CN101952438A - 通过n端的pi值控制生产可溶性重组蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及利用具有受控pI值的包含信号序列(方向信号)的N区的多肽片段或其变体和/或由具有受控pI值的亲水性多肽构成的分泌增强子提高重组异源蛋白分泌效率的方法。本发明的方法不仅可以有效用于通过防止不溶性沉淀物的沉淀和通过增加重组蛋白的胞外或周质外分泌效率来生产重组异源蛋白,而且可以有效用于通过利用强分泌增强子增加膜通透性来转导有效治疗性蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及用于提高重组蛋白的分泌效率的方法。
背景技术
现代生物工程中的关键技术之一是生产重组蛋白。特别地,生产处于天然形式的水溶性蛋白很重要。水溶性蛋白的生产对于活性蛋白的生产和回收、其用于功能研究的结晶以及工业化很重要。已经进行了关于利用大肠杆菌(E.coli)生产重组蛋白的研究。利用大肠杆菌具有许多优点,诸如易于操作,培养时间短,安全表达,低成本和易于规模化调控。
因为大肠杆菌中生成的异源重组蛋白不经过翻译后蛋白伴侣陪伴或翻译后加工,因此重组蛋白中不存在折叠或其变成不溶的蛋白内含体(Baneyx,Curr.Opin Biotechnol.(当前生物技术观点)10:411-421,1999)。
由于公开了信号序列诱导蛋白在周质外的胞外分泌,所以关于信号序列的结构和功能的研究已经集中在氨基端碱性区域(Lehnhardt等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)263:10300-10303,1988),疏水区域(Goldstein等,J.Bacteriol.(细菌学杂志)172:1225-1231,1990)和分裂区域(Duffaud和Inouye,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)263:10224-10228,1988)。同时,已经通过使用不同信号序列开发了多种载体,以生产水溶性蛋白质(ompA:Ghrayeb等,EMBO J.3:2437-2442,1984;Duffaud等,Methods Enzymol.(酶学方法)153:492-507,1987;phoA:Dodt等FEBS Lett.202:373-377,1986;Kohl等,Nucleic Acids Res.(核酸研究)18:1069,1990;eltA:Morika-Fujimoto等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)266:1728-1732,1991;bla:Oka等,Agric Biol.Chem.(农业生物化学)51:1099-1104,1987;eltIIb-B:Jobling等,Plasmid(质粒)38:158-173,1997)。然而,使用信号序列的载体目前限于表达水溶性蛋白和甚至是作为重组融合蛋白形式的表达的蛋白,其在裂解后包括位于N端处的信号肽酶或蛋白酶的裂解位点,因此很难获得具有天然氨基末端的重组蛋白。导致很难利用信号序列生产重组蛋白的原因是:1)不可能预测水溶性蛋白的产生且许多研究者认为重组蛋白的水溶性取决于整个蛋白的氨基酸序列的特征;和2)存在太多的作用为信号序列的不同序列且尚不存在用于研究SecA/信号肽的相互作用的适当分析方法(Triplett等,J.Biol.Chem.(生物化学杂志)276:19648-19655,2001)。
本发明人提供包含由多核苷酸构成的基因构建体的表达载体,所述多核苷酸各自编码包含N区和/或内含N区的疏水片段作为方向信号的平截信号序列和/或内含由亲水多肽构成的分泌增强子的平截信号序列,这记述在韩国专利公开号10-2007-0009453中,并且以前还验证了黏着蛋白Mefp1的可溶性表达可以通过将编码黏着蛋白Mefp1的核苷酸加入至包含上述基因构建体的载体而得到提高。本发明人还分析了pI值取决于信号序列的N区片段长度,并证实,从OmpASP1-3至OmpASP1-21的全长的片段具有相等的pI值(10.55)对于表达黏着蛋白Mefp1很重要。在韩国专利公开号10-2007-0009453中,本发明人报告了包含两亲性结构域的蛋白诸如牙鲆(olive flounder)Hepcidin I,在单独使用信号序列的N区片段条件下仅限于可溶性表达,且进一步构建通过将亲水性分泌增强子序列加入至基因构建体来提高水溶性形式的牙鲆Hepcidin I的表达的方法。
因此,本发明人构建了包含由多核苷酸构成的基因构建体的重组表达载体,所述多核苷酸编码具有不同pI值的信号序列,证实了重组载体中包含的信号序列的N端pI值在异源蛋白的可溶性表达中起一定的作用,并证明了当由于异种蛋白的结构特征而需要分泌增强子时,信号序列的N端pI值和分泌增强子的pI值之间的相互关系,并且进一步验证了在为表达异源蛋白而构建的重组表达载体中的信号序列的N端的pI值的控制在提高异源蛋白可溶性表达中很重要,从而导致完整本发明。
公开内容
技术问题
本发明的目的是提供用于生产关于外源基因的水溶性重组融合蛋白和回收在氨基端具有天然形式的蛋白的有效方法。
技术解决方案
为了实现以上目的,本发明提供用于提高异源蛋白的分泌效率的表达载体,所述表达载体包含基因构建体,其包括:(i)启动子和(ii)与所述启动子操作性相连接的编码多肽片段或其变体的多核苷酸,所述多肽片段中影响pI值的氨基酸之间的距离受到调控,所述多肽片段包含信号序列、和/或异源蛋白的前导序列的N区和/或前导序列的N区。
本发明还提供用于提高异源蛋白的分泌效率的表达载体,所述表达载体包含基因构建体,其包括:(i)启动子;(ii)与所述启动子操作性相连接的编码多肽片段或其变体的多核苷酸,在所述多肽片段中pI值受到调控,所述多肽片段包含信号序列和/或前导序列的N区;和(iii)与编码所述多肽片段或其变体的多核苷酸操作性相连接的编码分泌增强子的多核苷酸,所述分泌增强子包括具有受控pI值的亲水性增强序列。
本发明还提供通过用以上表达载体转化宿主细胞制备的转化体。
本发明还提供利用所述转化体提高重组蛋白分泌效率的方法。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法。
本发明还提供通过以上方法生产的重组融合异源蛋白。
本发明还提供药物组合物,其包含以上重组融合异源蛋白和药用载体。
本发明还提供用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法。
另外,本发明提供用于生产靶物质的胞内载体的方法。
有利效果
本发明的方法有利于防止重组蛋白作为不溶蛋白沉淀和提高蛋白在胞质外或进入周质中的分泌效率,由此其可以有效地用于生产重组异源蛋白和用于通过利用强分泌增强子增加膜通透性来转导治疗性蛋白。
附图说明
参考附图更好地理解本发明优选实施方案的应用,其中:
图1是图示通过信号序列0mpASPtr及其变体前导序列进行的粘黏着蛋白Mefp1(可溶级分:约20μg)的比较可溶性表达的图表(箭头:重组Mefp1)。获自密度计分析的数值表示三种不同克隆中蛋白表达的比较平均值:
(A)SDS-PAGE;
(B)蛋白质印迹;和,
(C)密度计分析
1a:
M:标记;
泳道1:Met-Ala-Lys(pI 9.90)(SEQ.ID.NO:15);
泳道2:Met-Lys-Ala-Lys(pI 10.55)(SEQ.ID.NO:16);
泳道3:Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.82)(SEQ.ID.NO:17);
泳道4:Met-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.99)(SEQ.ID.NO:18);
泳道 5:Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.11)(SEQ.ID.NO:19);
泳道6:Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.21)(SEQ.ID.NO:20);
泳道7:Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.28)(SEQ.ID.NO:21);和,
泳道8:Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI11.41)(SEQ.ID.NO:22);
1b:
M:标记;
泳道1:Met-Ala-Lys(pI 9.90)(SEQ.ID.NO:15);
泳道2:Met-Arg-Ala-Lys(pI 11.52)(SEQ.ID.NO:23);
泳道3:Met-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 12.51)(SEQ.ID.NO:24);
泳道4:Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 12.98)(SEQ.ID.NO:25);
泳道5:Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 13.20)(SEQ.ID.NO:26);和,
泳道6:Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI13.35)(SEQ.ID.NO:27)。
图2是图示通过在重组载体pET22b(+)(ompASP1-7×mefp1*)的前导序列中修饰的克隆进行的黏着蛋白Mefp1(可溶级分:约20μg)的比较可溶性表达的图表(箭头:重组Mefp1)。获自密度计分析的数值表示三种不同克隆中蛋白表达的比较平均值:
(A)SDS-PAGE;
(B)蛋白质印迹;和,
(C)密度计分析
M:标记;
泳道1:Met-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI 2.73)(SEQ.ID.NO:35);
泳道2:Met-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI 2.87)(SEQ.ID.NO:36);
泳道3:Met-Glu-Glu(pI 3.09)(SEQ.ID.NO:37);
泳道4:Met-Ala-Glu(pI 3.25)(SEQ.ID.NO:3 8);
泳道5:Met-Ala-Ala(pI 5.60)(SEQ.ID.NO:39);
泳道6:Met-Cys-His(pI 7.13)(SEQ.ID.NO:40);
泳道7:Met-Ala-His(pI 7.65)(SEQ.ID.NO:41);
泳道8:Met-Ala-Lys(pI 9.90)(SEQ.ID.NO:15);和,
泳道9:Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 12.98)(SEQ.ID.NO:25)。
图3是图示由在前导序列区Met-Glu-Glu(pI 3.09)和因子Xa识别位点(Xa)之间具有不同距离的克隆获得的重组Mefp1融合蛋白(可溶级分:约20μg)的可溶性表达的图(箭头:重组Mefp1):
(A)SDS-PAGE;和
(B)蛋白质印迹;
M:标记;
泳道1:Met-Glu-Glu(pI 3.09)(SEQ.ID.NO:37);
泳道2:Met-Glu-Glu-Xa(pI 4.01)(SEQ.ID.NO:46);
泳道3:Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Xa(pI 4.01)(SEQ.ID.NO:47);
泳道4:Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Xa(pI 4.01)(SEQ.ID.NO:48);和,
泳道5:Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Xa(pI 4.01)(SEQ.ID.NO:49)。
图4是图示由通过修饰pET-22b(+)[ompASP1-11-7×mefp1*](*:Ra-6×His)克隆从而在Lys-Lys之间具有不同长度而设计的前导序列克隆获得的重组Mefp1融合蛋白(可溶级分:约20μg)的可溶性表达的图(箭头:重组Mefp1):
(A)SDS-PAGE;和
(B)蛋白质印迹;
4a:
M:标记;
泳道1:Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Lys(pI10.82)(SEQ.ID.NO:56);
泳道2:Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=0)(SEQ.ID.NO:57);
泳道3:Met-Lys-Ala-Thr-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=2)(SEQ.ID.NO:58);
泳道4:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=4)(SEQ.ID.NO:59);
泳道5:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Lys-Val-Ala-Ala-Ala(pI10.55,d1=6)(SEQ.ID.NO:60);和,
泳道5:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Lys-Ala-Ala(pI10.55,d1=8)(SEQ.ID.NO:61);
4b:
M:标记;
泳道1:Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.82)(SEQ.ID.NO:17);
泳道2:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Lys(pI 10.82,d1=4,d2=1)(SEQ.ID.NO:106);
泳道3:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Lys(pI 10.82,d1=4,d2=2)(SEQ.ID.NO:107);
泳道4:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82,d1=4,d2=3)(SEQ.ID.NO:108);和,
泳道5:Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82,d1=4,d2=4)(SEQ.ID.NO:109)。
图5是图示氨基酸序列pI值和为了提供信号传导功能和分泌增强功能而作为前导序列插入的Met-7×同源氨基酸的疏水性值对ofHepcidin I可溶性表达(可溶级分:约20μg)的影响的图(箭头:ofHepcidin I的重组体):
(A)SDS-PAGE;和
