KR101764538B1 - 코돈 최적화된 막 관통 rankl의 대장균 내 수용성 발현 방법 및 상기 rankl 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코돈 최적화된 막 관통 RANKL(transmembrane receptor activator of nuclear factor (NF)-kB ligand; mRANKL)의 대장균 내 수용성 발현 방법 및 반응표면분석법을 통한 발현 최적화에 관한 것으로서, 상세하게는 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL) 유전자를 제공한다. 또한, 상기 코돈 최적화된 RANKL 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 RANKL 단백질 생산방법을 제공한다. 또한, 본 발명자들은 mRANKL의 침투성 방법의 투여를 통해 M 세포 및 면역 세포의 생리학적 수를 연속적으로 유도하고, 점막부착성 및 pH 민감성 경구 전달 시스템을 통한 M 세포 표적 항원의 연속적인 전달을 통해 경구 백신의 효율을 향상시키기 위한 새로운 전략을 제시하였다.

Description

코돈 최적화된 막 관통 RANKL의 대장균 내 수용성 발현 방법 및 상기 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물{Method for soluble expression of codon optimized transmembrane RANKL in E.coli and composition for stimulating immune response comprising the RANKL protein}

본 발명은 코돈 최적화된 막 관통 RANKL(transmembrane receptor activator of nuclear factor (NF)-kB ligand; mRANKL)의 대장균 내 수용성 발현 방법 및 반응표면분석법을 통한 발현 최적화에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물에 관한 것이다.

핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL)는 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor; TNF)의 한 멤버로서, 조골세포(osteoblast) 및 기질세포 계통에서 우선적으로 발현되는 반면, 이의 수용체 RANK는 파골세포(osteoclast) 계통에서 우선적으로 발현된다. RANKL은 상기 세포들에서 타입 II 막 관통 단백질로 생산되고, 특정 금속단백분해효소(metalloproteinases)에 의해 세포외 수용성 형태로 절단된다. 후자의 형태는 TNF-관련 세포사멸 유도 리간드(TNF-related apoptosis inducing ligand; TRAIL), FasL (TNF-관련 리간드) 및 TNF 자체와 높은 유사성을 갖는다. RANKL 및 RANK는 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 조절하는데 필수적인 역할을 하는 것으로 잘 알려져 있다. RANKL-RANK의 필수적인 생리학적 역할은 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 연구들을 통해 밝혀지고 있다. RANKL-RANK 시스템은 파골세포 분화, 활성화 및 생존을 촉진하는 세포 내 신호 전달 네트워크를 촉발시키기 위해 필요한 것으로 현재 알려지고 있다. 더구나, RANKL은 성숙 파골세포의 발달을 이끄는 주석산염-저항 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase; Trap), 칼시토닌 수용체(calcitonin receptor; CalcR), 카텝신 K(cathepsin K; CtsK), 대식세포-콜로니-형성 인자에 대한 수용체(receptor for macrophage-colony-stimulating factor; Cfms) 및 활성 T-세포 핵 인자(nuclear factor of activated T-cells; Nfatc1)를 포함하는 유전자들의 발현을 유도하는데 필수적이다. RANKL의 생물학적 활성은 그의 생리학적 유인 수용체(decoy receptor)인 오스테오프로테게린(osteoprotegerin; OPG)에 의해 균형을 이루는데, OPG는 RANKL에 대하여 RANK와 경쟁적이고, 재흡수된 뼈의 양에 영향을 미친다. OPG, RANK 및 RANKL에 의해 매개되는 신호전달 기작의 규명은 파골세포 생물학에 있어 RANKL의 역할을 명확히 밝히는데 중요한 돌파구를 제공했다.

RANKL-RANK 신호전달은 뼈 생리학에 연관되어 있을 뿐만 아니라, 면역 체계의 성숙 및 활성화에 있어서도 필수적인 역할을 한다. 또한, RANKL-RANK 시스템은 림프절 형성, 수질 흉선 상피세포(thymic medullary epithelial cells)의 발달, 중심 체온조절, 임신 중 수유 유선 발달, 수지상 세포(dendritic cells; DCs) 생존 촉진 및 Peyer's patches의 정상 발달에도 기능적으로 관련되어 있다. 최근 보고에 의하면, RANKL은 RANK-발현 장내 상피 전구 세포 유래 미세주름 세포(microfold cells; M 세포)의 분화를 조절하는 중요한 인자라고 밝혀졌다. 그 결과, RANKL 결핍 마우스는 Peyer's patches에서 M 세포를 발달시키는데 실패하였는데, 외인성 RANKL의 참투성 방법의 투여에 의해 회복될 수 있었다.

여러 세포에서 RANKL의 다양한 역할에도 불구하고, RANKL의 생리학적 역할은 그의 수용성 특성으로 인해 주로 세포외(extracellular) 형태를 이용하여 연구되었다. 이에, 막 관통 RANKL의 기능을 밝히기 위한 실험적 연구를 수행할 필요가 있다. 하지만, 생물물리학적 특성 연구를 위해서는 많은 양의 기능성 단백질이 필요하다. 동물 발현 시스템은 비싸고, 오랜 시간이 소요되며, 동물 단백질의 발현을 위해 최적 조건을 제공하여 규모를 확장시키는데 어려움이 있기 때문에, 동물 단백질의 과발현을 위해 진핵 세포 대신 E. coli가 실현 가능한 대체 숙주로서 사용될 수 있다. 재조합 DNA 기술에 의해 단백질 이종 숙주 생산을 위한 E. coli 발현 시스템은 오래 전에 확립되었다. E. coli 과발현 시스템은 비싸지 않고, 빨리 성장하며, 유전자 조작이 간단하고, 돌연변이 숙주 균주 및 발현 벡터가 많이 존재하며, 확장성이 있고, 발현율이 높다는 장점이 있다.

하지만, 박테리아 및 동물은 서로 사용하는 코돈이 상이하며, E. coli에서 동물 단백질을 이종 숙주 발현시키는데 영향을 미치는 주요 인자 중 하나가 편향된 코돈 사용이다. 코돈 편향의 문제는 코돈 최적화로 해결할 수 있는데, 이는 숙주의 세포 시스템에서 외부 유전자를 최적화하여 발현시키기 위해서 전체 유전자를 통틀어 한 균주에서 존재하는 희귀 코돈을 숙주가 더 선호하는 코돈 세트로 교체하는 유전적 기술이다. 코돈-최적화된 유전자를 얻기 위한, 표적 유전자의 합성이 종종 더 빠르고 더 싸다. 유전자 합성에 있어서, 유전자 최적화 알고리즘은 희귀 코돈 뿐만 아니라 번역 효율에 영향을 미칠 수 있는 mRNA 2차 구조도 최적화할 수 있는 추가적인 혜택을 제공한다.

한편, 단백질 발현은 적절한 프로모터를 가진 벡터의 선택, 융합 태그, 발현 숙주 및 온도, 유도 농도, 유도 시간과 배양 배지의 조성과 같은 발현 조건을 포함하는 여러 지표에 의해 영향을 받는다. 상기 지표들은 발현 단백질의 수율을 개선함으로써 최적화될 수 있다. 단백질 발현 및 생산의 최적화는 전통적인 1회 1인자 접근법(one-factor-at-a-time approach)에 의해 수행될 수 있다. 상기 방법은 한 세트의 조건에서 다른 모든 인자들은 고정시키고, 단일 인자를 변화시킴으로써 최적화를 수행한다. 하지만, 상기 방법은 시간이 많이 소요될 뿐만 아니라, 영향을 주는 인자들 간의 상호작용을 무시한 방법이기 때문에 진정한 최적화 조건을 얻을 수 없다. 대안으로, 인자들 간의 영향 뿐만 아니라 각 인자의 개별적 역할도 결정하기 위한 반응표면분석법(response surface methodology; RSM)이 사용될 수 있다. RSM은 실험을 설계하고, 모델을 수립하고, 여러 인자들의 영향을 평가하고, 제한된 수의 실험으로 원하는 반응의 최적 조건을 찾아내기 위한 수학적이고 통계적인 기술이다.

소장에는 융모가 없고 작은 좁쌀 형태의 집단이 도톰하게 부풀어 있는 특이한 모습의 림프 소절 집합인 Peyer's patch는 수집 개의 림프 소절이 모여 있는 것으로 세균이나 바이러스에 민감하게 반응한다. Peyer's patch을 덮는 상피에는 특별한 형태의 M 세포가 모자이크 형태로 섞여 있고, 이 M 세포가 세균을 통과시킨다. M 세포는 항원을 포집하여 트랜스시토시스(transcytosis)에 의해 기저부 측면에 위치하는 항원제시세포와 임파구로 전달한다. 즉, 트랜스시토시스(transcytosis)에 의해 항원이 M 세포에서 Peyer's patch로 이동하여 장 상피를 통과하는 기작은 점막 항원에 대한 효과적인 면역 반응을 유발하는데 매우 중요하다.

미국공개특허 US2005/0148533(2005.07.07 공개)

본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL) 유전자를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 코돈 최적화된 RANKL 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 RANKL 단백질 생산방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 생산된 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물 또는 면역 백신 보조제(ajuvant)를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL) 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 코돈 최적화된 RANKL 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 RANKL 단백질 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 백신 보조제(adjuvant)를 제공한다.

본 발명은 코돈 최적화된 막 관통 RANKL(transmembrane receptor activator of nuclear factor (NF)-kB ligand; mRANKL)의 대장균 내 수용성 발현 방법 및 반응표면분석법을 통한 발현 최적화에 관한 것으로서, 막 관통 및 세포 외 형태의 RANKL 모두를 이종 숙주에서 생산하기 위해서 코돈 최적화 전략 및 반응표면분석법을 활용하여, E. coli에서 발현되는 수용성 mRANKL 단백질 생산을 최적화하였다. 이를 통해 mRANKL의 생산에 대한 여러 인자들의 영향을 평가하고, 제한된 수의 실험으로 원하는 반응의 최적 조건을 찾아낼 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 mRANKL의 침투적 방법(systemic)의 투여를 통해 M 세포 및 면역 세포의 생리학적 수를 연속적으로 유도하고, 점막부착성 및 pH 민감성 경구 전달 시스템을 통한 M 세포 표적 항원의 전달을 통해 경구 백신의 효율을 향상시키기 위한 새로운 전략을 제시하였다.

