KR20090055457A - Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법 - Google Patents

Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20090055457A
KR20090055457A KR1020080035162A KR20080035162A KR20090055457A KR 20090055457 A KR20090055457 A KR 20090055457A KR 1020080035162 A KR1020080035162 A KR 1020080035162A KR 20080035162 A KR20080035162 A KR 20080035162A KR 20090055457 A KR20090055457 A KR 20090055457A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
expression vector
foreign protein
value
leader sequence
Prior art date
Application number
KR1020080035162A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101049859B1 (ko
Inventor
이상준
김영옥
남보혜
Original Assignee
대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국(관리부서:국립수산과학원) filed Critical 대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority to CA2707188A priority Critical patent/CA2707188A1/en
Priority to US12/745,187 priority patent/US20100305040A1/en
Priority to PCT/KR2008/002173 priority patent/WO2009069862A1/en
Priority to AU2008330433A priority patent/AU2008330433A1/en
Priority to JP2010535865A priority patent/JP2011504746A/ja
Priority to CN2008801254690A priority patent/CN101952438A/zh
Priority to EP08741418A priority patent/EP2220235A4/en
Publication of KR20090055457A publication Critical patent/KR20090055457A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101049859B1 publication Critical patent/KR101049859B1/ko
Priority to US14/309,764 priority patent/US9422356B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 pI값이 조절된 신호서열(directional signal)의 N-영역을 포함하는 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체 및/또는 pI값이 조절된 친수성 폴리펩타이드로 구성된 분비증강자를 이용한 재조합 단백질의 분비효율 향상방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 재조합 단백질의 불용성 침전을 방지하고, 세포질 밖 또는 페리플라즘으로의 재조합 단백질의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 외래단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 강력한 분비증강자를 이용하여 막 침투성을 향상시켜, 유용 치료용 단백질의 이동(transduction)에 이용될 수 있다.
재조합 단백질, N-말단 pI값, MefpI, 헵시딘