(B)蛋白质印迹;
M:标记;
泳道1:MRRRRRRR(pI 13.28,hy+1.97)(SEQ.ID.NO:70);
泳道2:MKKKKKKK(pI 11.28,hy+1.97)(SEQ.ID.NO:71);
泳道3:MHHHHHHH(pI 8.08,hy-0.35)(SEQ.ID.NO:72);
泳道4:MYYYYYYY(pI 5.59,hy-1.55)(SEQ.ID.NO:73);
泳道5:MCCCCCCC(pI 4.57,hy-0.69)(SEQ.ID.NO:74);
泳道6:MEEEEEEE(pI 2.78,hy+1.97)(SEQ.ID.NO:75);和,
泳道7:MDDDDDDD(pI 2.52,hy+1.97)(SEQ.ID.NO:76)。
图6是图示在由具有受控的pI值的OmpASP片段(Met-2aas)-OmpASP4-10-分泌增强子候选序列-Xa构成的前导序列中N端pI值对分泌增强序列和可溶性表达(可溶级分:约20μg)的影响的图(箭头:ofHepcidin I的重组体):
(A)SDS-PAGE;和
(B)蛋白质印迹;
M:标记;
泳道1:MAH(pI 7.65)-OmpASP4-10(pI 5.70)-6×Arg(pI 13.20;hy+1.75)-Xa(pI 7.05)(SEQ.ID.NO:86);
泳道2:MAH-OmpASP4-10-6×Tyr(pI 5.55;hy-1.33)-Xa(SEQ.ID.NO:87);
泳道3:MAH-OmpASP4-10-6×Glu(pI 2.82;hy+1.75)-Xa(SEQ.ID.NO:88);
泳道4:MAA(pI 5.60)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa(SEQ.ID.NO:89);
泳道5:MAA-OmpASP4-10-6×Tyr-Xa(SEQ.ID.NO:90);
泳道6:MAA-OmpASP4-10-6×Glu-Xa(SEQ.ID.NO:91);
泳道7:MEE(pI 3.09)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa(SEQ.ID.NO:92);
泳道8:MEE-OmpASP4-10-6×Tyr-Xa(SEQ.ID.NO:93);和,
泳道9:MEE-OmpASP4-10-6×Glu-Xa(SEQ.ID.NO:94)。
最佳模式
本发明中使用的术语记述在下文中。
“异源蛋白”或“靶异源蛋白”是本领域中技术人员为了进行大规模生产所靶定的蛋白,其包括可能利用包含编码该蛋白的多核苷酸的重组表达载体在转化体中表达的各种蛋白。
“融合蛋白”指向原始异源蛋白的N端或C端添加另一种氨基酸序列或融合另一种蛋白而生产的蛋白。
“信号序列”是帮助在病毒、原核细胞或真核生物中表达的异源蛋白有效通过胞内膜进行胞外或周质外分泌的有效序列。信号序列由带正电的N区、中间特征性疏水区域和具有裂解位点的C区构成。本发明中使用的信号序列指包含带正电区域、中间特征性疏水区域和具有裂解位点的C端的序列的全长或一部分。
“前导序列”指异源蛋白的N端的氨基酸序列。
“多肽片段”指具有特定多肽功能和最小长度或较大尺寸的多肽序列。除非另外指出,全长多肽不包括在本发明的“多肽片段”中。例如,“包含信号序列N区的多肽片段”指起信号序列功能的缩短的信号序列,且不包括完整的信号序列。
“多核苷酸”指这样的聚合物分子,其中两个以上核酸分子通过磷酸二酯键相连接,其包括DNA和RNA。
“分泌增强子”指由亲水性氨基酸构成的亲水性多肽,其在信号序列或前导序列之后,起增加亲水性的作用。
“信号序列N区”是一般信号序列中保留的一部分,其是强碱性序列,位于N端并根据信号序列,包含1-10个氨基酸。
“中间特异性疏水区域”指在一般信号序列中在N区后的区域,其显示强疏水性,这归因于许多个疏水性氨基酸。
“信号序列片段”指信号序列的一部分,且除非另外指出,其是具有C端缺失的信号序列片段。
“信号序列片段变体”指通过改变信号序列中除第一个氨基酸Met以外的任何序列区域而制备的片段。
“蛋白酶识别位点”指由蛋白酶裂解的特定氨基酸序列区域。
“两亲性结构域”是具有亲水性和疏水性两种区域的结构域,其是具有与跨膜结构域相似的结构的蛋白内部区域。在本发明中,其在含义上等同于“跨膜样结构域”。
“跨膜样(TM样)结构域”指在多肽氨基酸序列分析中预期具有与跨膜蛋白的跨膜结构域相似的结构的区域(Brasseur等,Biochim Biophys Acta(生物化学生物物理学学报)1029(2):267-273,1990)。通常,通过各种预测跨膜结构域的计算机软件容易地预测所述跨膜样结构域。并且所述软件例如TMpred,HMMTOP,TBBpred,DAS-TMfilter(//www.enzim.hu/DAS/DAS.html),等。本文中的“跨膜样结构域”包括被验证具有真正跨膜特征的“跨膜结构域”。
“表达载体”是由与用于载体转录的另外的片段操作性地连接的编码靶多肽的片段构成的线性或环形DNA分子。所述另外的片段包括启动子和终止密码子序列。所述表达载体包含一个或多个起点,一个或多个选择标记,增强子,多腺苷酸化信号和其他。所述表达载体一般源自质粒或病毒DNA或包含来自这二者的元件。
“操作性地连接”意指排列片段以使其起到它们应该起到的功能,例如,一旦在启动子处开始转录,它经过编码片段到达终止密码子。
在下文中,详细描述本发明。
本发明人通过将OmpASP1(Met)和OmpASP1-2(Met-Lys)的编码序列融合于编码黏着蛋白Mefp1的7×mefp1的5’末端,构建了pET-22b(+)(ompASP1-7×mefp1*)和pET-22b(+)(ompASP1-2-7×mefp1*)克隆(见表1),所述OmpASP1(Met)和OmpASP1-2(Met-Lys)是作为在大肠杆菌中诱导蛋白分泌的信号序列的OmpA信号肽(OmpASP)的一部分。用构建的克隆载体转化大肠杆菌BL21(DE3),随后进行表达。结果,仅一个氨基酸(赖氨酸;Lys;K;pI=9.72)的改变使得蛋白Met-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:15)和Met-Lys-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:16)由以上两种克隆的可溶性表达显著不同(见图1a,泳道1和泳道2)。因此,验证了位于N端的影响pI值的Lys在可溶性表达中起重要作用。然后,确定范围为从OmpASPtr的Met末端到N端的倒数第二个氨基酸Lys(Ala-Lys)的序列作为用于计算前导序列pI值的标准。从OmpASP片段(Met[M]或Met-Lys)到Mefp1蛋白的前两个氨基酸(Ala-Lys)的pI值通过利用计算机程序DNASISTM(日立(Hitachi),日本)来分析。结果,Met-Ala-Lys的pI值为9.90且Met-Lys-Ala-Lys的pI值为10.55(见表1)。为了验证以上结果,通过融合与OmpASP1-2相比具有另外一个Lys的信号序列片段OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)(SEQ.ID.NO:17)的编码序列构建pET-22b(+)(ompASP1-3-7×mefp1*)克隆,随后通过与上述相同的方式研究可溶性表达。结果,从OmpASP1-3到前导序列前两个氨基酸(Ala-Lys),即Met-Lys-Lys-Ala-Lys的pI值是10.82,这支持与可溶性表达增加的良好关联性(见图1a,泳道3)。
为了验证pI值的控制是否能够影响可溶性蛋白表达,通过将Lys插入到OmpASP1-3片段和Mefp1的第一个氨基酸Ala之间从而增加pI值来构建pET-22b(+)(ompASP1-3-Lysn-7×mefp1*)克隆。且还通过将Arg插入到Met(OmpASP1)和Mefp1的第一个氨基酸Ala之间从而增加pI值来构建pET-22b(+)(ompASP1-Argn-7×mefp1*)克隆。分析了上述蛋白从N端到Mefp1的前两个氨基酸(Ala-Lys)的pI值(见表1)。用构建的克隆载体转化大肠杆菌BL21(DE3),随后表达。该表达与蛋白Met-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:15),Met-Lys-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:16)和Met-Lys-Lys-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:17)的表达进行比较。结果,其中pI值通过额外的Lys增加至10.99-11.21(SEQ.ID.NO:18-NO:20)的蛋白的可溶性表达与pI值为10.55(SEQ.ID.NO:16)的对照相似(见图1,泳道4-泳道6),但是从pI值11.28(见图1,泳道7)开始减少的表达。特别地,当pI值为11.41(SEQ.ID.NO:22)时,表达显著减少(见图1,泳道8)。以上结果表明,当前导序列的pI值是10.55以上时,pI值特别涉及膜通透性。当前导序列的pI值通过Lys增加至10.82-11.41时,即前导序列具有额外的Lys,即为OmpASP1-3-Lysn-Ala-Lys时,预测该序列具有与具有pI值10.55的OmpASP等价的跨膜通道。
通过添加ArgpI值增加为11.52-13.35(SEQ.ID.NO:23-NO:27)的蛋白的可溶性表达随pI值增加而减少,例外是当与两个Arg相连接的前导序列的pI值是12.51时,该表达略微增加。且当pI值为13.35时,该表达显著减少(见表1和图1b)。在Arg的情形中,推测两个Arg相连接(见图1b,泳道3)的区域的减小的分子量是由通过蛋白酶裂解前导序列的一部分引起的。因此,假定在其序列OmpASP1-Argn-Ala-Lys中包含额外的Arg的前导序列普遍具有Arg特异性膜通透性。然而,本文中没有解释Arg特异性膜通透性机制和TAT(双-精氨酸-易位)系统的信号序列(Berks,Mol.Microbiol.(分子微生物学)22:393-404,1966)之间的相互关系。
为了研究具有低可控的pI值的前导序列的N端对靶蛋白可溶性表达的影响,将pET-22b(+)(ompASP1-7×mefp1*)用作对照,并区别性修饰前导序列Met-Ala-Lys的Ala-Lys,以将pI值调节至2.73-7.65(SEQ.ID.NO:35-NO:41),由此形成前导序列变体(MDDDDDAA;pI2.73,MDDDAA;pI2.87,MEE;pI3.09,MAE;pI3.25,MAA;pI5.60,MCH;pI7.13,MAH;pI7.65)的构建(见表2),随后研究它们的表达。结果,当pI值为2.87-7.65时,黏着蛋白Mefp1的可溶性表达类似或高于pI值为9.90的对照的可溶性表达。特别地,该表达在pI值为3.09(SEQ.ID.NO:37)时最高(见图2,泳道3)。表达模式如下:存在两种类型的表达(在pI值2.73-3.25时的Asp/Glu特异性表达和在pI值3.25-9.90时的表达的适度增加)。因此,验证了在由具有下调的(down-controlled)pI的前导序列中的N端pI值诱导的黏着蛋白Mefp1可溶性表达中存在2种不同的型谱。即,N端的pI值控制影响可溶性蛋白表达。前导序列N端变体,MAA(pI5.60)(SEQ.ID.NO:39),MCH(pI7.13)(SEQ.ID.NO:40)和MAH(pI7.65)(SEQ.ID.NO:41),是与电荷具有弱相互关系的序列。由于变体的短序列,不太可能存在记述在韩国专利公开号10-2007-0009453中的分泌增强子。因此,表达通过前导序列N端变体的pI值来调节。如前文所述,由pET-22b(+)(ompASP1-3-Lysn-7×mefp1*)或pET-22b(+)(ompASP1-Argn-7×mefp1*)表达的、在前导序列中具有高+电荷的黏着蛋白Mefp1的表达,和在前导序列MDDDDDAA(SEQ.ID.NO:35)中具有强-电荷的黏着蛋白Mefp1的表达与电荷无关。
基于以上结果,研究了pI依赖性可溶性表达模式。在黏着蛋白Mefp1在高pI下的可溶性表达的情形中,①在pI值约10.82(9.90-11.41)时涉及Lys特异性膜通透机制,且②在pI值约12.51,其中具有Arg(11.52-13.35)时,涉及Arg特异性膜通透机制。在宽的pI低范围(2.73-9.90)内,③在低pI值(2.73-3.25)时涉及Asp/Glu特异性膜通透机制和④在pI值3.25-9.90时涉及相当的非特异性膜通透机制。因此,假设具有高pI值的前导序列具有Lys特异性OmpASP Sec系统(pI 9.90-11.41)和Arg特异性膜通透机制(pl 11.52-13.35),具有宽的pI低范围(pI 2.73-9.90)的前导序列具有Asp/Glu特异性膜通透机制(pI 2.73-3.25,最适pI:3.09)并具有相当的非特异性膜通透性,即在无3.25-9.90范围内的中点pI值条件下的一种被动膜通透机制。以上四种膜通透机制与表达和电荷增加无关。因此,pI值与蛋白膜通透性之间相互关系的分析结果可以有效用于基于膜通透机制对可溶性重组蛋白表达的进一步研究。
在11.41和13.35的高pI值下表现出低表达率的前导序列(SEQ.ID.NO:22和SEQ.ID.NO:27)具有相当高的亲水性值1.93,且在低pI值2.73下表现出低表达率的前导序列(SEQ.ID.NO:35)也具有相当高的亲水性值1.09。前导序列中显著增加的亲水性可能通过诱导具有脂双层膜的亲水性跨膜样结构域的结合而导致膜通透性的减小,这与以前的专利申请(韩国专利公开号10-2007-0009453)中提出的假说相一致,该假说认为亲水性跨膜样结构域抑制牙鲆Hepcidin I的可溶性表达。然而,当添加Lys时,前导序列(SEQ.ID.NO:18-21)的亲水性可以在一定程度上被抵消,尽管该前导序列仍具有高亲水性。因此,非常有趣的是,添加Lys导致膜通透性的增加。
由关于由MEE(pI 3.09)(SEQ.ID.NO:37)增加的表达的研究,判断黏着异源蛋白Mefp1的前导序列的最适pI之一是3.09。为了最优化前导序列变体和与其相连接的异源蛋白之间的距离和为了生产具有天然氨基端的蛋白,将因子Xa识别位点(Xa)插入序列中,由此形成MEE(i=n)-Xa,并将不影响pI值的OmpASP4-9的氨基酸作为插入物插入到()中(i)=n(0,2,4,6)。结果,构建了pET-22b(+)(MEE-(i=n)-Xa-7×mefp1*)(见表3)。当没有氨基酸插入到MEE和Xa之间时,和当有2个氨基酸插入其中时,可溶性蛋白的表达最高(见图3)。即,前导序列和因子Xa识别位点之间的距离在i=0-2时最适合。本文中的可溶性蛋白包含因子Xa识别位点,因此通过按照本领域中技术人员已知的常规方法用因子Xa蛋白酶处理,其可以作为具有天然N端形式的重组蛋白而产生。