도 1은 회귀 모델의 타당성을 평가하기 위한 진단 플롯을 나타낸다. (A) mRANKL 생산에 대한 예측값 및 실제값 사이의 연관성. (B) mRANKL 생산에 대한 스튜던트화 및 정상 백분율 확률 플롯.
도 2는 각 인자의 반응 및 실험 수준 사이의 연관성을 가시화하기 위한 반응 표면 플롯을 나타낸다. mRANKL 생산에 있어 (A) 세포 밀도(OD₆₀₀) 및 락토오스 농도, (B) OD₆₀₀ 및 유도 후 온도, (C) OD₆₀₀ 및 유도 후 시간, (D) 유도 후 온도 및 락토오스 농도, (E) 유도 후 시간 및 락토오스 농도 및 (F) 유도 후 온도 및 유도 후 시간의 병용 효과에 대한 3차원 표면 플롯.
도 3은 mRANKL 융합 단백질의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏 분석 결과를 나타낸다. A: mRANKL 융합 단백질(~ 75 kDa)을 발현하는 2 개의 SHuffle E. coli-pOmR-c5X 콜로니로부터 얻은 용해물을 나타내는 쿠마시 블루 염색된 SDS 젤. Lane 1: 단백질 표준 마커, 분자량은 킬로달톤(kilodaltons; kDa)으로 표시하였다; Lanes 2 및 3: 클론 1로부터 얻은 각각의 불용성 및 수용성 분획; Lanes 4 및 5: 클론 2로부터 얻은 각각의 불용성 및 수용성 분획. B: 아밀로오스 레진을 이용한 mRANKL 정제를 나타내는 쿠마시 블루 염색된 SDS 젤. Lane 1: 미가공 융합 mRANKL; Lane 2: 통과액; Lane 3: 단백질 표준 마커, 분자량은 킬로달톤(kilodaltons; kDa)으로 표시하였다; Lanes 4-6: 용출 분획. C: mRANKL의 웨스턴 블랏 분석 결과. 다양한 양의 정제된 융합 mRANKL를 4-20% SDS 젤에 반응시켰고, 니트로셀룰로오스 막에 옮겼다. 항-RANKL 1차 항체, goat IgG HRP-접합 2차 항체 및 화학발광 기질을 이용하여 검출하였다. Lane 1: 단백질 마커; Lanes 2-5: 각각 30, 50, 100 및 200 ng의 정제된 융합 mRANKL 단백질.
도 4는 친화 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피에 의한 mRANKL의 정제 결과이다. A. 정제 mRANKL의 SDS-PAGE 분석 결과. 융합 mRANKL은 Factor Xa에 의해 절단되었고, 친화 크로마토그래피에 의해 정제된 후, 젤 여과 크로마토그래피로 정제되었다. 용출된 단백질 분획(Lane 2-7)은 SDS-PAGE 젤에 의해 확인되었다. Lane 1: 단백질 표준 마커, 분자량은 킬로달톤(kilodaltons; kDa)으로 표시하였다. B. 미변성 PAGE 분석 결과. PAGE 분석은 mRANKL의 미변성 상태를 나타내는데(대략적인 분자량은 100 kDa), 이는 동종삼중체(homotrimer)의 크기와 유사함. Lane 1: 단백질 표준 마커; Lane 2: mRANKL. C. 젤 여과 크로마토그래피 프로파일. 알려진 분자 표준 마커의 용출 부피를 기초로 한, 측정 분자량 ~97 및 ~44 kDa과 관련된 14.90 ml 및 20.09 ml에서의 용출 피크. 단백질의 삼중체 형태(~104 kDa) 및 단량체 형태(~35 kDa)의 측정 분자량은 예측 분자량과 유사하다. y 축은 280 nm에서의 흡광도를 밀리흡광도 단위(milliabsorbance units; mAU)로 나타내고, x 축은 컬럼을 통과하는 부피를 밀리리터(milliliters; ml)로 나타낸다.
도 5는 TRAP 염색 분석결과를 나타낸다. RAW 246.7 세포는 각 단백질 100 ng/ml 농도로 6일 동안 처리하였고, TRAP-양성 파골세포는 현미경 하에서 가시화되었다. mRANKL (A); RANKL-Ex (B); 미처리 RAW 246.7 세포 (C).
도 6은 RAW264.7 세포에서의 RANKL에 의한 파골세포 형성 유도 결과를 나타낸다. TRAP 활성은 mRANKL(30-200 ng/ml)로 6일 동안 처리한 RAW264.7 세포 배지에서 측정하였다. (A) mRANKL과 같이 기재한 수치는 mRANKL의 농도를 나타낸다; (B) RAW264.7 세포는 100 ng/ml mRANKL 및 RANKL-Ex로 각각 6일 동안 처리하였다.
도 7은 정량적 RT-PCR 분석 결과를 나타낸다. RAW 246.7 세포에 mRANKL (100 ng/ml) 및 RANKL-Ex (100 ng/ml)을 노출하고 6일 후에, 파골세포 분화(A-C) 및 기능성 마커(D, E)의 발현을 조사하였다. 관심 유전자들의 mRNA 수준은 GAPDH(대조 유전자)로 표준화시켰고, 플롯하였다. 세 번의 다른 실험에 대한 대표적 결과를 나타낸다.
도 8은 코돈 최적화 전과 후의 mRANKL 유전자 염기서열을 비교한 결과이다.
도 9는 경구 면역 일정을 나타내는 모식도이다.
도 10은 MLNs에서의 FACS 플랏 결과(A) 및 선천적 면역세포의 절대적 수(B)를 나타낸다. 수지상 세포(Dendritic cells; DCs); 단핵구(monocytes; Mono); 대식세포(macrophages; Mac).
도 11은 비장에서의 FACS 플랏 결과(A) 및 선천성 면역세포의 절대적 수(B)를 나타낸다. 수지상 세포(Dendritic cells; DCs); 단핵구(monocytes; Mono); 대식세포(macrophages; Mac).
도 12는 MLNs에서의 FACS 플랏 결과(A) 및 후천성 면역세포의 절대적 수(B)를 나타낸다.
도 13은 비장에서의 FACS 플랏 결과(A) 및 후천성 면역세포의 절대적 수(B)를 나타낸다.
도 14는 마우스에서 RANKL 유도 골 손실에 대한 조직계측학적 분석 결과(A) 및 RANKL 처리한 마우스의 대퇴골의 micro-CT 3D 이미지 결과를 나타낸다.
도 15는 RANKL 처리 및 대조군 마우스로부터 분리한 소장 Peyer's patch의 전체 마운트 염색 결과를 나타낸다.
도 16은 RANKL 처리 마우스의 Peyer's patch 내로의 항원 흡수 결과를 나타낸다.
도 17은 면역화된 마우스에서의 IgG 반응 결과를 나타낸다.
도 18은 면역화된 마우스에서의 분비 IgA 반응 결과를 나타낸다.
도 19는 비장에서의 면역기억반응에 대한 유세포 분석 결과를 나타낸다.

이에 본 발명자들은 E. coli에서 발현되는 수용성 단백질로서, 막 관통 및 세포 외 형태의 RANKL 모두를 이종 숙주에서 생산하기 위해서 코돈 최적화 전략 및 반응표면분석법을 활용하였다. 또한, 본 발명자들은 상기 단백질을 생산하는 데 있어 여러 중요한 지표를 최적화하고 평가하였다. 최종적으로 본 발명자들은 주석산염-저항 산성 인산분해효소(tartrate-resistant acid phosphatase; TRAP) 분석 및 정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(quantitative real-time polymerase chain reaction; qRT-PCR)을 통해 상기 단백질의 기능적 특성을 분석하고 비교하였다.

또한, 본 발명자들은 mRANKL의 침투성 방법의 투여를 통해 M 세포 및 면역 세포의 생리학적 수를 연속적으로 유도하고, 점막부착성 및 pH 민감성 경구 전달 시스템을 통한 M 세포 표적 항원의 전달을 통해 경구 백신의 효율을 향상시키기 위한 새로운 전략을 제시하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL) 유전자를 제공한다.

상세하게는 상기 RANKL 유전자는 막 관통 RANKL 유전자(transmembrane RANKL gene; mRANKL)이다.

본 발명에 있어서, “코돈 최적화”는 RANKL 유전자의 코돈을 E. coli에서의 발현을 보다 효율적으로 하기 위하여 E. coli 유전자에서 높은 빈도로 사용되는 코돈으로 치환하는 것을 의미한다. 상기 서열번호 1의 RANKL 유전자는 E. coli에서 이종 단백질의 발현을 개선시키기 위해 코돈최적화 된 염기서열이다.

또한, 본 발명은 상기 코돈 최적화된 RANKL 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.

바람직하게는, 상기 재조합 발현벡터는 수용성 향상 태그 유전자를 더 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는, 상기 수용성 향상 태그 유전자는 말토오스-결합 단백질(maltose-binding protein; MBP)을 코딩하는 유전자일 수 있다.

본 발명에 있어서, “벡터”는 클론유전자(또는 클론 DNA의 다른 조각)를 운반하는데 사용되는 스스로 복제되는 DNA분자를 의미한다.

본 발명에서 있어서, “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 앰피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol) 과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 “수용성 향상 태그”는 RANKL 재조합 단백질을 수용성 형태로 발현시킬 수 있는 것이면 어느 것이든 제한 없이 이용가능하다. 예를 들어, 상기 수용성 향상 태그는 헥사히스티딘(hexahistidine; His₆), 티오레독신(thioredoxin; Trx), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST), 말토스 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP), N-이용 기질 단백질 A(N-utilization substance Protein A; NusA) 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 미생물은 대장균일 수 있고, 보다 바람직하게는, SHuffle Express E. coli 일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 RANKL 단백질 생산방법을 제공한다. 상세하게는 상기 RANKL 단백질은 수용성 단백질일 수 있다.

바람직하게는, 상기 배양은 상기 재조합 미생물의 배양시 세포 밀도(OD₆₀₀)가 0.5 내지 0.7일 수 있다.

바람직하게는, 상기 배양은 락토오스(Lactose)가 5 내지 10 mM 포함된 배지에서 배양할 수 있다.

바람직하게는, 상기 배양은 락토오스로 상기 RANKL 단백질 발현을 유도 후 22 내지 30℃에서 배양할 수 있다.

바람직하게는, 상기 배양은 락토오스로 상기 RANKL 단백질 발현을 유도 후 4 내지 6시간 배양할 수 있다.

보다 바람직하게는, 상기 RANKL 단백질 생산방법은 상기 재조합 미생물을 세포 밀도(OD₆₀₀) 0.6까지 배양하는 단계; 및 상기 배양된 재조합 미생물을 7.5mM의 락토오스가 포함된 배지에서 26℃로 5시간 동안 배양하여 RANKL 단백질 발현을 유도하는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "면역증강"은, 면역세포의 초기활성화 과정에서 비특이적으로 항원에 대해 면역반응을 촉진하는 기능, 또는 면역계의 세포의 활성을 증대시킴으로써 면역을 강화하는 기능을 의미한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글라이콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글라이콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 10 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 50 내지 500 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 상기 투여량은 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 바람직하게는 복강 내 또는 점막 내로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 RANKL 단백질을 유효성분으로 포함하는 면역 백신 보조제(ajuvant)를 제공한다.