Description

Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산 방법{Production of soluble recombinant protein by pI value control of N-terminal}
본 발명은 재조합 단백질의 분비효율 향상방법에 관한 것이다.
현대의 생명공학에 있어서 핵심은 재조합 단백질의 생산이며 그 중에서도 중요한 것은 원래 형태의 수용성 단백질을 손쉽게 생산하는 것이다. 수용성 단백질의 생산은 활성 단백질의 생산 및 회수, 기능 연구를 위한 결정화, 산업화 등에 매우 중요하다. 현재까지 대장균을 이용한 많은 재조합 단백질 생산 연구가 진행되어 왔는데, 이는 대장균이 조작이 쉽고, 짧은 성장시간, 안전한 발현, 저비용과 규모를 쉽게 바꿀 수 있는 장점이 있기 때문이다.
그러나 대장균(E. coli)에서 생산된 외래 기원의 재조합 단백질은 적절한 ‘전사 후 샤페론(post-translational chaperons)’이나 ‘전사 후 과정(post-translational processing)’이 없기 때문에, 생산된 재조합 단백질의 적절한 접힘(fold)이 일어나지 않거나 또는 불가용성 단백질 응집체(inclusion body)로 형성된다(Baneyx, Curr. Opin Biotechnol. 10:411-421, 1999).
신호서열(signal sequence)이 단백질을 페리플라즘(periplasm) 밖으로 분비하도록 한다는 것이 알려져 있기 때문에, 이러한 문제들을 해결하기 위해 신호서열(signal sequence)의 구조 및 기능에 대한 연구가 아미노 말단 염기성 지역(amino terminal basic region)(Lehnhardt, et al ., J. Biol . Chem, 263:10300-10303, 1988), 소수성 지역(hydrophobic region)(Goldstein et al ., J. Bacteriol . 172:1225-1231, 1990), 절단 지역(cleavage region)(Duffaud and Inouye, J. Biol . Chem, 263:10224-10228, 1988)을 대상으로 하여 진행되었다. 동시에 수용성 단백질을 생산하기 위해 여러 가지 신호서열(signal sequence)을 이용한 벡터들이 개발되었다( ompA : Ghrayeb et al ., EMBO J. 3:2437-2442, 1984; Duffaud et al ., Methods Enzymol , 153:492-507, 1987; phoA : Dodt et al ., FEBS Lett. 202:373-377, 1986; Kohl et al ., Nucleic Acids Res . 18:1069, 1990; eltA : Morika-Fujimoto et al ., J Biol Chem 266:1728-1732, 1991; bla : Oka et al ., Agric Biol . Chem. 51:1099-1104, 1987; eltIIb -B : Jobling et al ., Plasmid, 38:158-173, 1997). 그러나 지금까지의 신호서열(signal sequence)을 이용한 벡터들은 수용성 단백질을 발현시키는데 한계가 있고, 또한 발현된 단백질조차도 재조합 융합(fusion) 단백질로 생산되기 때문에 신호서열 절단효소(signal peptidase) 및 단백질 절단 효소의 절단부위를 가져 원래 형태의 아미노 말단을 가진 재조합 단백질을 얻기는 매우 어려운 실정이다. 신호서열(signal sequence)을 이용한 재조합 단백질 생산이 어려운 원인으로는 1) 수용성 단백질의 생산에 대한 예측이 불가능하여 많은 연구자들이 재조합 단백질의 수용성은 전체 단백질의 아미노산 서열의 특 성에 달렸다고 추측하고 있으며; 2) 신호서열(signal sequence)로 작용하는 다른 서열(sequence)이 너무 많고, 신호 펩타이드(signal peptides)의 상호작용을 직접적으로 조사할 수 있는 분석방법이 개발되지 못하였기 때문이다(Triplett et al ., J Biol Chem 276:19648-19655, 2001).
본 발명자들은 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 신호서열(directional signal)의 N-영역 및/또는 N-영역을 포함하는 신호서열의 소수성 단편을 포함하는 변이된 신호서열 및/또는 친수성 폴리펩타이드로 구성된 분비증강자를 포함하는 변이된 신호서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 발현 벡터를 제공하고, 접착성 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하도록 함으로써, 상기 유전자 컨스트럭트에서 접착성 단백질의 수용성 발현이 증가됨을 밝혔었다. 또한, 상기 신호서열의 N-영역의 단편의 길이에 따른 pI값을 분석하고, 상기 단편 즉, OmpASP1 -3 내지 전체 길이 OmpASP1 -21이 동일한 pI값(10.55)을 가지는 것이 접착성 단백질의 수용성 발현에 중요한 영향을 주는 것을 확인하였다. 아울러 본 발명자들은 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 넙치 Hepcidin I과 같은 양친매성 도메인을 포함하는 단백질의 경우 상기 신호서열의 N-영역의 단편만으로는 수용성 발현에 한계가 있음을 발견하였고, 친수성의 분비증강자 서열을 유전자 컨스트럭트에 추가함으로써 넙치 Hepcidin I의 수용성 발현을 증가시키는 방법을 확립하였다.
이에, 본 발명자들은 다양한 pI값의 신호서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하여, 상기 재조합 벡터에서 신호서열 N-말단의 pI값이 외래 단백질의 수용성 발현에 영향을 주는 것과, 외래 단백질의 구조적 특성에 따라 분비증강자가 필요한 경우 신호서열 N-말단의 pI값과 분비증강자 간의 pI값에 연관성을 증명하고, 외래 단백질을 발현하도록 구성된 재조합 발현 벡터에서 신호 서열의 pI값을 조절하는 방법이 상기 외래 단백질의 수용성 발현에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 외래 기원의 유전자로부터 효과적으로 수용성 재조합 융합 단백질을 생산하고 원래 형태의 아미노 말단을 가진 단백질로 회수하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 및/또는 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리가 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 (ⅲ) 상기 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체에 작동 가능하도록 연결된 pI값이 조절된 친수성 증가서열로 구성된 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질 전환하여 제조한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 재조합 단백질의 분비 효율 향상 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 재조합 융합 외래단백질의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 융합 외래단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 외래단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 원래 형태의 외래단백질 생산 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 세포 내로 전달시키고자 하는 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"외래 단백질(heterologous protein) 또는 목적 외래단백질(target heterologous protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 형질전환체에서 발현할 수 있는 모든 단백질을 의미한다.
"융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 외래단백질의 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.
"신호서열(signal sequence)"은 바이러스, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포에서 발현되는 외래 단백질을 페리플라즘 또는 세포 외부로 분비하기 위해 상기 외래 단백질이 세포내막을 통과할 수 있도록 도와주는 효율적인 서열을 의미한다. 신호서열은 N-말단에 양전하가 충전된 N-영역(positively charged N-region), 중앙의 특이적인 소수성 영역(central characteristic hydrophobic region) 및 C-말단 절단 영역(C-region with a cleavage site)으로 구성되어 있다. 본 발명에서 사용한 신호서열 단편은 N-말단에 양전하가 충전된 영역(positively charged region)과 중앙의 특이적인 소수성 영역(central characteristic hydrophobic region) 및 C-말단 절단 영역의 전체 또는 일부를 의미한다.
"선도서열(leader sequence)"은 외래 단백질의 N-말단에 위치하는 아미노산 서열을 의미한다.
"폴리펩타이드 단편(polypeptide fragment)"은 특정 폴리펩타이드의 기능을 유지하면서 최소 길이 또는 그 이상의 크기를 갖는 폴리펩타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에서 특별히 언급하지 않는 한, 전체 길이의 폴리펩타이드는 이에 포함되지 않는다. 예를 들어, 본 명세서에서 언급하고 있는 '신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩타이드 단편'은 신호서열 중 신호서열로 기능 하는 단축된 신호서열을 의미하며, 전체 신호서열은 이에 포함되지 않는다.
"폴리뉴클레오티드"는 두 개 이상의 핵산분자가 이인산에스테르 결합으로 연 결된 중합체 분자를 의미하며, DNA 및 RNA가 이에 포함된다.
"분비증강자(secretional enhancer)"는 신호서열(signal sequence) 또는 선도서열 영역 바로 뒤에서 친수성을 증가시키는 역할을 수행하는, 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 폴리펩타이드를 의미한다.
"신호서열의 N-영역(N-region)"은 통상의 신호서열에서 보존적으로 발견되는 부분으로서, N-말단에 위치한 염기성이 강한 서열을 의미하며 신호서열에 따라, 1 내지 10개의 아미노산을 구성된다.
"중앙 특이적 소수성 영역(central specific hydrophobic region)"은 통상적인 신호서열의 구조 중 N-영역에 바로 뒤따르는 지역으로서 다수의 소수성 아미노산에 의하여 소수성을 강하게 띄는 부분을 의미한다.
"신호서열 단편(signal sequence fragment)"은 모두 신호서열의 일부를 의미하며, 본 명세서에서 특별히 언급하지 않는 한, 신호서열의 C-말단 부위가 절단되어 제거된 단편을 의미한다.
"신호서열 단편의 변이체"는 신호서열 단편에서 첫 번째 아미노산 Met 이외의 서열을 임의로 변이시키는 것을 의미한다.
"단백질 절단효소 인식 부위"는 단백질 절단효소가 인식하여 절단하는 특정자리의 아미노산 서열을 의미한다.
"양친매성 도메인(amphipathic domain)"은 친수성 및 소수성 지역이 혼재하고 있는 도메인으로서, 막전위 도메인과 유사한 구조를 갖는 단백질 내부의 영역을 의미한다. 따라서 본 명세서에서는 "막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)"과 동일한 의미로 사용된다.
"막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)"은 폴리펩타이드의 아미노산 서열 분석 시, 막단백질의 막전위 도메인과 유사한 구조를 가질 것으로 예측되는 부위를 의미한다(Brasseur et al ., Biochim Biophys Acta 1029(2):267-273, 1990). 통상적으로 상기 막전위-유사 도메인은 막전위 도메인을 예측하는 다양한 컴퓨터 소프트웨어를 통해 용이하게 예측이 가능하다. 상기 컴퓨터 소프트웨어의 예로는 TMpred, HMMTOP, TBBpred, DAS-TMfilter(http://www.enzim.hu/DAS/DAS.html) 등이 존재한다. 상기 "막전위-유사 도메인"은 실제 막전위 특성을 가진 것으로 규명된 "막전위 도메인(transmembrane domain)"도 포함한다.
"발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩타이드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택마커, 증폭제(enhancer), 폴리아데닐화 신호, 기타 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.
"작동 가능하게 연결된"은 단편은 배열되어서 그들은 일제히 그들의 의도한 목적, 예를 들면, 전사는 프로모터에서 개시하고 암호화 단편을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하는 것을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 접착성 단백질을 코딩하는 염기서열 7×mefp1의 5‘ 말단에, 대장균에서 단백질 분비를 유도하는 신호서열(signal sequence) OmpA에서 OmpA 신호 펩타이드(signal peptide)(OmpASP)의 일부인 OmpASP1(Met) 및 OmpASP1-2(Met-Lys)의 코딩 서열을 융합하여 pET-22b(+)(ompASP 1-7×mefp1*) 및 pET-22b(+)(ompASP 1-2-7×mefp1*) 클론을 제작하였다(표 1 참조). 제작된 클론 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 발현한 결과, 하나의 아미노산(라이신; Lysine; Lys; K; pI = 9.72) 차이에 의해 상기 두 클론으로부터 발현된 Met-7×Mefp1*(서열번호 15) 및 Met-Lys-7×Mefp1*(서열번호 16) 단백질의 수용성 발현에 현저한 차이가 있음을 확인하였다(도 1a의 라인 1 및 라인 2 참조). 즉, N-말단에서 pI값에 영향을 주는 Lys가 아주 중요하게 수용성 발현에 작용함을 확인하고, 이번에는 상기 접착성 단백질의 N-말단에 있는 2번째 아미노산인 Lys(Ala-Lys)까지의 서열을 선도서열의 pI값을 계산하기 위한 기준으로 설정하였다. 상기 두 단백질을 대상으로 OmpASP 단편(Met[M] 또는 Met-Lys)부터 Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지의 pI값을 컴퓨터 프로그램 DNASISTM(Hitachi, Japan)으로 분석한 결과, Met-Ala-Lys 펩타이드의 pI값은 9.90이고 Met-Lys-Ala-Lys 펩타이드의 pI값은 10.55으로 나타났다(표 1 참조). 상기 결과를 뒷받침하기 위해 OmpASP1-2 보다 Lys를 하나 더 가지고 있는 신 호서열 단편 OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)(서열번호 17)의 코딩 서열을 융합하여 pET-22b(+)(ompASP 1-3-7×mefp1*) 클론을 제작하여, 위와 동일한 방법으로 수용성 발현을 조사한 결과(도 1a의 라인 3 참조), Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지의 선도서열 Met-Lys-Lys-Ala-Lys pI 값 10.82는 수용성 발현의 증가와 좋은 상관관계를 보였다.
이에, 본 발명자들은 pI값의 조절이 수용성 단백질 발현에 영향을 줄 수 있는 가를 확인하기 위하여 pET-22b(+)(ompASP 1-3 -7×mefp1*) 클론의 OmpASP 단편의 Lys과 Mefp1의 맨 처음 아미노산인 Ala 사이에 pI값을 증가시킬 수 있는 아미노산인 Lys를 추가로 삽입한 pET-22b(+)(ompASP 1-3 -Lys n -7×mefp1*) 및 Met(OmpASP1)과 Mefp1의 맨 처음 아미노산인 Ala 사이에 pI값을 증가시킬 수 있는 아미노산인 Arg를 추가로 삽입한 pET-22b(+)(ompASP 1 - Arg n -7× mefp1 *) 클론을 제조하였고, 상기 단백질들의 N-말단으로부터 Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지의 pI값을 분석하였다(표 1 참조). 제작된 클론 벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 발현하였고, 그 발현량을 상기 Met-7×Mefp1*(서열번호 15), Met-Lys-7×Mefp1*(서열번호 16) 및 Met-Lys-Lys-7×Mefp1*(서열번호 17) 단백질의 발현량과 비교한 결과, Lys에 의해 증가한 pI값 10.99 내지 11.21 사이(서열번호 18 내지 20)의 수용성 발현 결과는 대조구로 사용한 pI값 10.55(서열번호 16)와 유사한 발현 양을 보였으나(도 1의 라인 4 내지 라인 6 참조), pI값 11.28부터는 점차 감소하는 현상을 보였고(도 1의 라인 7 참조), 특히 pI값 11.41(서열번호 22)에서는 매우 감소한 결과를 보였 다(도 1의 라인 8 참조). 상기 결과는 Lys의 경우, 선도서열의 pI값이 10.55 이상에서 pI값이 막-투과성에 특이적으로 관여하고 있음을 나타내며, Lys에 의해 증가한 pI값 10.82 내지 11.41에서는 선도서열 OmpASP1-3-Lysn-Ala-Lys에서 Lys이 추가된 서열들이므로 OmpASP가 가지는 pI값 10.55와 동일한 막-투과 채널을 가질 것으로 예상된다.
또한, Arg에 의해 증가한 pI값 11.52 내지 13.35 사이(서열번호 23 내지 27)의 수용성 발현 결과는 두 개의 Arg이 연결된 선도서열의 pI값 12.51에서 발현이 약간 증가한 결과를 제외하고는 pI값이 상승할수록 점차 약하게 발현되었으며 pI 값 13.35에서는 매우 감소하였다(표 1 및 도 1b 참조). Arg의 경우도 두 개의 Arg가 연결된 경우 감소된 분자량(도 1b의 라인 3 참조)은 선도서열 부분이 일종의 단백질분해효소에 의해 절단되었다고 판단됨으로 선도서열 OmpASP1-Argn-Ala-Lys에 인위적으로 추가된 Arg을 가진 선도서열들도 공통적으로 Arg 특이적 막-투과성을 가지리라 사료된다. 그러나 현 단계에서 상기 Arg 특이적 막-투과 기작과 TAT(twin-arginine translocation) 시스템의 신호서열(Berks, Mol . Microbiol . 22:393-404, 1966)과의 관계는 설명하기 어렵다.
또한, 본 발명자들은 pI값이 낮게 조절된 선도서열의 N-말단이 Mefp1 단백질의 수용성 발현에 줄 수 있는 영향을 확인하기 위하여, pET-22b(+)(ompASP 1 -7×mefp1*)을 대조군으로 선도서열인 Met-Ala-Lys의 Ala-Lys의 서열을 다양하게 변형함으로써 pI값이 2.73 내지 7.65(서열번호 35 내지 41)로 낮은 pI값을 다양하게 갖 도록 하는 선도서열의 변이체들(MDDDDDAA; pI2.73, MDDDAA; pI2.87, MEE; pI3.09, MAE; pI3.25, MAA; pI5.60, MCH; pI7.13, MAH; pI7.65)을 제조하였고(표 2 참조), 그 발현량을 조사하였다. 그 결과, 접착성 단백질의 수용성 발현량은 pI값이 2.87 내지 7.65에서 대조구인 pI 9.90과 유사하거나 높게 발현된 것으로 나타났고, 특히 그 중에서도 pI값 3.09(서열번호 37)에서 발현량이 가장 높았다(도 2의 라인 3 참조). 발현 형태를 분석해 보면 pI 2.73 내지 3.25의 Asp/Glu 특이적 발현과 pI 값 3.25 내지 9.90의 비교적 완만한 경사의 두 가지 발현 형태가 존재하였다. 따라서 pI 값이 낮게 조절된 선도서열 N-말단 pI 값에 의한 접착성 단백질의 수용성 발현에는 두 가지 스펙트럼이 있음을 확인하였고, 다시 한 번 N-말단의 pI값의 영향을 확인할 수 있었다. 즉, 상기 선도서열의 N-말단 변이체들 중 MAA(pI5.60)(서열번호 39), MCH(pI7.13)(서열번호 40) 및 MAH(pI7.65)(서열번호 41)의 경우는 전하와는 상관관계가 낮은 서열이고, 상기 변이체들의 짧은 서열 내에 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제기한 것과 같은 분비증강자가 위치해 있을 수 없기 때문에, 상기 발현량의 차이는 전적으로 선도서열의 N-말단 변이체들의 pI값에 의한 것으로 판단된다. 앞서 기술한 바와 같이 pET-22b(+)(ompASP 1-3 -Lys n -7×mefp1*) 및 pET-22b(+)(ompASP 1 - Arg n -7× mefp1 *) 클론에서 발현된 선도서열에 높은 + 하전을 갖는 접착성 단백질 및 강한 - 하전을 갖는 선도서열 MDDDDDAA(서열번호 35)를 가진 접착성 단백질의 경우도 발현과 하전과는 상관성이 없음이 밝혀졌다.
따라서 상기 결과를 토대로 pI 값 범위에 따른 수용성 발현 패턴을 분석한 결과, 높은 pI 값에서 접착성 단백질의 수용성 발현에는 ① pI값 10.82를 중심으로 하는 pI값 (9.90 내지 11.41)의 Lys 특이적 막-투과 기작, ② 두 개의 Arg을 가진 pI값 12.51을 중심으로 하는 pI 값(11.52 내지 13.35)의 Arg 특이적 형태의 막-투과 기작이 있다고 사료되며, 그 밖의 광범위한 pI값(2.73 내지 9.90)에서는 ③ 낮은 pI 값 (2.73 내지 3.25) 사이에는 Asp/Glu 특이적 막-투과 기작과 ④ pI 값 3.25-9.90에서의 비교적 비특이적 막-투과 기작이 있는 것으로 예상된다. 이러한 막-투과 기작을 분류해보면 높은 pI 값을 갖는 선도서열들에서는 Lys 특이적 OmpASP의 Sec system(pI값 9.90 내지 11.41) 및 Arg 특이적 막-투과 기작(pI값 11.52 내지 13.35), 광범위한 낮은 pI값(pI값 2.73 내지 9.90)을 갖는 선도서열들에서는 최적 pI값 3.09를 가지는 Asp/Glu 특이적 막-투과 기작(pI값 2.73 내지 3.25) 및 다양한 pI 값 3.25 내지 9.90에서 중심 되는 pI 값이 없이 비교적 수평적 막-투과 기작을 가지는 일종의 수동적 막-투과 기작을 갖는 것으로 분류될 수 있다고 추측된다. 또한 이 네 가지 막-투과 기작은 모두 하전의 증가 및 발현 양의 관계와는 일치하지 않음을 알 수 있다. 따라서 pI 값과 단백질 막-투과성과의 연관성을 분석한 이러한 결과는 앞으로 단백질의 막-투과 기작을 밝혀 수용성 재조합 단백질의 발현 연구에 효과적으로 이용될 수 있을 것이다.
높은 pI 값 11.41 및 13.35에서 낮은 발현율을 보인 선도서열(서열번호 22 및 서열번호 27)들은 같은 값의 비교적 높은 친수성 값 1.93을 가지고 있고, 낮은 pI 값 2.73에서 낮은 발현률을 보인 선도서열(서열번호 35)도 비교적 높은 친수성 값 1.09를 가지고 있어 선도서열 부분에 지나치게 증가된 친수성 값은 앞서 출원 (대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호)에서 넙치 헵시딘 I의 경우 친수성을 가진 막-전위 유사 도메인이 내부에 존재할 때 수용성 발현을 억제한다는 가설과 유사하게 지질 이중막에 결합될 수 있음으로 막-투과력을 감소시킬 수 있다고 생각된다. 그러나 Lys를 첨가한 경우 선도서열(신호서열 18 내지 21)은 비교적 높은 친수성 값을 가지나 어느 정도 친수성 값의 상쇄가 있는 것처럼 보인다. 따라서 Lys 증가에 의한 막-투과력 증가는 매우 특이적이라 판단된다.
또한, MEE(pI 3.09)(서열번호 37) 변이체에 의해 증가된 발현의 결과로부터 상기 접착성 외래 단백질의 선도서열의 pI값 3.09가 하나의 적합한 pI 값인 것으로 판단할 수 있었다. 상기 선도서열 변이체와 연결된 외래 단백질 서열 간의 거리를 최적화시키고, 원래 형태의 아미노 말단을 가진 단백질을 생산하기 위해, Xa 인자 인식부위(Xa)를 포함하도록 MEE(i=n)-Xa의 형태로 디자인하였고, ( ) 안에 pI값에 영향을 주지 않는 OmpASP4 -9의 아미노산을 insert(i) = n(0, 2, 4, 6)개의 아미노산을 삽입하여 pET-22b(+)(MEE-(i=n)-Xa-7× mefp1 *) 클론을 제조하였다(표 3 참조). 그 결과, MEE와 Xa 사이에 아미노산의 삽입이 없을 때와 두 개의 아미노산이 삽입되었을 때 수용성 단백질의 발현량이 가장 많았다(도 3 참조). 즉, 선도서열과 절단효소 인식부위의 거리가 i = 0 내지 2에서 최적임이 확인되었다. 또한, 상기 수용성 단백질은 절단 효소 인식부위를 포함하고 있으므로 절단효소를 처리함으로써 공지된 방법에 의해 원래 형태의 N-말단을 가지는 재조합 단백질로 생산할 수 있다.
접착성 단백질의 수용성 발현에 신호서열을 포함하는 N-말단의 pI값이 영향 을 줄 수 있음을 확인한 본 발명자들은 이어서 단백질의 pI값에 영향을 줄 수 있는 아미노산(예를 들어, Lys)의 거리가 상기 단백질의 수용성 발현에 줄 수 있는 영향을 확인하고자 하였다. 즉, 단백질의 N-말단에서 선도서열 MKAK와 MKK는 계산적으로 같은 pI값을 가지나, Lys 사이에 pI값에 영향을 덜 주는 아미노산(예를 들어, Ala[알라닌; Alanine; A])이 포함되어 Lys 사이의 거리가 떨어진 경우에는 그 기능에 차이가 있을 것을 예상하고, 신호서열 OmpASP 단편 아미노산 서열을 토대로 MK1-(d=n)-K2-(8-n)의 형태로 디자인하고 ( ) 안에 pI값에 영향을 주지 않는 d1 = n(0, 2, 4, 6, 8) 개의 OmpASP1 -11의 아미노산을 삽입하여 pET-22b(+)[MK 1 -(d 1 =n)-K 2 -(8-n)-A A -mefp1 3-10 -6× mefp1 *] 클론을 제조하였다(표 4 참조). 그 결과, 두 K 사이의 거리(K1-K2의 거리 d1)가 d1 = 4에서 수용성 단백질이 가장 강하게 발현되었다(표 4 및 도 4a 참조). 즉, d1 = 4에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 최적거리임이 확인되었다. 추가적으로, d1 = 4로 하고, 상기 클론의 밑줄친 Ala를 Lys(K3)로 대체한 후, K2와 K3사이에 d2 = n(1, 2, 3, 4) 개의 Ala를 삽입하여 pET-22b(+)[MK 1 -(d 1 =4)-K 2 -(d 2 =n)-AK 3 -mefp1 3-10 -6× mefp1 *] 클론을 제조하였다(표 4 참조). 그 결과, K 사이(K2-K3의 거리 d2)는 d2= 2 > 1 > 4 > 3의 순서로 최적 거리가 확인되었고, 이러한 최적 거리에 대한 결과는 접착성 단백질의 수용성 발현과 직접적인 관련이 있음이 밝혀졌다. 또한 상기 결과는 선도서열의 pI 값 및 Lys-Lys 간의 거리 가 중요한 요인이지 서열이 중요한 요인이 아니라는 것을 보여 준다(표 4 및 도 4b 참조).
상기 접착성 단백질(Mefp1)은 도 1a의 라인 1에서 나타난 것처럼 신호서열의 Met만을 상기 단백질의 N-말단에 부착하여도 수용성 발현이 어느 정도 관찰되는 단백질이다. 또한, 신호서열 및 선도서열의 pI값 조절 및 상기 서열의 아미노산 간의 거리의 조절에 의해서 상기 접착성 단백질의 수용성 발현 량이 증가할 수 있었다. 그러나 넙치 헵시딘 I 단백질은 분자 내에 양친매성 도메인(amphipathic domain) 또는 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain)을 포함하고 있어서, 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서는 신호서열 기능과 상기 도메인을 상쇄할 수 있는 친수성 값이 큰 분비증강자가 포함되어야 수용성 단백질로 발현할 수 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 넙치 헵시딘 I의 수용성 단백질로의 발현을 위해 상기 단백질의 N-말단의 선도서열을 신호서열 기능과 상기 분비증강자 기능을 동시에 포함하도록 M-7×동형아미노산이 연결된 형태로 디자인하고 pI값이 2.52 내지 13.28로 조절되며 소수성 값 -1.55 내지 +1.97로 조절된 단백질의 발현을 위한 pET-22b(+)(ompASP 1 -7×동형아미노산- ofhep Ｉ**) 클론을 제조하였다(표 5 참조). 상기 동형 아미노산은 아르기닌(Arginine, Arg; R), 라이신(Lysine, Lys, K ), 히스티딘(Histidine, His; H), 티로신(Tyrosine, Tyr; Y), 시스테인(Cysteine, Cys; C), 글루탐산(Glutamic Acid, Glu; E) 및 아스파르트산(Aspartic Acid, Asp; D) 등이 동일한 아미노산 서열로 7번 연속된 것을 나타낸다. 상기 소수성 값은 DNASISTM(Hitachi, Japan)에 의해 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale, 창 크기: 6, 역치값: 0.00)로 계산되었다. 상기 소수성 값이 +가 될 경우 펩타이드는 친수성을 띄며, -가 될 경우 소수성을 띄며, 절대 값이 클수록 친수성 또는 소수성의 정도가 높음을 의미한다. 상기 단백질들의 발현량을 조사한 결과, MRRRRRRR 서열(pI 13.28, 친수성 값 +1.97)(서열번호 70) 및 MKKKKKKK 서열(pI 11.28, 친수성 값 +1.97)(서열번호 71)을 가진 클론에서만 헵시딘 I의 수용성 발현이 관찰되었다(도 5 참조). 상기 선도서열들은 신호서열(MRRRRRRR 및 MKKKKKKK)로서도 높은 pI값을 보이고, 분비증강자 서열(RRRRRRR 및 KKKKKKK)로서도 높은 pI값과 높은 친수성 값을 갖는 경우이다. 상기 결과는 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현의 경우에서, 넙치 헵시딘 I의 경우 신호서열의 높은 pI값과 내부에 포함된 양친매성 도메인 또는 막전위-유사 도메인보다 높은 친수성 값의 지표를 필요로 했던 사실과 일치한다. 그러나 상기 선도서열들(MRRRRRRR 및 MKKKKKKK)과 유사한 MKK(K)n(n=6)AK 및 M(R)n(n=8)AK 서열들은 접착성 단백질의 경우 대조구인 MAK 보다 거의 수용성 발현을 증가시키지 못하였다. 또한 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 pET-22b(+)(ompASP1 -8-SmaI-Xa-7×mefp1*) 클론의 SmaⅠ 자리에 6개의 아르기닌(Arg) 또는 6개의 리신(Lys)에 해당하는 뉴클리오타이드를 대치한 결과 접착성 단백질의 수용성 분비가 약간 증가되기는 하였으나 넙치 헵시딘 I의 분비증강자 서열에서와 같은 현저한 증가는 얻어지지 않았다(데이타 없음). 따라서 넙치 헵시딘 I에서 이 선도서열들(MRRRRRRR 서열; MKKKKKKK 서열)의 신호기능 부분과 분비증강기능 부분이 복합적인 것인지 또는 별개(Met만을 선도서열로 가질 경우: pI값 5.70)인지 판단하기는 매우 어렵다고 판단된다.
이어서 본 발명자들은 상기의 결과들을 토대로 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현에 낮은 pI값의 변이된 신호서열이 미치는 영향을 알아보고자 상기 단백질의 N-말단을 신호서열의 변이체들(MAH; pI7.65, MAA; pI5.60 또는 MEE; pI3.09), OmpASP4 -10-6×동형아미노산 및 Xa 인자 인식부위(Xa)가 ofHepI에 연결된 형태로 디자인하고 pI값과 소수성/친수성 값이 조절된 선도서열로 단백질의 발현을 위한 클론을 제조하였다(표 6 참조). 상기 클론들의 발현량을 조사한 결과, pET-22b(+)[MAH ( pI 7.65)-OmpASP 4-10 -6× Arg - Xa - ofHep Ｉ**] 및 pET-22b(+)[MAA ( pI 5.60)- OmpASP 4 -10 -6× Arg - Xa -ofHepＩ**] 에서는 양호하게 발현되었고, pET-22b(+)[MEE ( pI 3.09)- OmpASP 4 -10 -6× Arg - Xa - ofHep Ｉ**]에서는 약하지만 어느 정도 발현되었으며, pET-22b(+)[MEE ( pI 3.09)- OmpASP 4 -10 -6× Glu - Xa - ofHep Ｉ**]에서 비교적 양호한 수용성 발현이 관찰되었다(도 6 참조). 상기 결과는 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제시했던, 외래 단백질의 N-말단이 높은 pI값(10.55)의 신호서열 단편(OmpASP1 -10)과 높은 pI값 및 높은 친수성 값을 가진 6×Arg 및 6×Lys를 포함하도록 구성된 경우뿐만 아니라, 본 발명의 외래 단백질의 N-말단이 낮은 pI값으로 변이된 신호서열 단편과 낮은 pI값 및 높은 친수성 값을 가진 6×Glu를 포함하도록 구성된 넙치 헵시딘 I의 경우에서도 수용성 발현이 가능함을 나타낸다.
따라서 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현의 경우를 통해 신호서열 단편의 pI값과 분비증강 서열의 pI값 및 친수성 값과의 상호 간에 매우 긴밀한 관련성이 있고, 신호서열의 단편의 pI값이 5.60, 7.65 및 10.55일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자가 요구되며, 신호서열 단편의 낮은 pI값이 3.09일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자 뿐만 아니라 낮은 pI값 및 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자도 활용 가능함이 판명되었다. 즉, 신호서열 단편의 pI값이 분비증강자의 pI값 및 높은 친수성 값의 특성을 규정하는 것으로 보이며 신호서열 단편 pI값과 분비증강자 간에 상호성이 있음을 나타내었다.