在验证信号序列的N端的pI值可以影响黏着蛋白Mefp1的可溶性表达后,本发明人试图验证影响pI的氨基酸(例如Lys)的距离是否可能是影响蛋白可溶性表达的因素。在蛋白的N端中,前导序列MKAK和MKK具有相同的pI值,但当2个Lys-Lys由于在Lys-Lys之间插入非pI特异性氨基酸诸如Ala(丙氨酸;A)而远离时,可能存在功能差异。因此,基于信号序列OmpASP片段的氨基酸序列,构建MK1-(d=n)-K2-(8-n),并将不影响pI值的OmpASP1-11的氨基酸以d1=n(0,2,4,6,8)插入(),由此形成pET-22b(+)[MK1-(d1=n)-K2-(8-n)-AA-mefp13-10-6×mefp1*]克隆的构建(见表4)。结果,当d1=4时,说明2个Ks之间的距离(d1=K1-K2的距离)是4,可溶性蛋白的表达最显著(见表4和图4a)。即,当d1=4时,氨基酸的距离是最优化的。另外,当d1=4时,该克隆的Ala(下划线部分)被Lys(K3)取代并且将Ala(d2=n(1,2,3,4)插入到K2和K3之间,由此导致pET-22b(+)[MK1-(d1=4)-K2-(d2=n)-AK3-mefp13-10-6×mefp1*]的构建(见表4)。结果,2个Ks之间的最适距离(d2=K2-K3的距离)是d2=2>1>4>3。这些结果表明距离与黏着蛋白Mefp1的可溶性表达直接相关。以上结果还提示表达中的重要因子不是序列而是pI值和前导序列中Lys-Lys之间的距离(见表4和图4b)。
如图1a泳道1中所示,黏着蛋白Mefp1是这样的蛋白,其能够通过使信号序列的仅Met与蛋白的N端附着而被可溶性表达。黏着蛋白Mefp1的可溶性表达可以通过调节信号序列和前导序列的pI值和pI特异性氨基酸之间的距离来增加。牙鲆Hepcidin I蛋白包含两亲性结构域或跨膜样结构域。根据韩国专利公开号10-2007-0009453,该蛋白仅在添加具有信号序列功能和亲水性足够高以至于抵消内部TM样结构域的分泌增强子时,可以被可溶性表达。为了牙鲆Hepcidin I蛋白的可溶性表达,本发明人将N端的前导序列设计为M-7×同源氨基酸,从而起信号序列的作用且同时起分泌增强子的作用,并然后构建pET-22b(+)(ompASP1-7×同源氨基酸-ofhep I**),以表达具有2.52-13.28的受控pI值和-1.55-+1.97的疏水性的蛋白(见表5)。本文中的同源氨基酸选自由精氨酸(Arg;R),赖氨酸(Lys,K),组氨酸(His;H),酪氨酸(Tyr;Y),半胱氨酸(Cys;C),谷氨酸(Glu;E)和天冬氨酸(Asp;D)组成的组,其应该具有7个重复。疏水性由DNASISTM(日立(Hitachi),日本),以Hopp & Woods等级(窗尺寸(window size):6,阈值:0.00)来测量。如果疏水性值是+,则意味着肽是亲水性的,而如果疏水性值是-,则肽是疏水性的。这时,随着绝对值增加,亲水性或疏水性增加。研究了那些蛋白的表达。结果,仅在具有MRRRRRRR序列(pI 13.28,亲水性值+1.97)(SEQ.ID.NO:70)和MKKKKKKK序列(pI 11.28,亲水性值+1.97)(SEQ.ID.NO:71)的那些克隆中观察到Hepcidin I的可溶性表达(见图5)。这些前导序列保持作为信号序列(MRRRRRRR和MKKKKKKK)的高pI值和作为分泌增强子(RRRRRRR和KKKKKKK)的高pI值和高亲水性。该结果与韩国专利公开号10-2007-0009453的说明书相一致,该说明书认为牙鲆Hepcidin I的可溶性表达需要信号序列的高pI值和比该序列中包括的两亲性结构域或跨膜样结构域更高的亲水性值。然而,尽管与那些前导序列(MRRRRRRR和MKKKKKKK)相似的序列,MKK(K)n(n=6)AK和M(R)n(n=8)AK序列与作为对照的MAK相比,几乎不能增加黏着蛋白Mefp1的可溶性表达。韩国专利公开号10-2007-0009453还描述黏着蛋白Mefp1的可溶性分泌可以通过用与6×Arg或6×Lys相对应的核苷酸取代pET-22b(+)(ompASP1-8-SmaI-Xa-7×mefp1*)的Sma I而略微增加,但是该增加不如在牙鲆Hepcidin I的分泌增强子序列中所示的显著(数据未显示)。因此,非常难以判断牙鲆Hepcidin I的这些前导序列(MRRRRRRR和MKKKKKKK)是起信号序列或分泌增强子或二者的作用(在单独的Met起前导序列作用的情形中,pI:5.70)。
为了研究修饰的信号序列的低pI值对牙鲆Hepcidin I的可溶性表达的影响,本发明人制备了这样的蛋白,在该蛋白中信号序列变体(MAH;pI7.65,MAA;pI5.60或MEE;pI3.09),OmpASP4-10-6×同源氨基酸和Xa识别位点(Xa)与蛋白的N端中的ofHepI相连接,并然后利用具有受控pI和疏水性/亲水性值的前导序列构建了用于表达该蛋白的克隆(见表6)。由研究所述克隆的可溶性表达的结果,证实该可溶性蛋白在pET-22b(+)[MAH(pI 7.65)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**]和pET-22b(+)[MAA(pI 5.60)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**]中充分表达,而该蛋白表达在pET-22b(+)[MEE(pI 3.09)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**]中很弱。然而,可溶性表达在pET-22b(+)[MEE(pI3.09)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHep I**]是中等的(见图6)。以上结果表明,牙鲆Hepcidin I的可溶性表达可能不仅在将蛋白的N端设计为具有高pI值(10.55)的信号序列片段(OmpASP1-10)和高pI值和高亲水性的6×Arg和6×Lys作为分泌增强子的情形中(韩国专利公开号10-2007-0009453),而且在将蛋白的N端设计为具有低pI值的信号序列片段和低pI值但高亲水性的6×Glu作为分泌增强子的情形中被诱导。
通过观察牙鲆Hepcidin I的可溶性表达,公开了信号序列片段的pI值与分泌增强子序列的pI值和亲水性紧密相关。即,当信号序列的pI值是5.60,7.65和10.55时,需要包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子,而当信号序列片段的pI值低如3.09时,不仅可以使用包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子,而且可以使用包含具有低pI值但高亲水性的氨基酸的另一种分泌增强子。因此,非常可能的是,信号序列片段的pI值决定分泌增强子的特性,诸如控制pI值和亲水性,并且因此信号序列片段的pI值与分泌增强子紧密相关。
以上结果仅限于这样的情形,所述情形是当分泌增强子候选序列与N端中的Met直接相连接时,可溶性表达由Arg和Lys,即具有高pI值和高亲水性的氨基酸诱导。当控制包含疏水区域的信号序列片段的N端的pI值时,不仅包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的序列而且包含具有低pI值但高亲水性的氨基酸如Glu的序列,可以用作分泌增强子序列,这提示分泌增强子序列具有广泛范围的可用性。因此,亲水性分泌增强子序列的范围可以通过将疏水性片段与具有受控pI值的前导序列的N端相连接来降低N端的亲水性而得到扩展。
该结果还提示信号序列片段的pI值和修饰的信号序列片段的pI值在牙鲆Hepcidin I中具有它们各自的型谱。信号序列片段的pI值的范围影响分泌增强子的功能。因此,当控制信号序列中pI值为低至3.09时,Hepcidin I的可溶性表达被具有高pI值和高亲水性的起分泌增强子作用的6×Arg和具有低pI值但高亲水性的起另一种分泌增强子作用的6×Glu诱导。在其他pI值诸如5.60,7.65,和10.55时,该蛋白的可溶性表达仅被具有高pI值和高亲水性的起分泌增强子作用的6×Arg诱导。然而,当前导序列的pI值为3.09,5.60,和7.65时,如图2中所示,推定该pI值参与膜通透过程,这与由黏着蛋白Mefp1的前导序列的宽pI谱诱导的膜通透机制类似。然而,当前导序列的pI值为10.55时,如图1中所示,所述可溶性表达受OmpASP片段特异性pI值控制。
总之,信号序列片段pI值和前导序列片段的pI值在黏着蛋白Mefp1的可溶性表达中起关键作用,但与电荷无关。本发明人首先证实了黏着蛋白Mefp1的可溶性表达和前导序列的pI值之间的相互关系。具体地,本发明人发现了Lys特异性膜通透机制(pI 9.90-11.41),Arg特异性膜通透机制(pI 11.52-13.35),Asp/Glu特异性膜通透机制(pI 2.73-3.25)和非特异性膜通透机制(pI 3.25-9.90)。然而,当将分泌增强子序列多聚Lys和多聚Arg(韩国专利公开号10-2007-0009453)与黏着蛋白Mefp1的前导序列相连接时,蛋白的表达没有增加很多,这提示前导序列和分泌增强子之间的结合不影响不包含跨膜样结构域的所述蛋白的表达。本发明人还首先证实了对表达最适的条件是当前导序列与因子Xa识别位点相连接时和当适当控制信号序列中Lys-Lys之间的距离时。
在具有跨膜样结构域的牙鲆Hepcidin I中,可溶性表达在仅有信号序列片段的pI值和前导序列的pI值的条件下非常弱或或不可能。然而,当分泌增强子候选序列与Met直接相连接时,可溶性表达受具有高pI值和高亲水性的Arg和Lys诱导,且当具有高pI值和亲水性的分泌增强子序列与具有受控pI的信号序列片段相连接从而具有宽pI谱时,可溶性表达被诱导。当具有低pI值的前导序列与包含具有高pI值和亲水性的氨基酸的分泌增强子和包含具有低pI值但高亲水性的氨基酸的分泌增强子相连接时,也检测到表达。该结果支持以前的结果,即黏着蛋白Mefp1的表达可以在信号序列片段和前导序列的宽pI谱中被诱导。但是,分泌增强子序列通常需要具有高亲水性的氨基酸,与pI值无关。因此,为了诱导可溶性表达,亲水性必须高于牙鲆Hepcidin I中的跨膜样结构域的亲水性。
与当分泌增强子候选序列与Met直接相连接时相比,当改变包含疏水区域的信号序列片段的N端pI值时,可用的分泌增强子序列的谱变宽。该结果提示与信号序列相连接的疏水区域降低前导序列(在信号序列的N端中具有受控pI值的序列)的N端的亲水性,这使得前导序列自由地起锚定物的作用,从而使亲水性分泌增强子序列的膜通透范围增大。而且,推定前导序列的N端pI值和分泌增强子序列之间存在特定的相互作用。
在下文中,详细描述本发明的优选实施方案。
本发明提供包含基因构建体的、用于提高异源蛋白的分泌效率的分泌载体,其包括(i)启动子和(ii)与所述启动子操作性相连接的编码多肽片段的多核苷酸,所述多肽片段包含信号序列,和/或异源蛋白的前导序列的N区的pI值和/或其中影响pI值的氨基酸之间的距离受控的前导序列或其变体的N区的pI值。
本文中的启动子优选源自病毒、原核生物或真核生物。病毒来源的启动子的实例是巨细胞病毒(CMV)启动子,多瘤病毒启动子,禽痘病毒启动子,腺病毒启动子,牛乳头瘤病毒启动子,禽类肉瘤病毒启动子,反转录病毒启动子,乙型肝炎病毒启动子,单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子和猿猴病毒40(SV40)启动子,但不总是限于这些。原核生物来源的启动子的实例是T7启动子,SP6启动子,热激蛋白70启动子,β-内酰胺酶,乳糖启动子,碱性磷酸酶启动子,色氨酸启动子和tac启动子,但不总是限于这些。真核生物来源的启动子优选是酵母来源的启动子、植物来源的启动子或动物细胞来源的启动子。所述酵母来源的启动子的实例是3-磷酸甘油酸激酶启动子, 烯醇化酶启动子, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphate dihydrogenase)启动子,己糖激酶启动子,丙酮酸二羧化酶启动子,果糖磷酸激酶启动子,葡萄糖-6-磷酸异构酶启动子,3-磷酸甘油酸变位酶启动子,丙酮酸激酶启动子,丙糖磷酸异构酶(triosphosphate isomerase)启动子,磷酸葡萄糖异构酶启动子,葡糖激酶启动子,醇脱氢酶2启动子,异细胞色素C(isocytochrome C)启动子,酸性磷酸酶启动子,酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GAL1启动子,酿酒酵母GAL7启动子,酿酒酵母GAL10启动子和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)AOX1启动子,但不总限于这些。所述动物细胞来源的启动子的实例是热激蛋白启动子、肌动蛋白前体(proactin)启动子和免疫球蛋白启动子,但不总限于这些。在本发明中,可以使用能够在宿主细胞中表达外源基因的任何启动子。
本文的信号序列优选源自病毒、原核生物或真核生物,其示例是OmpA信号序列,CT-B(霍乱毒素亚基B)信号序列,LT II b-B(大肠杆菌热不稳定的肠毒素B亚基)信号序列,BAP(细菌碱性磷酸酶)信号序列(Izard和Kendall,Mol.Microbiol.(分子微生物学)13:765-773,1994),酵母羧肽酶Y信号序列(Blachly-Dyson和Stevens,J.Cell.Biol.(细胞生物学杂志)104:1183-1191,1987),乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)杀伤毒素γ亚基信号序列(Stark和Boyd.EMBO J.5(8):1995-2002,1986),牛生长激素信号序列(Lewin,B.(编),GENES V(基因V),第290页.牛津大学出版社,1994),流感神经氨酸酶信号-锚定(Lewin,B.(编),GENES V(基因V),第297页.牛津大学出版社,1994),易位子-相关蛋白亚基α(TRAP-α)信号序列(Prehn等,Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)188(2):439-445,1990)和双精氨酸易位(Tat)信号序列(Robisnon,Biol.Chem.(生物化学)381(2):89-93.2000),但不总是限于这些。
具有受控pI值的包含N-区的多肽片段优选是由1-6个氨基酸组成的多肽,其pI值被控制为9.90-11.41,或是由1-12个氨基酸组成的多肽,其pI值被控制为3.09-9.90,但不总是限于这些。所述肽的氨基酸可以被另一种氨基酸取代或所述肽的氨基酸序列和长度可以鉴于N区的pI值而被修饰。在本发明的优选实施方案中,为了异源蛋白的可溶性表达,可以筛选包含信号序列N区的多肽片段的pI值(见图1和表1)。同时,可以调节前导序列中可以影响pI值的氨基酸之间的距离,以获得异源蛋白的最佳可溶性表达(见图1-4和表1-4)。