상기 면역 백신 보조제(ajuvant)는 면역 백신의 효과를 높이기 위해서 사용되는 보조제(ajuvant) 일 수 있다. 상기 면역 백신 보조제(ajuvant)는 면역 백신을 개체에 투여하기 전에, 먼저 투여하는 전처리용 조성물로서 사용될 수 있으며, 상기 전처리시 면역 백신의 면역효과를 향상시킬 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. 시약

제한효소는 Takara (Shiga, Japan)에서 구입하였다. 따로 언급한 것을 제외한 다른 모든 화합물은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다

2. 균주, 벡터 및 배지

Escherichia coli (E. coli) DH5a (Invitrogen, USA)는 DNA 조작을 위해 사용되었다. 예비 스크리닝 실험을 위해, E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA), E. coli BL21 (Stratagene, USA), TOP10F' E. coli (Invitrogen, USA) 및 SHuffle Express E. coli (New England Biolabs, UK) 세포는 단백질의 발현을 위해 시험하였다. 두 형태의 RANKL 생산을 최적화하기 위해서, SHuffle Express E. coli를 발현 숙주로 사용하였다. 모든 E. coli 균주는 필요시 앰피실린 항생제(ampicillin antibiotic (100 ㎍/ml)를 첨가한 Luria-Bertani (LB) Broth (Becton, Dickinson and Company, USA) 또는 LB agar plate에서 37℃로 배양되었다. pGEM-T Easy vector (Promega, USA)는 PCR 산물의 클로닝을 위해 사용되었고, pMAL-c5X vector (New England Biolabs, UK), pET32a (+) vector (Novagen, USA) 및 pGEX-5X-1 (GE Healthcare, UK)는 발현 벡터로서 사용되었다.

3. 세포주 및 배양 조건

RANKL과 공동 배양시, TRAP-양성 기능성 파골세포로 분화되는 시스템으로 잘 확립된 파골 형성(osteoclastogenic) 세포 시스템인, 마우스 대식세포주 RAW 264.7은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구매하였다. RAW 264.7 세포는 10% 우태아혈청(Thermo Scientific HyClone, USA) 및 항생제(100 U/ml penicillin G and 100 ㎍/ml streptomycin)가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (Thermo Scientific HyClone, USA)에서 37℃, 5% CO₂로 유지되었다.

4. 컴퓨터를 이용한 코돈 최적화, 합성 유전자 구축 및 증폭

생쥐(Mus musculus) (GenBank accession no. AF013170.1)의 막 관통 RANKL 전장길이 mRNA 서열 (951 bp)은 DNAWorks (v3.2.2) software에 의해 코돈 최적화되었다. 야생형 및 코돈 최적화된 mRANKL의 예상 코돈 적응 지수(codon adaptation index; CAI) 수치는 높게 발현되는 것으로 이미 잘 알려진 E. coli 유전자 대조군 세트를 이용하여 E-CAI server (http://genomes.urv.es/CAIcal)로부터 계산되었다. NdeI 및 SalI 제한 효소 사이트가 측면에 위치한 코돈 최적화된 막 관통 RANKL 유전자(transmembrane RANKL gene; mRANKL)를 합성하였고, pUCIDT 벡터에 NdeI/SalI로 삽입되어 Mbiotech (Gyeonggi-Do, Korea)로부터 제공받았다. 합성 mRANKL은 NdeI/SalI로 처리하여 절단되었고, 젤 추출 키트 (NucleoGen, Korea)로 정제되었으며, 그 후, 재조합 플라스미드 pOmR-c5X를 얻기 위해, pMAL-c5X 발현 벡터 내 말토즈 결합 단백질(maltose binding protein; MBP)을 코딩하는 malE 유전자의 하부에 T4 DNA ligase (Takara, Japan)를 이용하여 연결하였다. 플라스미드 증폭을 위해 연결 산물을 E. coli DH5a competent cells (Invitrogen, USA) 내로 형질전환시켰고, 100 ㎍/ml 앰피실린이 포함된 LB agar plates에서 선별되었다. 상기 플라스미드는 DNA purification kit (NucleoGen, Korea)를 이용하여 추출하였고, 연결(ligation)은 제한효소 절단 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

5. 클로닝 및 발현 벡터 구축

mRANKL 또는 전장 길이 mRANKL의 세포 외 도메인(extracellular domain)(137-316 부위)을 코딩하고 있는 최적화된 세포 외 RANKL 유전자(RANKL - Ex)를 증폭하기 위해서, 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction; PCR)을 사용하였다. PCR은 표 1에 나타낸 프라이머 세트로 AccuPower PCR PreMix containing Top DNA Polymerase (Bioneer, Korea)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 Takara PCR thermal cycler (Takara, Japan)로 수행하였다. PCR 반응은 50 ng 플라스미드 DNA 및 각각 10 pmole의 프라이머가 포함된 총 부피 20 ml에서 다음의 조건으로 수행하였다: 94℃에서 3분 변성한 후, 30회 연장(94℃에서 30초, 52℃에서 30초, 72℃에서 1분)하고, 72℃에서 7분의 최종 연장을 수행하였다. PCR 산물은 젤 추출 키트로 정제하였고, T4 DNA Ligase (Promega, USA)를 이용하여 pGEM-T Easy vector로 연결시켰다. 연결 산물은 E. coli DH5a로 형질전환시켰고, 100㎍/ml 앰피실린이 첨가된 LB agar plates 상에서 선별되었다. 연결은 플라스미드 분리, 제한효소 절단 및 DNA 서열분석을 통해 확인하였다.

또한, pGEM-T Easy vector 내로 연결된 mRANKL는 XmaI-XhoI로 잘라냈고, pOmR-G5X를 얻기 위해 pGEX-5X-1로 삽입하였다. mRANKL를 가진 플라스미드 pOmR-c5X는 증폭되었고, 절단되었으며, pOmR-32를 얻기 위해 pET32a(+)의 NdeI-SalI 사이트로 연결되었다. 반면, RANKL - Ex는 pGEM-T vector로부터 NdeI-SalI으로 잘라낸 후, pOsREx-c5X를 제작하기 위해 pMAL-c5X로 연결되었다. 연결 산물은 플라스미드 증폭을 위해 E. coli DH5a로 형질전환시켰다.

[표 1] 본 발명에 사용한 프라이머들

6. 단백질 발현, 분리 및 분석

E. coli에서 단백질 발현을 최적화하기 위해서, 여러 발현 숙주들을 재조합 발현 플라스미드들로 형질전환시켰다(표 2). 형질전환된 단일 콜로니를 100㎍/ml 앰피실린이 첨가된 4 ml의 LB 배지에 접종하였고, 37℃에서 밤새도록 배양하였다. 밤새 배양한 500㎕ 배양액을 100 ml 동일 배지에 접종하기 위해 사용하였고, 37℃에서 배양하였다. 배양액의 OD₆₀₀이 0.5-0.7에 도달하였을 때, 0.4 mM IPTG 또는 20 mM 락토오스(lactose) 둘 중 하나로 단백질 발현을 유도하였고, 그 후 30℃에서 6시간 동안 배양하였다. 세포들은 3,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 수확하였고, 차가운 PBS 완충액으로 2번 씻어냈으며, 단백질-태그 시스템과 관련된 다음의 완충액 2 ml에 재현탁한 후, 10분 동안 얼음에서 두었다. MBP-태그 시스템을 위한 컬럼 완충액(20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7.4), His₆-태그 시스템을 위한 His₆-결합 완충액(20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazole, 0.5 mM NaCl, pH 7.9) 및 GST-태그 시스템을 위한 GST-결합 완충액(10 mM NaH₂PO₄, 1.8 mM KH₂PO₄, 2.7 mM KCl, 140 mM NaCl, pH 7.3). 그 후, 세포들을 9 s 펄스 및 4 s 대기의 주기로 총 8분 동안 얼음 수조에서 초음파로 파괴하였다(Vibra Cell; Sonics & Materials, Newtown, USA). 용해물은 4℃에서 30분 동안 원심분리(12,000×g)하였다. 단백질 발현은 소듐 도데실 설페이트폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 이용하여 4-20% SDS gel (Komabiotech, Korea)에서 관측되었다.

[표 2] 본 발명에 사용된 박테리아 균주 및 플라스미드들

7. 단백질 발현 최적화를 위한 반응표면분석법

중심합성계획법(Central composite design; CCD) 및 반응표면분석법(response surface methodology; RSM)은 SHuffle Express E. coli에서 말토오즈 결합 단백질-태그된 mRANKL 생산을 위한 배양 조건 최적화를 위해 적용되었다. 본 발명에서는 중심점(center point) 및 스타 포인트(star points)에서 4개의 독립적인 변수에 대한 반복적인 2⁴ 완전 배치 중심합성회전계획법을 사용하였다. 변수들; 유도 전 광학 밀도(OD₆₀₀)(0.5-0.7), 락토오스 농도(5-10 mM), 유도 후 온도(22-30℃) 및 유도 후 시간(4-6h)이 통계 분석 및 5개 코드 레벨(-α, -1, 0, +1, +α)에서 각각 RSM을 이용하여 시험되었다(표 3). 코드들에 있어서 상기 언급된 주어진 지표들의 범위에 대한 중심합성계획은 표 4에 나타냈다. 요인 설계(factorial design)를 위한 16번의 시도, 축점(axial points)을 위한 8번의 시도 및 중심점의 반복을 위한 6번의 시도를 포함하여 총 30번의 실험을 시도하고 수행하였다. 얻어진 실험 결과는 아래의 2차 다항 방정식을 이용하여 회귀 분석에 의해 통계학적으로 분석하였다:

상기 Y는 종속변수로서 사용된 예측 응답 값(mRANKL (mg/L))이고; n은 독립변수들(인자들)의 수이며, x_i (i=1, 2)는 입력된 독립 변수(인자)이고; β₀는 상수 계수로서, 계획의 중심점에서 고정 반응의 수치이며; β_i, β_ij 및 β_ii는 각각 선형계수, 교호작용계수 및 2차 회귀계수를 의미한다. 통계 소프트웨어 패키지로서 Design-Expert 8.0.7.1 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, USA)이 실험결과의 회귀 분석 및 3D 표면 반응 모델을 그리기 위해 사용되었다. 모델의 통계 분석은 분산 분석(ANOVA)의 형태로 나타냈고, 분산 값들의 최적점은 Design Expert의 "point optimization" 도구에 의해 얻었다.

[표 3]

[표 4]

8. 수용성 단백질의 정제 및 분자량 측정

수용성 단백질은 아밀로오스 친화 크로마토그래피에 의해 제조사의 지시에 따라 정제되었다. 간단히 설명하면, 컬럼 완충액에 녹인 조단백질 추출물을 2 ml의 아밀로오스 레진(New England Biolabs, UK)에 로딩하였고, 컬럼 완충액의 12 컬럼 부피로 씻어냈으며, 단백질들은 컬럼 완충액에 녹인 10 mM 말토오스로 용출시켰다. 용출 분획은 SDS-PAGE를 통해 분석한 후, Coomassie Brilliant Blue R-250으로 염색하였다. 정제된 MBP-태그된 단백질은 20 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl buffer (pH 7.4)로 4℃에서 24시간 동안 완충액을 3번 바꿔가며 투석하였다. 엔도톡신은 Detoxi-gel endotoxin removing columns (Thermo Scientific Pierce, USA)에 의해 제조사의 지시에 따라 제거되었다. 단백질 농도는 Nanophotometer (Implen GmbH, Germany)를 이용하여 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 확인하였다.