이러한 결과는, N-말단 단편으로 Met에 바로 분비증강자 후보서열을 연결할 경우, 수용성 발현이 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys에 국한되었지만, 소수성 부분을 포함하는 신호서열 단편의 N-말단에 pI 값을 변화시킨 경우에는 높은 pI 값과 친수성 아미노산뿐만 아니라 낮은 pI 값과 친수성을 가진 Glu까지 분비증강자 서열로 사용될 수 있어 분비증강자 서열의 활용 폭이 확대됨을 나타낸다. 이러한 결과는 pI 값이 변이된 선도서열의 N-말단에 소수성 단편이 연결되어 N-말단 단편 자체의 친수성을 낮추어 줌으로 뒤에 연결된 친수성의 분비증강자 서열의 범위를 확대해줄 수 있는 것으로 해석된다.
또한 상기 결과는 넙치 헵시딘 I에서도 신호서열 단편 및 변이된 신호서열 단편의 pI값에 스펙트럼이 있음을 나타낸다. 즉, 신호서열 단편 pI값의 스펙트럼의 차이는 분비증강자의 기능에 영향을 주어, 신호서열의 낮은 pI값 3.09에서 높은 pI값과 높은 친수성 값인 분비증강자 6×Arg 및 낮은 pI값과 높은 친수성 값인 분비증강자 6×Glu에 의한 수용성 헵시딘 I의 발현이 가능하였으며, 나머지 신호서열의 pI값 5.60, 7.65 및 10.55에서는 높은 pI값과 높은 친수성 값인 분비증강자 6×Arg에 의해 수용성 발현이 가능하였다. 그러나 상기 결과 중 선도서열 pI값 3.09, 5.60, 및 7.65의 경우는 도 2에서 나타낸 경우처럼 접착성 단백질의 넓은 스펙트럼의 선도서열 단편의 pI값이 갖는 막-투과 기작과 유사한 기능으로 막-투과 과정에 관여하리라 사료된다. 그러나 pI값 10.55는 도 1에서 나타낸 경우처럼 OmpASP 단편 특정 pI값 10.55의 특이적 pI값에 의한 수용성 단백질 발현의 조절을 받을 것으로 사료된다.
결론적으로 접착성 단백질의 신호서열 단편 및 선도서열 단편의 pI값이 수용성 발현에 결정적으로 영향을 미쳤고, 하전과는 상관성이 없었다. 접착성 단백질의 수용성 발현과 선도서열의 pI값과의 상호관계는 pI값 9.90 내지 11.41의 Lys에 의한 특이적 막-투과 기작, pI값 11.52 내지 13.35의 Arg에 의한 특이적 막-투과 기작, 낮은 pI 값 2.73 내지 3.25의 Asp/Glu 특이적 막-투과 기작과 pI 값 3.25 내지 9.90까지의 비특이적 막-투과 기작이 있음을 처음으로 확인하였다. 그러나 접착성 단백질의 경우 선도서열에 분비증강자 서열로 알려진 poly Lys 및 poly Arg 서열(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호)을 연결하였을 때 발현이 현저하게 증가하지는 않았음으로 접착성 단백질과 같이 내부에 막-전위 유사 도메인이 없는 경우는 선도서열에 분비증강자 서열을 연결하여도 발현 증가와는 상관성이 적은 것으로 예상된다. 또한 선도서열과 절단효소 인식부위를 연결할 때와 신호서열 단편 내의 Lys 거리 간에 최적 거리가 있음을 최초로 확인하였다.
막-전위 유사도메인이 있는 넙치 헵시딘 I은 신호서열 단편 및 선도서열의 pI값만으로 수용성 발현이 아주 미약하거나 불가능하였으나, N-말단 단편으로 Met에 바로 분비증강자 후보서열을 연결한 경우, 수용성 발현이 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys에서 수용성 발현이 가능하였고, 여러 pI값을 갖도록 N-말단의 pI값을 변이시킨 신호서열 단편에서 일반적으로 높은 pI 값과 친수성을 가진 분비증강자 서열과 연결하였을 때 수용성 발현이 가능하였으나, 낮은 pI 값을 가진 선도서열은 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산 및 낮은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산의 분비증강자 서열과 연결하였을 때 수용성으로 발현이 가능하였다. 이러한 결과는 신호서열 단편 및 선도서열의 pI 값이 앞서 접착성 단백질의 발현에서 보듯이 다양함을 알 수 있다. 그러나 분비증강자 서열들은 pI 값에 관계없이 높은 친수성을 가진 아미노산을 공통으로 필요로 하므로 수용성으로 발현되기 위해서는 넙치 헵시딘 I이 내부에 갖고 있는 막-전위 유사 도메인보다 높은 친수성이 공통으로 필요함을 알 수 있다.
또한 소수성 부분을 포함하는 신호서열 단편의 N-말단에 pI 값을 변화시킨 경우, Met에 바로 분비증강자 후보서열을 연결한 경우보다, 분비증강자 서열의 활용 폭이 확대됨을 알 수 있다. 이러한 결과는 신호서열에 연결된 소수성 부분이 선도서열(신호서열 단편의 N-말단에 pI 값을 변화시킨 서열) N-말단의 친수성을 낮추어 앵커로서 선도서열의 기능을 자유롭게 하여 친수성 분비증강자 서열의 막-투과 범위를 확대해줄 수 있는 것으로 해석되며 선도서열 N-말단 pI 값과 분비증강자 서 열 상호간에는 일종의 상호성이 있을 것으로 사료된다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시태양을 상세히 설명한다.
본 발명은 (i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 및/또는 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리가 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다.
이때, 상기 프로모터는 바이러스 기원의 프로모터, 원핵생물 기원의 프로모터 또는 진핵생물 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 바이러스 기원의 프로모터는 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 폴리오마 바이러스 프로모터, 계두 바이러스 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 소 유두종 바이러스 프로모터, 조류 육종 바이러스 프로모터, 레트로바이러스 프로모터, B형 간염 바이러스 프로모터, 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 프로모터 또는 원숭이 바이러스 40(SV40) 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 원핵생물 기원의 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, 열충격단백질(heat-shock protein) 70 프로모터, β-락타마제, 락토스 프로모터, 알칼라인 포스파타제 프로모터, 트립토판 프로모터, 또는 tac 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 진핵생물 기원의 프로모터는 효모 기원의 프로모터, 식물 기원의 프로모터 또는 동물 세포 기원의 프로모터인 것이 바람직하다. 상기 효모 기원의 프로모터는 3-포스포글리세레이트 키나제 프로모터, 에놀라제 프로모터, 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 프로모터, 헥소키나제 프로모터, 피루베이트 디카르복실라제 프로모터, 포스포프럭토키나제 프로모터, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 프로모터, 3-포스포글리세레이트 뮤타제 프로모터, 피루베이트 키나제 프로모터, 트리오스포스페이트 이소머라제 프로모터, 포스포글루코스 이소머라제 프로모터, 글루코키나제 프로모터, 알코올 디히드로게나제 2 프로모터, 이소시토크롬 C 프로모터, 애시딕포스파타제(acidic phosphatase) 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL1 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL7 프로모터, Saccharomyces cerevisiae GAL10 프로모터, 또는 Pichia pastoris AOX1 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 동물 세포 기원의 프로모터는 열-충격 단백질(heat-shock protein) 프로모터, 프로액틴 프로모터 또는 면역글로블린 프로모터인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 프로모터는 본 발명의 외래유전자를 숙주세포에서 정상적으로 발현시킬 수 있는 것이라면 모두 사용가능하다.
상기 신호서열(signal sequence)은 바이러스, 원핵생물 및 진핵생물 기원의 신호서열(signal sequence)인 것이 바람직하며, OmpA 신호서열, CT-B(cholera toxin subunit B) 신호서열, LTⅡb-B(E. coli heat-labile enterotoxin B subunit) 신호서열, BAP(bacterial alkaline phosphatase) 신호서열(Izard and Kendall, Mol. Microbiol. 13:765-773, 1994), 효모 카복시펩티다제(Yeast carboxypeptidase) Y 신호서열(Blachly-Dyson and Stevens, J. Cell. Biol. 104:1183-1191, 1987), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)의 치사독소 감마 서브유닛(killer toxin gamma subunit) 신호서열(Stark & Boyd, EMBO J 5(8):1995-2002, 1986), 소 성장호르몬(bovine growth hormone)의 신호서열(Lewin, B.(Ed), GENES V, p290. Oxford University Press, 1994), 인플루엔자 뉴라미니다제(influenza neuraminidase)의 신호-앵커(signal-anchor)(Lewin B(Ed), GENES V, p297. Oxford University Press, 1994), 트랜스로콘-결합 단백질 서브유닛 알파(Translocon-associated protein subunit alpha, TRAP-α, Prehn et al., Eur J Biochem 188(2):439-445, 1990)의 신호서열, Twin-arginine translocation(Tat) 신호서열(Robinson, Biol Chem 381(2):89-93, 2000) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 pI값이 9.90 내지 11.41로 조절된 1 내지 6개의 아미노산 길이로 구성되는 폴리펩타이드 또는 pI값이 3.09 내지 9.90으로 조절되고, 상기 아미노산은 1 내지 12개의 아미노산 길이로 구성되는 폴리펩타이드인 것이 바람직하나 그 길이는 이에 한정되지 않으며, 상기 펩타이드의 아미노산 서열 및 길이는 N-영역의 pI값을 고려하여, 다른 아미노산으로 대체되거나 적절한 길이로 조절할 수 있다. 더욱 바람직한 양태에서, 상기 신호서열의 N-영역을 포함하는 폴리펩타이드 단편의 pI값은 외래 단백질의 수용성 발현을 위해 스크리닝 될 수 있다(도 1 및 표 1 참조). 또한, 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리는 폴리펩타이드 단편은 외래단백질의 수용성 발 현을 최적화할 수 있는 길이로 조절될 수 있다(도 1 내지 4 및 표 1 내지 4 참조).
상기 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편들의 pI값의 조절에 있어서 N-영역의 아미노산 사이에 pI값에 영향을 줄 수 있는 아미노산을 추가함으로써 달성할 수 있다. 구체적으로, 상기 단편들의 pI값을 높이기 위해서는 염기성 아미노산, 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His) 등을 추가로 포함함으로써 달성할 수 있고, pI값을 낮추기 위해서는 산성 아미노산, 아스파르트산(Asp) 및 글루탐산(Glu) 등을 추가함으로써 달성할 수 있다. 또한, pI값에 영향을 주는 아미노산 간의 거리의 조절을 위해서는 글리신(Gln), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 메티오닌(Met), 시스테인(Cys) 및 프롤린(Pro)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 무극성 아미노산, 또는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 극성 아미노산을 추가로 포함함으로써 달성할 수 있다. 상기와 같은 아미노산의 치환방법은 당 업계에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., 1989. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York).
한편, 본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터의 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결된다(표 3 참조). 이때, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 또는 퓨린(Furin) 인식부위가 단독으로 사용되거나 어느 두 개 이상을 순차적으로 연결하여 사용할 수 있다. 한편, 상기 단백질 절단 효소 인식 부위는 Xa 인자의 경우, Ile-Glu-Gly-Arg인 것이 바람직하다. 또한, 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 뉴클레오티드 사이에 글리신(Gln), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 메티오닌(Met), 시스테인(Cys) 및 프롤린(Pro)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 무극성 아미노산, 또는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 극성 아미노산을 추가로 포함함으로써 길이가 0 내지 2로 조절된 아미노산을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 절단효소 인식부위를 연결할 대에 최적 거리의 범위를 확인하였다(표 3 및 도 3 참조).
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터는 추가로 외래단백질을 코딩하는 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위가 포함된다. 상기 제한효소 부위는 상기 신호서열의 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 뒤에 연결되고, 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함된 벡터의 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드 뒤에 연결될 수 있다. 만일, 벡터 내에 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 존재할 경우에는 제한효소 부위는 부가되거나 부가되지 않을 수 있는데, 원래 형태의 단백질을 생산한다는 관점에서는 제한효소 부위를 통한 외래단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝은 바람직 하지 않을 수 있다.
한편, 상술한 벡터에 외래단백질을 코딩하는 유전자가 추가로 삽입될 수 있다. 이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 재조합 융합 단백질로 발현할 수 있다. 또는, 상기 외래단백질은 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것이 바람직하며, 상기 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 없는 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Mefp1 중합체인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 (i) 프로모터 및 (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 단편 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 (ⅲ) 상기 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체에 작동 가능하도록 연결된 pI값이 조절된 친수성 증가서열로 구성된 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터를 제공한다.
상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 내부에 막전위 도메인(transmembrane domain), 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain) 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있는 단백질인 것이 바람직하다. 상기 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 외래단백질은 + 하전이 있는 부분이 막의 지질이중층(lipid bilayer)에 부착되어 이러한 막전위-유사 구조가 일종의 앵커 역할을 수행하여, 세포 외부로 분비가 잘 안 되는 것으로 추정된다. 이런 분비 곤란한 단백질을 세포 외로 분비시키는데 본 발명의 상기 발현벡터는 매우 효율적이다. 본 발명의 벡터가 상기와 같이 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 단백질의 수용성 생산에 적합한데, 이는 본 발명의 변이된 신호서열이 가지고 있는 유도 신호(directional signal)와 높은 친수도가 외래 목적 단백질이 내부에 가지고 있는 막전위 도메인이 가지고 있는 친수도 보다 클 경우, 미완성 단백질(nascent polypeptide)이 페리플라즘 밖으로 이동할 수 있기 때문인 것으로 사료된다. 그 원리는 상기 도메인들이 지질 이중층(lipid bilayer)에 붙는 힘보다 변이된 신호서열이 가지는 유도 신호(directional signal)의 방향성과 높은 친수도가 더 커서 분비가 촉진되기 때문인 것으로 추측된다. 상기 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 넙치 헵시딘 I인 것이 바람직하다.
다른 단백질의 경우에도, 소수성 프로파일을 분석할 때, 단백질의 내부에 막전위-유사 도메인으로 판정되는 부분이 나타나거나, 연속적인 다수의 소수성 아미노산으로 구성된 서열 뒤에 연속적인 다수의 친수성 아미노산으로 구성된 서열이 나타날 경우, 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인을 가진 단백질로 판정하여 본 발명의 발현시스템에 적용시킬 수 있다. 그러한 판정을 위해 서, 컴퓨터 소프트웨어를 이용할 수 있는데, 대표적인 것은 DNASISTM(Hitachi, Japan), DOMpro(Cheng et al., Knowledge Discovery and Data Mining 13(1):1-20, 2006; //www.ics.uci.edu/~baldig/dompro.html), TMpred(//www.ch.embnet.org /software/TMPRED_form.html), HMMTOP(//www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html), TBBpred(//www.imtech.res.in/raghava/tbbpred/), DAS-TMfilter(//www.enzim.hu/ DAS/DAS.html) 등이 존재한다.
이때, 본 발명의 (ⅲ)의 분비증강자의 pI 값은 (ii)의 폴리펩타이드의 단편의 pI 값에 따라 변화하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 폴리펩타이드 단편의 pI값이 5 내지 11로 조절된 경우, 상기 분비증강자는 pI값이 11 내지 14로 조절되는 것이 바람직하다. 또한, 즉, 상기 폴리펩타이드 단편의 pI값이 2 내지 5로 조절된 경우, 상기 분비증강자는 pI값이 2 내지 14로 조절되는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드 단편은 내부에 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His)으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 산성 아미노산이 상기 염기성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 높아지도록 조절될 수 있거나, 내부에 아스파르트산(Asp) 또는 글루탐산(Glu)의 산성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 염기성 아미노산이 상기 산성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 낮아지도록 조절될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현의 경우를 통해 신호서열 단편의 pI값과 분비증강 서열의 pI값 및 친수성 값과의 상호 간에 매우 긴밀한 관련성이 있고, 신호서열의 단편의 pI값이 5.60, 7.65 및 10.55일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자가 요 구되며, 신호서열 단편의 낮은 pI값이 3.09일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자 뿐만 아니라 낮은 pI값 및 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자도 활용 가능함이 판명되었다(표 5, 표 6, 도 5 및 도 6 참조).
본 발명의 벡터의 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하도록 분비증강자(secretional enhancer)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 연결될 수 있다. 분비증강자는 pI값이 조절된 친수성 증가서열로 구성되어 있으며, 이를 통해 신호서열의 친수성을 증가시켜 외래 단백질의 페리플라즘(periplasm) 밖으로의 이동을 촉진해 줄 수 있다. 상기 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 친수성 펩타이드이며, 더욱 바람직하게는 65% 이상의 친수성 아미노산, 가장 바람직하게는 70% 이상의 친수성 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드이며, 그 길이는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 4 내지 25개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드이며, 그보다 바람직하게는 6 내지 20개의 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드이며, 가장 바람직한 경우는 6개의 친수성 아미노산이 반복되는 구조를 갖는 폴리펩타이드로 구성된다. 상기 방법에 있어서, 친수성 아미노산은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 리신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 리신, 아르기닌, 글루탐산 또는 아스파르트산이다. 상기 분비증강자의 pI값은 외래 단백질의 수용성 발현을 위해 스크리닝 될 수 있다. 즉, 본 발명의 실시예에서 밝힌 외래 단백질에서 수용성 발현을 도울 수 있는 분비증강자의 pI값이 특정 값으로 특정되거나 넓은 범위로 특정될 수 있음을 근거로, 상기 폴리펩타이드의 신호서열 및 선도서열의 아미노산 서열 및 길이를 조절할 수 있다(표 5, 표 6, 도 5 및 도 6 참조).
본 발명의 발현 벡터에서 상기 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입되는데(표 6 참조), 이러한 삽입의 경우 상기 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 사이에 삽입된 제한효소 부위, 특히 SmaI과 같은 평활말단을 생성하는 제한효소에 의해 절단되는 제한효소 부위를 통해 이뤄지는 것이 바람직하다. 마찬가지로, 상기 단백질 절단효소 인식부위는 Xa 인자 인식부위, 엔테로키나제 인식부위, 제네나제(Genenase) I 인식부위 및 퓨린(Furin) 인식부위로 이루어진 군으로부터 단독 또는 융합의 형태로 사용된다.
발명의 실시태양에서, 본 발명의 발현벡터는, 유전자 컨스트럭트는 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된, 외래 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가로 포함하고, 상기 유전자 컨스트럭트에 작동 가능하도록 연결된 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 상기 외래 유전자는 제한효소 부위를 통해 클로닝될 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 추가로 포함될 수도 있고, 이 경우에는 상기 폴리뉴클레오티드와 틀이 맞도록(in frame) 연결되어, 외래단백질 분비 후 단백 질 절단효소로 절단 시, 원래 형태의 외래단백질이 생산될 수 있도록 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 숙주세포를 형질 전환하여 제조한 형질전환체를 제공한다.
이때, 상기 숙주세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것이 바람직하고, 상기 원핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이 바람직하며, 상기 진핵생물세포는 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 또는 식물 세포인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용한 재조합 단백질의 분비 효율 향상 방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하 도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 살펴본 바와 같이 접착성 단백질인 Mefp1의 수용성 발현을 위해 선도서열의 pI값을 다양하게 조절해 본 결과 pI값이 9.90 내지 11.41의 범위(표 1 및 도 1 참조) 또는 pI값이 3.09 내지 9.90의 범위에서 가장 수용성 발현량이 많은 것을 확인할 수 있었다(표 2 및 도 2 참조). 또한, 상기 선도서열의 pI값을 10.55 및 10.82로 정하고 pI값에 영향을 주는 Lys의 거리를 pI값에 영향을 주지 않는 아미노산 조성을 사용하여 조절한 결과, 최적의 발현을 나타내는 거리가 있음을 확인하였다(표 4 및 도 4 참조).
단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 바람직하게는 Lys이다.
이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 재조합 융합 단백질로 발현할 수 있다. 또는, 상기 외래단백질은 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것이 바람직하며, 상기 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 없는 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Mefp1 중합체인 것이 바람직하다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성 되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.
아울러, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 내부에 막전위 도메인(transmembrane domain), 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain) 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있는 단백질인 것이 바람직하다.
본 발명의 방법의 분비증강자의 pI 값은 폴리펩타이드의 단편의 pI 값에 따라 변화하는 것이 바람직하다. 즉, 상기 폴리펩타이드 단편의 pI값이 5 내지 11로 조절된 경우, 상기 분비증강자는 pI값이 11 내지 14로 조절되는 것이 바람직하다. 또한, 즉, 상기 폴리펩타이드 단편의 pI값이 2 내지 5로 조절된 경우, 상기 분비증강자는 pI값이 2 내지 14로 조절되는 것이 바람직하다. 상기 폴리펩타이드 단편은 내부에 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His)으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 산성 아미노산이 상기 염기성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 높아지도록 조절될 수 있거나, 내부에 아스파르트산(Asp) 또는 글루탐산(Glu)의 산성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 염기성 아미노산이 상기 산성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 낮아지도록 조절될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현의 경우를 통해 신호서열 단편의 pI값과 분비증강 서열의 pI값 및 친수성 값과의 상호 간에 매우 긴밀한 관련성이 있고, 신호서열의 단편의 pI값이 5.60, 7.65 및 10.55일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자가 요구되며, 신호서열 단편의 낮은 pI값이 3.09일 때에는 높은 pI값과 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강 자 뿐만 아니라 낮은 pI값 및 높은 친수성 값 아미노산의 분비증강자도 활용 가능함이 판명되었다(표 5, 표 6, 도 5 및 도 6 참조).
또한, 본 발명은 재조합 융합 외래단백질의 제조 방법을 제공한다.
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 재조합 융합 외래단백질은 상술한 본 발명의 발현벡터가 형질전환된 형질전환체에서 발현하여 단백질을 회수함으로써 생산할 수 있다. 회수 방법은 당업자에게 공지된 통상의 방법을 사용할 수 있다.
이때, 상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 당업자가 원하는 모든 단백질이 가능하며, 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청, 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 재조합 융합 단백질로 발현할 수 있다. 또는, 상기 외래단백질은 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것이 바람직하며, 상기 내부에 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 없는 단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, Mefp1 중합체인 것이 바람직하다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
아울러, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 내부에 막전위 도메인(transmembrane domain), 막전위-유사 도메인(transmembrane-like domain) 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있는 단백질인 것이 바람직하다.
더 나아가, 상기 외래단백질로 뇌를 표적으로 하는 치료용 단백질, 예를 들어 베타-아밀로이드에 특이적인 scFv(single chain variable fragment) 사용할 경우, 본 발명의 방법에 의하여 제조된 변이된 신호서열과 외래단백질 간의 융합 단백질은 종래에 단백질이 통과할 수 없었던, 뇌-혈관 장벽(blood-brain barrier)을 통과하여 뇌에 직접 작용할 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 약물전달체계(drug delivery system), 특히, 뇌질환 치료를 위한 약물전달체계의 발전에 획기적인 계기가 될 수 있다. 상기 뇌혈관 장벽의 통과 문제뿐만 아니라, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 융합 외래단백질은 경구투여시, 위 내에서 분해되기 전에, 위벽을 통과하거나, 경피에 도포 또는 패치 함으로써 피부를 통과하여 체내에 온전하게 전달될 수 있다. 그럼으로써, 종래의 단백질 제제의 가장 큰 문제점인 투여 방법의 제한(정맥주사, 근육주사, 피하주사 또는 비강투여)을 해소하고, 더욱 간편한 투여방법인 경구투여, 경피투여를 가능하게 할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 융합 외래단백질을 제공한다.
이때, 외래단백질은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌를 표적으로 하는 치료용 단백질인 것이 바람직하다. 또한, 상기 방법에 의하여 제조되는 융합 외래단백질은 본 발명의 변이된 신호서열로 말미암아 뇌-혈관 장벽을 통과할 수 있는 막투과 부위를 갖게 된다.