所述多肽片段的pI值可以通过将另外的可以改变pI值的氨基酸插入到N区氨基酸之间来控制。具体地,该片段的pI值可以通过插入另外的碱性氨基酸诸如Lys,Arg和His等增加。相反,pI值可以通过添加酸性氨基酸诸如Asp和Glu来减小。为了调节氨基酸之间的距离,该距离是影响pI值的重要因素,可以另外添加选自由Gln,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Met,Cys和Pro组成的组中的非极性中性氨基酸,或选自由Ser,Thr,Tyr,Asn和Gln组成的组中的极性中性氨基酸。用于取代氨基酸的方法是本领域中技术人员公知的(Sambrook等,1989.″Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册)″,第2版.Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),冷泉港,纽约)。
在本发明的优选实施方案中,编码蛋白酶识别位点的多核苷酸操作性性地与编码pI值受控的具有N-区的多肽片段的多核苷酸连接(参见表3)。本文的蛋白酶识别位点可以是下列各项中的一种:因子Xa识别位点、肠激酶识别位点、genenase I识别位点和弗林蛋白酶识别位点,或可以由两个或更多个顺序排列的识别位点组成。如果蛋白酶识别位点是因子Xa识别位点,那么其优选由Ile-Glu-Gly-Arg组成。还优选将选自由Gln,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Met,Cys和Pro组成的组中的非极性中性氨基酸,或选自由Ser,Thr,Tyr,Asn和Gln组成的组中的极性中性氨基酸插入到编码包含具有受控pI值的N区的多肽片段的多核苷酸和编码蛋白酶识别位点的核苷酸之间,从而将氨基酸之间的距离调节为0-2。在本发明的优选实施方案中,通过使蛋白酶识别位点与编码pI值受控的具有N区的多肽片段的多核苷酸相连接而产生最适距离(见表3和图3)。
在本发明的另一个优选实施方案中,本发明的表达载体另外包括用于插入编码异源蛋白的基因的蛋白酶识别位点。本文中的蛋白酶识别位点连接到编码具有受控pI值的包含信号序列N区的多肽片段的多核苷酸之后。在包含编码分泌增强子的多核苷酸的载体中,该位点连接到该多核苷酸之后。在包含编码蛋白酶识别位点的多核苷酸的载体中,可以或可以不加入蛋白酶识别位点。通过使用蛋白酶识别位点克隆编码异源蛋白的基因可能不利于生产处于天然形式的蛋白。
在所述载体中可以另外包括编码异源蛋白的基因。异源蛋白不受限且可以接受本领域中技术人员优选的任何蛋白。而且,选自由抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清、和细胞蛋白组成的组的任何蛋白可以作为重组融合蛋白表达。本文中的异源蛋白优选是不含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中一种或多种的蛋白,其优选是Mefp1聚合物,但不总是限于这些。
本发明还提供用于提高异源蛋白的分泌效率的表达载体,所述表达载体包含基因构建体,其包括:(i)启动子;(ii)与所述启动子操作性相连接的编码多肽片段或其变体的多核苷酸,在所述多肽片段中,pI值受到调控,所述多肽片段包含信号序列区段和/或异源蛋白的前导序列的N区;和(iii)与所述多肽片段或其变体操作性相连接的编码分泌增强子的多核苷酸,所述分泌增强子包括具有受控pI值的亲水性增强序列。
以上异源蛋白优选是包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白。提示包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白的具有+电荷的区域粘附在膜的脂双层上,并且该结构起锚定物样作用以抑制胞外分泌。本发明的表达载体有助于所述难以胞外分泌的蛋白的胞外分泌。因此本发明的载体适合于具有跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白的可溶性生产。当修饰的信号序列具有方向信号和高于异源靶蛋白的跨膜结构域所具有的亲水性时,新生多肽分泌到周质外。这似乎是因为信号序列的方向信号和亲水性高于粘附脂双层的倾向,从而使结构域的分泌加快。包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的异种蛋白优选是牙鲆Hepcidin I,但不总是限于此。
如果通过疏水性(亲水性)特征分析检测到跨膜样结构域或在由一系列多个疏水性氨基酸组成的序列后的由一系列多个亲水性氨基酸组成的序列而将蛋白质鉴定为具有跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白质,则可以将该蛋白应用于本发明的表达系统。为了决定,可以使用这样的计算机软件如DNASISTM(日立(Hitachi),日本),DOMpro(Cheng等,Knowledge Discovery and Data Mining(知识发现和数据采集)13(1):1-20,2006;//www.ics.uci.edu/~baldig/dompro.html),TMpred(//www.ch.embnet.org /software/TMPRED_form.html),HMMTOP(//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html),TBBpred(//www.imtech.res.in/raghava/tbbpred/)和DAS-TMfilter (//www.enzim.hu/DAS/DAS.html)。
本发明(iii)的分泌增强子的pI值优选由(ii)的多肽片段的pI值改变。具体地,当将多肽片段的pI值控制为5-11时,分泌增强子的pI值优选控制为11-14。当将多肽片段的pI值控制为2-5时,分泌增强子的pI值优选控制为2-14。所述多肽片段可以另外包括选自由Lys,Arg和His组成的组中的碱性氨基酸,或该片段的内部酸性氨基酸之一可以被碱性氨基酸取代从而增加pI值。或者,可以另外将酸性氨基酸诸如Asp或Glu插入到该片段中或其内部碱性氨基酸之一可以被酸性氨基酸取代以减小pI值。在本发明的优选实施方案中,由牙鲆Hepcidin I的可溶性表达检验,验证了信号序列的pI值和分泌增强子序列的pI值和亲水性彼此密切相关。当信号序列片段的pI值为5.60,7.65或10.55时,需要包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子。同时,当信号序列片段的pI值低至3.09时,可以使用包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子和/或包含具有低pI值但高亲水性的氨基酸的另一种分泌增强子(见表5、表6、图5和图6)。
编码分泌增强子的多核苷酸可以与编码pI值受控的具有本发明载体的N区的多肽片段的多核苷酸操作性地连接。本文中的分泌增强子由具有受控pI值的亲水性增强序列组成,由其增加信号序列的亲水性从而诱导异源蛋白向周质外分泌。本文中的分泌增强子是由至少60%,优选至少65%,和更优选至少70%的亲水性氨基酸组成的亲水性肽,且其长度不受限,但优选为2-50个氨基酸,且更优选为4-25个氨基酸,且最优选为6-20个氨基酸长。所述增强子的最优选实例之一是具有6个亲水性氨基酸重复的多肽。本文中,亲水性氨基酸不受限,但优选是Asn,Gln,Ser,Lys,Arg,Asp或Glu,且更优选是Lys,Arg,Glu或Asp。为了异源蛋白的可溶性表达,可以筛选分泌增强子的pI值。即,所述多肽的信号序列和前导序列的氨基酸序列和长度可以基于分泌增强子的pI控制而调节到有利于异源蛋白可溶性表达的特定范围(见表5、表6、图5和图6)。
在本发明的表达载体中,将编码分泌增强子的多核苷酸插入到编码具有受控pI值的包含N区的多肽片段的多核苷酸和编码蛋白酶识别位点的多核苷酸之间(见表6)。且该插入优选通过用产生平端的蛋白酶诸如SmaI消化的蛋白酶识别位点进行。所述蛋白酶识别位点选自由因子Xa识别位点、肠激酶识别位点、genenase I识别位点和弗林蛋白酶识别位点组成的组。所述蛋白酶识别位点可以单独使用或在融合时使用。
在本发明的优选实施方案中,本发明的表达载体包含与编码分泌增强子的多核苷酸相连接的基因构建体,用于插入外源基因的蛋白酶识别位点,和与所述基因构建体操作性相连接的编码异源蛋白的多核苷酸。外源基因可以克隆到蛋白酶识别位点中。本发明的表达载体可以另外包括编码蛋白酶识别位点的多核苷酸。同时,该多核苷酸与上述多核苷酸框内相连接,从而在分泌和用蛋白酶分裂后生成天然形式的所插入的异源蛋白。
本发明还提供通过用所述表达载体转化宿主细胞产生的转化体。
本文中的宿主细胞优选是原核细胞或真核细胞,但不总是限于此。而且,本文中的原核细胞优选选自由病毒、大肠杆菌和芽孢杆菌属(Bacillus)组成的组,但不总是限于此。本文中的真核细胞优选是哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母或植物细胞,但不总是限于此。
本发明还提供利用所述转化体提高重组蛋白分泌效率的方法。
具体地,本发明提供用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)从步骤5)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
另外,本发明提供用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)从步骤4)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
在本发明的优选实施方案中,为了黏着蛋白Mefp1的可溶性表达而控制前导序列的pI值。结果,当将该pI值控制为9.90-11.41(见表1和图1)或当将该pI值控制为3.09-9.90时,该蛋白的可溶性表达最显著(见表2和图2)。而且,将前导序列的pI值控制为10.55和10.82,且通过加入不影响pI值的氨基酸调节影响pI值的Lys-Lys之间的距离。结果,本发明人确定用于表达的最适距离(见表4和图4)。
步骤2)中影响pI值的所述氨基酸优选是Lys。
本文中的异源蛋白不受限且可以是本领域中技术人员可以接受的任意蛋白,其可以利用选自由抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清、和细胞蛋白组成的组的蛋白表达为重组融合蛋白。异源蛋白优选是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白,其优选是Mefp1聚合物,但不总是限于此。
本发明还提供用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)从步骤4)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域,蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;和
7)从步骤6)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
本文中的异源蛋白优选是包含跨膜结构域,跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白,但不总是限于此。
本发明的分泌增强子的pI值优选由所述多肽片段的pI值改变。具体地,当将多肽片段的pI值控制为5-11时,分泌增强子的pI值优选控制为11-14。当将多肽片段的pI值控制为2-5时,分泌增强子的pI值优选控制为2-14。所述多肽片段可以另外包括选自由Lys,Arg和His组成的组中的碱性氨基酸,或该片段的内部酸性氨基酸之一可以被碱性氨基酸取代从而增加pI值。或者,可以另外将酸性氨基酸诸如Asp或Glu插入到该片段中或其内部碱性氨基酸之一可以被酸性氨基酸取代以减小pI值。在本发明的优选实施方案中,由牙鲆Hepcidin I的可溶性表达检验,验证了信号序列的pI值和分泌增强子序列的pI值和亲水性彼此密切相关。当信号序列片段的pI值为5.60,7.65或10.55时,需要包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子。同时,当信号序列片段的pI值低至3.09时,可以使用包含具有高pI值和高亲水性的氨基酸的分泌增强子和/或包含具有低pI值但高亲水性的氨基酸的另一种分泌增强子(见表5、表6、图5和图6)。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域,蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;和
7)从步骤6)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
本文中的重组融合异源蛋白可以通过在用所述表达载体转化的转化体中表达所述蛋白并且从中回收所述蛋白来生产。用于回收蛋白的方法可以在本领域中技术人员已知的常规方法中选择。
异源蛋白不受限,且可以接受本领域中技术人员优选的任何蛋白。而且,选自由抗原、抗体、细胞受体、酶、结构蛋白、血清、和细胞蛋白组成的组的任何蛋白可以作为重组融合蛋白表达。本文中的异源蛋白优选是不含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域的蛋白,其优选是Mefp1聚合物,但不总是限于这些。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
本发明还提供用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
本文中的异源蛋白优选是包含跨膜结构域,跨膜样结构域或两亲性结构域的蛋白,但不总是限于此。
如果将靶向脑的治疗性蛋白质,例如,β-淀粉状蛋白特异的scFv(单链可变片段)用作异源蛋白,那么通过本发明的方法由修饰的信号序列和异源蛋白的融合而产生的融合蛋白可以通过血脑屏障,直接作用于脑,这与一般蛋白不同。因此,本发明的方法是发展用于治疗脑疾病的药物递送系统中的显著势头。除通过血脑屏障的优势外,通过本发明的方法制备的融合异源蛋白可以体内任何部分递送,因为它可以在胃中被分解前穿过胃壁并可以在施用于或贴附在皮肤上时透过皮肤并涂入体内。因此,本发明的方法克服了常规蛋白制剂在施药方法(静脉内注射、肌内注射、皮下注射或鼻施药)的局限,从而促进更简单的施药方法诸如口服施药和经皮施药。
本发明提供通过所述方法制备的重组融合异源蛋白。
本发明的异源蛋白不受限,但优选靶向脑的治疗性蛋白。由本发明的方法制备的重组融合异源蛋白内含跨膜结构域,所述跨膜结构域通过包含修饰的信号序列而可以通过血脑屏障。此外,本发明还提供药物组合物,其包含修饰信号序列和异源蛋白的重组融合异源蛋白和药用载体。所述药用组合物优选用于治疗脑疾病,但不总是限于此。
本发明还提供药物组合物,其包含重组融合异源蛋白和药用载体。