MBP 융합파트너로부터 RANKL의 분리는 Factor Xa (Amersham Biosciences, UK)로 단백질 가수분해에 의한 절단을 통해 수행되었고, 상기 반응은 4℃로 50 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 7.4)에서 밤새도록 수행하였다. 미절단 융합 단백질 및 MBP는 아밀로오스 레진을 2차적으로 통과시켜 제거하였다. 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)이 포함된 완충액으로 평형화시킨 Superdex 20010/300 GL column (GE Healthcare, UK)를 이용한 젤 여과 크로마토그래피를 통해 상기 단백질은 추가로 더 정제하였다. 상기 컬럼은 AKTA explorer 100 fast protein liquid chromatography apparatus (Amersham Biosciences, UK)에 연결되었고, 동일한 완충액으로 용출시켰다. 비변성된 막 단백질의 질량 측정을 위해, 정제된 단백질은 비변성 조건하에서 Tris-Glycine-PAG Pre-Cast Gel, non-SDS, 4-20%(Komabiotech, Korea)을 사용하여 젤 전기영동하였다. 분자량 측정을 위해, 5 mg/ml 정제 단백질을 a Superdex 200 10/300 GL column에 적용하였다. 상기 컬럼은 젤 여과 분자량 마커 키트 (MWGF200, Sigma)로 보정하였다. 젤-상 분배계수(gel-phase distribution coefficient; Kav)는 아래와 같이 계산되었다.

상기 V_e는 용출 부피이고, V₀는 틈새 부피이며, V_c는 컬럼 부피이다.

9. 단백질 발현의 확인을 위한 웨스턴 블랏 분석

단백질들의 이종 발현은 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인하였다. 간단히 설명하면, 단백질들은 4-20% SDS 젤 내의 환원 조건하에서 XCell SureLock Mini-Cell (Life Technologies, USA)을 이용하여 130V에서 2시간 동안 분리되었다. Precision plus protein dual-color standards (BioRad, USA)가 분자량 마커로서 사용되었다. 전기영동 후, Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, USA)을 이용하여, 단백질들은 10V에서 60분 동안 전기적으로 니트로셀룰로스 막(Protran nitrocellulose membrane, Whatman, UK)으로 옮겨졌다. 상기 막은 트리스-완충된 살린-트윈(Tris-buffered saline-Tween; TBST) 완충액에 녹인 5% 스킴 밀크로 상온에서 60분 동안 차단시킨 후, TBS-Tween으로 세 번 씻어냈다. 그 후, 상기 막은 RANKL에 대한 항체(R&D Systems, USA)로 교반기에서 4℃로 밤새도록 반응시켰고, TBST 완충액으로 각각 15분 동안 세 번 씻어냈다. 그 후, 상기 막은 TBST 완충액에 녹인 goat IgG horseradish peroxidase (HRP)-conjugated antibody (R&D Systems, USA)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. TBST 완충액으로 각각 15분 동안 세 번 연속적으로 씻어낸 후, 증강 화학발광(enhanced chemiluminescence; ECL) 검출 시스템 (GE Healthcare, UK)으로 단백질을 검출하였고, 웨스턴 블랏 상의 화학발광 신호를 수집하기 위하여 Gel Doc XR system (BioRad, USA)에 노출시켰다.

10. 파골세포 분화 분석

RAW 264.7 세포는 여러 농도의 mRANKL (30-100 ng/ml) 또는 RANKL-Ex (100 ng/ml)의 존재하에서 웰 당 2×10⁴ 세포 밀도로 6-웰 플레이트 상에 접종하여 6일 동안 배양하였다. 배양 배지는 상기에 언급된 샘플을 포함한 새로운 배지로 48시간 마다 6일 과정으로 교환되었다. 그 후, TRAP-양성 파골세포 유사 세포들의 생산을 확인하기 위해서 배양된 세포들을 제조사의 지시에 따라 TRAP-염색 (B-Bridge, USA)에 적용하였다. 간단히 설명하면, 세포들은 PBS로 씻어냈고, 접착제로 5분 동안 상온에서 고정시켰다. 상기 세포들을 증류수로 세 번 씻어낸 후, 발색 기질로 37℃에서 60분 동안 염색하였으며, 발색이 최적화되었을 때 반응을 중단시키기 위해 최종적으로 증류수로 씻어냈다. TRAP-양성 파골세포는 광학현미경에 의해 가시화되었고 촬영되었다. 미처리 세포들은 대조군으로서 사용되었다. 각 파골세포 분화 분석은 3번 이상 수행되었다. TRAP 활성을 정량하기 위해서, 타르트레이트(tartrate) 함유 완충액에 희석된 170㎕의 발색 기질 (3 mg/5 mL) 존재하에서 30㎕의 배양 상등액을 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 흡광도는 Infinite 200 PRO multimode reader (Tecan, Switzerland)를 사용하여 540 nm에 측정하였다.

11. RNA 추출, 역전사 및 실시간 PCR 분석

파골세포 분화에 있어서 RANKL의 효과를 측정하기 위해서, RAW 264.7 세포를 100 ng/ml의 mRANKL 또는 RANKL-Ex로 처리하였다. 그 후, 제조사의 지시에 따라 Trizol reagent (Life Technologies, USA)를 사용하여, RANKL-처리된 세포로부터 전체 RNAs를 분리함으로써 파골세포 분화 과정 중 연관 유전자의 전사 수준을 분석하였다. 간단히 설명하면, 세포들은 1 ml 트리졸에 균질화되었다. 샘플들을 200 ml 클로로포름에 혼합한 후, 12,000×g로 4℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 중간층을 건들이지 않고 상부 수층을 새로운 튜브로 주의 깊게 옮겼고, 동량의 이소프로판올을 튜브에 첨가하였다. 혼합물은 완전히 재현탁시켰고, 12,000×g로 4℃에서 10분 동안 원심분리하였다. 침전된 RNA 펠렛은 1 ml 에탄올 (75%, v/v)로 씻어냈다. RNA 펠렛은 12,000×g로 4℃에서 5분 동안 원심분리한 후 회수되었다. RNA 샘플들은 2-3분 동안 공기 중에서 건조된 후, 50㎕ 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)-처리된 물(Life Technologies, USA)에 재현탁시켰다. 제조사의 지시에 따라 Qiagen RNeasy mini kit 및 Rnase-free DNAse set (Qiagen, Germany)를 이용하여 RNA를 더 정제하였다. RNA는 Nanophotometer로 정량하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 Quantitect reverse transcription kit (Qiagen, Germany)를 이용하여, 최종 부피 20㎕로 42℃에서 30분 동안 각 샘플로부터 동량의 전체 RNA(1㎍)를 cDNA로 역전사시켰다. 각 cDNA는 사용 전까지 -20℃에서 보관하였다.

TOPreal qPCR 2X PreMIX (SYBR Green) (Enzynomics, Korea)을 이용하여 전체 반응 부피 20㎕에서 qRT-PCR을 수행하였다. cDNA 주형 및 프라이머를 nTaq-HOT DNA polymerase, dNTP mixture 및 SYBR-Green I이 포함된 SYBR Green에 첨가하였다. 그 후, MyiQTM single color real-time PCR detection system (Bio-Rad)을 이용하여 다음의 조건에서 실시간 PCR을 수행하였다: 95℃에서 30초 반응시킨 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 30초로 40회 반복시키고, 그 후 72℃에서 1분 반응시켰으며, 분리 단계(95℃에서 15초)가 진행되었다. 증폭 산물의 특이성을 확인하기 위해서 융해곡선을 그렸다. 표적 유전자 전사 수준에 있어서의 상대적 변화를 분석하기 위해서 2^-ΔΔCt 방법을 사용하였다. qRT-PCR에 사용된 프라이머들은 표 1에 나타냈다.

12. 면역세포의 유세포 분석

정제된 mRANKL 또는 RANKL-Ex (10, 100 또는 200 ㎍/day)를 4일 연속 마우스의 복강(intraperitoneal; IP) 내 주사를 통해 투여하였다. 5일 째, 각각의 마우스로부터 장간막 림프절(mesenteric lymph nodes; MLNs) 및 비장(spleen)을 무균 상태로 얻어냈고, 1.5 ml 배지(5% 열 불활화된 FBS가 첨가된 RPMI-1640)가 포함된 60 mm 디쉬(dish)에서 피스톤이 달린 실린지로 분쇄하였다.

최종 세포 부유액은 100 mm nylon cell strainer (BD Falcon, USA)를 통해 여과하였다. 세포들은 5 ml 배지에 부유되었고, 3분 동안 4℃에서 2000 rpm으로 원심분리하였다. 비장 샘플의 경우, 세포들을 1 ml ACK lysing buffer (Life Technologies, USA)로 처리하였고, 상온에서 5분 동안 반응시켰으며, 100 mm strainer를 통해 여과하였다. 한편, MLNs 및 비장 유래 세포는 5 ml 배지에 부유시켰고, 3분 동안 4℃에서 2000 rpm으로 원심분리하였다. 세포들은 1 ml 배지에 재현탁시켰고, 100 mm strainer를 통해 여과하였다. 96 웰 플레이트에 10^{- 6}cells/well로 접종하기 위해서, 세포들을 희석시켰고(100X), Biorad automated cell counter로 계수하였다.

최종적으로, MLN 및 비장의 단일 세포 부유물은 얼음 상에서 30분 동안 암조건으로 형광색소(fluorochrome)-접합 항체들의 다양한 조합을 통해 염색시켰다. 결과 수집은 FACSCantoII flow cytometry (BD) 상에서 수행하였고, 결과는 FlowJo (TreeStar) software로 분석하였다. 다음의 항체 클론들은 BD Biosciences, eBiosciences 및 Biolegend로부터 구입하여 사용하였다: CD11b (M1/70), CD11c (HL3), CD80 (16-10A1), CD86 (GL1), F4/80 (BM8), CD4 (RM4-5), CD8a (53-6.7) TCRb (H57-597), B220 (RA3-6B2), CD44 (IM7), CD62L (MEL-14), CD27 (LG.3A10).