더 나아가, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 변이된 신호서열과 외래단백질의 재조합 융합 외래단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 뇌질환 치료에 사용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 융합 외래단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 특히 뇌졸증과 노인성 치매(알츠하이머)에 현재 사용되고 있는 뇌질환 치료용 단백질 제제의 전달 가능성을 높일 수 있을 것이라 기대된다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로 국부, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등으로 투여될 수 있고, 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형할 수 있으며, 바람직한 제형은 주사제이다. 주사제는 등장 멸균 용액 또는 건조 특히 멸균수 또는 적절한 생리 식염수의 첨가 가능하고 피하주사, 근육내 주사 및 정맥 주사 등이 가능하다. 투여량은 환자의 질병 종류 및 중증도, 연령, 성별, 투여방법, 표적 세포, 발현정도 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 통상의 담체, 예를 들어 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있다. 상기 붕해제로는 전분글리콜산나트륨, 크로스포비돈, 크로스카멜로스나트륨, 알긴산, 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 카르복시 메틸셀룰로오스 나트륨, 키토산, 구아검, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 폴라크릴린 칼륨 등이 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨, 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용가능한 첨가제는 상기 약학적 조성물에 대해 0.1~90 중량부 포함되는 것이 바람직하다.
경구투여를 위한 고형제제에는 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 연질캅셀제, 환 등이 포함된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 에어로졸 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제로는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 멸균된 수용액, 액제, 비수성용제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 좌제, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사제제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용 약학적 조성물을 제조하여 사용할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 치료할 질병의 중증 정도에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 경구 투여제의 경우 일반적으로 성인에게 1일에 체중 1 kg당 본 발명의 약학적 조성물을 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/ ㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 원래 형태의 외래단백질 생산 방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;
7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질이며, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys이 사용될 수 있다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 한다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질이며, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 한다.
아울러, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질이며, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 한다.
아울러, 본 발명은 세포 내로 전달시키고자 하는 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;
7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
9) 단계 8)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질이며, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys이 사용될 수 있다.
상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 한다.
상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질이며, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 한다.
상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
아울러, 구체적으로
1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법을 제공한다.
상기 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질이며, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 한다.
상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 재조합 단백질의 불용성 침전을 방지하고, 세포질 밖 또는 페리플라즘으로의 분비 효율을 향상시킴으로써, 재조합 외래단백질의 생산에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 강력한 분비증강자를 이용하여 막 침투성을 향상시켜, 유용 치료용 단백질의 이동(transduction)에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 접착성 단백질 유전자 DNA 다중체 카세트의 클로닝
본 발명자들은 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖 고, 본 발명에서는 서열번호 95(Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys)로 기재되는 아미노산 서열을 기본 단위 Mefp1을 근거로 하여, 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열번호 96(5'-TAC AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC-3')으로 기재되는 정방향 프라이머와 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖고, 본 발명에서는 서열번호 97(5'-TTT GTA GGT TGG CGG ATA AGA CGG CTT AGC-3')로 기재되는 역방향 프라이머를 이용하여 합성 mefp1 DNA를 제작하였다. 왼쪽 어댑터(Left adapter: 이하 "La"라 칭함) 합성 DNA는 BamHI/EcoRI/SmaI의 제한효소 자리를 가지는 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖고, 본 발명에서는 서열번호 98(5'-GAT CCG AAT TCC CCG GG-3')로 기재되는 정방향 프라이머와 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖고, 본 발명에서는 서열 번호 99(5'-TTT GTA CCC GGG GAA TTC G-3')로 기재되는 역방향 프라이머를 이용하여 합성하였고, 오른쪽 어댑터(Right adapter: 이하 "Ra"라 칭함) 합성 DNA는 Arg/HindIII/SalI/XhoI의 제한효소 자리를 가지는 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖고, 본 발명에서는 서열번호 100(5'-TAC AAA CGT AAG CTT GTC GAC C-3')으로 기재되는 정방향 프라이머와 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호와 동일한 서열을 갖고, 본 발명에서는 서열번호 101(5'-TCG AGG TCG ACA AGC TTA CG-3')으로 기재되는 역방향 프라이머를 이용해서 합성하여, 대한민국 등록특허 제 379,025호에 공시된 방법으로 mefp1 DNA 다중체(multimer)를 제작하여 pBluescriptⅡSK(+) 벡터(Stratagene, USA)에 클로닝하였고, 7번 반복된 mefp1 DNA 다중체를 탐색하여 pBluescriptⅡSK(+)La-7×mefp1-Ra이라 명명하였다.
< 실시예 2> N-말단 변이체 클론에서 접착성 단백질의 발현 조사
본 발명자들은 Mefp1 N-말단의 pI값의 조절에 의한 수용성 발현을 위해 OmpA 신호서열 펩타이드(OmpA signal peptide: OmpASP) 단편을 도입하여 pBluescriptⅡSK(+)La-7×mefp1-Ra를 주형으로 PCR을 수행하여 pET-22b(+) 벡터에 다양한 pI값의 신호서열 OmpASP 단편 및 그 변이체, Mefp1의 선도서열과 상기 실시예 1의 방법으로 제작한 mefp1 카세트(cassette)가 연결되도록 재조합함으로써 제작하였다(표 1 내지 표 4).
상기 표 1 내지 표 4와 같이 제작한 N-말단을 가진 발현벡터를 E. coli BL21(DE3)에 통상의 방법으로 형질전환하여 LB 배지[트립톤(tryptone) 20 g, 효모 추출물(yeast extract) 5.0 g, NaCl 0.5 g, KCl 1.86 mg/ℓ]에 50 ㎍／㎖ 암피실린(ampicillin)과 함께 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이후 배양액을 LB 배지를 사용하여 200배 희석하였다. 희석된 배양액에 1 mM IPTG를 첨가하여 OD600값이 0.3이 되도록 배양하였다. 발현을 위해 3시간 동안 배양하였다. 배양액 1 ㎖을 4,000×g, 4℃에서 30분간 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 100 내지 200 ㎕ 시료 버퍼(sample buffer: 0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 1% glycerol, 0.1% bromphenol blue)로 현탁하였다. 현탁액은 단백질을 분리하기 위하여 소니케이터(sonicator)를 사용하여 15× 2-s cycle pulses(at 30% power output)로 분쇄하였고, 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하기 위하여 16,000 rpm, 30분, 4℃에서 원심분리를 수행하여 비수용성 부분(insoluble fraction)을 분리하였다. 수용성 분획(soluble fraction)의 단백질을 Bradford 방법(Bradford, Anal Biochem 72:248-254, 1976)으로 정량한 후, 16% SDS-PAGE 젤을 사용하여 Laemmli 등의 방법(Laemmli, Nature 227:680-685, 1970)으로 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 블루 염색법(Coomassie Brilliant Blue stain; Sigma, USA)으로 염색하였다. 상기 SDS-PAGE를 수행한 젤을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; Roche, USA)에 이동시켰다. 이후 5% 스킴 밀크(skimmed milk; Difco, USA)에 담근 후, 막을 0.4 ㎍／㎖ 항-His6 모노클로날 항체(monoclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology, USA)가 포함된 용액에 37℃, 2시간 동안 담갔다. 이후 HRP-결합 토끼 항-마우스 IgG(horseradish peroxidase conjugated rabbit anti-mouse IgG; Santa Cruz Biotechnology, USA)를 2차 항체로 사용하여 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)를 염색액으로 사용하여 염색하였다. 상기 방법으로 얻어진 접착성 단백질 밴드의 농도는 Quantity One program(Bio Rad, USA)을 이용하여 덴시토미터 분석방법으로 정량화하였다.
< 실시예 3> pI 값이 증가한 짧은 신호서열 및 그 변이체 서열이 접착성 단백질 발현에 미치는 영향
본 발명자들은 접착성 외래 단백질을 코딩하는 염기서열 7×mefp1의 5 말단에 대장균에서 분비를 유도하는 OmpA 신호서열 펩타이드(OmpA signal peptide: OmpASP) OmpASP(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 서열번호 46 또는 Movva et al ., J Biol Chem 255, 27-29, 1980)의 일부인 OmpASP1(Met), OmpASP1 -2(Met-Lys) 및 OmpASP1-3(Met-Lys-Lys)의 코딩 서열을 융합하여 pET-22b(+)(OmpASP 1-7×mefp1*), pET-22b(+)(OmpASP 1-2-7×mefp1*) 및 pET-22b(+)(OmpASP 1 -3-7×mefp1*) 클론을 제작하였다(표 1).
제작된 클론 벡터를 실시예 2의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, 하나의 아미노산(라이신; Lysine; Lys; K; pI = 9.72) 차이에 의해 상기 두 클론으로부터 발현된 Met-7×Mefp1*(서열번호 15) 및 Met-Lys-7×Mefp1*(서열번호 16) 단백질의 수용성 발현에 현저한 차이가 있음을 확인하였다(도 1a의 라인 1 및 라인 2, 표 1). 상기 결과는 하나의 아미노산인 Lys이 융합단백질의 N-말단에서 접착성 단백질의 발현량에 크게 영향을 주는 것을 의미하고, 이로부터 접착성 단백질의 N-말단 두 번째에 위치하는 Lys도 수용성 발현에 영향을 미칠 것을 예상하였다. 이에 상기 두 단백질로부터 OmpASP 단편(Met[M] 및 Met-Lys)부터 Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지를 선도서열로 하여 pI값을 컴퓨터 프로그램 DNASISTM(Hitachi, Japan)으로 분석한 결과, Met-Ala-Lys(서열번호 15) 펩타이드의 pI값은 9.90이고 Met-Lys-Ala-Lys(서열번호 16) 펩타이드의 pI값은 10.55으로 나타났다. 상기 결과를 뒷받침하기 위해 OmpASP1 -2 보다 Lys를 하나 더 가지고 있는 신호서열 단편 OmpASP1 -3(Met-Lys-Lys)의 코딩 서열을 이용하여 위와 동일한 방법으로 클론을 제작하여 접착성 단백질의 수용성 발 현을 조사한 결과(도 1a의 라인 3), 수용성 발현의 증가는 Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지의 선도서열 OmpASP1 -3(Met-Lys-Lys)-Ala-Lys의 pI 값 10.82와 좋은 상관관계를 보였다(도 1a의 라인 3 및 표 1). 따라서 상기 결과는 선도서열에서 Lys 증가에 의한 pI값 변이 범위 9.90에서 10.82까지는 선도서열의 pI값과 발현량이 잘 일치함을 최초로 증명하였다.
재조합 벡터 pET22b(+)(ompASP tr -7× mefp1 *)에서 pI값이 증가한 OmpASPtr 및 그 변이체 클론의 프라이머, 선도서열 및 Mefp1의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 아미노산 서열은 OmpASPtr 및 그 변이체가 접착성 단백질 N-말단(Ala - Lys)과 연결된 선도서열(pI값) 수용성 발현량
1 CAT ATG GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 15 OmpASP1(Met)-Ala - Lys(pI 9.90) ++
2 CAT ATG AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 16 OmpASP1 -2(Met-Lys)-Ala - Lys(pI 10.55) +++
3A CAT ATG AAA AAG GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 17 OmpASP1 -3(Met-Lys-Lys)-Ala -Lys(pI 10.82) +++
4 CAT ATG AAA AAA AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 18 Met-Lys-Lys-Lys-Ala - Lys(pI 10.99) +++
5 CAT ATG AAA AAA AAA AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 19 Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala - Lys(pI 11.11) +++
6 CAT ATG AAA AAA AAA AAA AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 20 Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala -Lys(pI 11.21) +++
7 CAT ATG AAA AAA AAA AAA AAA AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 21 Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala -Lys(pI 11.28) ++
8 CAT ATG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 22 Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.41) +/-
9 CAT ATG CGT GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 23 Met-Arg-Ala - Lys(pI 11.52) ++
10 CAT ATG CGT CGC GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 24 Met-Arg-Arg-Ala - Lys(pI 12.51) ++
11 CAT ATG CGT CGC CGT CGC GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 25 Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala - Lys(pI 12.98) ++
12 CAT ATG CGT CGC CGT CGC CGT CGC GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 26 Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala -Lys(pI 13.20) ++
13 CAT ATG CGT CGC CGT CGC CGT CGC CGT CGC GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC 27 Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 13.35) +
역방향 프라이머
14A CTC GAG GTC GAC AAG CTT ACG -
*: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2의 Ra 및 His 태그(6×His)의 잉여 서열을 나타낸다.
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
이탤릭 굵은 문자: 신호서열단편-접착성 단백질의 선도서열단편(Mefp1의 두 번째까지의 아미노산; Ala-Lys) 및 그 변이체를 코딩하는 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일반 문자: Ala-Lys를 제외한 Mefp1 세 번째 아미노산부터를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
( ): 신호서열단편 및 그 변이체가 접착성 단백질의 N-말단(Ala-Lys)과 연결된 선도서열의 pI값을 나타낸다.
OmpASPtr: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 OmpASP의 단편을 의미한다.
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2에서 나타나는 Ra(오른쪽 어댑터; Arg/HindⅢ/SalI/XhoI)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 Mefp1 단백질의 발현 결과는 무발현시 "-", 약하게 발현시 "+/-" 및 발현시 "+"의 개수로 발현량을 표시하였다.
<실시예 4> 선도서열의 높은 pI값이 접착성 단백질의 발현에 미치는 영향
본 발명자들은 실시예 3에서 Lys에 의한 선도서열 pI값의 조절이 수용성 단백질 발현과 관련이 있음을 확인하였고, 이에 상기 pI값이 수용성 단백질 발현에 보편적으로 영향을 줄 수 있는 가를 확인하기 위하여 pET-22b(+)(ompASP 1-3 -7×mefp1*) 클론의 OmpASP1-3 단편과 Mefp1 사이에 pI값을 증가시킬 수 있는 아미노산인 Lys를 추가로 삽입한 pET-22b(+)[ompASP 1-3 -(Lys) n -7×mefp1*](n=1, 2, 3, 4, 6)(서열번호 4 내지 서열번호 8 및 서열번호 18 내지 서열번호 22) 및 Met(OmpASP1)과 Mefp1 사이에 pI값을 증가시킬 수 있는 아미노산인 Arg를 추가로 삽입한 pET-22b(+)[ompASP 1 -(Arg) n -7×mefp1*](n=1, 2, 4, 6, 8)(서열번호 9 내지 서열번호 13 및 서열번호 23 내지 서열번호 27) 클론을 제조하였고(표 1), 각 클론의 OmpASP 단편으로부터 Mefp1의 처음 두 아미노산(Ala-Lys)까지의 선도서열 pI값을 분석하였다.
제작된 클론 벡터를 실시예 2의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, Lys에 의해 pI값이 증가한 선도서열(도 1a의 라인 4 내지 라인 8 및 표 1 서열번호 18 내지 서열번호 22)과 연결된 접착성 단백질 중 pI값이 10.99 내지 11.21로 증가한 선도서열(도 1a의 라인 4 내지 라인 6 및 표 1 서열번호 18 내지 서열번호 20)의 경우에서는 대조구인 pI값이 10.55 선도서열(도 1a의 라인 2 및 표 1 서열번호 16)과 유사하거나 약간 증가한 수용성 발현량을 나타내었으나, pI값이 11.28 선도서열(도 1a의 라인 7 및 표 1 서열번호 21)의 경우에서는 수용성 발현량이 대조군보다 감소하였고, pI값이 11.41 선도서열(도 1a의 라인 8 및 표 1 서열번호 22)의 경우에서는 거의 발현이 되지 않았다. pI 값 증가에도 불구하고 발현양이 현저히 감소한 pI 값이 11.41인 선도서열(신호서열 22)은 비교적 높은 친수성 값 1.93을 가지고 있어 선도서열 부분에 지나치게 증가된 친수성 값은 지질 이중막에 결합될 수 있는 것(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호)으로 막-투과력을 감소시키리라 판단된다. 그러나 Lys를 첨가한 경우 pI 값 10.99, 11.11, 11.21 및 11.28의 선도서열(신호서열 18 내지 21)은 비교적 높은 친수성 값(각각 1.14, 1.32, 1.53 및 1.69)을 가지나 어느 정도 친수성 값의 상쇄가 있는 것처럼 보여 특이적 막-투과 기작을 가질 것으로 보인다. 그러나 하전의 증가와 발현 양과는 전혀 일치하지 않음을 알 수 있다.
또한 Arg에 의해 pI값이 증가한 선도서열(서열번호 23 내지 서열번호 27; pI값 11.52 내지 13.35)과 연결된 접착성 단백질 중 pI값이 11.52 내지 12.51로 증가한 선도서열(서열번호 23 내지 서열번호 24)의 경우에서는 대조구인 pI값이 9.90 선도서열(서열번호 15)과 유사하거나 약간 증가한 수용성 발현량(2개의 Arg을 가진 pI 값 12.51를 가진 선도서열, 서열번호 24)을 나타내었으나 그 발현량의 차가 크지 않았고, pI값이 12.98, 13.20 및 13.35인 선도서열(서열번호 25 내지 27)의 경우에서는 pI값의 증가와 함께 수용성 발현량이 감소하였다(표 1 및 도 1b 참조). 발현양이 가장 낮은 pI 값 13.35인 선도서열(서열번호 27)은 비교적 높은 친수성 값 1.93을 나타내고 있어 선도서열 부분에 지나치게 증가된 친수성 값은 지질 이중막에 결합될 수 있는 것(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호)으로 막-투과력을 감소시키리라 판단된다. 또한 이 경우 하전의 증가와 발현 양과는 전혀 일치하지 않음을 알 수 있다.
두 개의 Arg이 연결된 pI값 12.51인 선도서열(MRRAK, 서열번호 24)은 발현이 약간 증가된 결과를 보였다. 상기 선도서열을 가진 수용성 접착성 단백질은 3/3 빈도로 예상보다 감소된 분자량을 보여 N-말단 부분이 절단되었으리라 사료되며(도 1b의 라인 3 참조), 이러한 현상은 페리플라즘 분획에서도 동일하게 관찰되었다(데이타 없음). 하지만 다른 Arg이 연결된 선도서열들에서는 선도서열 부분에 절단이 관찰되지 않았다. 따라서 절단된 선도서열의 존재는 일종의 단백질분해효소가 관여한다고 생각되며, 인위적으로 Arg가 추가된 선도서열들도 공통적으로 Arg 특이적 막-투과 기작을 가질 것으로 예상된다.
<실시예 5> 선도서열의 낮은 pI값 조절에 의한 접착성 단백질의 수용성 발현
본 발명자들은 pI값이 낮게 조절된 선도서열의 N-말단이 Mefp1 단백질의 수용성 발현에 줄 수 있는 영향을 확인하고자 하였다.
구체적으로, OmpASP 1-7×mefp1*을 대조군으로 선도서열인 Met(OmpASP1)+Ala-Lys(Mefp1의 N-말단)의 아미노산 서열을 다양하게 변형함으로써 pI값을 2.73 내지 7.65로 다양하게 하는 서열번호 35 내지 서열번호 41의 선도서열의 변이체들[MDDDDDAA(서열번호 35; pI값 2.73), MDDDAA(서열번호 36; pI값 2.87), MEE(서열번호 37; pI값 3.09), MAE(서열번호 38; pI값 3.25), MAA(서열번호 39; pI값 5.60), MCH(서열번호 40; pI값 7.13), MAH(서열번호 41; pI값 7.65)]을 제조하였고(표 2), 상기 변이체들의 pI값을 분석하였으며, 대조군으로서 MAK(서열번호 15; pI값 9.90) 및 MRRRRAK(서열번호 25; pI값 12.98)을 사용하여 그 발현량을 조사하였다.
제작된 클론 벡터를 실시예 2의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, 서열번호 35 내지 서열번호 41의 선도서열을 포함하는 모든 클론에서 수용성의 접착성 단백질이 발현되었고, 그 중에서도 pI값 3.09 내지 7.65(서열번호 37 내지 서열번호 41)은 대조군 pI값 9.90(서열번호 15) 및 12.98(서열번호 25) 보다 현저히 높은 발현량을 보였으며, 특히 pI값이 3.09(서열번호 37)에서 그 발현량이 가장 높았다(도 2 및 표 2). 가장 낮은 발현률을 보인 선도서열(서열번호 35; pI값 2.73)도 비교적 높은 친수성 값 1.09를 가지고 있어 선도서열 부분에 지나치게 증가된 친수성 값은 지질 이중막에 결합될 수 있는 것(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호)으로 막-투과력을 감소시키리라 판단된다. 또한 이 경우 역시 하전의 증가와 발현 양과는 일치하지 않음을 알 수 있다.
재조합 벡터 pET22b(+) ompASP 1 -7× mefp1 *의 선도서열(Met-Ala-Lys) 변이체 클론들의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 OmpASP1(Met)-Ala - Lys이 변이된 선도서열(pI값) 수용성 발현량
28 CAT ATG GAC GAT GAC GAT GAC GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 35 Met-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala (pI 2.73) +
29 CAT ATG GAC GAT GAC GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 36 Met-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI 2.87) ++
30 CAT ATG GAA GAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 37 Met-Glu-Glu(pI 3.09) +++
31 CAT ATG GCT GAA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 38 Met-Ala-Glu(pI 3.25) +++
32 CAT ATG GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 39 Met-Ala-Ala(pI 5.60) +++
33 CAT ATG TGC CAC CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 40 Met-Cys-His(pI 7.13) +++
34 CAT ATG GCT CAC CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 41 Met-Ala-His(pI 7.65) +++
역방향 프라이머
14A CTC GAG GTC GAC AAG CTT ACG -
*: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2의 Ra 및 His 태그(6×His)의 잉여 서열을 나타낸다.
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
이탤릭 굵은 문자: 선도서열(Met-Ala-Lys) 및 그 변이체를 코딩하는 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일반 문자: Ala-Lys를 제외한 Mefp1 세 번째 아미노산부터를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
( ): 선도서열(Met-Ala-Lys)의 변이체 서열의 pI값을 나타낸다.
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2에서 나타나는 Ra(오른쪽 어댑터; Arg/HindⅢ/SalI/XhoI)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 Mefp1 단백질의 발현 결과는 무발현시 "-", 약하게 발현시 "+/-" 및 발현시 "+"의 개수로 발현량을 표시하였다.
<실시예 6> 원래 형태(native form)의 접착성 단백질 생산을 위한 선도서열과 절단효소 인식부위(Xa) 거리의 최적화
실시예 5에서 Mefp1 단백질의 선도서열에 의한 증가된 발현의 결과로부터 상기 접착성 외래 단백질의 선도서열의 pI값이 3.09(MEE; 서열번호 37)가 적합한 것으로 확인되었다. 이어서, 상기 pI값이 3.09인 선도서열(MEE)과 Xa 인자 인식부위(Xa)와의 거리를 상기 선도서열과 연결된 Mefp1 서열 일부분의 길이로 최적화시켜, 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에 공지된 방법으로 원래 형태의 아미노말단을 가진 수용성 단백질을 회수할 수 있는 융합단백질을 생산하였다. 이것은 선도서열(MEE)에 연결된 Mefp1 목적 단백질의 아미노산 서열 일부(Mefp13 -8)를 삽입서열(insert=i)로 사용함으로써 최대한 선도서열의 연장된 부분에 의한 구조적 변화를 줄이기 위함이다.
구체적으로, Xa 인자 인식부위를 포함하도록 MEE-(i=n)-Xa의 형태로 디자인하였고( ) 안에 선도서열 MEE에 연결된 Mefp1 서열 일부분의 아미노산 n = 0, 2, 4 및 6을 삽입하여 최적 단백질 발현을 위한 pET-22b(+)(MEE-(i=n)-Xa-7×mefp1*) 클론을 제조하였다(표 3).
제작된 클론 벡터를 실시예 2의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, MEE와 Xa 사이의 거리가 i = 0 > 2 > 6 > 4의 순서로 발현량이 감소하였다(도 3). 또한, 상기 수용성 단백질은 절단 효소 인식부위를 포함하고 있으므로 상기의 방법으로 생산된 재조합 단백질을 절단효소 Xa 인자로 처리함으로써 공지된 방법에 의해 MEE-(i=n)-Xa이 제거된 원래 형태의 N-말단을 가지는 재조합 단백질(7×Mefp1*)을 생산할 수 있다.
재조합 벡터 pET-22b(+)(MEE -(i=n)- Xa -7× mefp1 *)의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 선도서열의 아미노산 서열(pI 4.01) 및 삽입 아미노산 수(i) 수용성 발현량
42 CAT ATG GAA GAG ATC GAA GGT CGT GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 46 Met-Glu-Glu-Xa(i=0) +++
43 CAT ATG GAA GAG CCG TCT ATC GAA GGT CGT GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 47 Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Xa(i=2) +++
44 CAT ATG GAA GAG CCG TCT TAT CCG ATC GAA GGT CGT GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 48 Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Xa(i=4) +