期望所述药物组合物增加用于脑疾病诸如中风和老年性痴呆(阿尔茨海默病)的常规治疗性蛋白的递送效率。
本发明的药物组合物可以通过可以将药物递送到靶区域内的任何常规途径,特别是通过局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下、眼部或经皮施用来施用。该组合物可以配制为溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊剂和缓释制剂,且优选是可注射的溶液。为了制备可注射的溶液,可以加入灭菌的等渗溶液或盐水,且可注射的溶液可以通过皮下注射、肌内注射和静脉内注射来施用。该组合物的有效剂量可以由本领域中技术人员通过考虑疾病的严重性和类型、年龄、性别、施药方法、靶细胞、表达水平等来确定。
本发明的药物组合物可以另外地包括药用载体,例如,赋形剂、崩解剂、甜味剂、润滑剂和调味剂。所述崩解剂的实例为羟基乙酸淀粉钠(sodium starch glycolate)、交聚维酮(crospovidone)、交联羧甲纤维素钠(croscarmellose sodium)、褐藻酸(alginic acid)、羧甲基纤维素钙(calcium carboxymethyl cellulose)、羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl cellulose)、脱乙酰壳多糖(chitosan)、瓜尔胶(guar gum)、低取代的羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)、硅酸镁铝(magnesium aluminum silicate)、聚克立林钾(polacrilin potassium)等。本发明的药物组合物可以另外包括药用添加剂,其实例为淀粉、胶凝淀粉、微晶纤维素、乳糖、聚乙烯吡咯烷酮(povidone)、胶状二氧化硅、磷酸氢钙、乳糖、甘露醇、乳脂糖(taffy)、阿拉伯橡胶(Arabia rubber)、预胶化淀粉(pregelatinized starch)、玉米淀粉、纤维素粉末、羟丙基纤维素、欧巴代(Opadry)、卡那巴蜡(carunauba wax)、合成硅酸铝、硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸铝、硬脂酸钙、精制糖(white sugar)、葡萄糖、山梨醇、滑石等。本文中的药用添加剂优选以0.1-90重量份加入药物组合物。
用于口服施药的固体制剂是粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、软胶囊剂和丸剂。用于口服施药的液体制剂是混悬液、溶液、乳剂、糖浆剂和气雾剂,且上述制剂除一般使用的简单稀释剂诸如水和液体石蜡以外,可以包含多种赋形剂诸如湿润剂、甜味剂、芳香剂和防腐剂。对于肠胃外施药的制剂,可以常规制备粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、灭菌的混悬液、液体、水不溶性赋形剂、混悬液、乳剂、糖浆剂、栓剂、外用诸如气雾剂和灭菌的注射剂,且优选地可以制备皮肤外用药物组合物诸如膏剂、凝胶、贴剂、喷雾剂、软膏、硬膏、洗剂、擦剂、糊剂或泥敷剂(cataplasm),但不总是限于此。水不溶性赋形剂和混悬液除一种或多种活性化合物外可以包含丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射酯如ethylolate等。栓剂除一种或多种活性化合物外可以包含witepsol、聚乙二醇(macrogol)、吐温61、可可油脂、月桂精油脂(laurin butter)、甘油明胶(glycerogelatin)等。
本发明的药用组合物的有效剂量可以由本领域中技术人员根据活性成分的吸收、失活率、排泄率、年龄、性别、健康状况和疾病严重性来确定。在口服施药的情形中,药物组合物可以以0.0001-100mg/kg/日对成人施用,和更优选以0.001-100mg/kg/日施用。施药频率是一天一次或一天几次。所述剂量不以任何方式限制本发明的范围。
本发明还提供用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法。
具体地,本发明提供用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括下列步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;
7)从步骤6)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白;和
8)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤7)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
本文中的异源蛋白优选是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的影响pI值的所述氨基酸可以是Lys。
具体地,本发明还提供用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括下列步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
本文中的异源蛋白特别是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
本发明还提供生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
本文中的异源蛋白特别是包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的所述亲水性分泌增强子的pI 值控制为11-14。
本发明还提供生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
本文中的异源蛋白特别是包含跨膜结构域、跨膜样结构域或两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的所述亲水性分泌增强子的pI值控制为2-14。
本发明还提供用于生产用于将靶物质递送到细胞内的胞内载体的方法。
具体地,本发明提供用于生产用于将靶物质递送到细胞内的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;
7)从步骤6)的培养液中分离所述融合异源蛋白;
8)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤7)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
9)将步骤8)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽与应递送到所述细胞中的靶物质组合。
本文中的异源蛋白优选是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的影响pI值的氨基酸可以是Lys。
本文中应递送到所述细胞中的物质优选选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组,但不总是限于此。
本发明还提供用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽与应递送到所述细胞中的靶物质组合。
本文中的异源蛋白优选是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
本文中应递送到所述细胞中的物质优选选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组,但不总是限于此。
本发明还提供用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽与应递送到所述细胞中的靶物质组合。
本文中的异源蛋白特别是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的亲水性分泌增强子的pI值控制为11-14。
本文中应递送到所述细胞中的物质优选选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组,但不总是限于此。
本发明还提供用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽与应递送到所述细胞中的靶物质组合。
本文中的异源蛋白特别是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白,且步骤2)的亲水性分泌增强子的pI值控制为2-14。
本文中应递送到所述细胞中的物质优选选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组,但不总是限于此。
发明实施方式
如以下实施例中所示,举例说明本发明的实践和目前优选实施方案。
然而,应该理解本领域中技术人员在考虑本公开内容的基础上,可以在本发明的精神和范围内进行修改和改进。
实施例1:克隆黏着蛋白基因DNA多聚体盒
本发明人基于具有与韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的相同序列并以SEQ.ID.NO:95(Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys)表示的Mepf1,使用与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用正向引物相同的由SEQ.ID.NO:96(5′-TAC AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCAACC-3′)表示的正向引物和与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用反向引物相同的由SEQ.ID.NO:97(5′-TTT GTA GGT TGG CGG ATA AGA CGG CTT AGC-3′)表示的反向引物,构建了合成的mefp1 DNA。左侧衔接子(下文中称为“La”)合成DNA通过使用与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用正向引物相同的由SEQ.ID.NO:98(5′-GAT CCG AAT TCC CCG GG-3′)表示的内含BamHI/EcoRI/SmaI位点的正向引物和与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用反向引物相同的由SEQ.ID.NO:99(5′-TTT GTA CCC GGG GAA TTC G-3′)表示的反向引物来合成。同时,右侧衔接子(下文中称为“Ra”)合成DNA通过使用与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用正向引物相同的由SEQ.ID.NO:100(5′-TAC AAA CGT AAG CTT GTC GAC C-3′)表示的内含Arg/HindIII/SalI/XhoI位点的正向引物和与韩国专利公开号10-2007-0009453中所用反向引物相同的由SEQ.ID.NO:101(5′-TCG AGG TCG ACA AGC TTA CG-3′)表示的反向引物来合成。通过韩国专利号379,025中所述的方法制备mefp1 DNA多聚体,然后将其克隆到pBluescript II SK(+)载体(Stratagene,美国)中。筛选重复7次的mefp1 DNA多聚体并命名为‘pBluescript II SK(+)La-7×mefp1-Ra’。
实施例2:在N端变体克隆中表达黏着蛋白
本发明人利用pBluescript II SK(+)La-7×mefp1-Ra作为模板进行PCR,以引入OmpA信号肽(OmpASP)片段,从而根据Mefp1的N端的受控pI值进行可溶性表达。结果,通过连接pET-22b(+)载体与具有不同pI值的OmpASP片段或其变体、Mefp1的前导序列和实施例1中制备的mefp1盒相连接来构建具有N端的表达载体(表1-表4)。
大肠杆菌BL21(DE3)用如表1-表4所示构建的包含N端的表达载体按照常规方法转染,随后在增补了50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g/l)中,在30℃培养16小时。用LB培养基将该培养液稀释200倍。将1mM IPTG加入到稀释的培养液中,随后培养直至OD600达到0.3。培养再继续3小时。对1ml培养溶液在4℃以4,000×g进行离心30分钟,并将沉淀重新悬浮在100-200μlPBS中。通过利用超声波仪,以15×2-s循环脉冲(以30%功率输出)匀浆混悬液,以分离蛋白。离心以4℃,16,000rpm进行30分钟,从而消除细胞碎片,从而引起不溶性级分的分离。可溶性级分的蛋白通过Bradford法(Bradford,Anal Biochem(分析生物化学)72:248-254,1976)量化,随后通过利用15%SDS-PAGE凝胶,按照Laemmli等(Laemmli,Nature(自然)227:680-685,1970)的方法进行SDS-PAGE。进行考马斯亮蓝(西格玛(Sigma),美国)染色。将SDS-PAGE凝胶转移到硝化纤维膜(罗氏(Roche),美国)上。在5%脱脂乳(脱脂的乳;Difco,美国)中浸过后,将该膜在0.4μg/ml抗-His6单克隆抗体溶液(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz生物技术),美国)中在37℃浸泡2小时。利用与兔抗小鼠IgG缀合的辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz生物技术),美国)作为第二抗体进行DAB(3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐,西格玛(Sigma),美国)染色。通过密度计分析,利用Quantity One程序(Bio Rad,美国)测量由此获得的黏着蛋白Mefp1条带的浓度。
实施例3:具有增加的pI值的短信号序列片段及其变体对黏着蛋白表达
的影响
编码黏着异源蛋白Mefp1的核苷酸序列7×mefp1的5’末端与诱导蛋白分泌的OmpA信号肽(OmpASP,韩国专利公开号10-2007-0009453,SEQ.ID.NO:46或Movva等,J Biol Chem(生物化学杂志)255,27-29,1980)片段OmpASP1(Met)、OmpASP1-2(Met-Lys)和OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)的编码序列融合,由此引起克隆pET-22b(+)(OmpASP1-7×mefp1*),pET-22b(+)(OmpASP1-2-7×mefp1*)和pET-22b(+)(OmpASP1-3-7×mefp1*)的构建(表1)。