13. 대퇴골(femur bone)의 미세단층촬영 분석

mRANKL 또는 RANKL-Ex (10, 100 또는 200 ㎍/day)를 마우스의 복강 내로 4일 연속 주사하였다. 첫 번째 주사 5일 후, 오른쪽 대퇴부를 절단하였고, 연조직들을 제거하여 10% 포르말린 용액에 고정시켰다. 그 후, 대퇴부를 스캐닝 튜브에 올려놓고, 고해상도 미세단층촬영기(micro-computed tomography; Micro-CT; SkyScan 1172 scanner, Kontich, Belgium)로 스캔하였다. 지주골량(trabecular bone volume; BV/TV), 골소주 두께(trabecular thickness; Tb.Th), 골소주 계수(trabecular number; Tb.N) 및 골소주 거리(trabecular separation; Tb.Sp)와 같은 구조 파라미터를 결정하기 위해서, 상기 스캔 결과는 SkyScan CT-volume software를 사용하여 3차원(three-dimensional; 3D) 이미지로 재구성되었고, Skyscan CT analyzer software (Skyscan, Kontich, Belgium)로 분석하였다.

14. 마우스에서 RANKL의 침투성 방법의 투여

Samtako, Co. Ltd. (Osan, Korea)에서 구입한 암컷 BALB/c mice (6 주령)를 본 발명에 사용하였다. 마우스는 서울대학교 실험동물 사육 및 사용 가이드라인에 따라 특정 무병원균 조건 하에서 사육하였다. 각 그룹의 모든 마우스들은 동일한 사료 및 수분을 마음대로 섭취할 수 있도록 하였다.

실험 분석을 하기 전, mRANKL 또는 RANKL-Ex (200 ㎍/day) 또는 PBS (대조군)를 4일 연속 마우스의 복강 내 주사를 통해 투여하였다.

15. pH-민감성 및 점막부착성 폴리머의 합성

하이드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트-55(Hydroxypropyl methyl cellulose phthalate-55; HPMCP)는 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. L-시스테인 하이드로클로라이드(L-cysteine hydrochloride)를 이용한 HPMCP의 화학적 변형은 이전에 보고된 대로 수행하였다(Int. J. Pharm. 359 (2008) 205-210).

16. M 세포 표적 항원의 발현 및 정제

대장균에서 M 세포 표적 모델 항원(M cell targeting model antigen; M-BmpB)으로 발현시키기 위해, M 세포 표적 펩타이드(CKSTHPLSC)를 외막 단백질 BmpB에 접합시켰다. M-BmpB 단백질을 발현하는 E. coli BL 21(DE3)는 100 ㎍/ml 앰피실린(ampicillin)이 첨가된 800ml LB 배지로 37℃에서 200 rpm로 진탕 배양하였다. M-BmpB의 발현은 1 mM IPTG로 유도시켰다. M-BmpB는 His-결합 완충액에서 추출하였고, His·Bind^® Resin을 사용하여 정제하였다. Detoxi-Gel™ endotoxin을 사용하여 엔도톡신(endotoxin)을 제거한 후, 정제된 M-BmpB를 동결 건조시키고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

17. 미립자 항원의 특성 분석

M-BmpB 로딩된 T-HPMCP 미립자(M-BmpB/T-HPMCP MPs)는 이전에 보고된 대로 water-in-oil-in-water (W/O/W) 이중 유제 증발법(double emulsion solvent evaporation method)을 통해 제조하였다(Int. J. Pharm. 359 (2008) 205-210).

미립자의 표면 형태 및 평균 크기는 Supra 55VP-SEM (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 이용한 전계방사형 주사전자현미경(field-emission scanning electron microscope; FE-SEM)으로 분석하였다. 평균 지름 및 입자-크기 분포는 DLS-7000 (Otsuka Electronics, Japan)을 이용한 동적광산란법(dynamic light scattering; DLS)을 통해 측정하였다.

캡슐화 효율 및 MPs의 중량 단위 당 로딩 항원은 이전에 보고된 방법으로 측정하였다(Biomaterials 59 (2015) 144-159). 시험관 내에서(In vitro), MPs 유래 항원 방출은 10 mg/mL의 농도로, 2 종류의 생리학적 완충액 조건에서 MPs를 반응시킴으로써 측정하였다. 2 종류의 생리학적 완충액 조건은 37℃에서 100 rpm으로 일정하게 교반시킨 인공위액(simulated gastric fluid; pH 2.0) 및 인공장액(simulated intestinal fluid; pH 7.4)이다. 상등액은 6000×g로 10분 동안 원심분리한 후, 미리 결정된 시간 간격인 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 24 h에서 수집하였다. 항원 방출량은 BCA 단백질 분석에 의해 정량화하였다. 이상의 모든 실험은 3번 반복하여 수행하였다.

18. M 세포를 통한 항원 흡수율의 생체 내(in vivo) 측정

마우스에 200 ㎍ 단백질에 해당하는 FITC-M-BmpB/T-HPMCP MPs를 경구 투여하였다. 전달 8시간 후, 마우스를 안락사시켰고, 소장(ileum)으로부터 Peyer's patch를 잘라냈으며, 차가운 PBS로 세척한 후, 포르말린으로 고정시켰다. 동결절편(cryosection)을 위해, Peyer's patch를 최적 절단 온도 배지에 넣고, 동결된 조직 절편(10 mm 두께)은 Leica CM1850 cryomicrotome (Leica Microsystems Inc., USA) 상에서 절단하였다. 차가운 아세톤으로 헹군 후, 절편을 마운팅 배지(Dako, Ely, UK)에 마운팅시켰고, DAPI로 대비염색하여 CLSM을 통해 측정하였다. FAE 하에 위치한 형광 항원은 ImageJ v1.36b software (http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 이용하여 정량하였다.

19. 항원-특이 항체의 경구 면역 및 측정

5 마리의 암컷 BALB/c 마우스(6주령) 그룹에게 mRANKL 또는 RANKL-Ex (200 ㎍/day)를 4일 연속 IP 주사를 통해 투여한 후, 미립자 항원(200 ㎍ 항원)으로 3주 연속 5일째 및 6일째 경구 면역화시켰다(도 9). 대조군으로서, RANKL-미처리 마우스는 미립자 항원 또는 PBS로 면역화시켰다.

0주차 및 5주차에 면역화된 동물의 혈액 및 대변 펠렛을 수집하였다. 혈청 내 항원-특이 IgG 항체 및 대변 추출물 내 분비 IgA를 BD OptEIA ELISA kit (BD Biosciences, California, USA)을 사용하여 직접 ELISA로 측정하였다.

< 실시예 1> mRANKL 의 코돈 최적화 및 클로닝

다른 생물체들은 다른 선호도에 따라 동의 코돈(synonymous codons)을 사용한다. 결과적으로, 이종 단백질, 특히 인간 단백질은 E. coli에서 드물게 사용되는 표적 mRNA에서의 "희귀" 코돈의 존재로 인하여 E. coli에서는 발현시킬 수 없다. 이러한 코돈으로는 아르기닌(AGA, AGG, CGA), 이소류신(AUA), 류신(CUA) 및 프롤린(CCC)이 포함된다. E. coli 숙주에서 선호되는 동의 코돈을 선별함으로써, E. coli에서 이종 단백질의 발현을 상당히 개선시킬 수 있다. 희귀 코돈 계산기인 RaCC (http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/)에 의해 예측된 바에 따르면, 생쥐(Mus musculus)의 mRANKL의 전장-길이 서열은 아르기닌(AGA, AGG, CGA)에 대한 11개의 코돈, 이소류신(AUA)에 대한 3개의 코돈, 류신(CUA)에 대한 2개의 코돈 및 프롤린(CCC)에 대한 3개의 코돈을 포함하여 19개의 희귀 코돈을 가지고 있다. E. coli에서 높게 발현되는 유전자로 제작하기 위해서, DNAWorks (v3.2.2)가 예측된 동의 코돈 316개 중 198개의 코돈을 변형시키는데 사용되었다(도 8). 그 결과, 비변성 아미노산 구조는 온전하게 유지시키면서, mRANKL이 코돈 최적화되었다. CAI는 숙주 코돈에 대한 코돈 최적화된 mRANKL의 적응도를 측정하기 위해 사용되었다. CAI는 숙주에서 높게 발현되는 유전자들의 코돈 사용빈도(codon usage)에 대한 유전자 코돈 사용빈도(codon usage)의 상대적 적응도 수치이다. mRANKL의 코돈 최적화를 통해 CAI 수치가 0.64(야생형)에서 0.76(최적화된 코돈)으로 증가하였는데, 이는 최적화된 유전자가 E. coli에서 높게 발현되는 유전자에 가까워졌다는 것을 나타낸다. 최종적으로, mRANKL 유전자는 합성되었고, 여러 발현 벡터에 클로닝되었다.

< 실시예 2> E. coli 에서 mRANKL 의 발현

'시행착오(trial and error)' 접근법을 기반으로, 3개의 다른 수용성 태그 헥사히스티딘(hexahistidine; His6), 글루타치온 S-트랜스퍼라제(glutathione S-transferase; GST) 및 말토오스-결합 단백질(maltose-binding protein; MBP)를 각각 포함하는 3개의 벡터 시스템인 pET32a(+), pGex-5X-1 및 pMAL-c5X와, E. coli BL21 (DE3), E. coli BL21, TOP10F' E. coli 및 SHuffle Express E. coli가 포함된 4개의 E. coli 숙주가 mRANKL의 이종 발현을 시험하기 위해서 선택되었다. 이에, E. coli MBP-mRANKL, E. coli His₆-mRANKL 및 E. coli GST-mRANKL 발현 시스템을 제작하였고, 재조합 RANKL은 각각의 시스템으로부터 IPTG 또는 락토오스 유도하여 MBP-mRANKL, His₆-mRANKL 및 GST-mRANKL로 얻어냈다. 상기 시스템에 있어서 mRANKL의 발현은 SDS-PAGE에 의해 관측되었다. 모든 시험 조건에서 His₆-태그 발현 시스템을 가진 모든 E. coli 숙주 및 GST-태그 시스템을 가진 3개의 E. coli 숙주로부터 mRANKL의 발현을 SDS 젤에서 가시적으로 확인할 수 없었다. IPTG로 유도시, E. coli BL21에서 수용성 GST-mRANKL가 무시할 수 있을 정도의 양으로 얻어졌다. 모든 시험 조건에서 MBP-태그된 시스템을 가진 3개의 E. coli 숙주는 너무 낮은 수율의 mRANKL를 생산한 반면, SHuffle E. coli-pOmR-c5X에서는 상당한 양의 mRANKL을 생산하였는데, 락토오스로 유도시 높은 수준의 mRANKL 발현이 봉입체로 얻어졌다. 이러한 예비 실험을 통해, 시험된 시스템 중에서 SHuffle E. coli-pOmR-c5X로부터 가장 높은 수율의 단백질을 얻을 수 있다는 것을 확인하였고, 이후 E. coli에서 수용성 mRANKL의 생산을 최적화하는데 상기 시스템을 적용하였다.