45 CAT ATG GAA GAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC ATC GAA GGT CGT GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 49 Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Xa(i=6) ++
역방향 프라이머
14A CTC GAG GTC GAC AAG CTT ACG
*: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2의 Ra 및 His 태그(6×His)의 잉여 서열을 나타낸다.
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
굵은 문자: 선도서열(MEE)의 올리고뉴클레오티드.
이탤릭 굵은 문자: 표 2의 선도서열(MEE) 클론에서 MEE에 연결된 Mefp1 서열 일부분(Mefp13-8)의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
ATC GAA GGT CGT: Xa 인자 절단효소 인식부위의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일반 문자: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 서열번호 1인 Mefp1 기본단위 아미노산 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2에서 나타나는 Ra(오른쪽 어댑터; Arg/HindⅢ/SalI/XhoI)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 Mefp1 단백질의 발현 결과는 무발현시 "-", 약하게 발현시 "+/-" 및 발현시 "+"의 개수로 발현량을 표시하였다.
(i): 선도서열(MEE)과 Xa 사이에 삽입된 아미노산의 수를 나타낸다.
<실시예 7> OmpASP 1-11 내에서 Lys 거리 조절에 의한 접착성 단백질의 수용성 발현
본 발명자들은 접착성 외래 단백질의 수용성 발현에 신호서열을 포함하는 N-말단의 pI값이 영향을 줄 수 있음을 확인한 후, OmpA 신호서열 단편(OmpASPtr)에서 pI값에 영향을 줄 수 있는 아미노산(예를 들어, Lys)의 거리가 Mefp1 단백질의 수용성 발현에 줄 수 있는 영향을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 선도서열 MKK(서열번호 56)와 MKAK(서열번호 16)는 단백질의 N-말단에서 계산적으로 같은 pI값 10.55를 가지나, Lys 사이에 pI값에 영향을 덜 주는 아미노산(예를 들어, Ala[알라닌; Alanine; A])이 포함되어 Lys 사이의 거리(distance=d)가 떨어진 경우에는 그 기능에 차이가 있을 것을 예상하였다.
이에, 신호서열 단편 OmpASP1-11 아미노산 서열을 토대로 MK1-(d=n)-K2-(8-n)의 유사체 형태로 디자인하였고, ( ) 안에 pI값에 영향을 주지 않는 OmpASP1-11 조성 아미노산 d1 = n(0, 2, 4, 6, 8)을 삽입하여 pET-22b(+)[MK 1 -(d 1 =n)-K 2 -(8-n)-A A -mefp1 3-10 -6×mefp1*] 클론을 제조하였다(표 4). 상기 클론의 선도서열은 OmpASP1-2 단편(Met-Lys)으로부터 pI값에 영향을 주는 Mefp1의 두 번째 아미노산인 Lys가 밑줄 친 Ala로 변이된 서열(Ala-Ala)까지는 모두 동일한 pI값 10.55를 가지고 있다. 표 4와 같이 제작된 클론 벡터를 실시예 2의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하였고 그 발현량을 확인하였다.
그 결과, 두 K 사이의 거리(K1-K2의 거리 d1)가 d1 = 4 > 2 > 6 > 0 > 8의 순서로 발현이 감소하였다. 따라서 d1 = 4에서 수용성 단백질이 가장 강하게 발현되어 pI값에 영향을 주는 아미노산의 최적거리임이 확인되었다.
추가적으로, d1 = 4로 하고, 상기 클론의 밑줄친 Ala를 Lys(K3)로 대체한 후, K2와 K3사이에 d2 = n(1, 2, 3, 4) 개의 Ala를 삽입하여 pET-22b(+)[MK 1 -(d 1 =4)-K 2 -(d 2 =n)-AK 3 -mefp1 3-10 -6×mefp1*] 클론을 제조하였고(표 4), 상기와 같은 방법으로 발현량을 확인하였다.
그 결과, K 사이(K2-K3의 거리 d2)는 d2= 2 > 1 > 4 > 3 의 순서로 최적 거리가 확인되었고, 이러한 최적 거리에 대한 결과는 접착성 단백질의 수용성 발현과 직접적인 관련이 있음이 밝혀졌다.
또한 상기 결과는 선도서열의 pI 값 및 Lys-Lys 간의 거리가 중요한 요인이지 서열이 중요한 요인이 아니라는 것을 보여 준다(표 4 및 도 4).
결론적으로, 접착성 단백질의 선도서열 단편의 pI값이 수용성 발현에 결정적으로 영향을 미쳤고, pI 값 스팩트럼에 따른 최대 발현 pI 값이 존재하였으며, 접착성 단백질의 수용성 발현과 하전과는 관련이 없음을 밝혔고, 또한 pI값에 영향을 주는 아미노산 Lys 간의 거리가 중요한 요인임을 보여 주었다.
재조합 벡터 pET22b(+) ompASP 1-11-7×mefp1* 및 OmpASP1-11 변이체 클론들의 프라이머, 선도서열 및 Mefp1의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 아미노산 서열은 신호서열 단편(OmpASP1 -11)의 변이체 서열과 변이된 접착성 단백질 N-말단(Ala-Ala)이 연결된 선도서열(pI 10.55 및 10.82) 및 Lys간 거리(d)를 나타냄 수용성 발현량
50A CAT ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 56 Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Lys(pI 10.82) positive control, +++
51 CAT ATG AAA AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GCA GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 57 Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=0) Ala mutant control, ++
52 CAT ATG AAA GCT ACA AAG ATC GCG ATT GCA GTG GCA GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 58 Met-Lys-Ala-Thr-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=2) +++
53 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC AAG ATT GCA GTG GCA GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 59 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=4) +++
54 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC GCG ATT AAG GTG GCA GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 60 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Lys-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=6) ++
55 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG AAG GCT GCA CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 61 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Lys-Ala-Ala(pI 10.55, d1=8) +
102 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC AAG GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 106 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=1) +++
103 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC AAG GCA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 107 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=2); ++++
104 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC AAG GCT GCA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 108 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=3); ++
105 CAT ATG AAA GCT ACA GCT ATC AAG GCA GCT GCA GCT AAG CCG TCT TAT CCG CCA ACC TAC 109 Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=4); +++
역방향 프라이머
14A CTC GAG GTC GAC AAG CTT ACG
*: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2의 Ra 및 His 태그(6×His)의 잉여 서열을 나타낸다.
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
이탤릭 문자: 접착성 단백질의 N-말단(Ala-Ala)과 연결된 신호서열 단편 OmpASP1-11 또는 그 변이체 선도서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
이탤릭 굵은 문자: 선도서열 단편에서의 Lys 아미노산을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
Ala: 접착성 단백질의 N-말단의 Ala-Lys의 Lys이 Ala로 대체되었다.
일반 문자: Ala-Lys를 제외한 Mefp1 세 번째 아미노산부터를 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 도 2에서 나타나는 Ra(오른쪽 어댑터; Arg/HindⅢ/SalI/XhoI)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 Mefp1 단백질의 발현 결과는 무발현시 "-"로, 발현시 "+"의 개수로 발현량을 표시하였다.
(d): Lys 간의 거리를 나타낸다.
<실시예 8> N-말단 변이체에 의한 넙치 헵시딘 Ｉ의 발현 조사
본 발명자들은 넙치 헵시딘 I(Kim et al., Biosci Biotechnol Biochem 69:1411-1414, 2005)은 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에 의한 상기 헵시딘 I의 수용성 발현에 신호기능과 분비증강자가 동시에 필요하다는 결과를 근거로 하여, 본 실시 예에서는 헵시딘 I의 선도서열 N-말단 pI값의 조절에 의한 수용성 발현을 위해 pET-22b(+) 벡터에 다양한 pI값의 신호기능과 분비증강자 기능을 동시에 갖는 선도서열 또는 신호서열 OmpASP 단편의 변이체, 분비증강자 후보서열 또는/및 Xa 인자 인식부위(Xa)와 ofHepI이 작동가능하게 폴리뉴클레오티드가 연결되도록 pET-22b(+) 벡터에 재조합함으로써 제작하였다(표 5 내지 표 6).
상기 표 5 및 표 6과 같이 제작한 N-말단을 가진 발현벡터를 E. coli BL21(DE3)에 통상의 방법으로 형질전환하여 LB 배지[트립톤(tryptone) 20 g, 효모 추출물(yeast extract) 5.0 g, NaCl 0.5 g, KCl 1.86 mg/ℓ]에 50 ㎍／㎖ 암피실린(ampicillin)과 함께 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 LB 배지를 사용하여 200배 희석하였다. 희석된 배양액에 1 mM IPTG를 첨가하여 OD600값이 0.3이 되도록 배양하였다. 발현을 위해 3시간 동안 배양하였다. 배양액 1 ㎖을 4,000×g, 4℃에서 30분간 원심 분리하여 펠렛(pellet)을 100 내지 200 ㎕ 시료 버퍼(sample buffer: 0.05 M Tris-HCl, pH 6.8, 0.1 M DTT, 2% SDS, 1% glycerol, 0.1% bromphenol blue)로 현탁하였다. 현탁액은 단백질을 분리하기 위하여 소니케이터(sonicator)를 사용하여 15× 2-s cycle pulses(at 30% power output)로 분쇄하였고, 세포 찌꺼기(cell debris)를 제거하기 위하여 16,000 rpm, 30분, 4℃에서 원심분리를 수행하여 비수용성 부분(insoluble fraction)을 분리하였다. 수용성 분획(soluble fraction)의 단백질을 Bradford 방법(Bradford, Anal Biochem 72:248-254, 1976)으로 정량한 후 16% SDS-PAGE 젤을 사용하여 Laemmli 등의 방법(Laemmli, Nature 227:680-685, 1970)으로 SDS-PAGE를 수행하고 쿠마시 블루 염색법(Coomassie Brilliant Blue stain; Sigma, USA)으로 염색하였다. 상기 SDS-PAGE를 수행한 젤을 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane; Roche, USA)에 이동시켰다. 이후 5% 스킴 밀크(skimmed milk; Difco, USA)에 담근 후, 막을 0.4 ㎍/㎖ 항-His6 모노클로날 항체(monoclonal antibody, Santa Cruz Biotechnology, USA)가 포함된 용액에 37℃, 2시간 동안 담갔다. 이후 HRP-결합 토끼 항-마우스 IgG(horseradish peroxidase conjugated rabbit anti-mouse IgG; Santa Cruz Biotechnology, USA)를 2차 항체로 사용하여 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride(DAB, Sigma, USA)를 염색액으로 사용하여 염색하였다.
<실시예 9> 선도서열의 pI값 조절에 의한 넙치 헵시딘 Ｉ의 수용성 발현
본 발명자들은 실시예 4 및 5에서와 유사하게, 선도서열의 pI값 조절에 의한 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현에 미치는 영향을 확인하였다.
이에 넙치 헵시딘 I의 수용성 단백질로의 발현을 위해, 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 분비증강자를 스크린 하는 방법과 유사하게, 상기 단백질의 N-말단을 Met과 분비증강자 후보서열을 포함하도록 Met-7×동형아미노산이 연결된 형태로 디자인하고 pI값이 2.52 내지 13.28로 조절되며 소수성/친수성 값 -1.55 내지 +1.97로 조절된 단백질의 발현을 위한 pET-22b(+)(Met-7×동형아미노산-ofhepＩ**) 클론을 제조하였다(표 5). 상기 동형 아미노산은 아르기닌(Arginine, Arg; R), 라이신(Lysine, Lys, K), 히스티딘(Histidine, His; H), 티로신(Tyrosine, Tyr; Y), 시스테인(Cysteine, Cys; C), 글루탐산(Glutamic Acid, Glu; E) 및 아스파르트산(Aspartic Acid, Asp; D) 등이 동일한 아미노산 서열로 7번 연속된 것 중에서 선택되었다. 상기 소수성 값은 DNASISTM(Hitachi, Japan)에 의해 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale, 창 크기: 6, 역치값: 0.00)로 계산되었다. 상기 소수성 값이 +가 될 경우 펩타이드는 친수성을 띄며, -가 될 경우 소수성을 띄며, 절대값이 클수록 친수성 또는 소수성의 정도가 높음을 의미하였다.
제작된 클론 벡터를 실시예 8의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, MRRRRRRR 서열(pI 13.28, 소수성 값 +1.97[친수성]) 및 MKKKKKKK 서열(pI 11.28, 소수성 값 +1.97[친수성])을 가진 클론에서만 헵시딘 I의 수용성 발현이 관찰되었다(도 5).
재조합 벡터 pET-22b(+)(Met -7× homologous aas - ofhep Ｉ**)의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 아미노산 서열(pI값, 소수성 값 hy) 수용성 발현량
62 CAT ATG CGT CGC CGT CGC CGT CGC CGT CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 70 MRRRRRRR(pI 13.28, hy +1.97) ++
63 CAT ATG AAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 71 MKKKKKKK(pI 11.28, hy +1.97) ++
64 CAT ATG CAC CAT CAC CAT CAC CAT CAC CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 72 MHHHHHHH(pI 8.08, hy -0.35) -
65 CAT ATG TAC TAT TAC TAT TAC TAT TAC CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 73 MYYYYYYY(pI 5.59, hy -1.55) -
66 CAT ATG TGC TGT TGC TGT TGC TGT TGC CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 74 MCCCCCCC(pI 4.57, hy -0.69) -
67 CAT ATG GAA GAG GAA GAG GAA GAG GAA CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 75 MEEEEEEE(pI 2.78, hy +1.97) -
68 CAT ATG GAC GAT GAC GAT GAC GAT GAC CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 76 MDDDDDDD(pI 2.52, hy +1.97) -
역방향 프라이머
69A CTC GAG GTC GAC AAG CTT TTC GAA CTT GCA GCA GGG GCC ACA GCC
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
굵은 문자: pI값 및 소수성 값에 영향을 주는 선도서열 부분의 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
ofhepⅠ: olive flounder Hepcidin I(ofHepcidinⅠ: ofHepI)의 유전자를 나타낸다(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호; Kim et al., Biosci. Biotechnol. Biochem. 69, 1411-1414, 2005).
**: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ-6×His를 나타낸다(Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ은 역방향 프라이머 디자인에서 유래).
일반 문자: 헵시딘 Ⅰ 부분의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 ofHepcidinⅠ의 C-말단 및 Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ 부분이 포함된 상보 서열의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 ofHepⅠ** 발현 결과는 무발현시 "-"로, 발현시 "+"의 개수로 발현량을 표시하였다.
소수성 값: 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale with window size: 6 and threshold line: 0.00)에 의한 DNASISTM로 계산되었다. 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값이 +가 나올 경우 당해 펩타이드는 친수성을 띄며, -가 나올 경우 소수성을 띈다. 절대값이 클수록 친수성 또는 소수성은 정도가 높음을 의미한다.
<실시예 10> 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현에 신호서열 변이체의 낮은 pI값이 미치는 영향
비교적 높은 pI값 10.55를 가진 OmpASP1-10을 신호서열로 사용하여 넙치 헵시딘 I의 수용성 단백질로의 발현 결과는 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 보고하였다. 그러나 본 연구에서 접착성 단백질의 경우, 실시예 4 및 실시예 5의 결과를 통해 선도서열의 높은 pI값뿐만 아니라 낮은 pI값에서도 수용성 발현이 증가되는 것을 알았다. 이에, 본 발명자들은 넙치 헵시딘 I의 수용성 발현에 신호서열 변이체의 낮은 pI값이 미치는 영향을 조사하였다.
구체적으로, 선도서열은 신호서열 단편 OmpASP1-3의 변이체[MAH(서열번호 41); 7.65, MAA(서열번호 39); 5.60 또는 MEE(서열번호 37); 3.09]-OmpASP4-10-6×동형아미노산(다양한 pI값과 소수성 값을 가진 아미노산)-Xa 인자 인식부위(Xa)가 순차적으로 연결된 형태로 디자인하였고, 이로부터 헵시딘 I의 발현을 위한 클론을 제조하였다(표 6). 상기 동형 아미노산은 아르기닌(Arginine, Arg, R), 티로신(Tyrosine, Tyr; Y) 및 글루탐산(Glutamic Acid, Glu; E) 등이 동일한 아미노산 서열로 6번 연속된 것 중에서 선택되었다. 상기 소수성 값은 DNASISTM(Hitachi, Japan)에 의해 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale, 창 크기: 6, 역치값: 0.00)로 계산되었다. 상기 소수성 값이 +가 될 경우 펩타이드는 친수성을 띄며, -가 될 경우 소수성을 띄며, 절대값이 클수록 친수성 또는 소수성의 정도가 높음을 의미하였다.
표 6의 클론 벡터를 실시예 8의 방법으로 대장균 BL21(DE3)에 형질 전환하여 단백질을 발현하고 그 발현량을 확인한 결과, 재조합 단백질 MAH(pI 7.65)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHepＩ**는 양호하게 발현되었고, MAH(pI 7.65)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHepＩ**도 아주 약하게 발현되었으며, MAA(pI 5.60)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHepＩ**는 양호하게 발현되었고, MAA(pI 5.60)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHepＩ**도 아주 약하게 발현되었으며, MEE(pI 3.09)-OmpASP4-10-6×Arg-Xa-ofHepＩ**는 어느 정도 발현되었고, MEE(pI 3.09)-OmpASP4-10-6×Glu-Xa-ofHepＩ**는 비교적 양호하게 수용성으로 발현되었다(도 6).
이러한 결과는 N-말단 단편으로 Met에 바로 분비증강자 후보서열을 연결한 경우, 수용성 발현은 높은 pI 값과 친수성을 가진 아미노산인 Arg 및 Lys에 국한되었지만, 소수성 부분을 가진 신호서열 단편의 N-말단에 pI 값을 변화시킨 경우 높은 pI 값과 친수성 아미노산뿐만 아니라 낮은 pI 값과 친수성을 가진 Glu까지 분비증강자 서열로 사용될 수 있어 분비증강자 서열의 폭이 확대됨을 알 수 있다. 따라서 이러한 결과는 선도서열의 N-말단에 연결된 소수성 부분이 N-말단 단편 자체의 친수성을 낮추어 주어 앵커로서 신호서열의 활동을 자유롭게 하여 친수성의 분비증강자 서열의 범위를 확대해줄 수 있는 것으로 해석된다. 또한 이 결과는 신호서열 단편의 N-말단의 pI 값 변이에 따라 연결된 분비증강자 서열에 의한 수용성 발현 양의 차이가 있음으로 선도서열 N-말단 pI 값과 분비증강자 서열 간에는 일종의 상호성이 있을 것으로 예상된다.
재조합 벡터 pET-22b(+)(ompASP 1 -2 aas-ompASP 4-10 -6×homologous aas-Xa-ofhepＩ**)의 발현 결과
서열번호 정방향 프라이머 서열 서열번호 낮은 pI로 변이된 신호서열 영역 + 분비증강자 후보서열(pI값 및/또는 소수성 값) 수용성 발현량
77 CAT ATG GCT CAC ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG CGC CGT CGC CGT CGC CGT ( ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 86 MAH(pI 7.65)-TAI AIA V(OmpASP4-10, pI 5.70)-6×Arg(pI 13.20; hy 1.75)-Xa(pI 7.05) +++
78 CAT ATG GCT CAC ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG TAC TAT TAC TAT TAC TAT ( ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 87 MAH-OmpASP4 -10-6×Tyr (pI 5.55; hy -1.33)-Xa -
79 CAT ATG GCT CAC ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GAA GAG GAA GAG GAA GAG ( ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 88 MAH-OmpASP4 -10-6×Glu (pI 2.82; hy 1.75)-Xa +/-
80 CAT ATG GCT GCA ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG CGC CGT CGC CGT CGC CGT (ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 89 MAA(pI 5.60)-OmpASP4 -10-6×Arg-Xa +++
81 CAT ATG GCT GCA ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG TAC TAT TAC TAT TAC TAT (ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 90 MAA-OmpASP4 -10-6×Tyr-Xa -
82 CAT ATG GCT GCA ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GAA GAG GAA GAG GAA GAG (ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 91 MAA-OmpASP4 -10-6×Glu-Xa +/-
83 CAT ATG GAA GAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG CGC CGT CGC CGT CGC CGT (ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 92 MEE(pI 3.09)-OmpASP4 -10-6×Arg-Xa +
84 CAT ATG GAA GAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG TAC TAT TAC TAT TAC TAT( ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 93 MEE-OmpASP4 -10-6×Tyr-Xa -
85 CAT ATG GAA GAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA GTG GAA GAG GAA GAG GAA GAG( ATC GAA GGT CGT ) CAC ATC AGC CAC ATC TCC ATG TGC 94 MEE-OmpASP4 -10-6×Glu-Xa ++
역방향 프라이머
69A CTC GAG GTC GAC AAG CTT TTC GAA CTT GCA GCA GGG GCC ACA GCC
ofhepⅠ: olive flounder Hepcidin I(ofHepcidinⅠ)의 유전자를 나타낸다(Kim et al., Biosci Biotechnol Biochem 69:1411-1414, 2005).
**: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ-6×His를 나타낸다(Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ은 역방향 프라이머 디자인에서 유래).
CAT: NdeI 자리를 보존하기 위하여 연장되었다.
굵은 문자: pI값에 영향을 주는 신호서열 변이체의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
이탤릭 굵은 문자: 분비증강자 후보서열로 다양한 pI 및 소수성 값과 연관된 아미노산의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
일반 문자: 헵시딘 Ⅰ 부분의 올리고뉴클레오티드를 나타낸다(대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호; Kim et al., Biosci Biotechnol Biochem 69:1411-1414, 2005).
A: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호에서 제작된 프라이머를 나타낸다.
역방향 프라이머: 대한민국 공개특허 제 10-2007-0009453호의 ofHepcidinⅠ의 C-말단 및 Glu/HindⅢ/SalⅠ/XhoⅠ 부분이 포함된 상보 서열의 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
재조합 ofHepⅠ** 발현 결과는 무발현시 "-", 약하게 발현시 "+/-" 및 발현시 "+"의 개수로 표시하였다.
소수성 값: 호프 앤 우드 스케일(Hopp & Woods scale with window size: 6 and threshold line: 0.00)에 의한 DNASISTM로 계산되었다. 호프 앤 우드 스케일에 의한 소수성 값이 +가 나올 경우 당해 펩타이드는 친수성을 띄며, -가 나올 경우 소수성을 띈다. 절대값이 클수록 친수성 또는 소수성은 정도가 높음을 의미한다.
도 1은 신호서열로 사용한 OmpASPtr 및 그 변이체 선도서열에 의해 수용성으로 발현된 접착성 단백질(수용성 분획 약 20 ㎍)의 상대적인 발현량을 나타낸 도이다(화살표: 재조합 Mefp1). 덴시토미터 분석 값은 3 개의 다른 클론에서 발현된 발현 량의 상대적 평균치이다:
(A) SDS-PAGE;
(B) 웨스턴 블롯; 및,
(C) 덴시토미터 분석;
1a :
M: 마커;
라인 1: Met-Ala-Lys(pI 9.90)(서열번호 15);
라인 2: Met-Lys-Ala-Lys(pI 10.55)(서열번호 16);
라인 3: Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.82)(서열번호 17);
라인 4: Met-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.99)(서열번호 18);
라인 5: Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.11)(서열번호 19);
라인 6: Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.21)(서열번호 20);
라인 7: Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.28)(서열번호 21); 및,
라인 8: Met-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 11.41)(서열번호 22);
1b :
M : 마커;
라인 1 : Met-Ala-Lys (pI 9.90)(서열번호 15);
라인 2 : Met-Arg-Ala-Lys (pI 11.52)(서열번호 23);
라인 3 : Met-Arg-Arg-Ala-Lys (pI 12.51)(서열번호 24);
라인 4 : Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys (pI 12.98)(서열번호 25);
라인 5 : Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys (pI 13.20)(서열번호 26); 및,
라인 6 : Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys (pI 13.35)(서열번호 27).
도 2는 재조합 벡터 pET22b(+)(ompASP 1 -7×mefp1*)의 선도서열(Met-Ala-Lys)을 변이시킨 클론들에 의해 수용성으로 발현된 접착성 단백질(수용성 분획 약 20 ㎍)의 상대적인 발현량을 나타낸 도이다(화살표: 재조합 Mefp1). 덴시토미터 분석 값은 3 개의 다른 클론에서 발현된 발현 량의 상대적 평균치이다:
(A) SDS-PAGE;
(B) 웨스턴 블롯; 및,
(C) 덴시토미터 분석;
M: 마커;
라인 1: Met-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI 2.73)(서열번호 35);
라인 2: Met-Asp-Asp-Asp-Ala-Ala(pI 2.87)(서열번호 36);
라인 3: Met-Glu-Glu(pI 3.09)(서열번호 37);
라인 4: Met-Ala-Glu(pI 3.25)(서열번호 38);
라인 5: Met-Ala-Ala(pI 5.60)(서열번호 39);
라인 6: Met-Cys-His(pI 7.13)(서열번호 40);
라인 7: Met-Ala-His(pI 7.65)(서열번호 41);
라인 8: Met-Ala-Lys(pI 9.90)(서열번호 15); 및,