通过与实施例2中所述相同的方式用上述构建的克隆载体来转化大肠杆菌BL21(DE3),并量化蛋白表达。结果,一个氨基酸(赖氨酸;Lys;K;pI=9.72)的改变引起以上两种克隆对Met-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:15)和Met-Lys-7×Mefp1*(SEQ.ID.NO:16)可溶性表达的显著不同(图1a,泳道1和泳道2,表1)。以上结果表明氨基酸Lys在该融合蛋白的N端显著影响黏着蛋白Mefp1的表达,且由此还预期N端的第二个Lys可以影响黏着蛋白Mefp1的可溶性表达。确定前导序列为由OmpASP片段(Met[M]和Met-Lys)至Mefp1的前两个氨基酸(Ala-Lys),且通过计算机程序DNASISTM(日立(Hitachi),日本)来分析前导序列的pI值。结果,Met-Ala-Lys(SEQ.ID.NO:15)肽的pI值为9.90,且Met-Lys-Ala-Lys(SEQ.ID.NO:16)的pI值为10.55。为了验证以上结果,通过利用具有比OmpASP1-2多一个Lys的信号序列片段OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)的编码序列,通过与上述相同的方式构建更多克隆,随后量化黏着蛋白Mefp1的可溶性表达(图1a,泳道3)。结果,可溶性表达与前导序列OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)-Ala-Lys的pI值相关,所述pI值为10.82(图1a,泳道3和表1)。因此,以上结果证明前导序列中由Lys控制为9.90-10.82的pI值与可溶性表达有关。
表1
重组载体pET22b(+)(ompASP1-7×mefp1*)的引物、前导序列和来自pI值增加的OmpASPtr及其变体克隆的Mefp1表达
*:韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra和His标记(6×His)的盈余序列(Surplus sequence)。
CAT:延长以保持NdeI位点。
斜粗体字母:编码信号序列片段-黏着蛋白(至Mefp1的第二个氨基酸:Ala-Lys)及其变体的不同尺寸的寡核苷酸。
一般字母:除前两个氨基酸Ala-Lys以外从Mefp1的第三个氨基酸开始编码的寡核苷酸。
():前导序列的pI值,在所述前导序列中信号序列片段及其变体与黏着蛋白的N端(Ala-Lys)融合。
OmpASPtr:韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的OmpASP片段。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:与韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra(右侧衔接物;Arg/HindIII/SalI/XhoI)互补的寡核苷酸序列。
至于重组Mefp1蛋白的表达,″-″表示无表达,″+/-″表示弱表达,且″+″的数目表示表达水平。
实施例4:前导序列的增加的pI值对黏着蛋白表达的影响
本发明人在实施例3中验证了通过使用Lys控制前导序列的pI值与蛋白的可溶性表达相关。且本发明人还希望验证pI值的控制是否还可以影响可溶性蛋白的一般表达。为此,将Lys另外插入OmpASP1-3片段和Mefp1之间,导致构建pET-22b(+)[ompASP1-3-(Lys)n-7×mefp1*](n=1,2,3,4,6)(SEQ.ID.NO:4-SEQ.ID.NO:8和SEQ.ID.NO:18-SEQ.ID.NO:22),并还将增加pI值的氨基酸Arg另外插入Met(OmpASP1)和Mefp1之间,导致构建pET-22b(+)[ompASP1-(Arg)n-7×mefp1*](n=1,2,4,6,8)(SEQ.ID.NO:9-SEQ.ID.NO:13和SEQ.ID.NO:23-SEQ.ID.NO:27)(表1)。研究了范围为由每个克隆的OmpASP片段至Mefp1的前两个氨基酸(Ala-Lys)的前导序列的pI值
通过与实施例2中所述相同的方式,用上述构建的克隆载体转化大肠杆菌BL21(DE3),并量化其中诱导的蛋白表达。结果,与通过添加Lys而具有增加的pI值10.99-11.21的前导序列融合的黏着蛋白Mefp1的可溶性表达(图1a,泳道4-泳道6和表1,SEQ.ID.NO:18-SEQ.ID.NO:20)与具有pI值10.55的对照的水平(图1a,泳道2和表1,SEQ.ID.NO:16)相似或略微增加。同时,与具有pI值11.28的前导序列融合的黏着蛋白Mefp1的可溶性表达(图1a,泳道7和表1,SEQ.ID.NO:21),与具有pI值10.55的对照相比减少。且几乎观察不到与具有pI值11.41的前导序列融合的黏着蛋白Mefp1的可溶性表达(图1a,泳道8和表1,SEQ.ID.NO:22)。不管pI值的增加,具有pI值11.41并表现出减少的表达的前导序列(SEQ.ID.NO:22)具有相当高的亲水性(1.93)。因此,假设前导序列中亲水性的显著增加通过增加与脂双层的结合力更减小膜通透性(韩国专利公开号10-2007-0009453)。然而,不管分别具有pI值10.99,11.11,11.21,和11.28的前导序列的高亲水性,当另外插入Lys时,亲水性被一定程度地抵消,这提示膜通透是可能的。然而,黏着蛋白Mefp1的表达与电荷增加无关。
另外,在pI值增加的前导序列(pI 11.52-13.35:SEQ.ID.NO:23-SEQ.ID.NO:27)中,与通过添加Arg而具有增加的pI值11.52-12.51的前导序列(SEQ.ID.NO:23-SEQ.ID.NO:24)融合的黏着蛋白Mefp1的可溶性表达与具有pI值9.90的对照(SEQ.ID.NO:1 5)的可溶性表达相似或略微增加(通过添加2个Arg而具有pI值12.51的前导序列,SEQ.ID.NO:24),尽管增加不显著。与具有pI值12.98,13.20和13.35的前导序列(SEQ.ID.NO:25-NO:27)融合的黏着蛋白Mefp1的可溶性表达随着pI值的增加而减少(表1和图1b)。表现出最低表达的、具有pI值13.35的前导序列(SEQ.ID.NO:27)具有相当高的亲水性(1.93)。因此,假设前导序列中亲水性的显著增加通过增加与脂双层的结合力而更减小膜通透性(韩国专利公开号10-2007-0009453)。同时,表达与电荷增加无关。
与通过添加2个Arg而具有pI值12.5 1的前导序列(MRRAK,SEQ.ID.NO:24)融合的黏着蛋白Mefp1的表达略微增加。具有前导序列的可溶性黏着蛋白具有以3/3频率减小的分子量,这提示N端被切下(图1b,泳道3)。该现象在周质级分中始终观察到(数据未显示)。然而,具有另外的Arg的其他前导序列无缺失。因此,缺失似乎归因于蛋白酶且认为具有另外的Arg的那些前导序列具有Arg特异性膜通透机制。
实施例5:前导序列的低pI值对黏着蛋白的可溶性表达的影响
本发明人研究了前导序列N端的下控pI值对Mefp1可溶性表达的影响。
具体地,使用OmpASP1-7×mefp1*作为对照并对前导序列Met(OmpASP1)+Ala-Lys(Mefp1的N端)的氨基酸序列进行不同的修饰,以生成前导序列的变体,其以SEQ.ID.NO:35-SEQ.ID.NO:41[MDDDDDAA(SEQ.ID.NO:35;pI=2.73),MDDDAA(SEQ.ID.NO:36;pI=2.87),MEE(SEQ.ID.NO:37;pI=3.09),MAE(SEQ.ID.NO:38;pI=3.25),MAA(SEQ.ID.NO:39;pI=5.60),MCH(SEQ.ID.NO:40;pI=7.13),MAH(SEQ.ID.NO:41;pI=7.65)]表示,具有pI值2.73-7.65(表2)。研究了那些变体的pI值。使用MAK(SEQ.ID.NO:15;pI=9.90)和MRRRRAK(SEQ.ID.NO:25;pI=12.98)作为对照,并研究表达。
通过与实施例2中所述相同的方式,用上述构建的克隆载体转化大肠杆菌BL21(DE3),并量化其中的蛋白表达。结果,在每个包含由SEQ.ID.NO:35-SEQ.ID.NO:41表示的前导序列的克隆中观察到可溶性黏着蛋白Mefp1表达。具体地,包含具有pI值3.09-7.65的前导序列(SEQ.ID.NO:37-SEQ.ID.NO:41)的克隆表现出比包含具有pI值9.90(SEQ.ID.NO:15)和12.98(SEQ.ID.NO:25)的前导序列的克隆中的表达显著更高的表达,且当将pI值控制为3.09(SEQ.ID.NO:37)时观察到特别更高的表达(图2和表2)。甚至表现出最低表达的前导序列(SEQ.ID.NO:35;pI=2.73)具有1.09的相当高的亲水性。因此,假设前导序列中亲水性的显著增加通过增加与脂双层的结合力而更减小膜通透性(韩国专利公开号10-2007-0009453)。同时,表达与电荷增加无关。
表2
重组载体pET22b(+)ompASP1-7×mefp1*的前导序列(Met-Ala-Lys)的变体克隆的表达
*:韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra和His标记(6×His)的盈余序列。
CAT:延长以保持NdeI位点。
斜粗体字母:编码前导序列(Met-Ala-Lys)及其变体的不同尺寸的寡核苷酸。
一般字母:除前两个氨基酸Ala-Lys以外从Mefp1的第三个氨基酸开始编码的寡核苷酸。
():前导序列(Met-Ala-Lys)变体的pI值。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:与韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra(右侧衔接物;Arg/HindIII/SalI/XhoI)互补的寡核苷酸序列。
至于重组Mefp1蛋白的表达,″-″表示无表达,″+/-″表示弱表达,且″+″的数目表示表达水平。
实施例6:为了生产处于天然形式的黏着蛋白,最优化前导序列和因子
Xa识别位点(Xa)之间的距离
在实施例5中,由通过前导序列的受控pI值而引起表达增加的Mefp1蛋白表达模式的研究,验证了黏着异源蛋白Mefp1的前导序列的最适pI值之一是3.09(MEE;SEQ.ID.NO:37)。然后,具有pI值3.09(MEE)的前导序列和Xa因子识别位点(Xa)之间的距离通过控制该前导序列和与其相连接的Mefp1序列之间的距离来最优化,随后根据韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的方法生产融合蛋白,以促进回收具有天然氨基端的可溶性蛋白。通过使用与前导序列(MEE)相连接的Mefp1的氨基酸的一些部分(Mefp13-8)作为插入物来最小化由前导序列延长导致的结构变化。
具体地,包含因子Xa识别位点(Xa),由此导致MEE-(i=n)-Xa,并将以n表示的与前导序列MEE相连接的部分Mefp1的氨基酸插入(n=0,2,4,和6),以构建克隆pET-22b(+)(MEE-(i=n)-Xa-7×mefp1*),从而最优化蛋白表达(表3)。
通过与实施例2中所述相同的方式,用上述构建的克隆载体转化大肠杆菌BL21(DE3),并量化蛋白表达。结果,当MEE和Xa之间的距离为4时,表达最显著减少,准确地,以i=0>2>6>4的顺序(图3)。可溶性蛋白包含因子Xa识别位点(Xa),因此消除MEE-(i=n)-Xa的具有天然N端(7×Mefp1*)的重组蛋白可以在用因子Xa蛋白酶处理该重组蛋白后,通过常规方法生产。
表3
重组载体pET-22b(+)(MEE-(i=n)-Xa-7×mefp1*)的表达
*:韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra和His标记(6×His)的盈余序列。
CAT:延长以保持NdeI位点。
粗体字母:前导序列(MEE)的寡核苷酸。
斜粗体字母:与表2的前导序列(MEE)相连接的部分Mefp1(Mefp13-8)的寡核苷酸。
ATC GAA GGT CGT:因子Xa识别位点的寡核苷酸。
一般字母:编码由韩国专利公开号10-2007-0009453中所述SEQ.ID.NO:1表示的Mefp1的碱性氨基酸序列的寡核苷酸。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:与韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra(右侧衔接物;Arg/HindIII/SalI/XhoI)互补的寡核苷酸序列。
至于重组Mefp1蛋白的表达,″-″表示无表达,″+/-″表示弱表达,且″+″的数目表示表达水平。
(i):在前导序列(MEE)和Xa之间插入的氨基酸数目。
实施例7:通过控制OmpASP
1-11
中Lys-Lys之间的距离引起的黏着蛋白可
溶性表达
本发明人验证了包含N端的信号序列的pI值可以影响黏着异源蛋白Mefp 1的可溶性表达。然后,本发明人还研究了OmpA信号序列片段(OmpASPtr)中影响pI值的氨基酸之间(例如Lys-Lys之间)的距离是否可以影响Mefp 1的可溶性表达。具体地,虽然前导序列MKK(SEQ.ID.NO:56)和MKAK(SEQ.ID.NO:16)在N端中具有相等的pI值10.55,但是Lys-Lys之间的距离(d)由于插入不太影响pI值的氨基酸(例如,Ala[丙氨酸;A])更远,这可能存在功能改变。
基于信号序列片段OmpASP1-11的氨基酸序列,通过将组成OmpASP1-11的不影响pI值的氨基酸d1=n(0,2,4,6,8)插入到设计为MK1-(d=n)-K2-(8-n)类似物的()中,来构建pET-22b(+)[MK1-(d1=n)-K2-(8-n)-AA-mefp13-10-6×mefp1*](表4)。上述克隆的前导序列从OmpASP1-2片段(Met-Lys)至代替影响pI值的Mefp1的第二个Lys的加下划线的第二个Ala(Ala-Ala),具有相等pI值10.55。通过与实施例2中所述相同的方式,用上述构建的如表4中所示的克隆载体来转化大肠杆菌BL21(DE3),并量化其中的蛋白表达。
结果,表达以d1=4>2>6>0>8(d1=K1-K2的距离)的顺序减少。即,当d1=4时,可溶性表达最显著,因此d1=4被确定为氨基酸之间的最适距离。另外,调节d1为4并用Lys(K3)取代克隆中加下划线的Ala和以d2=n(1,2,3,4)插入Ala,由此导致克隆pET-22b(+)[MK1-(d1=4)-K2-(d2=n)-AK3-mefp13-10-6×mefp1*](表4)的构建,随后通过与上述相同的方式量化蛋白表达。
