链CH₂-CH₂-CH₂，该侧链与氨基酸主链的伯N形成一个环。因此，它的侧链是体积庞大的并且可能被认为阻挡该口袋。然而，情况可能并非如此，因为Thornton数据库预测Pro不能结合到Lys53Lys55侧链上。然而，它被预测能够在顶环至Lys53Lys55的另一端上与Gly57、Glu58、Ile59、Pro61以及Val62的任一项结合并且形成显著的簇集几何形状。

甲硫氨酸具有一个较大侧链CH₂-CH₂-S-CH₃并且侧链相互作用(Thornton)的检查显示N端甲硫氨酸被预测不能与Lys53Lys55形成任何簇集。然而，甲硫氨酸被预测与定位在顶环中的异亮氨酸59(Ile59)或缬氨酸62(Val62)形成多重相互作用。

令人感兴趣的是注意到在N端位置具有甲硫氨酸的变异体结合CpG-ODN的能力方面存在差异，这取决于它后面紧接着是哪个氨基酸。可以假定的是这个差异是由于Met后面这些氨基酸与顶环中Ile59亦或Val62附近那些额外的侧链相互作用。

可以建议的是这些氨基酸实际上结合到该口袋外面的顶环上，因为它们有可能不能结合到Lys53Lys55的侧链上并且配合到该口袋中。这种结合进一步可以引起顶环和该分子作为一个整体发生不同的构象改变，因此能够更紧密地结合CpG-ODN并且增强对Ala-Cpn10的免疫调节。

Claims (23)

1.一种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽，该多肽与一种野生型Cpn10多肽具有至少70％的序列一致性，并且与所述野生型多肽相比较包括延长了至少两个额外氨基酸残基的一个N端。

2.如权利要求1所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中与Ala-Cpn10（SEQ IDNO：3）相比较该多肽具有增加的免疫调节功能。

3.如权利要求1或权利要求2所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中与Ala-Cpn10（SEQ ID NO:3）对于所述PAMP的结合亲和力相比较该多肽具有对于一种病原体相关分子模式（PAMP）增加的结合亲和力。

4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中所述变异体多肽的N端以一个甲硫氨酸残基开始。

5.如权利要求4所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中所述甲硫氨酸残基在选自下组的一个氨基酸残基前面，其构成为：精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸。

6.如权利要求1至5中任一项所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中所述多肽包括如SEQ ID NO：9、12、15、18、24、26、29、32、38、41、44、47、49、78、90或93的任一项中列出的一种氨基酸序列。

7.一种对权利要求1至6中任一项所述的多肽进行编码的分离的核酸。

8.如权利要求7所述的分离的核酸，其中所述核酸包括如SEQ ID NO：10、13、14、16、17、19、20、25、27、28、30、31、33、34、39、40、42、43、45、46、48、50、51、91、92、94或95的任一项中列出的一种核苷酸序列。

9.如权利要求1至3中任一项所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中所述多肽包括如SEQ ID NO：52、55、58、60、81、84、87或96的任一项中列出的一种氨基酸序列。

10.一种对权利要求9所述的多肽进行编码的分离的核酸。

11.如权利要求10所述的分离的核酸，其中所述核酸包括如SEQ ID NO：53、54、56、57、59、61、62、82、83、85、86、88、89、97或98的任一项中列出的一种核苷酸序列。

12.一种分离的伴侣蛋白10（Cpn10）变异体多肽，该多肽与一种野生型Cpn10多肽具有至少70％的序列一致性，并且与所述野生型多肽相比较包括延长了一个额外氨基酸残基的一个N端，其中所述额外氨基酸残基是一个丝氨酸或脯氨酸残基，并且其中与人Ala-Cpn10相比较所述变异体多肽具有增加的免疫调节功能。

13.如权利要求12所述的分离的Cpn10变异体多肽，其中所述多肽包括如SEQ ID NO：21或35中列出的一种氨基酸序列。

14.一种对权利要求12或权利要求13所述的多肽进行编码的分离的核酸。

15.如权利要求14所述的分离的核酸，其中所述核酸包括如SEQ ID NO：7、8、22、23、36、或37的任一项中列出的一种核苷酸序列。

16.一种组合物，包括下面任何一项或多项：

a)如权利要求1至6、9、或12至13中任一项所述的多肽；或者

b)如权利要求7至8、10至11、或14至15中任一项所述的核酸。

17.如权利要求16所述的组合物，进一步包括一种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

18.一种用于抑制受试者体内免疫活化的方法，所述方法包括向该受试者施用一个治疗有效量的下面各项：

a)如权利要求1至6、9、或12至13中任一项所述的多肽；

b)如权利要求7至8、10至11、或14至15中任一项所述的核酸；或者

c)如权利要求16或权利要求17所述的组合物。

19.一种用于预防或治疗受试者体内炎性疾病的方法，所述方法包括向该受试者施用一个治疗有效量的下面各项：

a)如权利要求1至6、9、或12至13中任一项所述的多肽；

b)如权利要求7至8、10至11、或14至15中任一项所述的核酸；或者

(c)如权利要求16或权利要求17所述的组合物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述炎性疾病是选自下组，其构成为：类风湿性关节炎，炎症性肠病（克罗恩病，溃疡性结肠炎），I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，幼年型糖尿病），慢性疲劳综合征，阿尔茨海默病，格雷夫斯病，骨性关节炎，II型胶原关节炎，多发性硬化症，系统性红斑狼疮，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢疾病，自身免疫性甲状腺疾病，自身免疫性神经炎，自身免疫性肝炎，自身免疫性葡萄膜视网膜炎，自身免疫性葡萄膜炎，银屑病，斯耶格伦病，肉样瘤病，皮肌炎，白细胞分裂性血管炎，重症肌无力，变应性脑脊髓炎，甲状腺毒症，恶性贫血，风湿性多肌痛和多发性肌炎慢性阻塞性肺病（COPD），传染性疾病，肠漏症，心血管疾病（如充血性心脏病），变态反应（如过敏反应，药物反应，皮肤变态反应，湿疹，过敏性鼻炎，荨麻疹，特异性皮炎，过敏性接触性变态反应，食物变态反应，过敏性结膜炎，昆虫毒液过敏症），哮喘，急性呼吸窘迫综合征（ARDS）以及动脉硬化和传染性疾病。

21.一种筛选免疫抑制剂的方法，所述方法包括：

a)在适用于在一种候选剂与如权利要求7至8、10至11、或14至15中任一项所述的核酸之间发生结合的条件下使所述核酸与所述候选剂相接触；并且

b)测量由所述核酸编码的多肽的生产。

22.一种筛选免疫抑制剂的方法，所述方法包括在适合于在一种候选剂与所述多肽之间发生结合的条件下使一种混合物与所述候选剂相接触，并且在所述免疫细胞中检测由所述多肽诱导的PRR-介导的细胞信号水平，该混合物包括：

a)(a)表达一种模式识别受体（PRR）的一种免疫细胞；

b)所述PRR的一种配体；以及

c)如权利要求1至6、9、或12至13中任一项所述的多肽。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述检测是通过下面任一项或多项来执行：

(a)测量所述免疫细胞产生和/或分泌的细胞因子和/或趋化因子；

(b)测量所述免疫细胞表达的活化标志物；

(c)检测所述免疫细胞中的Toll样受体介导的NF-κΒ活化。

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