라인 9: Met-Arg-Arg-Arg-Arg-Ala-Lys(pI 12.98)(서열번호 25).
도 3은 선도서열 부분 Met-Glu-Glu(pI 3.09)과 절단효소 인식부위(Xa) 사이에 삽입된 접착성 단백질 부분의 거리가 다양한 여러 클론으로부터 얻어진 재조합 Mefp1 융합단백질(수용성 분획 약 20 ㎍)의 수용성 상층액 발현량을 나타낸 도이다(화살표: 재조합 Mefp1):
(A) SDS-PAGE; 및,
(B) 웨스턴 블롯;
M: 마커;
라인 1: Met-Glu-Glu(pI 3.09)(서열번호 37);
라인 2: Met-Glu-Glu-Xa(pI 4.01)(서열번호 46);
라인 3: Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Xa(pI 4.01)(서열번호 47);
라인 4: Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Xa(pI 4.01)(서열번호 48); 및,
라인 5: Met-Glu-Glu-Pro-Ser-Tyr-Pro-Pro-Thr-Xa(pI 4.01)(서열번호 49).
도 4는 pET-22b(+)[ompASP 1-11 -7× mefp1*](*: Ra-6× His) 클론을 기본으로 Lys간의 거리가 다르게 디자인된 여러 선도서열 클론으로부터 얻어진 재조합 Mefp1 융합단백질(수용성 분획 약 20 ㎍)의 수용성 상층의 발현량을 나타낸 도이다(화살표: 재조합 Mefp1):
(A) SDS-PAGE; 및,
(B) 웨스턴 블롯;
4a :
M: 마커;
라인 1: Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Lys(pI 10.82)(서열번호 56);
라인 2: Met-Lys-Lys-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=0)(서열번호 57);
라인 3: Met-Lys-Ala-Thr-Lys-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=2)(서열번호 58);
라인 4: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ile-Ala-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=4)(서열번호 59);
라인 5: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ala-Lys-Val-Ala-Ala-Ala(pI 10.55, d1=6)(서열번호 60); 및,
라인 5: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Ala-Ile-Ala-Val-Lys-Ala-Ala(pI 10.55, d1=8)(서열번호 61);
4b :
M: 마커;
라인 1: Met-Lys-Lys-Ala-Lys(pI 10.82)(서열번호 17);
라인 2: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=1)(서열번호 106);
라인 3: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=2)(서열번호 107);
라인 4: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=3)(서열번호 108); 및,
라인 5: Met-Lys-Ala-Thr-Ala-Ile-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Lys(pI 10.82, d1=4, d2=4)(서열번호 109).
도 5는 선도서열로서 신호 기능과 분비증강 기능을 동시에 갖도록 삽입된 Met-7×동형 아미노산의 아미노산 서열 pI값 및 소수성 값이 ofHepcidinⅠ수용성 발현(수용성 분획 약 20 ㎍)에 미치는 효과를 나타낸 도이다(화살표: 재조합 ofHepcidinⅠ):
(A) SDS-PAGE; 및,
(B) 웨스턴 블롯;
M: 마커;
라인 1: MRRRRRRR(pI 13.28, hy +1.97)(서열번호 70);
라인 2: MKKKKKKK(pI 11.28, hy +1.97)(서열번호 71);
라인 3: MHHHHHHH(pI 8.08, hy -0.35)(서열번호 72);
라인 4: MYYYYYYY(pI 5.59, hy -1.55)(서열번호 73);
라인 5: MCCCCCCC(pI 4.57, hy -0.69)(서열번호 74);
라인 6: MEEEEEEE(pI 2.78, hy +1.97)(서열번호 75); 및,
라인 7: MDDDDDDD(pI 2.52, hy +1.97)(서열번호 76).
도 6은 pI값이 조절된 변이된 OmpASP 단편(Met-2 aas)-OmpASP4-10-분비증강자 후보서열-Xa로 구성된 선도서열에서 N-말단 pI값이 분비증강자 서열 및 수용성 발현(수용성 분획 약 20 ㎍)에 미치는 효과를 나타낸 도이다(화살표: 재조합 ofHepcidinⅠ):
(A) SDS-PAGE; 및,
(B) 웨스턴 블롯;
M: 마커;
라인 1: MAH(pI 7.65)-OmpASP4-10(pI 5.70)-6× Arg(pI 13.20; hy +1.75)-Xa(pI 7.05)(서열번호 86);
라인 2: MAH-OmpASP4-10-6× Tyr(pI 5.55; hy -1.33)-Xa(서열번호 87);
라인 3: MAH-OmpASP4 -10-6× Glu(pI 2.82; hy +1.75)-Xa(서열번호 88);
라인 4: MAA(pI 5.60)-OmpASP4-10-6× Arg-Xa(서열번호 89);
라인 5: MAA-OmpASP4-10-6× Tyr-Xa(서열번호 90);
라인 6: MAA-OmpASP4-10-6× Glu-Xa(서열번호 91);
라인 7: MEE(pI 3.09)-OmpASP4-10-6× Arg-Xa(서열번호 92);
라인 8: MEE-OmpASP4-10-6× Tyr-Xa(서열번호 93); 및,
라인 9: MEE-OmpASP4 -10-6× Glu-Xa(서열번호 94).
<110> National Fisheries Research and Development Institute <120> Production of soluble recombinant protein by pI value control of N-terminal <130> 8p-03-59 <160> 109 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1 <400> 1 catatggcta agccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 2 <400> 2 catatgaaag ctaagccgtc ttatccgcca acctac 36 <210> 3 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3 <400> 3 catatgaaaa aggctaagcc gtcttatccg ccaacc 36 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4 <400> 4 catatgaaaa aaaaagctaa gccgtcttat ccgccaacc 39 <210> 5 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5 <400> 5 catatgaaaa aaaaaaaagc taagccgtct tatccgccaa cc 42 <210> 6 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 <400> 6 catatgaaaa aaaaaaaaaa agctaagccg tcttatccgc caacc 45 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7 <400> 7 catatgaaaa aaaaaaaaaa aaaagctaag ccgtcttatc cgccaacc 48 <210> 8 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 8 <400> 8 catatgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa gctaagccgt cttatccgcc aacc 54 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 9 <400> 9 catatgcgtg ctaagccgtc ttatccgcca acctac 36 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 10 <400> 10 catatgcgtc gcgctaagcc gtcttatccg ccaacc 36 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 11 <400> 11 catatgcgtc gccgtcgcgc taagccgtct tatccgccaa cc 42 <210> 12 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 12 <400> 12 catatgcgtc gccgtcgccg tcgcgctaag ccgtcttatc cgccaacc 48 <210> 13 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 13 <400> 13 catatgcgtc gccgtcgccg tcgccgtcgc gctaagccgt cttatccgcc aacc 54 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14 <400> 14 ctcgaggtcg acaagcttac g 21 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 15 <400> 15 Met Ala Lys 1 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 16 <400> 16 Met Lys Ala Lys 1 <210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 17 <400> 17 Met Lys Lys Ala Lys 1 5 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 18 <400> 18 Met Lys Lys Lys Ala Lys 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 19 <400> 19 Met Lys Lys Lys Lys Ala Lys 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 20 <400> 20 Met Lys Lys Lys Lys Lys Ala Lys 1 5 <210> 21 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 21 <400> 21 Met Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ala Lys 1 5 <210> 22 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 22 <400> 22 Met Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Ala Lys 1 5 10 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 23 <400> 23 Met Arg Ala Lys 1 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 24 <400> 24 Met Arg Arg Ala Lys 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 25 <400> 25 Met Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 26 <400> 26 Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1 5 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 27 <400> 27 Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Ala Lys 1 5 10 <210> 28 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28 <400> 28 catatggacg atgacgatgc tgcaccgtct tatccgccaa cctac 45 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 29 <400> 29 catatggacg atgacgctgc accgtcttat ccgccaacct ac 42 <210> 30 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 30 <400> 30 catatggaag agccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 31 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 31 <400> 31 catatggctg aaccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 32 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 32 <400> 32 catatggctg caccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 33 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 33 <400> 33 catatgtgcc acccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 34 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 34 <400> 34 catatggctc acccgtctta tccgccaacc tac 33 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 35 <400> 35 Met Asp Asp Asp Asp Ala Ala 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 36 <400> 36 Met Asp Asp Asp Ala Ala 1 5 <210> 37 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 37 <400> 37 Met Glu Glu 1 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 38 <400> 38 Met Ala Glu 1 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 39 <400> 39 Met Ala Ala 1 <210> 40 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 40 <400> 40 Met Cys His 1 <210> 41 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 41 <400> 41 Met Ala His 1 <210> 42 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 42 <400> 42 catatggaag agatcgaagg tcgtgctaag ccgtcttatc cgccaaccta c 51 <210> 43 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 43 <400> 43 catatggaag agccgtctat cgaaggtcgt gctaagccgt cttatccgcc aacctac 57 <210> 44 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 44 <400> 44 catatggaag agccgtctta tccgatcgaa ggtcgtgcta agccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 45 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 45 <400> 45 catatggaag agccgtctta tccgccaacc atcgaaggtc gtgctaagcc gtcttatccg 60 ccaacctac 69 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 46 <220> <221> SITE <222> (4)..(7) <223> Xa recognition site <400> 46 Met Glu Glu Ile Glu Gly Arg 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 47 <220> <221> SITE <222> (6)..(9) <223> Xa recognition site <400> 47 Met Glu Glu Pro Ser Ile Glu Gly Arg 1 5 <210> 48 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 48 <220> <221> SITE <222> (8)..(11) <223> Xa recognition site <400> 48 Met Glu Glu Pro Ser Tyr Pro Ile Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 49 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 49 <220> <221> SITE <222> (10)..(13) <223> Xa recognition site <400> 49 Met Glu Glu Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Ile Glu Gly Arg 1 5 10 <210> 50 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 50 <400> 50 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcagcta agccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 51 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 51 <400> 51 catatgaaaa agacagctat cgcgattgca gtggcagctg caccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 52 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 52 <400> 52 catatgaaag ctacaaagat cgcgattgca gtggcagctg caccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 53 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 53 <400> 53 catatgaaag ctacagctat caagattgca gtggcagctg caccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 54 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 54 <400> 54 catatgaaag ctacagctat cgcgattaag gtggcagctg caccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 55 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 55 <400> 55 catatgaaag ctacagctat cgcgattgca gtgaaggctg caccgtctta tccgccaacc 60 tac 63 <210> 56 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 56 <400> 56 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 57 <400> 57 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 58 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 58 <400> 58 Met Lys Ala Thr Lys Ile Ala Ile Ala Val Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 59 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 59 <400> 59 Met Lys Ala Thr Ala Ile Lys Ile Ala Val Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 60 <400> 60 Met Lys Ala Thr Ala Ile Ala Ile Lys Val Ala Ala Ala 1 5 10 <210> 61 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 61 <400> 61 Met Lys Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Lys Ala Ala 1 5 10 <210> 62 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 62 <400> 62 catatgcgtc gccgtcgccg tcgccgtcac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 63 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 63 <400> 63 catatgaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaacac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 64 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 64 <400> 64 catatgcacc atcaccatca ccatcaccac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 65 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 65 <400> 65 catatgtact attactatta ctattaccac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 66 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 66 <400> 66 catatgtgct gttgctgttg ctgttgccac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 67 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 67 <400> 67 catatggaag aggaagagga agaggaacac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 68 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 68 <400> 68 catatggacg atgacgatga cgatgaccac atcagccaca tctccatgtg c 51 <210> 69 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 69 <400> 69 ctcgaggtcg acaagctttt cgaacttgca gcaggggcca cagcc 45 <210> 70 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 70 <400> 70 Met Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 71 <400> 71 Met Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5 <210> 72 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 72 <400> 72 Met His His His His His His His 1 5 <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 73 <400> 73 Met Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 74 <400> 74 Met Cys Cys Cys Cys Cys Cys Cys 1 5 <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 75 <400> 75 Met Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 76 <400> 76 Met Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp 1 5 <210> 77 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 77 <400> 77 catatggctc acacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 78 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 78 <400> 78 catatggctc acacagctat cgcgattgca gtgtactatt actattacta tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 79 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 79 <400> 79 catatggctc acacagctat cgcgattgca gtggaagagg aagaggaaga gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 80 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 80 <400> 80 catatggctg caacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 81 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 81 <400> 81 catatggctg caacagctat cgcgattgca gtgtactatt actattacta tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 82 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 82 <400> 82 catatggctg caacagctat cgcgattgca gtggaagagg aagaggaaga gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 83 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 83 <400> 83 catatggaag agacagctat cgcgattgca gtgcgccgtc gccgtcgccg tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 84 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 84 <400> 84 catatggaag agacagctat cgcgattgca gtgtactatt actattacta tatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 85 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 85 <400> 85 catatggaag agacagctat cgcgattgca gtggaagagg aagaggaaga gatcgaaggt 60 cgtcacatca gccacatctc catgtgc 87 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 86 <400> 86 Met Ala His Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 87 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 87 <400> 87 Met Ala His Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 88 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 88 <400> 88 Met Ala His Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 89 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 89 <400> 89 Met Ala Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 90 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 90 <400> 90 Met Ala Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 91 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 91 <400> 91 Met Ala Ala Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 92 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 92 <400> 92 Met Glu Glu Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 93 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 93 <400> 93 Met Glu Glu Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 94 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 94 <400> 94 Met Glu Glu Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Ile Glu Gly Arg 20 <210> 95 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mefp1 <400> 95 Ala Lys Pro Ser Tyr Pro Pro Thr Tyr Lys 1 5 10 <210> 96 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mefp1 forward primer <400> 96 tacaaagcta agccgtctta tccgccaacc 30 <210> 97 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mefp1 reverse primer <400> 97 tttgtaggtt ggcggataag acggcttagc 30 <210> 98 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> La forward primer <400> 98 gatccgaatt ccccggg 17 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> La reverse primer <400> 99 tttgtacccg gggaattcg 19 <210> 100 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ra forward primer <400> 100 tacaaacgta agcttgtcga cc 22 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ra reverse primer <400> 101 tcgaggtcga caagcttacg 20 <210> 102 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 102 <400> 102 catatgaaag ctacagctat caaggctaag ccgtcttatc cgccaaccta c 51 <210> 103 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 103 <400> 103 catatgaaag ctacagctat caaggcagct aagccgtctt atccgccaac ctac 54 <210> 104 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 104 <400> 104 catatgaaag ctacagctat caaggctgca gctaagccgt cttatccgcc aacctac 57 <210> 105 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 105 <400> 105 catatgaaag ctacagctat caaggcagct gcagctaagc cgtcttatcc gccaacctac 60 60 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 106 <400> 106 Met Lys Ala Thr Ala Ile Lys Ala Lys 1 5 <210> 107 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 107 <400> 107 Met Lys Ala Thr Ala Ile Lys Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 108 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 108 <400> 108 Met Lys Ala Thr Ala Ile Lys Ala Ala Ala Lys 1 5 10 <210> 109 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 109 <400> 109 Met Lys Ala Thr Ala Ile Lys Ala Ala Ala Ala Lys 1 5 10