两个氨基酸(K2-K3)之间的最适距离是d2=2且遵从d2=2>1>4>3的顺序。该结果表明最适距离也是影响黏着蛋白Mefp1的可溶性表达的重要因素。
还提示重要因素是Lys-Lys之间的距离和前导序列的pI值而非序列自身(表4和图4)。
总之,前导序列的pI值在黏着蛋白Mefp1的可溶性表达中起重要作用,且在其关于最佳表达的谱中存在最适pI值。然而,黏着蛋白Mefp1的可溶性表达与电荷无关。影响pI值的Lys和Lys之间的距离也是关于表达的重要因素。
表4
pET22b(+)ompASP1-11-7×mefp1*的引物、前导序列和来自OmpASP1-11变体克隆的Mefp1表达
*:韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra和His标记(6×His)的盈余Surplus序列。
CAT:延长以保持NdeI位点。
斜体字母:编码与黏着蛋白的N端(Ala-Ala)相连接的信号序列片段OmpASP1-11或其变体的前导序列的寡核苷酸。
斜粗体字母:编码前导序列片段中的氨基酸lys的寡核苷酸。
Ala:黏着蛋白的N端的Ala-Lys中的Lys被Ala取代。
一般字母:除前两个氨基酸Ala-Lys以外从Mefp1的第三个氨基酸开始编码的寡核苷酸。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:与韩国专利公开号10-2007-0009453的图2中所示的Ra(右侧衔接物;Arg/HindIII/SalI/XhoI)互补的寡核苷酸序列。
至于重组Mefp1蛋白的表达,″-″表示无表达,″+″的数目表示表达水平。
(d):Lys-Lys之间的距离。
实施例8:由N端变体引起的牙鲆Hepcidin I的可溶性表达
基于韩国专利公开号10-2007-009453中报告的早期实验结果,即其认为Hepcidin I的可溶性表达(Kim等,Biosci Biotechnol Biochem(生物科学生物技术和生物化学)69:1411-1414,2005)需要号序列和分泌增强子,本发明人构建了利用控制Hepcidin I的前导序列N端的pI值而用于可溶性表达Hepcidin I的重组载体。具体地,起信号序列并且同时起分泌增强子或信号序列OmpASP片段变体作用的前导序列、分泌增强子候选序列或/和Xa识别位点操作性地与ofHep1相连接,并将其引入pET-22b(+)中(表5和表6)。
大肠杆菌BL21(DE3)用如表5和表6中所示构建的包含N端的表达载体来转化,随后在增补了50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(胰蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl 10g/l)中在30℃培养16小时。用LB培养基将该培养溶液稀释200倍。将1mM IPTG加入到稀释的培养溶液中,随后培养直至OD600达到0.3。培养再继续3小时以诱导表达。对1ml培养溶液在4℃,4,000×g进行离心30分钟,并将沉淀重新悬浮在100-200μlPBS中。通过利用超声波仪,以15×2-s循环脉冲(以30%功率输出)匀浆混悬液,以分离蛋白。离心以4℃,16,000rpm进行30分钟,从而消除细胞碎片,从而引起不溶性级分的分离。可溶性级分的蛋白通过Bradford法(Bradford,Anal Biochem(分析生物化学)72:248-254,1976)量化,随后通过利用15% SDS-PAGE凝胶,按照Laemmli等(Laemmli,Nature(自然)227:680-685,1970)的方法进行SDS-PAGE。进行考马斯亮蓝(西格玛(Sigma),美国)染色。将SDS-PAGE凝胶转移到硝化纤维膜(罗氏(Roche),美国)上。在5%脱脂乳(脱脂的乳;Difco,美国)中浸过后,将该膜在0.4μg/ml抗-His6单克隆抗体溶液(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz生物技术),美国)中在37℃浸泡2小时。利用与兔抗小鼠IgG缀合的辣根过氧化物酶(Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz生物技术),美国)作为第二抗体进行DAB(3,3’-二氨基联苯胺四盐酸盐,西格玛(Sigma),美国)染色。
实施例9:通过控制前导序列的pI值引起的牙鲆Hepcidin I的可溶性表
达
本发明人以与实施例4和实施例5中所述相似的方式研究了前导序列中pI控制对牙鲆Hepcidin I的可溶性表达的影响。
为了牙鲆Hepcidin I的可溶性表达,类似于韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的分泌增强子的筛选方法,构建pET-22b(+)(Met-7×同源氨基酸ofhep I**)克隆,以表达具有受控的pI值2.52-13.28和疏水性/亲水性-1.55-+1.97的蛋白,该蛋白被设计为使蛋白的N端与Met-7×同源氨基酸相连接,从而包含Met和分泌增强子候选序列(表5)。此处的同源氨基酸选自由精氨酸(Arg;R),赖氨酸(Lys,K),组氨酸(His;H),酪氨酸(Tyr;Y),半胱氨酸(Cys;C),谷氨酸(Glu;E)和天冬氨酸(Asp;D)组成的组,认为其具有7个重复。疏水性通过DNASISTM(日立(Hitachi),日本)以Hopp & Woods等级(窗尺寸:6,阈值:0.00)来计算。如果疏水性值是+的,则该肽是亲水性的,而如果疏水性值是-的,则该肽是疏水性的。而且,随着该数值增加,亲水性或疏水性增加。
通过与实施例8中所述相同的方式用上述构建的克隆载体来转化大肠杆菌BL21(DE3),然后量化蛋白表达。结果,Hepcidin I的可溶性表达仅在具有MRRRRRRR(pI:13.28,疏水性:+1.97[亲水性])和MKKKKKKK(pI:11.28,疏水性:+1.97[亲水性])的克隆中观察到(图5)。
表5
重组载体pET-22b(+)(Met-7×同源氨基酸-ofhepI**)的表达
CAT:延长以保持NdeI位点。
粗体字母:具有不同尺寸的影响pI值和疏水性的前导序列的寡核苷酸。
ofhep I:牙鲆Hepcidin I(ofHepcidin I:ofHepI)基因(韩国专利公开号10-2007-0009453;Kim等,Biosci.Biotechnol.Biochem.(生物科学生物技术和生物化学)69,1411-1414,2005)。
**:韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的Glu/HindIII/Sal I/Xho I-6×His(Glu/HindIII/Sal I/Xho I源自反向引物设计)。
一般字母:Hepcidin I区的寡核苷酸。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:包含韩国专利公开号10-2007-0009453的ofHepcidin I的C端和Glu/HindIII/Sal I/Xho I位点的寡核苷酸序列。
至于重组ofMefp1**的表达,″-″表示无表达,″+″的数目表示表达水平。
疏水性:通过DNASISTM(日立(Hitachi),日本)以Hopp & Woods等级(窗尺寸:6,阈值:0.00)来计算。如果疏水性值是+的,则该肽是亲水性的,而如果疏水性值是-的,则该肽是疏水性的。而且,随着绝对值增加,亲水性或疏水性增加。
实施例10:信号序列变体的低pI值对牙鲆Hepcidin I可溶性表达的影响
韩国专利公开号10-2007-009453描述通过使用具有相当高的pI值10.55的OmpASP1-10作为信号序列引起的牙鲆Hepcidin I的可溶性表达。然而,本发明人在本发明的实施例4和实施例5中验证了不仅前导序列的高pI值而且低pI值可以增加黏着蛋白Mefp1的可溶性表达。因此,本发明人研究了信号序列变体的低pI值对牙鲆Hepcidin I的可溶性表达的影响。
具体地,将前导序列设计为顺序包含信号序列片段OmpASP1-3变体[MAH(SEQ.ID.NO:41);7.65,MAA(SEQ.ID.NO:39);5.60或MEE(SEQ.ID.NO:37);3.09]-OmpASP4-10-6×同源氨基酸(具有不同pI值和疏水性值的氨基酸)-Xa识别位点(Xa),由其构建用于表达Hepcidin I的克隆(表6)。此处的同源氨基酸选自由精氨酸(Arg;R),酪氨酸(Tyr;Y)和谷氨酸(Glu;E)组成的组,认为其具有6个重复。疏水性通过DNASISTM(日立(Hitachi),日本)以Hopp & Woods等级(窗尺寸:6,阈值:0.00)来计算。如果疏水性值是+的,则该肽是亲水性的,而如果疏水性值是-的,则该肽是疏水性的。而且,随着绝对值增加,亲水性或疏水性增加。
用表6的克隆载体,通过与实施例8中所述相同的方式来转化大肠杆菌BL21(DE3),然后量化蛋白表达。结果,重组蛋白MAH(pI7.65)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**充分表达。MAH(pI7.65)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHep I**也表达但非常弱。MAA(pI5.60)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**充分表达。MAA(pI5.60)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHep I**弱表达。MEE(pI3.09)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHep I**表达且MEE(pI3.09)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHep I**也充分表达(图6)。
以上结果表明当分泌增强子序列与Met直接相连接时,可溶性表达限于具有高pI值和亲水性的Arg和Lys。然而,当具有疏水区域的信号序列片段的N端的pI值改变时,分泌增强子的型谱变宽,以使得不仅具有高pI值和高亲水性的氨基酸而且具有低pI值和高亲水性的氨基酸诸如Glu可以作为分泌增强子序列使用。因此,提示与前导序列的N端相连接的疏水区域减小N端的初始亲水性,由此使该片段担当起信号序列作用的自由锚定物,从而导致分泌增强子的型谱的加宽。基于以上结果,还预期前导序列的N端的pI值与分泌增强子序列具有相互关系,如上验证地,即,信号序列的N端的受控pI值引起可溶性表达的改变。
表6
重组载体pET-22b(+)(ompASP1-2 aas-ompASP4-10-6×同源氨基酸-Xa-ofhep I**)的表达
ofhep I:牙鲆Hepcidin I(ofHepcidin I)基因(Kim等,Biosci.Biotechnol.Biochem.(生物科学生物技术和生物化学)69,1411-1414,2005)。
**:韩国专利公开号10-2007-0009453中所述的Glu/HindIII/Sal I/Xho I-6×His(Glu/HindIII/Sal I/Xho I源自反向引物设计)。
CAT:延长以保持NdeI位点。
粗体字母:影响pI值的信号序列变体的寡核苷酸。
一般字母:OmpASP4-10的寡核苷酸。
斜粗体字母:与不同pI值和疏水性值有关的氨基酸的寡核苷酸,其是分泌增强子候选序列。
加下划线的普通字母:因子Xa识别位点的寡核苷酸。
斜体字母:Hepcidin I区的寡核苷酸(韩国专利公开号10-2007-0009453;Kim等,Biosci Biotechnol Biochem(生物科学生物技术和生物化学)69:1411-1414,2005)。
A:韩国专利公开号10-2007-0009453中构建的引物。
反向引物:包含韩国专利公开号10-2007-0009453的ofHepcidin I的C端和Glu/HindIII/Sal I/Xho I位点的寡核苷酸序列。
至于重组ofMefp1**的表达,″-″表示无表达,″+/-″表示弱表达,且″+″的数目表示表达水平。
疏水性:通过DNASISTM(日立(Hitachi),日本)以Hopp & Woods等级(窗尺寸:6,阈值:0.00)来计算。如果疏水性值是+的,则该肽是亲水性的,而如果疏水性值是-的,则该肽是疏水性的。而且,随着绝对值增加,亲水性或疏水性增加。
本领域中的技术人员应该理解前述说明书中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修改或设计用于实施本发明相同目的其他实施方案的基础。本领域中的技术人员还应该理解这样的等价实施方案不偏离如所附权利要求中所阐明的本发明的精神和范围。
Claims (79)
1.用于提高异源蛋白的分泌效率的表达载体,所述表达载体包含基因构建体,其包括:
(i)启动子;和
(ii)与所述启动子操作性相连接的编码多肽片段或其变体的多核苷酸,所述多肽片段中影响pI值的氨基酸之间的距离受到调控,所述多肽片段包含信号序列,和/或异源蛋白的前导序列的N区和/或前导序列。
2.按照权利要求1的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段是由1-6个氨基酸构成的多肽,其pI值被控制为9.90-11.41。
3.按照权利要求1的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段是由1-12个氨基酸构成的多肽,其pI值被控制为3.09-9.90。
4.按照权利要求2的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段的pI值通过添加选自由Lys,Arg和His组成的组中的碱性氨基酸或用所述碱性氨基酸取代初始酸性氨基酸而增加。
5.按照权利要求3的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段的pI值通过添加选自由Asp和Glu组成的组中的酸性氨基酸或用所述酸性氨基酸取代初始碱性氨基酸而减小。
6.按照权利要求1的表达载体,其中在所述多肽片段中影响pI值的氨基酸之间的距离通过添加选自由Gln,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Met,Cys和Pro组成的组中的中性非极性氨基酸,或通过添加选自由Ser,Thr,Tyr,Asn和Gln组成的组中的中性极性氨基酸来调节。
7.按照权利要求1的表达载体,其中所述基因构建体另外包含融合在编码具有受控pI值的包含N区的多肽片段的多核苷酸前面的编码蛋白酶识别位点的核苷酸。
8.按照权利要求7的表达载体,其中所述前导序列和所述编码蛋白酶识别位点的核苷酸之间的距离通过添加选自由Gln,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,Met,Cys和Pro组成的组中的中性非极性氨基酸或通过添加选自由Ser,Thr,Tyr,Asn和Gln组成的组中的中性极性氨基酸而调节为0-2。
9.按照权利要求1至权利要求8中任一项的表达载体,其中所述基因构建体另外包括用于插入编码异源蛋白的基因的蛋白酶识别位点。
10.按照权利要求9的表达载体,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
11.用于提高异源蛋白的分泌效率的表达载体,所述表达载体包含基因构建体,其包括:
(i)启动子;
(ii)与所述启动子操作性相连接的编码其中pI值受控的多肽片段或其变体的多核苷酸,所述多肽片段包含信号序列和/或前导序列的N区;和
(iii)与编码所述多肽片段或其变体的多核苷酸操作性相连接的编码分泌增强子的多核苷酸,所述分泌增强子包括具有受控pI值的亲水性增强序列。
12.按照权利要求11的表达载体,其中包含N区的所述多肽片段的pI值被控制为5-11。
13.按照权利要求12的表达载体,其中步骤2)的亲水性分泌增强子的pI值被控制为11-14。
14.按照权利要求11的表达载体,其中包含N区的所述多肽片段的pI值被控制为2-5。
15.按照权利要求14的表达载体,其中步骤2)的亲水性分泌增强子的pI值被控制为2-14。
16.按照权利要求12的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段的pI值通过添加选自由Lys,Arg和His组成的组中的碱性氨基酸或用所述碱性氨基酸取代初始酸性氨基酸而增加。
17.按照权利要求14的表达载体,其中具有受控的pI值的包含N区的所述多肽片段的pI值通过添加选自由Asp和Glu组成的组中的酸性氨基酸或用所述酸性氨基酸取代初始碱性氨基酸而减小。
18.按照权利要求11的表达载体,其中所述分泌增强子是编码由2-50个氨基酸组成的肽的多核苷酸,在所述2-50个氨基酸中至少60%是亲水性氨基酸。
19.按照权利要求11的表达载体,其中所述分泌增强子是编码具有亲水性氨基酸的6-20个重复的肽的多核苷酸。
20.按照权利要求18的表达载体,其中所述亲水性氨基酸选自由Lys,Arg,Glu和Asp组成的组。
21.按照权利要求11的表达载体,其中所述基因构建体另外包含用于插入与编码分泌增强子的多核苷酸相连接的外源基因的蛋白酶识别位点。
22.按照权利要求11的表达载体,其中所述基因构建体另外包含操作性连接的编码外源基因的多核苷酸。
23.按照权利要求22的表达载体,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
24.按照权利要求23的表达载体,其中包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的所述蛋白是牙鲆(olive flounder)Hepcidin I。
25.转化体,其通过用权利要求1至权利要求24的表达载体之一转化宿主细胞而制备。
26.按照权利要求25的转化体,其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。
27.按照权利要求26的转化体,其中所述原核细胞选自由病毒、大肠杆菌(E.coli)和芽孢杆菌属(Bacillus)组成的组。
28.按照权利要求26的转化体,其中所述真核细胞选自由哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞和植物细胞组成的组。
29.用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)从步骤5)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
30.按照权利要求29的用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
31.按照权利要求29的方法,其中步骤2)的影响pI值的氨基酸是Lys。
32.用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)从步骤4)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
33.按照权利要求32的用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
34.用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子,蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)从步骤4)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
35.按照权利要求34的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
36.按照权利要求34的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为11-14。
37.用于提高异源蛋白分泌效率的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)从步骤4)的所述转化体的培养物中选择表现出靶蛋白最高可溶性表达的转化体。
38.按照权利要求37的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
39.按照权利要求37的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为2-14。
40.用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;和
7)从步骤6)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
41.按照权利要求40的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
42.按照权利要求40的方法,其中步骤2)的影响pI值的所述氨基酸是Lys。
43.用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
44.按照权利要求43的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
45.用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
46.按照权利要求45的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
47.按照权利要求45的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为11-14。
48.用于生产重组融合异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;和
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白。
49.按照权利要求48的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
50.按照权利要求48的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为2-14。
51.通过权利要求40的方法或权利要求50的方法制备的重组融合异源蛋白。
52.药物组合物,其包含权利要求51的重组融合蛋白和药用载体。
53.按照权利要求52的药物组合物,其中所述组合物用于治疗脑疾病。
54.用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;
7)从步骤6)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白;和
8)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤7)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
55.按照权利要求54的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
56.按照权利要求54的方法,其中步骤2)的影响pI值的所述氨基酸是Lys。
57.用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述重组融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
58.按照权利要求57的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
59.用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养溶液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
60.按照权利要求59的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
61.按照权利要求59的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为11-14。
62.用于生产处于天然形式的异源蛋白的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离处于天然形式的异源蛋白。
63.按照权利要求62的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
64.按照权利要求62的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为2-14。
65.用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值9.90-11.28的前导序列;
2)调节所述前导序列中影响pI值的氨基酸之间的距离;
3)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、步骤2)的受控距离区域、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
4)通过将步骤3)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
5)通过用步骤4)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
6)培养步骤5)的所述转化体;
7)从步骤6)的培养液中分离所述融合异源蛋白;
8)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤7)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
9)将步骤8)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的所述肽与应递送到细胞中的靶物质组合。
66.按照权利要求65的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
67.按照权利要求65的方法,其中步骤2)的影响pI值的所述氨基酸是Lys。
68.按照权利要求65的方法,其中应递送到细胞中的所述物质选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组。
69.用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值3.09-9.90的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的所述肽与应递送到细胞中的靶物质组合。
70.按照权利要求69的方法,其中所述异源蛋白是不包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
71.按照权利要求69的方法,其中应递送到细胞中的所述物质选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组。
72.用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值5-11的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的所述肽与应递送到细胞中的靶物质组合。
73.按照权利要求72的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
74.按照权利要求72的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为11-14。
75.按照权利要求72的方法,其中应递送到细胞中的所述物质选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组。
76.用于生产用于递送靶物质的胞内载体的方法,其包括以下步骤:
1)设计具有信号序列和/或异源蛋白前导序列N区的具有受控pI值2-5的前导序列;
2)构建由编码顺序包含步骤1)的所述前导序列、亲水性分泌增强子、蛋白酶识别位点和所述异源蛋白的融合蛋白的多核苷酸组成的基因构建体;
3)通过将步骤2)的所述基因构建体操作性地插入通用表达载体中来构建重组表达载体;
4)通过用步骤3)的所述重组表达载体转化宿主细胞生成转化体;和
5)培养步骤4)的所述转化体;
6)从步骤5)的培养液中分离所述融合异源蛋白;和
7)在用可以裂解所述蛋白酶识别位点的蛋白酶裂解步骤6)的所述融合异源蛋白后分离包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的肽,所述肽不是处于天然形式的异源蛋白;和
8)将步骤7)的包含所述前导序列、所述亲水性分泌增强子和所述蛋白酶识别位点的所述肽与应递送到细胞中的靶物质组合。
77.按照权利要求76的方法,其中所述异源蛋白是包含跨膜结构域、跨膜样结构域和两亲性结构域中的一种或多种的蛋白。
78.按照权利要求76的方法,其中步骤2)的所述亲水分泌增强子的pI值被控制为2-14。
79.按照权利要求76的方法,其中应递送到细胞中的所述物质选自由天然化合物、合成化合物、RNA、DNA、多肽、反义肽核酸、酶、蛋白、配体、抗体、抗原、细菌或真菌的代谢物和生物活性分子组成的组。
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