< 실시예 3> 반응표면분석법을 이용한 mRANKL 의 최적화

적절한 발현 벡터, 융합 태그 및 발현 숙주 외에도, E. coli에서 표적 단백질의 발현을 최적화하는데 변수가 될 수 있는 다양한 지표들이 있고, 이러한 각 지표들은 단백질의 용해도 및 활성에 영향을 미친다. 여러 지표들을 기반으로, E. coli로부터 mRANKL 생산에 대한 최적 조건을 결정하기 위해서 RSM을 적용하였다. RSM은 제한된 수의 실험으로 반응에 영향을 미치는 여러 독립 변수들의 효과를 동시에 분석하는데 유용한 통계적 방법이다. 재조합 단백질의 이종 생산에 영향을 미치는, 유도 전 세포 밀도, 락토오스 농도, 유도 후 온도 및 유도 후 시간과 같은 4개의 가장 중요한 변수의 효과를 조사하기 위해서, RSM 하의 2차 모델로 적합하게 계획된 효과적인 도구인, 중심합성계획법(Central composite design; CCD)을 사용하였다. 최적화 과정에서, 통계적으로 계획된 조합에 대한 반응이 측정되었고, 반응 함수에 대한 실험 결과를 적용함으로써 계수를 산정하였으며, 적용 모델의 반응을 예측하고, 모델의 타당성을 software Design-Expert (version 8.0.1)를 사용하여 입증하였다. 독립 변수 및 코드 인자 수준은 표 3에 나타냈다. mRANKL 생산에 있어 2⁴ 완전 배치 CDD 계획 매트릭스(full factorial CDD design matrix)와, 예측 및 실험 결과는 표 4에 나타냈다. mRANKL의 생산을 최적화하기 위해서, 5개의 수준에서 4개의 인자에 대해 전체 30번의 실험을 수행하였다. 필요 실험수(N)는 다음에 의해 예측되었다: 2^k (2⁴= 16; star points) +2 k (2×4= 8; axial points) +6 (center points; 6 반복). 최소제곱법(least square method)을 이용한 30번의 관측 반응이 모델을 산출하기 위해 사용되었다. 식 (1)에 나타낸 이차 다항 방정식의 함수에 의해, 상기 반응 (mRANKL (mg/L))은 4개의 다른 인자인 세포 밀도, 락토오스 농도, 유도 후 온도 및 유도 후 시간과 관련되어 있었다. 실험 결과로부터, 다음 코드 형태의 2차 회귀 모델을 얻었다:

상기에서 Y는 반응(mRANKL 생산)이고, A, B, C 및 D는 각각 유도 전 세포 밀도, 락토오스 농도, 유도 후 온도 및 유도 후 시간의 4개의 변수에 대한 코드 용어이다. A, B, C 또는 D 앞의 계수는 특정 인자의 영향을 나타내는데, AB, AC, AD, BC, BD 또는 CD 앞의 계수 및 A², B², C² 또는 D² 앞의 계수는 2개의 인자와 2차 영향 사이의 상호작용을 각각 나타낸다. 양수는 상승효과를 나타내는 반면, 음수는 길항효과를 나타낸다.

4개의 변수들에 대한 다양한 조합으로 8.3 내지 51.6 mg/L 범위의 MBP-태그 mRANKL가 생산되었다(표 4). 융합 mRANKL의 최대 생산량(51.6 mg/L)은 OD₆₀₀: 0.6, 락토오스 농도: 7.5 mM, 유도 후 온도: 26℃ 및 유도 후 시간: 5 h의 중심점 수치에서 각각 얻었고, 최소 생산량은 OD₆₀₀: 0.6, 락토오스 농도: 7.5 mM, 유도 후 온도: 34℃ 및 유도 후 시간: 5 h에서 각각 얻었다.

< 실시예 4> 모델 검증

mRANKL 생산의 최적화에 적용된 CCD로부터 얻어진 2차 회귀 모델에 대한 분산 분석(ANOVA) 결과는 표 5에 나타냈다. 2차 모델의 통계적 유의성은 분산 분석에 대한 F- 및 p-수치를 통하여 확인하였다. 높은 F-수치는 대부분의 편차가 회귀 방정식에 의해 해석될 수 있다는 것을 나타내고, 낮은 p-수치(<0.05)는 모델이 통계학적으로 유의성이 있다는 것을 나타낸다. 즉, 높은 F-수치(63.23) 및 p > F 수치(0.0001)의 매우 낮은 확률은 회귀 분석이 통계적으로 유의성이 있다는 사실을 나타냈다. 또한, 모델에 대한 적합결여검정(lack of fit test) 결과는 적합결여가 95% 신뢰 수준에서 통계적 유의성이 없다는 것을 나타냈다. 2차 모델의 타당성은 조절된 R² _adj 결정 계수의 허용 범위 내에서 R² 결정 계수에 의해 확인될 수 있다. ANOVA 분석 결과, mRANKL 생산에 대한 R² 수치는 0.9833 및 R² _adj 수치는 0.9677로 나타났고, 둘 다 1에 가까웠는데, 이는 실험값 및 예측값 사이에 높은 연관성이 있음을 보장한다. 회귀 모델의 타당성을 평가하기 위해 사용된 진단 플롯은 도 1에 나타냈다. mRANKL 생산에 있어 실제값 및 예측값 사이의 연관성으로부터, 선형 회귀 적합성에 경향이 있고, 모델이 연구된 실험 범위를 타당하게 해석하고 있다는 것이 명백하다(도 1A). 실제값은 특정 반응에서 얻어진 결과이고, 예측값은 CCD 모델에서 독립 변수로부터 얻어졌다. 정상 백분율 확률(percentage probability) 및 스튜던트화 잔차 플롯(studentized residual plot)은 반응 변환이 필요하지도 않으며, 정규성에 따른 어떠한 분명한 문제도 없는 것으로 나타냈다(도 1B). 이에, ANOVA 결과는 실험 결과에 대한 2차 모델의 조절에 있어 만족스러운 결과를 나타낸다.

[표 5] mRANKL 생산에 대한 반응 표면 2차 모델의 ANOVA 분석 결과

< 실시예 5> 공정 독립 변수의 상호 영향

mRANKL의 생산에 있어 변수들의 상호 영향은 3차원 (3D) 반응 표면 플롯의 형태로 얻어졌다(도 2A-F). 반응 표면 플롯은 각 인자의 반응 및 실험 수준 간의 관계를 가시화하기 위해 사용된 회귀 방정식의 그래프로 표현하였다. mRANKL 생산에 있어 락토오스 및 유도 전 세포 밀도의 통합적인 영향은 도 2A에 나타냈다. mRANKL 생산에 대한 최적 조건은 OD₆₀₀이 0.6이고, 락토오스 농도가 7.5 mM인 것으로 나타났다. 반면, mRANKL의 생산은 OD₆₀₀이 증가함에 따라 증가하는 것으로 관측되었고, mRANKL 생산에 있어서 락토오스 농도는 큰 영향이 없는 것으로 나타났다. 하지만, 최적 범위를 넘은 OD₆₀₀의 증가는 mRANKL 생산을 감소시키는 결과를 가져왔다. 도 2B에서는 유도 후 온도 및 OD₆₀₀의 함수로서 mRANKL 생산을 나타냈다. 온도 및 OD₆₀₀의 증가에 따라 mRANKL 생산이 증가했다. 30℃ 이상의 온도에서는 mRANKL 생산이 모든 OD₆₀₀에서 감소하기 시작하였다. 도 2C에서는 mRANKL 생산에 있어 유도 후 시간 및 OD₆₀₀과의 연관성을 나타냈다. mRANKL 생산은 OD₆₀₀ 및 유도 후 시간에 따라 증가하는 것으로 확인되었다. 상기 두 인자가 최적 범위(OD₆₀₀: 0.6 및 유도 시간: 5 h)를 넘으면, mRANKL 생산은 감소하는 결과를 나타냈다. 도 2D는 mRANKL 생산 정도에 있어 유도 후 온도 및 락토오스 농도의 상호 영향을 나타낸다. mRANKL 생산에 있어, 유도 후 시간 및 락토오스 농도의 통합적인 영향은 도 2E에 나타냈고, 유도 후 시간 및 유도 후 온도에 대한 병용 효과는 도 2F에 나타냈다. 결과적으로, 상기 플롯들은 OD₆₀₀이 0.7 이하이고, 유도 후 시간이 5시간 이하이며, 유도 후 온도가 낮으면 RANKL 생산에 효과적인 반면, 락토오스 농도는 mRANKL 생산에 보다 적은 영향을 미치는 것으로 나타났다.

< 실시예 6> 최적 조건에서의 검증 실험

모델 및 실험으로부터 얻어진 결과가 일치하는지는 최적 조건을 적용한 추가적인 실험을 통하여 확인하였다. 모델은 유도 전 OD₆₀₀이 0.6, 락토오스 농도가 7.5 mM, 유도 후 온도는 26℃ 및 유도 후 시간이 5h에서, 세포 밀도당 최대 49.5 mg/L mRANK 생산할 것으로 예측하였다. 표 6에 나타낸 바와 같이, 추가적인 실험을 통해 얻은 mRANKL은 모델의 예측과 유사한 것으로 밝혀졌다. 실험은 세 번 반복하여 수행하였다. 상기 최적 조건으로, 100 mL 에서 1L 배양 부피로 성공적으로 mRANKL의 생산 규모를 확대시켰다. 융합 mRANKL (~75 kDa)의 발현은 SDS-PAGE에 의해 확이되었다(도 3A). 융합 단백질은 아밀로오스 친화 크로마토그래피에 의해 정제되었고(도 3B), 그 후 웨스턴 블랏 분석에 의해 확인되었다(도 3C). 최종적으로, mRANKL은 MBP 융합 파트너로부터 분리되었고, 친화 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 정제되었다(도 4A).

[표 6] mRANKL 생산에 대한 검증 실험

< 실시예 7> 반응표면분석법을 이용한 RANKL - Ex 발현 최적화

SHuffle Express E. coli에서 mRANKL의 수용성 형태로의 성공적인 발현은 본 발명자들로 하여금 RANKL-Ex 과발현도 시도하게 하였다. 즉, 재조합 발현 벡터 pOsREx-c5X를 제작하기 위하여, RANKL-Ex를 증폭하였고 클로닝하였으며, SHuffle Express E. coli로 형질전환시켰다. E. coli에서 RANKL-Ex의 과발현을 위한 최적 조건을 결정하기 위해서 CCD 및 RSM이 적용되었다. 유도 전 세포 밀도, 락토오스 농도, 유도 후 온도 및 유도 후 시간이 4개의 독립 변수로 선택되었다. 실험 결과는 Design Expert 8.0.7.1을 이용하여 분석하였고, 회귀 모델이 제안되었다.

독립 변수 및 코드 인자 수준은 표 3에서 나타냈다. 한편, RANKL-Ex의 생산을 최적화시키기 위해서 5 개의 수준에서 4개의 인자로 전체 30번의 실험을 수행하였다. RANKL-Ex 생산 및 변수 사이의 관계를 나타낼 수 있는 2차 다항 모델을 식 (3)에 표시하였다.

상기에서 Y는 반응(RANKL-Ex 생산)이고, A, B, C 및 D는 각각 유도 전 OD₆₀₀, 락토오스 농도, 유도 후 온도 및 유도 후 시간의 4개의 변수에 대한 코드 용어이다.

4개 변수의 다양한 조합을 통해, 19.9 내지 128.7 mg/L 범위의 MBP-태그 RANKL-Ex 생산 수율을 얻었다. 융합 mRANKL의 경우와 마찬가지로, 융합 RANKL-Ex의 최대 생산값 (128.7 mg/L)은 각각 OD₆₀₀이 0.6, 락토오스 농도가 7.5 mM, 유도 후 온도는 26℃ 및 유도 후 시간이 5h일 때의 중심점 값에서 얻었고, 최저 생산값(19.9 mg/ml)은 각각 OD₆₀₀이 0.6, 락토오스 농도가 7.5 mM, 유도 후 온도는 34℃ 및 유도 후 시간이 5h일 경우로 나타났는데, 이는 유도 후 온도가 30℃ 이상이면 RANKL-Ex의 생산이 선호되지 않는다는 것을 의미한다.

RANKL-Ex 생산 최적화에 적용된 CCD로부터 얻어진 2차 회귀 모델에 대한 분산 분석 결과 (ANOVA) 수치는 다음과 같다. 높은 F-수치 (66.84), 낮은 확률의 p > F 수치 (0.0001), 0.9842의 R² 수치 및 0.9694의 R² _adj 수치는 2차 모델이 타당성이 있다는 것을 나타냈다. 회귀 모델의 타당성을 평가하기 위해 사용된 진단 플롯 및 3D 반응 표면 플롯은 실험 범위 내의 RANKL-Ex의 생산에 있어 변수의 상호 영향을 나타낸다. 추가적인 확인 실험 결과, 동일 조건 하에서 RANKL-Ex의 생산은 모델에 의한 예측과 가까웠다. RANKL-Ex의 생산은 1L 배양 배지로 확대하였다. 정제된 융합 RANKL-Ex (~ 62 kDa)은 SDS-PAGE에 의해 평가되었고, 웨스턴 블랏 분석에 의해 확인되었다. 최종적으로 RANKL-Ex는 그의 융합 파트너를 제거되기 위해 절단되었고, RANKL-Ex는 친화 크로마토그래피 및 젤 여과 크로마토그래피에 추가적으로 정제되었다.

< 실시예 8> 동형삼중체 ( homotrimer )로의 mRANKL 자가-조립

세포 외 RANKL가 동형삼중체(homotrimer)로 자가-조립된다는 결정학적 연구를 기반으로, 비변성 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis; PAGE) 및 젤 여과 크로마토그래피에 의해 mRANKL의 자가-조립을 시험하였다. SDS 첨가 없이 PAGE 상에서 반응시킨 단백질들은 비변성 막 단백질의 질량 측정이 가능한 비변성 형태를 기반으로 분리되었다. 비변성 조건 하에서 정제된 mRANKL의 PAGE 분석 결과, 동형삼중체의 크기인 대략 100 kDa의 분자량을 보였다(도 4B). 유사하게, 정제된 mRANKL를 Superdex 200 10/300 GL column 상에 적용시켰다. 알려진 분자 표준의 용출 부피를 기초로, 최종 크로마토그램은 대략 97 kDa 및 44 kDa으로 계산된 분자량과 관련된 14.9 ml 및 20.0 ml의 용출 부피에서 2개의 주요 피크를 나타냈다(도 4C). 계산된 분자량은 mRANKL의 삼중체 형태 (~104 kDa) 및 단량체 형태 (~35 kDa)의 예측 분자량과 유사했다.

< 실시예 9> 파골세포 분화를 유도하는 mRANKL

RANKL은 파골세포 분화/활성화에 필수적인 주요 사이토카인인 것으로 잘 알려져 있다. RAW264.7 세포주는 시험관 내(in vitro) 파골세포 분화 연구에 광범위하게 사용되는 모델 시스템으로서, 파골세포는 TRAP 분석에 의해 확인된다. TRAP은 파골세포에서 높은 수준으로 발현되므로, 파골세포 기능을 확인하기 위한 마커로서 사용된다. 이에, 시험관 내 파골세포 형성(osteoclastogenesis)을 유도하는 mRANKL의 잠재력을 시험하기 위해서, RAW264.7 세포를 낮은 세포 밀도로 배양하였고, 세포 분화를 촉진하기 위해서 여러 농도의 mRANKL로 6일 동안 처리하였다. 그 후, TRAP 활성을 측정하기 위해 배양물을 고정시키고 염색하였다. 미처리 배양물은 대조군으로 사용하였다. 배양 6일 후, TRAP-양성 파골세포를 mRANKL 처리된 배양물에서 현미경으로 관측하였다(도 5). RAW 264.7 세포에서 30 ng/ml 정도의 낮은 농도에서도 mRANKL은 충분히 TRAP 방출을 유도했다. 미처리된 세포와 비교시, mRANKL 처리된 RAW264.7 세포 배지에서 TRAP 활성이 상당히 증가하였다. 또한, mRANKL은 농도-의존적 방법으로 RAW264.7 세포에서 TRAP 형성을 증가시킴으로써 파골세포 분화를 유도하였다(도 6A).

< 실시예 10> 파골세포-연관 유전자를 상향 조절하는 mRANKL

파골세포 형성 과정에서, 파골세포는 Trap , CalcR , Cfms , Nfatc1 및 CtsK 같은 여러 마커 유전자들을 발현한다. 이러한 특정 파골세포 유전자들은 파골세포 전구체에서 파골세포로의 분화를 확인하는 주요 지표이다. 따라서, 이러한 유전자들의 전사 조절은 RAW 264.7 세포에서 mRANKL를 처리하여 qRT-PCR을 통해 시험하였다. 전사 수준을 정량적으로 분석하면, 비처리된 세포와 비교시 mRANKL 처리된 세포에서 Trap mRNA 수준은 대략 15 배 정도 높아졌다(도 7A). 유사하게, mRANKL 처리된 세포에서 CalcR (도 7B) 및 Cfms (도 7C) mRNA 발현 수준은 각각 6 배 및 7.5 배 높아졌다. 한편, 비처리된 세포와 비교시 mRANKL 처리된 세포에서 Nfatc1 (도 7D) 및 CtsK (도 7E) mRNA 수준은 각각 대략 6 배 및 14 배 높아졌다.

< 실시예 11> RANKL - Ex 에 대해 기능적으로 우수한 mRANKL

파골세포 형성을 유도하는 mRANKL 및 RANKL-Ex 사이의 기능적 차이점을 비교하기 위해서, RAW264.7 세포를 100 ng/ml mRANKL 또는 RANKL-Ex로 6일 동안 처리하였고, TRAP 분석을 수행하였다. RANKL-Ex로 처리된 것과 비교시, mRANKL 처리된 RAW264.7 세포 배지에서 분비된 TRAP 활성은 대략 2배 정도인 것으로 나타났다(도 6B). 즉, TRAP 분석 결과, RANKL-Ex과 비교시 mRANKL이 파골세포 형성 유도에 더 효과적인 것으로 나타났다. 또한, 파골세포 표현형 및 기능성 마커들의 mRNA 수준에 있어 mRANKL 및 RANKL-Ex의 효과를 qRT-PCR로 비교하였다. RANKL-Ex로 처리된 것과 비교시, mRANKL 처리된 세포에서 Trap mRNA 수준은 대략 2배 정도 높아졌다(도 7A). CalcR (도 7B) 및 Cfms (도 7C)의 mRNA 수준은 mRANKL 처리된 세포에서 각각 약 1.7 배 및 1.6 배 증가하였다. 유사하게, Nfatc1 (도 7D) 및 CtsK (도 7E)의 mRNA 수준은 RANKL-Ex와 비교시 mRANKL 처리에 의해 각각 대략 2.5 배 및 1.6 배 정도 높게 유도되었다.

< 실시예 12> 2차 림프 조직에서 면역세포를 활성화시키는 RANKL

생체 내에서(in vivo) mRANKL의 면역조절기능을 확인하기 위해서, 마우스에 용량 의존적 방법(10, 100 또는 200 ㎍/dose/mouse/day)으로 4일 연속 IP 주사를 통해 mRANKL을 투여하였다. RANKL-Ex (양성 대조군), 열-불활화된 RANKL (음성 대조군) 및 PBS (대조군)으로 실험을 수행하였다. 5일째, MLNs 및 비장으로부터 단일 세포 부유액을 분리하였고, 유세포 분석기를 통해 분석하였다.

도 10에서 나타낸 바와 같이, MLNs에서 두 종류의 RANKLs은 모두 용량-의존적 방법으로 선천성 면역세포를 활성화시키는 능력을 나타냈다. RANKL 처리 후 MLNs에서 CD11c^hi CD11b^- DCs 및 CD11c^hi CD11b⁺ DCs의 수가 PBS 또는 불활화된 RANKL 보다 높은 것으로 나타났으나, 유의적 차이점은 없었다. RANKLs에 의한 상기 수지상세포(DCs)의 활성화와 유사한 경향은 비장에서도 관찰되었다(도 11). 한편, 수지상세포, 과립구, 단핵구 또는 대식세포를 포함하는 면역세포의 수는 mRANKL 및 RANKL-Ex-처리 마우스 사이에 큰 차이가 없었다. 또한, RANKL-처리군과 비교하여 대조군에서 면역세포의 수는 낮은 것으로 나타났으나, PBS 및 열-불활화된 RANKL 대조군 간에는 유사한 수준을 나타냈다.

또한, 후천성 면역세포에서 RANKLs의 효과를 확인하기 위해서, 비장 및 MLNs로부터 분리한 세포를 염색하여 분석하였다. 유세포 분석 결과, MLNs 및 비장에서 두 종류의 RANKLs은 모두 CD4⁺TCRβ⁺ 세포, CD8⁺TCRβ⁺ 세포 및 B220⁺TCRβ^- 세포를 활성화시키는 능력은 낮게 나타났다(도 12 및 도 13). MLNs 뿐만 아니라 비장에서도, 불활화된 대조군에 비해 mRANKL 또는 RANKL-Ex의 침투성 방법의 투여 후에 전체적인 후천성 면역 세포의 수가 증가하는 것으로 나타났으나, 유의적 차이점은 없었다.

< 실시예 13> RANKL 및 뼈 흡수 활성

RANKL의 복강 내 주입이 생체 내(in vivo)에서 극심한 뼈 손상을 유도하는지 확인하기 위해서, 다양한 용량(10, 100 또는 200 ㎍/day)의 RANKLs을 마우스에 처리하여 미세단층촬영기((micro-CT)를 통해 대퇴골을 분석하였다. 낮은 용량(10 또는 100 ㎍/day)의 RANKLs로 처리한 마우스의 대퇴골은 지주골(trabecular bone) 구조에 아무런 영향을 미치지 않았다. 단지 고용량(200 ㎍/day)의 mRANKL 및 RANKL-Ex를 주입한 경우만이 대조군에 비해, 조직 부피 당 지주골량, 골소주 계수 및 골소주 두께를 감소시켰고, 골소주 거리를 증가시켰다(도 14A). 한편, 고농도(200 ㎍/day)의 RANKL을 주입해도 대조군 마우스에 비해 골 손실에 있어 차이를 나타내지 않았다(도 14B).