Claims (79)

  1. (i) 프로모터; 및,
    (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 단편 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 및/또는 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리가 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터.
  2. 제 1항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 pI값이 9.90 내지 11.41로 조절된 1 내지 6개의 아미노산 길이로 구성되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  3. 제 1항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 pI값이 3.09 내지 9.90으로 조절된 1 내지 12개의 아미노산 길이로 구성되는 폴리펩타이드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  4. 제 2항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 내부에 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His)으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 산성 아미노산이 상기 염기성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 높아진 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  5. 제 3항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 내부에 아스파르트산(Asp) 또는 글루탐산(Glu)의 산성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 염기성 아미노산이 상기 산성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 낮아진 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  6. 제 1항에 있어서, pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리가 조절된 폴리펩타이드 단편은 글리신(Gln), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 메티오닌(Met), 시스테인(Cys) 및 프롤린(Pro)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 무극성 아미노산, 또는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 극성 아미노산을 추가로 포함함으로써 아미노산의 거리가 조절되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  7. 제 1항에 있어서, 유전자 컨스트럭트는 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 앞에 연결된, 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  8. 제 7항에 있어서, 선도서열과 단백질 절단효소 인식부위를 코딩하는 뉴클레오티드 사이에 글리신(Gln), 알라닌(Ala), 발린(Val), 루신(Leu), 이소루신(Ile), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 메티오닌(Met), 시스테인(Cys) 및 프롤린(Pro)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 무극성 아미노산, 또는 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 티로신(Tyr), 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)으로 구성된 군으로부터 선택되는 중성의 극성 아미노산을 추가로 포함함으로써 길이가 0 내지 2로 조절된 아미노산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중의 어느 한 항에 있어서, 유전자 컨스트럭트는 외래단백질을 코딩하는 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  10. 제 9항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  11. (i) 프로모터;
    (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하도록 연결된 신호서열(signal sequence) 단편 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및,
    (ⅲ) 상기 폴리펩타이드 단편 또는 이의 변이체에 작동 가능하도록 연결된 pI값이 조절된 친수성 증가서열로 구성된 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 외래단백질의 분비효율 향상을 위한 발현 벡터.
  12. 제 11항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 pI값이 5 내지 11로 조절되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  13. 제 12항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  14. 제 11항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 pI값이 2 내지 5로 조절되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  15. 제 14항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  16. 제 12항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 내부에 리신(Lys), 아르기닌(Arg) 및 히스티딘(His)으로 구성된 군으로부터 선택되는 염기성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 산성 아미노산이 상기 염기성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 높아진 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  17. 제 14항에 있어서, N-영역을 포함하는 pI값이 조절된 폴리펩타이드 단편은 내부에 아스파르트산(Asp) 또는 글루탐산(Glu)의 산성 아미노산이 추가되거나 상기 단편 내부의 염기성 아미노산이 상기 산성 아미노산으로 대체됨으로써 pI값이 낮아진 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  18. 제 11항에 있어서, 분비증강자는 적어도 60% 이상의 친수성 아미노산을 포함하는 2 내지 50개의 아미노산으로 구성된 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 재조합 발현 벡터.
  19. 제 11항에 있어서, 분비증강자는 친수성 아미노산이 6 내지 20개 반복된 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  20. 제 18항에 있어서, 친수성 아미노산은 리신, 아르기닌, 글루탐산 및 아스파르트산인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  21. 제 11항에 있어서, 유전자 컨스트럭트는 분비증강자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결된, 외래 유전자의 삽입을 위한 제한효소 부위를 추가로 포함하는 발현 벡터.
  22. 제 11항에 있어서, 상기 유전자 컨스트럭트에 작동 가능하도록 연결된 외래단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  23. 제 22항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)을 가지고 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  24. 제 23항에 있어서, 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인이 있는 단백질은 넙치 헵시딘 I인 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  25. 제 1항 내지 제 24항 중의 어느 한 항의 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 제조한 형질전환체.
  26. 제 25항에 있어서, 숙주세포는 원핵생물세포 또는 진핵생물세포인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  27. 제 26항에 있어서, 원핵생물세포는 바이러스, 대장균, 바실러스(Bacillus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  28. 제 26항에 있어서, 진핵생물세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모, 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  29. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
    3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하 도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
    6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭 트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하 도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 34항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증강자의 pI값은 11 내지 14로 조절된 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성 되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및,
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하여 수용성 발현량이 가장 높은 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 외래단백질의 분비 효율을 향상시키는 방법.
  38. 제 37항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 37항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증강자의 pI값은 2 내지 14로 조절된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
    3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
    7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법.
  41. 제 40항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법.
  44. 제 43항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법.
  46. 제 45항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 45항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계; 및,
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 재조합 융합 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 재조합 융합 외래단백질의 제조방법.
  49. 제 48항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특 징으로 하는 방법.
  50. 제 48항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 40항 또는 제 50항의 제조 방법에 의하여 제조된 재조합 융합 외래단백질.
  52. 제 51항의 재조합 융합 외래단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물.
  53. 제 52항에 있어서, 뇌질환의 치료에 사용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  54. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
    3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
    8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법.
  55. 제 54항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 54항에 있어서, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법.
  58. 제 59항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법.
  60. 제 59항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 59항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계; 및,
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 분리하는 단계를 포함하는 원래 형태의 외래단백질의 생산방법.
  63. 제 62항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 9.90 내지 11.28의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 선도서열 내에서 pI값에 영향을 주는 아미노산의 거리를 조절하는 단계;
    3) 단계 1)의 선도서열, 단계 2)의 거리 조절 부위, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    6) 단계 5)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    7) 단계 6)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
    8) 단계 7)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
    9) 단계 8)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법.
  66. 제 65항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 65항에 있어서, 단계 2)의 pI값에 영향을 주는 아미노산은 Lys인 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 65항에 있어서, 상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 3.09 내지 9.90의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제 조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
    8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법.
  70. 제 69항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 없는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 69항에 있어서, 상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산 물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 5 내지 11의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
    8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법.
  73. 제 72항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 72항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은11 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 72항에 있어서, 상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 1) 신호서열(signal sequence) 및/또는 외래 단백질의 선도서열의 N-영역을 포함하는 pI값 2 내지 5의 선도서열을 설계하는 단계;
    2) 단계 1)의 선도서열, 친수성 분비증강자, 절단효소 인식부위 및 상기 외래단백질을 순차적으로 포함하는 융합단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 구성되는 유전자 컨스트럭트를 제조하는 단계;
    3) 단계 2)에서 제조된 유전자 컨스트럭트를 통상의 발현벡터에 작동 가능하도록 삽입하여 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 단계 3)의 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환하여 형질전환체를 제조하는 단계;
    5) 단계 4)의 형질전환체를 배양하는 단계;
    6) 단계 5)의 배양액으로부터 상기 융합 외래단백질을 분리하는 단계;
    7) 단계 6)의 분리된 융합 외래단백질을 상기 단백질 절단효소 인식 부위를 절단할 수 있는 단백질 절단효소로 절단한 후 원래 형태의 외래단백질을 제외한 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 분리하는 단계; 및,
    8) 단계 7)의 선도서열, 친수성 분비증강자 및 절단효소 인식부위가 연결된 펩티드를 세포 내로 전달시키고자 하는 물질과 결합시키는 단계를 포함하는 상기 물질의 세포 내 운반체의 제조방법.
  77. 제 76항에 있어서, 외래단백질은 내부에 하나 이상의 막전위 도메인, 막전위-유사 도메인 또는 양친매성 도메인(amphipathic domain)이 있는 단백질인 것을 특 징으로 하는 방법.
  78. 제 76항에 있어서, 단계 2)의 친수성 분비증가자의 pI값은2 내지 14로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제 76항에 있어서, 상기 세포 내로 전달시키고자 하는 물질은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 안티센스 펩티드 핵산(antisense peptide nucleic acids), 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아 또는 진균의 대사산물 및 생활성 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020080035162A 2006-01-31 2008-04-16 Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법 KR101049859B1 (ko)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA2707188A CA2707188A1 (en) 2007-11-28 2008-04-17 Production of soluble recombinant protein by pi value control of n-terminal
US12/745,187 US20100305040A1 (en) 2007-11-28 2008-04-17 Production of soluble recombinant protein by pi value control of n-terminal
PCT/KR2008/002173 WO2009069862A1 (en) 2007-11-28 2008-04-17 Production of soluble recombinant protein by pi value control of n-terminal
AU2008330433A AU2008330433A1 (en) 2007-11-28 2008-04-17 Production of soluble recombinant protein by pi value control of N-terminal
JP2010535865A JP2011504746A (ja) 2007-11-28 2008-04-17 Ｎ−末端ｐＩ値調節による水溶性組換えタンパク質生産方法
CN2008801254690A CN101952438A (zh) 2007-11-28 2008-04-17 通过n端的pi值控制生产可溶性重组蛋白
EP08741418A EP2220235A4 (en) 2007-11-28 2008-04-17 PREPARATION OF SOLUBLE RECOMBINANT PROTEIN BY PI VALUE CONTROL OF N-TERMINUS
US14/309,764 US9422356B2 (en) 2006-01-31 2014-06-19 Artificial signal peptide for expressing an insoluble protein as a soluble active form