< 실시예 14> Peyer's patches에서 M 세포의 분화를 유도하는 RANKL

생체 내(in vivo) M 세포 분화에 있어 mRANKL의 기능을 확인하기 위하여, 앞서 기재한 바와 같이 4일 연속 IP 주사를 통해 마우스에 mRANKL 또는 RANKL-Ex (200 ㎍/dose)를 투여하였다. 5일째, Peyer's patches를 마우스로부터 수집하였고, M 세포 특이적인 항-당단백질 2(glycoprotein 2; GP2) 단일클론항체로 전체-마운트 면역염색 후에 M 세포를 공초점 현미경을 통해 분석하였다. GP2는 성숙 M 세포의 특이적 표면 마커이다. mRANK 투여 마우스의 FAE 내 GP2+ M 세포 수는 대조군 마우스에 비해 상당히 증가하였다(***P < 0.0003). 이에 비해, RANKL-Ex 투여 마우스 내 M 세포 수는 약간 증가하였다(*P < 0.0362). mRANKL 및 RANKL-Ex 투여 마우스의 FAE 내 M 세포의 밀도는 대조군 마우스에서 관측된 것보다 2.76 및 1.70 배 높았다(도 15A 및 B). 또한, Peyer's patches 내 GP2+ M 세포 수는 M 세포 마커(GP2)의 실시간 PCR 분석에 의해 정량화하였다. 실시간 정량 PCR 분석 결과, Peyer's patches에서 Gp2 mRNA 발현은 대조군 마우스에 비해 mRANKL 투여 마우스에서 상당히 높게 나타났다(***P < 0.0005)(도 15C). RANKL의 침투성 방법의 투여 후, 능성 M 세포가 증가된다는 것은 형광 비드 흡수 분석을 통해 확인하였다. 형광 비드의 흡수는 대조군 마우스에 비해 mRANKL 투여 마우스에서 2.5배 증가하였고(***P < 0.0004), RANKL-Ex 투여 마우스에서 1.6배 증가하였다(*P < 0.036)(도 15D). 또한, 형태학적 분석 결과, mRANKL 및 RANKL-Ex 투여 마우스의 FAE 크기가 대조군 마우스 보다 각각 2.4배(***P < 0.0008) 및 1.4배(*P < 0.0332) 더 큰 것으로 나타났다(도 15E). Peyer's patches에서 M 세포 수의 증가는 FAE 의 전체적인 크기를 증가시키는데 기여할 수 있다.

< 실시예 15> M 세포 매개 항원 트랜스시토시스(transcytosis)를 상향 조절하는 RANKL

M 세포를 통한 항원의 트랜스시토시스(transcytosis)를 확인하기 위해서, 모델 항원(M-BmpB)을 FITC로 표지하였다. mRANKL 또는 RANKL-Ex를 4일 연속 IP 주사를 통해 주입한 마우스에게 FITC-M-BmpB/T-HPMCP MPs를 경구 투여하였다. 그 결과, Peyer's patches에서의 녹색 형광은 mRANKL-처리 마우스가 RANKL-Ex-처리 마우스 보다 상당히 높게 나타났는데, 이는 mRANKL 투여 마우스에서 FAE를 통과하는 FITC-M-BmpB의 트랜스시토시스(transcytosis)가 높게 일어난다는 것을 의미한다(도 16A). imageJ 분석에 의한 정량 결과, 트랜스시토시스(transcytosis)는 대조군 마우스에 비해 mRANKL 투여 마우스에서 약 3배(***P < 0.0008) 및 RANKL-Ex 투여 마우스에서 약 2배(*P < 0.0309) 정도 높게 일어나는 것으로 확인되었다(도 16B).

< 실시예 16> RANKL 투여 마우스에서의 침투성 방법에 따른 IgG 항체 반응 촉진

전체적인 경구 면역화에 있어 RANKL 처리 효과를 확인하기 위해서, 본 발명자들은 전달된 항원에 대한 IgG 항체 역가 수준을 측정하였다. 마우스에 mRANKL 또는 RANKL-Ex를 투여하였고, 계획된 일정에 따라 미립자 항원으로 면역화시켰다. 그 결과, PBS 투여 대조군 마우스 보다 항원 투여 마우스에서의 IgG 수준이 상당히 높은 것으로 나타났다(P < 0.0055)(도 17). mRANKL 투여 마우스는 대조군(P < 0.0001) 및 항원 투여군(P < 0.0018) 보다 항원-특이적 IgG 생산 수준이 상당히 향상되었다. RANKL-Ex 투여 마우스의 IgG 수준도 대조군(P < 0.0007) 및 항원 투여군(P < 0.0311) 보다 상당히 높게 나타났다.

< 실시예 17> RANKL 투여 마우스에서의 항원-특이적 IgA 반응 향상

면역화된 마우스에서 RANKL 처리 유무에 따른 항원-특이적 분비 IgA 생산 수준을 확인하기 위해서, 면역화 전후의 대변 샘플을 수집하였다. ELISA로 항원-특이적 IgA를 측정 결과, mRANKL 투여 마우스는 PBS 투여군(P < 0.0002) 및 RANKL 미처리 면역화군(P < 0.0037)에 비해 상당히 높은 IgA 역가를 나타냈다(도 18). RANKL-Ex 투여군에서의 IgA 역가 수준도 PBS 투여군(P < 0.0029) 및 RANKL 미처리 면역화군(P < 0.0486)에 비해 높게 나타났다.

< 실시예 18> RANKL 투여 면역화 마우스에서의 헬퍼 T-세포 매개 면역기억반응

헬퍼 T-세포 매개 면역기억반응(Helper T-cell-mediated memory immune responses)에 대한 RANKL의 효과를 확인하기 위하여, 최종 면역화 2주 후에 RANKL 투여 마우스의 비장에서 작용 기억 CD4⁺ T 세포(CD44^intCD62L^-CD27^-CD4⁺TCRβ⁺)의 세포수(frequency)를 측정하였다. 그 결과, 항원 또는 PBS 단독 투여군에 비해 항원으로 면역화된 RANKL 투여군은 초기 작용 기억 CD4⁺ T 세포(CD44^hiCD62L^-CD27⁺CD4⁺TCRβ⁺) 및 후기 작용 기억 CD4⁺ T 세포(CD44^hiCD62L^-CD27^-CD4⁺TCRβ⁺)를 모두 높은 세포수로 유도하였다(도 19). 이는 RANKL이 헬퍼 T 세포의 작용 기억 반응을 유도하는데 관련되어 있다는 것을 나타낸다.

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method for soluble expression of codon optimized transmembrane RANKL in E.coli and composition for stimulating immune response comprising the RANKL protein <130> ADP-2016-0140 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 948 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 atgcgtcgtg cgagccgcga ctatggtaag tacctgcgtt cttctgaaga gatgggttct 60 ggccctggtg tgccgcacga aggtccactg catcctgccc cgagcgcgcc agctccggca 120 cctccgccag cggcctctcg cagcatgttt ctggcgctgc tgggtctcgg tctgggtcaa 180 gttgtgtgct ctattgcgct gttcctgtac ttccgtgcgc agatggatcc gaatcgtatc 240 tccgaggact ctacccattg cttctaccgt attctgcgtc tgcatgaaaa tgcgggtctg 300 caagattcta ccctggaatc tgaggatacc ctgccggatt cttgccgtcg tatgaaacag 360 gcgttccaag gtgcggttca gaaagaactg cagcacatcg ttggtccgca acgtttctct 420 ggtgctccag cgatgatgga aggtagctgg ctggacgtgg cgcagcgcgg caaaccggaa 480 gcgcagccgt tcgcgcatct gactattaac gccgcgtcta ttccgtctgg ttctcataag 540 gttaccctgt cctcttggta tcacgaccgt ggttgggcga aaatctccaa catgacgctc 600 tctaacggta aactgcgtgt taaccaagac ggtttctact acctctacgc gaacatctgc 660 tttcgtcacc acgagacgtc cggctctgtt ccgacggact acctgcagct catggtttac 720 gttgttaaaa cctccatcaa aatcccgtct tctcacaacc tgatgaaagg tggttctacc 780 aaaaactggt ctggtaacag cgaattccac ttctactcta tcaacgtcgg tggcttcttt 840 aagctgcgtg ctggtgaaga aattagcatc caggtatcca acccgtctct gctggacccg 900 gatcaggacg cgacctattt cggtgctttc aaagttcagg acatcgac 948

Claims (19)

1. 서열번호 1로 표시되는 코돈 최적화된 핵 인자-κB 리간드 수용체 활성화제(Receptor activator of nuclear factor (NF)-κB ligand; RANKL) 유전자.
2. 제1항에 있어서, 상기 RANKL 유전자는 막 관통 RANKL 유전자(transmembrane RANKL gene; mRANKL)인 것을 특징으로 하는 RANKL 유전자.
3. 제1항의 코돈 최적화된 RANKL 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터.
4. 제3항의 재조합 발현벡터는 수용성 향상 태그 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
5. 제4항에 있어서, 상기 수용성 향상 태그 유전자는 말토오스-결합 단백질(maltose-binding protein; MBP)을 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 재조합 발현벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
7. 제6항에 있어서, 상기 미생물은 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
8. 제7항에 있어서, 상기 대장균은 SHuffle Express E. coli인 것을 특징으로 하는 재조합 미생물.
9. 제6항의 재조합 미생물을 배양하는 단계를 포함하는 RANKL 단백질 생산방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 RANKL 단백질은 수용성 단백질인 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
11. 제9항에 있어서, 상기 배양은 상기 재조합 미생물의 배양시 세포 밀도(OD₆₀₀)가 0.5 내지 0.7인 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
12. 제9항에 있어서, 상기 배양은 락토오스(Lactose)가 5 내지 10 mM 포함된 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
13. 제9항에 있어서, 상기 배양은 락토오스로 상기 RANKL 단백질 발현을 유도 후 22 내지 30℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
14. 제9항에 있어서, 상기 배양은 락토오스로 상기 RANKL 단백질 발현을 유도 후 4 내지 6시간 배양하는 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
15. 제9항에 있어서, 상기 RANKL 단백질 생산방법은 상기 재조합 미생물을 세포 밀도(OD₆₀₀) 0.6까지 배양하는 단계; 및
    상기 배양된 재조합 미생물을 7.5mM의 락토오스가 포함된 배지에서 26℃로 5시간 동안 배양하여 RANKL 단백질 발현을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RANKL 단백질 생산방법.
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