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070121977 2007-11-28
KR20070121977 2007-11-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20090055457A true KR20090055457A (ko) 2009-06-02
KR101049859B1 KR101049859B1 (ko) 2011-07-19

Family

ID=40987122

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080035162A KR101049859B1 (ko) 2006-01-31 2008-04-16 Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20100305040A1 (ko)
EP (1) EP2220235A4 (ko)
JP (1) JP2011504746A (ko)
KR (1) KR101049859B1 (ko)
CN (1) CN101952438A (ko)
AU (1) AU2008330433A1 (ko)
CA (1) CA2707188A1 (ko)
WO (1) WO2009069862A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011142529A2 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Republic Of Korea Represented By National Fisheries Research & Development Institute Soluble expression of bulky folded active proteins
US9422356B2 (en) 2006-01-31 2016-08-23 Republic Of Korea (Republic Of National Fisheries Research And Development Institute) Artificial signal peptide for expressing an insoluble protein as a soluble active form

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2007262635B2 (en) 2006-06-23 2014-09-11 Adc Therapeutics Sa Polynucleotides and polypeptide sequences involved in cancer
AU2009321508B2 (en) 2008-11-03 2015-03-12 Adc Therapeutics Sa Antibodies that specifically block the biological activity of a tumor antigen
KR20110011463A (ko) * 2009-07-28 2011-02-08 엘지이노텍 주식회사 라이트 유닛 및 이를 구비한 표시장치
BR112013025198A2 (pt) 2011-03-31 2018-12-04 Alethia Biotherapeutics Inc. anticorpos contra antígeno 1 associado a rim e fragmentos de ligação a antígeno do mesmo
PL2802351T3 (pl) 2012-01-09 2019-11-29 Adc Therapeutics Sa Środki do leczenia potrójnie negatywnego raka piersi

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1981979A4 (en) * 2006-01-31 2009-07-29 Republic Of Korea Republic Of PROCESS FOR PRODUCING A SOLUBLE NATIVE FORM OF RECOMBINANT PROTEIN USING THE SIGNAL SEQUENCE AND A SECRETION ENHANCING AGENT
KR101184011B1 (ko) * 2010-05-11 2012-09-27 대한민국 폴딩되는 큰 활성 단백질의 수용성 발현

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9422356B2 (en) 2006-01-31 2016-08-23 Republic Of Korea (Republic Of National Fisheries Research And Development Institute) Artificial signal peptide for expressing an insoluble protein as a soluble active form
WO2011142529A2 (en) * 2010-05-11 2011-11-17 Republic Of Korea Represented By National Fisheries Research & Development Institute Soluble expression of bulky folded active proteins
WO2011142529A3 (en) * 2010-05-11 2012-04-26 Republic Of Korea Represented By National Fisheries Research & Development Institute Soluble expression of bulky folded active proteins
US20130084602A1 (en) * 2010-05-11 2013-04-04 Republic Of Korea Represented By National Fisheries Research & Development Institute Soluble expression of bulky folded active proteins

Also Published As

Publication number Publication date
KR101049859B1 (ko) 2011-07-19
WO2009069862A1 (en) 2009-06-04
CA2707188A1 (en) 2009-06-04
JP2011504746A (ja) 2011-02-17
EP2220235A1 (en) 2010-08-25
CN101952438A (zh) 2011-01-19
US20100305040A1 (en) 2010-12-02
EP2220235A4 (en) 2011-01-26
AU2008330433A1 (en) 2009-06-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100981356B1 (ko) 신호서열 및 변이된 신호서열로 디자인된 분비증강자에의한 원래 형태의 수용성 재조합 단백질 생산 방법
KR101049859B1 (ko) Ｎ-말단 ｐＩ 값 조절에 의한 수용성 재조합 단백질 생산방법
EP1904656B1 (en) Library of translational fusion partners for producing recombinant proteins and translational fusion partners screened therefrom
WO2016066995A1 (en) Incorporation of unnatural amino acids into proteins
CN101384621A (zh) 产生受体和配体同种型的方法
US20220228148A1 (en) Eukaryotic semi-synthetic organisms
KR20070091156A (ko) 단백질 제조
KR20100105846A (ko) 메틸영양요구성 효모 피키아 파스토리스에서의 생체 내 비천연 아미노산 발현
KR20200033952A (ko) 신규 융합 단백질의 제조 및 이의 단백질 합성 향상에서의 응용
CN112955547A (zh) 通过使用转录因子来增加蛋白质表达的手段和方法
CN111542615A (zh) 蛋白质的制造方法
CN113797326B (zh) 一种预防冠状病毒引起疾病的疫苗
KR101184011B1 (ko) 폴딩되는 큰 활성 단백질의 수용성 발현
Tamás et al. Heterologous expression and protein engineering of wheat gluten proteins
EP1304376A1 (en) Process for producing recombinant protein
US9422356B2 (en) Artificial signal peptide for expressing an insoluble protein as a soluble active form
KR101782938B1 (ko) 사카로마이세스 세레비지애 효모의 만노스 인산화 활성에 핵심적인 유전자 mnn14 및 그 결손 변이주를 활용한 재조합 당단백질 생산 방법
KR100915670B1 (ko) 야로위아 리폴리티카 유래의 신규 ＹｌＭＰＯ１ 유전자 및이의 파쇄 균주를 이용한 만노스 인산이 제거된 당단백질생산 방법
KR102008407B1 (ko) 코돈 최적화된 il-21 및 이의 용도
JP2002000276A (ja) タンパク質のｏ−グリコシル化に関わるアミノ酸配列
KR101582655B1 (ko) 광활성 메티오닌 모사체 표지 단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소 변이체
KR101623526B1 (ko) 인간 보체 인자 h의 생산 방법
JP2023525833A (ja) 外因性タンパク質の産生のための改変された糸状菌
US10442840B2 (en) Artificial forisome body with SEO-F fusion proteins, plant or yeast cells comprising vectors which code for these proteins, as well as vectors which code for SEO-F fusion proteins
Evans et al. RECOMBINANT BACULOVIRUS OCCLUSION BODIES IN 4870014 VACCINES AND BIOLOGICAL INSECTICIDES CLONING OF THERMOLABILE

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant