KR20150131292A - 인플루엔자 핵단백질 백신 - Google Patents

인플루엔자 핵단백질 백신 Download PDF

Info

Publication number
KR20150131292A
KR20150131292A KR1020157029403A KR20157029403A KR20150131292A KR 20150131292 A KR20150131292 A KR 20150131292A KR 1020157029403 A KR1020157029403 A KR 1020157029403A KR 20157029403 A KR20157029403 A KR 20157029403A KR 20150131292 A KR20150131292 A KR 20150131292A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
influenza
protein
antigen
seq
fusion protein
Prior art date
Application number
KR1020157029403A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102379951B1 (ko
Inventor
주디스 델 캄포 아스카라테일
페르갈 힐
Original Assignee
이막시오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이막시오 filed Critical 이막시오
Publication of KR20150131292A publication Critical patent/KR20150131292A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102379951B1 publication Critical patent/KR102379951B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A61K47/4833—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/11—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • C07K14/155—Lentiviridae, e.g. human immunodeficiency virus [HIV], visna-maedi virus or equine infectious anaemia virus
    • C07K14/16—HIV-1 ; HIV-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 인플루엔자로부터 온 핵단백질 항원의 세포 면역원성을 증가시키기 위한 인플루엔자 균주 A, B 또는 C로부터 온 핵단백질 항원의 변종 및 C4bp 올리고머화 도메인의 변종을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인플루엔자 질병의 예방 및 치료를 위한 백신 또는 면역요법으로의 사용을 위한 핵산, 벡터, 융합 단백질 및 면역원성 조성물에 관한 것이다.

Description

인플루엔자 핵단백질 백신{INFLUENZA NUCLEOPROTEIN VACCINES}
배경기술
개선된 인플루엔자 백신에 대한 수요가 존재한다. 인플루엔자에 대한 현재의 백신 전략은 적혈구응집소에 대한 활발한 항체(체액성) 반응 생성에 집중한다. 한 해에 걸친 인플루엔자 균주 순환 중의 높은 정도의 항원 변이로 인해, 백신 균주는 특별히 각 인플루엔자 계절에 대해 새로 만들어져야 한다. 매년의(또는 매계절의) 인플루엔자 백신이 상이한 연령 범위에서 다른 정도로 성공적이지만, 특히 어린이 및 노인에 대해 보다 효과적인 방어가 명확히 요구된다. 또한, "항원 변위"로 알려진 과정에서 매우 다른 HA(적혈구응집소) 유전자를 얻은 재조합 바이러스가 진화할 주된, 영구적인 위험이 존재한다. 현재의 인플루엔자 백신은 HA 항원에 본질적으로 의존하기 때문에 이는 공중 보건 비상 사태를 초래할 수 있다.
인플루엔자는 오소믹소바이러스과의 바이러스에 속하는 껍질보유, 단일 가닥, 네거티브-센스 RNA 바이러스로, 3 주요 종류: A, B, 및 C로 나뉜다. 인플루엔자 A 바이러스는, 인간, 새, 돼지, 말, 박쥐 등을 포함한 다양한 동물을 감염시키지만, 임의의 특정 인플루엔자 바이러스의 친화성은 일반적으로 특정 숙주에 매우 맞춰져 있다. 인플루엔자 B 바이러스는 더 작은 수의 종, 즉 인간 및 물개를 감염시키지만, 그럼에도 불구하고 매년의 인플루엔자 유행병의 실질적인 원인이다. 대부분의 인간 인플루엔자 감염은 인플루엔자 A 또는 B에 의해 발생하고; 인간 및 돼지를 감염시키는 인플루엔자 C 바이러스는, 심각한 인간 감염 또는 유행병의 원인이 거의 되지 않는다(Lamb).
현재의 비활성화된 인플루엔자 바이러스 백신은 밀접한 관계가 있는 바이러스 균주를 방어하는 항체를 유도한다. 현재 허가된 백신은 바이러스 표면의 주요 항원 결정기인 적혈구응집소(HA)에 대해 주로 균주-특이적 중화 항체를 유도하는데, 이는 매우 면역원성이고, 일치하는 바이러스 균주 감염에 의해 발생하는 질병을 예방할 수 있다. 그러나, HA는 현저한 항원 변이가 있어 폭넓은 방어를 제공하도록 설계된 백신에서 단독으로의 사용이 배제된다. 이러한 이유로, 덜 변동성인 표적을 향한 방어 반응을 발생시키는 대안적인 백신 전략이 큰 관심사이다.
인플루엔자 A 바이러스의 자연 감염은 체액 및 세포 면역 둘 다를 유도한다. 오래 지속되는 세포 면역은 대부분 핵단백질(NP)과 같은 보존된, 내부 바이러스 단백질을 향한다. NP 항원은 자연 감염 후 인간에게 면역원성이지만, 유도되는 세포독성 T 림프구는 짧은 수명을 갖는다(McMichael a, McMichael b).
NP에 대한 세포 면역은 소중한데, 이는 NP 항원결정인자의 상이한 변종을 향하기 때문이며, NP-표적 DNA 백신은 동물에서 교차 방어성 면역을 유도했다(Schotsaert).
핵단백질(NP) 항원은 오랫동안 매우 보존된 항원으로 여겨져 왔으며: 가장 분지성인 인플루엔자 A 균주조차 그들이 인코딩하는 NP 단백질에서 90 % 동일성을 공유한다(Gorman, Xu). NP의 항원 변이는 드물고 사소한 정도로만 일어난다(Stanekova).
종래 기술
백신에서의 항원으로의 핵단백질의 용도
인플루엔자 핵단백질을 항원으로 사용하는 것은 1980년대에 기술되었다(Wraith). NP에 대한 마우스에서의 세포 면역 반응은 면역을 유도할 수 있고, 주로 분지성 A형 바이러스에 대해 교차 방어를 생성할 수 있다. 치사 이종발현성(H1N1) 검사로부터 H3N2 바이러스로부터 정제된 NP를 사용한 마우스의 면역화가 상당한 방어(75 %)를 제공할 수 있다는 것이 밝혀졌으나, 감염을 예방하지는 않았다.
NP 유전자를 사용하는 DNA 백신은 20 년 전부터 알려져 있었고: DNA 백신 접종 자체를 위한 첫번째 "개념 입증" 실험에 사용되었다(Ulmer).
바이러스 벡터로부터의 NP 발현은 1980년대에 처음으로 입증되었고(Yewdell 1985), 이 벡터를 사용한 면역화는 DNA 백신과 비교하여 다양한 인플루엔자 A 균주에 대한 세포독성 T 림프구의 향상된 생성과 관련되었으나 인플루엔자 B에 대해서는 그렇지 않았다.
그 후, PR8 핵단백질을 발현하는 MVA 벡터를 사용한 마우스의 면역화가 이종서브타입 인플루엔자 바이러스에 의한 저용량 감염에 대해 방어하는 것으로 확인되었다(Altstein). 더욱 최근에는, M1 단백질에 융합된 NP 단백질을 인코딩하는 바이러스 벡터가 인간 면역화에 사용되었다(Lillie, Berthoud, Antrobus). 이들 연구는 체액 반응이 면역노화를 통해 감소할 때 특히 NP에 대한 세포 면역 반응이 노인에서 현저히 상승될 수 있다는 것을 밝혔다(Antrobus).
핵단백질 분비
일부 연구는 NP 단백질이 주로 핵에 위치하여, 이러한 DNA 백신의 면역원성을 감소시킨다는 것을 시사했다(Stanekova).
NP에 대한 개선된 세포 면역 반응은 NP 분비를 강제함으로써, 예를 들어 tPA 신호 펩티드를 NP 유전자에 융합함으로써(Luo), DNA 제조에 의해(Greenland, Sullivan) 및 DNA 전달 향상을 위한 전기천공(Laddy) 사용에 의해 얻을 수 있다.
단량체성 인플루엔자 핵단백질
C4bp 올리고머화 도메인과의 융합에서의 단량체성 항원의 바람직한 사용은 특허 출원 WO 2005/014654에 기술되었다. 그러나 단량체화된 항원을 사용함에 있어서의 위험은 이들의 감소된 면역원성이다. 이는 배크만(Bachmann) 등에 의해 수포성 구내염 바이러스의 당단백질 G로(Bachmann 1993), 및 피어스(Fiers) 등에 의해 인플루엔자 항원 뉴라민분해효소, 또는 NA에 대해(Fiers 2001) 입증되었다. 인플루엔자 핵단백질로부터 고차 구조를 감소 또는 제거하는 것은 그의 면역원성을 감소시킬 것으로 예상된다.
다수의 돌연변이가 자연적으로 올리고머화되는 인플루엔자 핵단백질을 단량체성 형태로 전환하는 것으로 밝혀졌다(Ye 2006). 이 2006년 논문에 기술된 NP의 단량체성 버전은 보다 최근의 논문에서 단량체성인 것으로 확인되었다(Tarus, Ye 2012). 인플루엔자 A 핵단백질을 단량체성으로 만드는 이들 논문에 기술된 두 점 돌연변이는, 인플루엔자 B 및 C 균주의 핵단백질에 보존된다(Nakada의 도 3 참조). 따라서 인플루엔자 B 및 C 균주의 핵단백질에, 이들 다른 인플루엔자 핵단백질을 단량체성으로 만들기 위해, 동일한 점 돌연변이가 도입될 수 있다. 그러나 단량체성 핵단백질의 면역원성의 연구는 수행되지 않았다.
NP 항원을 사용하여 인플루엔자 백신을 제조하는 데에 있어 주된 기술적 과제는 강력하고 지속적인 세포 면역 반응을 유도하는 것이다. '세포 면역 반응'은 항원에 대한 반응으로 항체를 수반하지 않고 오히려 항원-특이적 T-림프구, 및 특히 세포독성 T 림프구의 활성화 및 다양한 사이토카인 방출을 수반하는 면역 반응이다. CD4 세포 또는 도움 T 세포는 면역 반응을 활성화하는 사이토카인을 분비함으로써 상이한 병원체에 대한 방어를 제공한다. 세포독성 T 세포(CD8)는 사이토카인을 사용하지 않고 병원체의 세포자멸에 의한 사멸을 일으킨다.
NP에 대한 CD4 또는 CD8 반응 중 어느 것이 방어에 더 중요한지에 대해 논란이 있지만(Epstein), 핵단백질에 대해 체액 보다 세포 반응이 이 항원이 유도할 수 있는 방어에 중요하다는 데 대해서는 의견이 일치한다(Thomas). 강력한 세포독성 T 세포 반응을 이끌어냄으로써 방어를 제공하는 백신은 T 세포 항원결정인자가 잘 보존된 NP 단백질로부터 유도될 때 유용할 수 있다(Epstein; Roy). T 림프구에 의해 중재되는 세포 면역 반응은, 인플루엔자 바이러스-감염된 세포 인지에 의해, 바이러스 복제 억제에 의해 그리고 바이러스 제거 가속화에 의해 주로 기능한다.
면역 부여에 수반되는 특이적 T 세포는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 다를 포함하고, 종종 각각 분비된 사이토카인 및 세포용해 활성의 작용을 통해 그 기능을 발휘한다. 특히 인플루엔자 NP-특이적 CD8+ CTL이 마우스에서의 치명 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 이형서브타입 방어 면역에서 중요한 역할을 할 수 있고(Gschoesser), 상기도 점막 표면으로부터의 인플루엔자 바이러스 제거를 포함하여(Mbawuike), 감염 후의 생존 및 회복을 촉진한다(Epstein). 최적의 NP-기재 백신은 CD4 및 CD8 세포 반응 둘 다를 향상시킬 것이다.
이 특허 출원은 인플루엔자 바이러스 핵단백질에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은, 인플루엔자 균주 A, B 또는 C로부터 온 NP 항원의 하나 이상의 변종을 운반 단백질로서의 닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종에 융합함으로써, 인플루엔자 바이러스로부터 온 NP 항원의 면역원성, 및 특히 세포 면역원성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 인플루엔자 균주 A, B 또는 C로부터 온 NP 항원의 하나 이상의 단량체성 변종, 및 특허 출원 WO2007/062819에 기술된 것과 같은 서열 1에 나타낸 서열을 갖는 운반 단백질 IMX313을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 특히, 서열 2에 나타낸 E339A 및 R416A 점 돌연변이를 나타내는 인플루엔자 균주 A로부터 온 NP 항원의 단량체성 변종, 및 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술한 것과 같은 서열 3에 나타낸 서열 ZXBBBBZ(식 중, (i) Z는 아미노산이거나 부재이고, (ii) X는 아미노산이고 (iii) B는 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다)을 갖는 하나 이상의 양으로 대전된 펩티드의 C-말단 치환을 갖는 IMX313 운반 단백질의 변종을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. IMX313 운반 단백질의 바람직한 변종은 프로타민과 교차 반응하는 항체를 유도하지 않는다.
본 발명은 특히, NP 항원의 단량체성 변종, 및 각각 서열 4 및 서열 5에 나타낸 변성된 운반 단백질 IMX313T 또는 IMX313P을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내의 DNA 서열을 포함하고, 서열 6에 나타낸 tPA와 같은 신호 펩티드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 융합 단백질을 인코딩하는 재조합 DNA 서열에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 또는 융합 단백질에 의해 인코딩된 DNA 서열을 포함하고, 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술한 대로 백신 보조제 또는 세포내 TLR에 대한 핵산 리간드를 추가로 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 인플루엔자의 치료 또는 예방 방법으로의 백신 또는 면역요법으로의 용도를 위한 DNA 플라스미드, 바이러스 벡터, 융합 또는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명을 자세히 기술하기 전에, 본 발명은 상세히 예시된 방법에 제한되지 않고, 물론 변동될 수 있다는 것을 이해해야 한다. 특히, 본 발명은 인플루엔자로부터 온 하나 이상의 핵단백질 항원을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이며, 특정 인플루엔자 핵단백질에 제한되지 않는다.
위에서든 또는 아래에서든 본원에서 인용되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 전체로서 참조문헌으로 본원에 포함된다. 그러나, 본원에서 언급되는 간행물은 그 간행물에서 보고되고 본 발명과 관련하여 사용될 수 있는 프로토콜, 시약 및 벡터를 기술하고 개시하는 목적으로 인용된다.
또한, 본 발명의 실시는 달리 언급하지 않는 한, 관련 기술 분야 내의 관련 통상적인 단백질 정제 및 분자 생물학적 기술을 사용한다. 이러한 기술은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌에 상세히 설명되어 있다. 다음에 오는 청구항 및 이어지는 발명의 상세한 설명에서, 언어 또는 필요한 함축을 표현하기 위해 문맥상달리 필요한 경우를 제외하고, 단어 "포함한다(comprise)", "함유한다(contain)", "수반한다(involve)" 또는 "포함한다(include)" 또는 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하는(containing)", "수반된(involved)", "포함한다(includes)", "포함하는(including)"과 같은 변형은 포함적 의미로, 즉, 언급된 특징의 존재를 명시하지만 본 발명의 다양한 실시태양에서 추가적인 특징의 존재 또는 추가를 배제하지 않도록 사용된다.
본 발명의 보다 나은 이해를 위해 다음의 용어를 정의한다:
인플루엔자 바이러스는 세 종류, A, B 및 C이다. 이 분류는 처음에 혈청학적이다: 인플루엔자 바이러스 A 핵단백질에 대한 항혈청은 다른 A형 바이러스의 핵단백질과 교차 반응하지만, B형 또는 C형 바이러스의 그것과는 하지 않는다. 인플루엔자 A 바이러스는, 그들의 적혈구응집소(H) 및 뉴라민분해효소(N) 당단백질의 혈청학적 교차 반응에 기초하여 아형으로 추가로 분류된다.
"인플루엔자 핵단백질"은 모든 세 종류의(A, B 및 C) 인플루엔자 바이러스의 핵단백질을 의미한다.
"운반 단백질"은 일반적으로 항원이 컨쥬게이션되거나 융합됨으로써 보다 면역원성이 되는 단백질을 의미한다. 여기에서 이 용어는 특히 항원을 운반하는 단백질의 의미로 사용된다. 단백질의 기능은 컨쥬게이션되거나 융합되는 상기 항원의 면역원성을 증가시키는 것이다.
"NP의 변종"은 인플루엔자 균주 A, B 및 C로부터 온 인플루엔자 핵단백질의 야생형의 90 % 이상의 동종성을 갖는 서열을 갖는 모든 단백질을 의미한다.
"닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종"은 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 WO2007/062819, 및 PCT/EP2013/076289(참조문헌 둘 다 참조문헌으로 본원에 포함된다)에 기술된 서열 1의 C4bp 도메인의 변종, 특히 특허 출원 WO2007/062819에 기술된 상기 서열 1의 48 이상의 연속적인 아미노산의 및/또는 70 % 이상 아미노산 서열 동일성을 갖는 단편이다.
"IMX313 운반 단백질의 변종"은 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술된다.
프로타민은 물고기로부터 얻어지는, 4500 돌턴의 평균 분자량을 갖는 일단의 이종성 펩티드로 이루어진다. 프로타민의 아미노산 조성의 약 67 %가 아르기닌이다. 이는 인슐린 제조(중성 프로타민 하게도른에서), 또는 헤파린 중성화에 오랫동안 사용되어왔다.
용어 "융합 단백질"은 융합된, 상이한 출처로부터의 두 도메인을 포함하는 자연적으로 존재하지 않는 재조합 단백질을 나타낸다. 보다 정확히, 본 발명에서, 융합 단백질은 닭 C4bp 올리고머화 도메인, 특히 'IMX313T' 또는 'IMX313P'의 운반 도메인 변종에 융합된 인플루엔자 핵단백질 항원을 포함한다. 융합은 균일한 생성물을 생성하는 이점을 갖는다. 보다 형식적으로, "컨쥬게이션"은 유전학적으로 기술될 수 있다: 전-면역원성 운반 단백질을 인코딩하는 DNA가 항원을 인코딩하는 DNA로 스플라이싱된다. 항원은 운반 단백질의 N- 또는 C- 말단에 융합될 수 있다.
본 발명은, 인플루엔자 핵단백질 항원의 하나 이상의 변종 및 C4bp 올리고머화 도메인의 변종을 포함하고, 인플루엔자 핵단백질 항원에 대한 증가된 세포 면역 반응을 발휘하는, 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 닭 C4bp 올리고머화 도메인, 특히 IMX313T 또는 IMX313P의 운반 단백질 변종에 융합된 핵단백질은, 임의의 종류의(A, B 또는 C) 인플루엔자 바이러스로부터 온 핵단백질일 수 있다.
핵단백질 항원은 운반 단백질, 특히 IMX313T 또는 IMX313P의 N- 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하나 이상의 핵단백질이 하나의 운반 단백질, 특히 IMX313T 또는 IMX313P에 융합된다; 그러나, 동일하거나 상이한 둘 이상의 핵단백질이 동일한 운반 단백질에 융합될 수 있다.
본 발명의 바람직한 측면에 따르면, 닭 C4bp 올리고머화 도메인, 특히 IMX313T 또는 IMX313P의 변종에 융합된 핵단백질 항원은 단량체성 항원이다. 정말로, 단량체화가 면역원성을 감소시키지 않는다면, 특허 출원 WO 2005/014654에 기술된 대로 단량체성 항원을 사용하는 것이 유리하다. 또한, NP는 결정에서 삼량체를(Ye 2006) 형성하고 다른 올리고머를 체 내(Arranz, Moeller) 형성한다. 삼량체성 또는 올리고머성 단백질을 IMX313T 또는 IMX313P과 같은 칠량체성 단백질에 융합하면 입체 충돌 발생의 위험이 있다. 반면, 자연적으로 올리고머성인 단백질의 단량체성 형태는 감소된 면역원성을 갖는다(Fiers).
단량체성 핵단백질 항원을 얻기 위해, 당업자는 단량체화를 유도하기 위해 NP 항원의 단백질 서열에 도입될 수 있는 상이한 점 돌연변이를 알고 있다. 특히, NP 항원은 다음의 두 점 돌연변이: E339A 및 R416A 중 하나 이상을 나타낸다.
본 발명의 한 실시태양에서, NP 항원은 인플루엔자 균주 A로부터 온다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, NP 항원은 점 돌연변이 E339A 및 R416A 둘 다를 포함하고, 따라서 단량체성이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, NP 항원은 서열 2에 나타낸 폴리펩티드 서열을 나타낸다.
DNA 백신으로부터 발현된 항원에 대한 증가된 세포 면역 반응은 종래에 IMX313을 인코딩하는 유전자에 항원의 유전자를 융합함으로써 얻어졌다(Spencer). 유리하게, 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술된 것과 같은, 항원에 융합되면 이 항원에 대해 개선된 면역 반응을 가능하게 하는, 서열 3에 나타낸 서열 ZXBBBBZ(식 중, (i) Z는 아미노산이거나 부재이고, (ii) X는 아미노산이고 (iii) B는 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다)를 갖는 하나 이상의 양으로 대전된 펩티드의 C-말단 치환을 나타내는 이 도메인의 변종. IMX313 운반 단백질의 바람직한 변종은 프로타민과 교차 반응하는 항체를 유도하지 않는다.
IMX313T 및 IMX313P로 불리는 특정 개선된 변종은 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 최근 기술되었다. 이들의 펩티드 서열은 다음과 같다:
Figure pct00001
본 발명의 다른 실시태양에서, 융합 단백질은 신호 펩티드를 포함하는 NP 항원을 포함한다. 여러 연구는 NP 단백질이 주로 핵에 위치하고, 이것이 이러한 DNA 백신 면역원성을 잠재적으로 감소시킬 수 있다는 것을 시사했다. 따라서, 신호 펩티드 첨가에 의해 NP 항원의 분비를 가능하게 하는 것이 바람직하다. 특히, 상기 신호 펩티드는 루오(Luo)에 기술된 tPA(조직 플라스미노겐 활성자(tissue plasminogen activator)) 분비 신호 펩티드이다.
본 발명의 특정 실시태양에서, NP 항원은 단량체성이고 신호 펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, NP 항원은 돌연변이 E339A 및 R416A 둘 다, 및 신호 펩티드 tPA를 포함한다. 실시예에 나타낸 대로, IMX313T 및 신호 펩티드를 포함하는 단량체성 NP 항원을 포함하는 융합 단백질은 마우스에 DNA 백신으로 주사될 때 Th2 반응보다 강력한 Th1 반응(IgG2a)을 유도한다(도 13). 면역학자들 사이에서는 Th1 반응이 Th2 반응보다 바람직하다는 인식이 있다. 그러나 이 목적을 위해 개발된 보조제 사용 없이 항원에 대해 Th1 반응을 우선적으로 향상시키는 방법은 알려지지 않았다. 아래의 실시예에서, 인플루엔자 핵단백질 항원에의 IMX313T 또는 IMX313P의 융합이 Th1 반응을 우선적으로 향상시키는 것으로 나타난다.
본 발명은 또한 코일드-코일 도메인을 포함하는 임의의 운반 단백질, 및 인플루엔자로부터 온 하나 이상의 핵단백질(NP) 항원을 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 특히, 상기 핵단백질 항원은 단량체성이다.
본 발명은 또한, 위에서 기술한 것과 같은 융합 단백질을 인코딩하는, 및 특히:
- NP 항원 및 IMX313T 또는 IMX313P를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는;
- 단량체성 NP 항원 및 IMX313T 또는 IMX313P를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는;
- 신호 펩티드를 포함하는 NP 항원 및 IMX313T 또는 IMX313P를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는;
- 신호 펩티드를 포함하는 단량체성 NP 항원 및 IMX313T 또는 IMX313P를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는, 핵산에 관한 것이다.
바람직한 실시태양으로, 상기 핵산은 인플루엔자 A로부터 온 단량체성 NP 항원을 포함하는 융합 단백질을 코딩한다. 바람직한 실시태양으로, 상기 핵산은 프로타민과 항체 교차 반응을 유도하지 않는 융합 단백질을 코딩한다. 특히, 상기 핵산은 서열 6 및 서열 7에 나타낸 서열을 나타낸다.
본 발명은 또한 위에서 나타낸 핵산, 및 숙주 세포 내의 DNA 카세트의 발현을 담보하기 위한 프로모터 및 인핸서와 같은 유전학적 요소를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한:
- 위에서 나타낸 융합 단백질 또는 핵산 또는 벡터, 및
- 세포내 TLR에 대한 핵산 리간드, 및/또는 임의의 다른 백신 보조제를 포함하는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
톨-유사 수용체( TLR )
선천성 면역계의 세포는 제한된 집단의 균계 인코딩된 수용체를 통해 병원체를 검출한다. 이들 선천성 면역 수용체는 병원체에 의해 발현된 일련의 보존된 분자 구조, PAMP(병원체 관련 분자 패턴(pathogen associated molecular patterns))를 인식한다.
이들 병원체-유래 분자는 일반적으로 한 세트의 병원체에 대해 매우 특이적인 복잡한 분자를 나타낸다. TLR은 병원체에 의한 감염 직후 면역계에 알릴 수 있는 한 세트의 면역 패턴 인식 수용체를 나타낸다. 이들은 선천성 및 적응성 면역 사이에서 중심 성분으로서의 중요한 역할을 하고 바이러스에서 기생충까지 다양한 병원체를 알아낼 수 있다. 첫번째 특성화된 톨이라고 불리는 TLR은, 지금까지 확인된 병원체 인식에 수반된 성체 초파리 및 10 인간 등가물에서 항진균 반응의 원인인 것으로 나타났다. TLR은 그들의 국소화 및 그들이 인식하는 PAMP의 종류에 기초하여 상이한 그룹으로 분류될 수 있다. TLR 1, 2, 4, 5 및 6은 주로 박테리아 생성물을 인식하는 세포 표면에 주로 발현되고, TLR 3, 7, 8 및 9는 세포내 구획에 국소화되고 주로 바이러스 생성물 및 핵산을 인식한다.
세포내 톨-유사 수용체
그밖에, 면역화 방법을 개선하기 위해서는, TLR 수용체를 통해 신호전달을 제한하는 것이 또한 매우 중요하다. 톨-유사 수용체(TLR)는 선천성 면역계에서 핵심 역할을 하는 단백질 종류이다. 일단 미생물이 생물의 물리적 장벽을 타파하면, 그들은 TLR에 의해 인식된다. 미생물로부터의 인식된 특징은 바이러스의 이중가닥 RNA, 박테리아 및 바이러스 및 특정 RNA 및 DNA 분자의 비메틸화된 CpG 위치 섬을 포함한다.
이러한 핵산은 톨-유사 수용체(이하 TLR) 종류에 대한, 및 특히 TLR3, TLR7, TLR8, TLR9 및 TLR13에 대한 리간드이므로 상당한 관심의 대상이다(Blasius 및 그의 참조문헌). 이들은 종종 "세포내 톨-유사 수용체"로 분류되지만, 적어도 TLR3은 일부 세포 표면에 또한 존재한다. TLR3은 기도, 자궁, 각막, 질, 자궁경부, 담관 및 장 상피 세포를 포함한 다양한 상피 세포에 발현되고, 이들 세포는 그들의 세포 표면 위에 TLR3을 발현하는 것으로 보인다(Akira).
이들 수용체, 및 특히 TLR3 수용체를 통한 신호전달 제한의 중요성은 용량 의존적이다. 따라서 핵산 리간드를 항원에 견고하게 결합시키는 것은, 항원이 없을 때 TLR에 결합하는 것을 방지하게 위해 필수적이다. 견고하게 결합된 세포내 TLR 리간드는 따라서 결합이 덜 견고한 제제에 비해 매우 바람직하다. 따라서, 통상의 기술자는, 다른 곳의 TLR 수용체에의 리간드 결합에 의해 매개되는 잠재적인 부정적인 효과를 감소시키는 목표와 더블어, TLR 리간드에 효율적으로 결합할 수 있어 항원이 면역 반응을 촉발하게 될 세포에 도달하기 전에 항원에서 분리되지 않는, 항원성 조성물을 찾고 있다.
본원에서, 및 특히 실시예에서, 다음의 세포내 TLR 리간드가 사용되었다:
- TLR3에 대해: 이중가닥 RNA의 유사체인, 폴리시티딜산에 혼성된 폴리이노신산의 폴리뉴클레오티드의 듀플렉스인 폴리 I:C. 사슬 길이는 각 가닥에 대해 20 뉴클레오티드였다.
- TLR7에 대해: 서열 5' GsCsCsCsGsUsCsUsGsUsUsGsUsGsUsGsAsCsUsC 3'(식 중, "s"는 포스포티오에이트 연결을 나타낸다)(서열 8)을 갖는 ssRNA40으로 불리는 올리고뉴클레오티드;
- TLR9에 대해: 서열: 5' tccatgacgttcctgacgtt 3'(서열 9)을 갖는 ODN1826으로 불리는 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 특정 측면에서, 면역원성 조성물은 다음을 포함한다:
- 위에서 나타낸 융합 단백질 또는 핵산 또는 벡터, 및
- 폴리 I:C.
본 발명은 또한 인플루엔자 질병의 예방 또는 치료를 위한 백신으로의 용도를 위한, 위에서 기술한 것과 같은 융합 단백질에 관한 것이다. 상기 인플루엔자 백신은 복수의 응용을 위해 사용될 수 있다:
- 계절성 인플루엔자의 예방;
- 유행병 상황에서의 예방;
- '전반적인' 예방, 즉 모든 종류의 인플루엔자 바이러스에 대한 백신 면역화;
- 모든 종류의 인플루엔자의 면역요법.
인플루엔자의 예방 또는 치료 방법은, 본 발명에 따른 특정 백신으로, 인체 또는 동물체에서 수행될 수 있다. 당업자는 각 특정 응용 및 특정 환자를 위해 백신 조성물을 조정하는 방법을 안다.
본 발명은 또한 인플루엔자 질병의 예방을 위한 DNA 백신으로의 용도를 위한, 위에서 기술한 것과 같은 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인플루엔자 질병의 예방을 위한 바이러스 백신으로의 용도를 위한, 위에서 기술한 것과 같은 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 또한 인플루엔자 질병의 예방을 위한 백신으로의 용도를 위한, 위에서 기술한 것과 같은 면역원성 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 항원의 서열 4 및 서열 5에 나타낸 서열을 갖는 운반 단백질 IMX313T 또는 IMX313P로의 융합을 포함하는, 인플루엔자의 핵단백질 항원에 대한 세포 면역 반응 증가 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 위에서 기술한 것과 같은 융합 단백질 또는 핵산 또는 벡터 또는 면역원성 조성물은 인플루엔자 질병의 면역요법에 사용된다.
도 1: 부모 플라스미드 pcDNA3 NP의 지도 - 실시예에서 기술한 대로 구축된 이 플라스미드 및 그의 유도체를 DNA 백신 접종을 위해 사용했다.
도 2: NP, 또는 IMX313에 융합된 NP를 인코딩하는 플라스미드를 사용한 면역화에 대한 반응으로 IFN-γ를 분비하는 총 T 세포의 비교.
도 3: NP를 인코딩하는 플라스미드 또는 IMX313에 융합된 NP를 인코딩하는 플라스미드를 사용한 면역화에 대한 반응으로 IFN-γ를 분비하는 CD8 및 CD4 T 세포의 비교.
도 4: NP 또는 IMX313에 융합된 NP를 인코딩하는 DNA 플라스미드에 의해 유도되는 재조합 NP에 대한 IgG 항체 반응의 비교.
도 5: NP 또는 IMX313에 융합된 NP를 인코딩하는 DNA 플라스미드에 의해 유도되는 재조합 NP에 대한 IgG 항체 서브클래스 반응의 비교.
도 6: NP, 단량체성 NP(NPm), IMX313에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313) 및 IMX313T에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313T)를 인코딩하는 플라스미드에 대한 총 T 세포 반응의 비교.
도 7: NP, 단량체성 NP(NPm), IMX313에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313) 및 IMX313T에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313T)를 인코딩하는 플라스미드에 대한 CD8+ 및 CD4+ T 세포 반응의 비교.
도 8: NP, 단량체성 NP(NPm), IMX313에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313) 및 IMX313T에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313T)를 인코딩하는 플라스미드에 대한, 재조합 NP를 사용하여 ELISA에 의해 측정한, IgG 항체 세포 반응의 비교.
도 9: NP, 단량체성 NP(NPm), IMX313에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313) 및 IMX313T에 융합된 단량체성 NP(NPm-IMX313T)를 인코딩하는 플라스미드에 대한, 재조합 NP를 사용하여 측정한, IgG 항체 서브클래스 반응의 비교.
도 10: 다양한 NP 융합 단백질에 대한 tPA 신호 펩티드에 의한 분비의 영향. 총 T 세포를 NP, 분비된 NP(tPA-NP), 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm), IMX313에 융합된 분비된 NP(tPA-NP-IMX313), IMX313에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313), 및 IMX313T에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313T)를 비교하여 IFNγ ELISpot에 의해 측정했다.
도 11: NP, 분비된 NP(tPA-NP), 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm), IMX313에 융합된 분비된 NP(tPA-NP-IMX313), IMX313에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313), 및 IMX313T에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313T)를 비교하는 IFNγ ELISpot에 의해 측정한, 다양한 NP 융합 단백질에 대한 CD8+ 및 CD4+ 반응에 대한 tPA 신호 펩티드에 의한 분비의 영향.
도 12: NP, 분비된 NP(tPA-NP), 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm), IMX313에 융합된 분비된 NP(tPA-NP-IMX313), IMX313에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313), 및 IMX313T에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313T)를 비교하는 ELISA에 의해 측정한, 다양한 NP 융합 단백질에 대한 IgG 반응에 대한 tPA 신호 펩티드에 의한 분비의 영향.
도 13: NP, 분비된 NP(tPA-NP), 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm), IMX313에 융합된 분비된 NP(tPA-NP-IMX313), IMX313에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313), 및 IMX313T에 융합된 분비된 단량체성 NP(tPA-NPm-IMX313T)를 비교하는 ELISA에 의해 측정한, 다양한 NP 융합 단백질에 대한 IgG 서브클래스 반응에 대한 tPA 신호 펩티드에 의한 분비의 영향.
도 14: 핵단백질의 IMX313T에의 융합은 NP의 면역원성을 수중유 보조제 아다백스(AddaVax)(인비보젠(Invivogen)) 내의 NP 제제와 동일한 정도로 증가시키고; 아다백스 및 NPm-IMX313T 융합 단백질의 사용은 시너지 효과를 나타낸다.
도 15: CD4 및 CD8 세포 분리 후 도 14에 나타낸 결과의 분석. 아다백스 및 NPm-IMX313T 단백질의 시너지 효과는 CD4 반응 및 CD8 반응 둘 다에서 나타난다.
도 16: 핵단백질에 대한 IgG 반응. 보조제 아다백스가 없을 때, 핵단백질의 IMX313T에의 융합은, NP에 비해 IgG 타이터의 현저한 변화를 보이지 않았다. 그러나 아다백스가 있을 때, 융합 단백질은 핵단백질보다 현저히 더 면역원성이다.
도 17: 아다백스가 있거나 없는 NP 또는 NPm-IMX313T를 사용한 면역화 후, 재조합 NP를 사용하여 측정한, IgG 항체 서브클래스 반응의 비교. 표 4에서 보이는 대로, 아다백스가 있거나 없는 NP는 Th1 반응을 유도했다. 그러나 아다백스가 있거나 없는 융합 단백질 NPm-IMX313T는 Th1에 대한 IgG 반응을 추가로 극성화했다.
도 18: 면역화에 사용된 재조합 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 분자량 마커(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)); 레인 2: 재조합 NP(임제넥스(Imgenex)); 레인 3: 정제된 NP; 레인 4: 정제된 NPm-IMX313T.
도 19: 재조합 NPm-IMX313P 단백질의 SDS-PAGE 분석. 레인 1: 정제된 NP; 레인 2: 정제된 NPm-IMX313T; 레인 3: 정제된 NPm-IMX313P; 레인 4: 분자량 마커(뉴 잉글랜드 바이오랩스).
도 20: IMX313P 단백질을 사용한 마우스의 면역화 후, 프로타민에 대한 또는 IMX313P에 대한 IgG 반응. 이는, 마우스가 IMX313P에 대해 IgG 항체(및 IMX313과 일부 교차 반응)를 생성하지만, 프로타민과 교차 반응하는 항체는 발견되지 않았다는 것을 나타낸다.
실시예
DNA 백신 접종을 위해, 도 1에 나타낸 부모 플라스미드 pcDNA3-NP를 아래의 실시예에서 기술한 대로 변형시켰다. 플라스미드 pIMX494 및 pIMX497은 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술된다.
실시예 1 - NP 인코딩 플라스미드로의 IMX313 삽입
올리고뉴클레오티드 프라이머 IMX1289 (5' caatgcagaggagtacgacaatggatccaagaagcaaggtgatgctgatg 3' - 서열 10) 및 IMX1290 (5' GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattactccttgctcagtccttgc 3' - 서열 11)을 사용하여 플라스미드 pIMX494로부터 IMX313 코딩 서열을 증폭시키고 가이저(Geiser)에 의해 기술된 대로 플라스미드 pcDNA3-NP로 삽입시켰다.
실시예 2 - tPA 신호 펩티드 삽입
올리고뉴클레오티드 IMX1305(5' cactgagtgacatcaaaatcatgGATGCAATGAAGAGAGGGC 3' - 서열 12) 및 IMX1306(5' cgtaagaccgtttggtgccttggctagctcttctgaatcgggcatggatttcc 3' - 서열 13)을 사용하여 벡터 pSG2-85A(Spencer)로부터 tPA 신호 펩티드를 증폭시키고 가이저에 의해 기술된 대로 다수의 플라스미드에서 NP 코딩 서열의 N-말단으로 인-프레임 삽입시켰다.
실시예 3 - 단량체성으로 만들기 위해 NP의 두 점 돌연변이 생성
올리고뉴클레오티드 프라이머 IMX1287(5' ccattctgccgcatttgCagatctaagag 3' - 서열 14) 및 IMX1288(5' CAAAAGGGAGATTTGCCTGTACTGAGAAC 3' - 서열 15)을 사용하여 NP 유전자의 내부 단편을 증폭시키고, 가이저에 의해 기술된 대로 PCR 생성물을 NP-인코딩 플라스미드로 삽입시켰다. 두 올리고뉴클레오티드 모두 NP 유전자에 불완전하게 매칭되었기 때문에, PCR 생성물의 삽입은 두 점 돌연변이를 생성했다. IMX1287 프라이머는 돌연변이 E339A(GAA에서 GCA)를 생성한 반면, IMX1288 프라이머는 NP 유전자에서 돌연변이 R416A(AGA에서 GCA)를 생성했다.
실시예 4 - IMX313T 삽입
올리고뉴클레오티드 프라이머 IMX1289(서열 10) 및 IMX051(5' GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3' - 서열 16)을 사용하여 플라스미드 pIMX497로부터 IMX313T 코딩 서열을 증폭시키고, 가이저에 의해 기술된 대로 다양한 pcDNA3-NP-유도 플라스미드로 삽입시켰다.
실시예 5 - 본 발명에 따른 핵산을 사용한 DNA 면역화
5.1. 프로토콜
다섯 마리 암컷 BALB/C 마우스 집단을, 다양한 플라스미드 DNA로, 주사당 20 ㎍의 각 플라스미드를 사용하여 14 일 간격으로 2 회 근육내로 면역화했다. 면역 반응을 28 일째에 측정하여, 다양한 변형: +/- IMX313 또는 IMX313T; +/- tPA 신호 펩티드; +/- 단량체화 돌연변이의 영향을 판단했다.
28 일째에 비장세포를 사용하여 ELISPOT에 의해 항원 특이적 T 세포 반응을 측정했다. 면역화된 마우스로부터 단리한 정제된 비장 CD4+, CD8+ 및 총 T 세포를 유로진텍(Eurogentec)에서 구입한 NP A 인플루엔자 펩티드(아미노산 366-374)와 공배양했다.
ELISPOT 분석: 편평-바닥, 96-웰 니트로셀룰로스 플레이트(밀리타이터; 밀리포어)를 IFN-γ mAb(15 ㎍/ml; 맵테크(MABTECH), 스톡홀름)로 코팅하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션했다. PBS로 세척 후, 플레이트를 10 % 소 태아 혈청으로 한 시간 동안 37 ℃에서 차단시켰다. 웰 당 2x106 세포를 15 ㎍/ml 항-인간 IFN-γ로 코팅된 IPVH-막 위에서 2 ㎍/ml의 최종 농도의 관련 펩티드(NP A 인플루엔자 펩티드)로 자극시키고 20 시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 플레이트를 PBS로 철저히 세척하여 세포를 제거하고, IFN-γ mAb(1 ㎍/ml의 비오틴, 맵테크를 각 웰에 첨가했다. 2 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고 스트렙타비딘-HRP (1 ㎍/ml; 맵테크)로 한 시간 동안 실온에서 전개시켰다. 세척 후, 기질(3-아미노-9-에틸카바졸 (시그마(Sigma)))를 첨가하고 15 분 동안 인큐베이션했다. 추가 세척 후, 붉은 점을 현미경하에서 계수했다.
체액 면역 반응을 연구하기 위해, 본 발명자들은 총 IgG에 대해 특이적인 ELISA에 의해, IgG1 및 IgG2a에 대해 별도로 항체 수준을 평가하여, Th1 및 Th2의 상대적인 비율을 평가했다. BALB/c 마우스는 IgG1 항체의 자극과 관련 있는 Th2-형 면역 반응으로 인플루엔자 백신에 통상적으로 반응한다. 그러나, 바이러스 감염으로부터 생존한 마우스의 혈청에 존재하는 주요 항체 동형은 IgG2a이고, 이는 Th1-형 면역 반응 도중 자극된다(Huber). IgG2a 항체의 자극은 인플루엔자 백신 접종의 증가된 효율과 관련되었다.
ELISA를 위해, 항원을 0.1 M 탄산/중탄산 나트륨(pH 9.6)에 5 mg/ml의 농도로 희석하고 이어서 맥시소르브(MaxiSorb) 플레이트(눈크-이뮬론(Nunc-Immulon), 덴마크)의 웰을 코팅하는 데에 사용했다. 시험 혈청의 2배 연속 희석액을 웰에 첨가하고, 세척 후, 결합된 항체를 겨자무 과산화효소에 컨쥬게이션된 항-마우스 IgG, 또는 항-마우스 IgG1 또는 항-마우스 IgG2a(시그마)로 검출했다. o-페닐렌디아민(시그마) 및 H2O2 첨가 후 490 nm에서 흡광을 측정했고; 반응은 1 M 황산으로 정지시켰다.
결과는 도 2 내지 5에 나타낸다.
5.2. 예비 실험에서, 본 발명자들은 NP 또는 IMX313에 융합된 NP를 인코딩하는 DNA 백신에 의해 유도된 NP에 대한 총 T 세포 반응을 시험했다. NP-IMX313 면역화된 마우스로부터 단리된 총 T 세포는 NP 면역화된 마우스의 그것에 비해 현저히 높은 IFNγ 반응을 나타내어 IMX313가 T 세포 반응을 증가시키는 능력을 확인했다.
도 2는 융합 단백질이 세포질에서 발현될 때도, 부모 NP 항원 유전자를 IMX313 유전자에 융합하는 것이 NP에 대한 T 세포 반응을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
5.3. ELISPOT에서 검출된 IFN-γ가 CD4 또는 CD8 T 세포에 의해 생성되었는지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 면역화된 마우스로부터 비장 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 정제했고, 이들을 인플루엔자 A NP 펩티드와 공배양했다. CD8+ T 세포로부터의 IFN-γ 생성의 현저한 증가가 NP-IMX313으로 면역화된 집단에서 검출되었다. IFN-γ를 생성하는 항원-특이적 CD8+ 세포의 퍼센티지는 CD4+ T의 상응하는 집단보다 높았다(도 3).
도 3은 NP 항원 유전자를 IMX313 유전자에 융합시키는 것이 NP 항원에 대한 CD4+ 및 CD8+ 반응 둘 다를 향상시킴을 나타낸다.
5.4. 이어서 본 발명자들은 면역화 후 및 최종 면역화 14 일 후 NP에 대한 항체 반응을 검사했고, NP-특이적 IgG Ab 반응이 혈청에서 측정되었다. NP 대조군 마우스 및 NP-IMX313이 주어진 마우스는 보통의 NP-특이적 IgG Abs를 나타냈고(도 4), 이는 NP-IMX313으로 면역화된 집단에서 더 높았다.
도 4는 NP 유전자를 IMX313 유전자에 융합시키는 것이 NP 항원에 대한 IgG 항체 반응을 향상시킴을 나타낸다.
5.5. NP-특이적 IgG1 및 IgG2a 항체(각각 Balb/C 마우스에서 Th2 및 Th1 유형 반응을 나타냄)의 존재에 대해 혈청을 또한 검사했다. NP-특이적 IgG1 및 IgG2a 항체 동형이 NP-IMX313 면역화된 마우스의 혈청에서 검출되었지만; NP가 단독으로 주어진 마우스로부터의 혈청 샘플은 단지 낮은 수준의 IgG1 및 IgG2a Ab를 나타냈다(도 5).
도 5는 NP 항원에 대해 유도된 항체의 서브클래스 분포를 나타낸다. IMX313 유전자로의 융합은 IgG1 반응보다 IgG2A 반응을 향상시켜, NP에 대한 Th2-편향된 반응을 NP-IMX313에 대한 Th1-편향된 반응으로 전환시켰다.
결과를 여기에 표로 나타낸다:
<표 1>
Figure pct00002
도 6은 NP의 단량체화(NPm)가 그의 면역원성을 약간 향상시킨다는 것(향상이 통계학적으로 의미 있지 않지만: NS); NPm 면역원성이 IMX313 유전자에의 융합에 의해 추가로 향상된다는 것; 및 마지막으로 단량체성 NP의 IMX313T 유전자로의 융합이 NP 면역원성을 추가로 향상시킨다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, NP의 단량체화는 그의 면역원성을 감소시키지 않는다.
도 7은, CD4+ 및 CD8+ 반응의 분석 결과, 도 6에서와 동일한 등급 순서가 나타난다는 것을 보여준다: NP의 단량체화는 NP의 면역원성을 약간 향상시키지만 현저히 향상시키지 않는다(NS); NP의 면역원성은 IMX313 유전자로의 융합에 의해 추가로 향상되지만, NP 면역원성의 가장 큰 개선은 단량체성 NP의 IMX313T 유전자로의 융합에 의해 얻어진다.
도 8은 도 6 및 7에서 T 세포 반응(CD4+ 및 CD8+ 둘 다)에 대해 본 것과 동일한 등급 순서가 B 세포 반응에 대해 발견된다는 것을 나타낸다. NP에 대한 총 IgG 반응은 IMX313보다 IMX313T의 경우에 더 높았다.
도 9는 단량체성 NP 항원에 의해 유도된 항체의 서브클래스 분포를 나타낸다. NP를 사용한 경우와 같이, IMX313 유전자로의 융합은 IgG1 반응보다 IgG2A 반응을 증강시켜, NP에 대한 Th2-편향된 반응(0.8)을 NP-IMX313에 대한 Th1-편향된 반응(1.51)으로 전환시켰다. Th2에서 Th1 편향으로의 이러한 반전은 IMX313보다는 IMX313T로의 융합에 의해 유지된다(1.5). 인플루엔자 백신에서의 IgG2a 항체 발현은 바이러스 제거 및 치명적인 인플루엔자 감염에 대한 증가된 방어와 상관관계가 있다. ELISA에 의해 측정한 항체 동형 모두의 증가된 유도는 백신 효율에 대해 중화 단독보다 더 나은 상관성이었다(Huber).
<표 2>
Figure pct00003
실시예 6 - NP 항원의 분비가 그의 면역원성을 향상시켰다
조직 플라스미노겐 활성자(tPA) 분비 신호 서열을 함유하는 일련의 NP DNA 백신 구축물을 제조했다: tPA-NP, tPA-NPm, tPA-NPm-IMX313, 및 tPA-NPm-IMX313T. tPA의 NP로의 융합이 면역화된 동물로부터의 체액 및 세포 면역 반응에 미치는 영향을 분석했다.
tPA 함유 구축물로 면역화된 마우스는 NP 면역화된 마우스의 그것에 비해 현저히 높은 IFNγ 반응을 보였고 IMX313T 및 단량제화 돌연변이가 T 세포 반응을 증가시키는 능력을 확인했다.
도 10는, 단량체이든 아니든 간에(tPA-NP 대 tPA-NPm), NP 항원 분비를 강제시키는 것이 그의 면역원성을 향상시키는 것을 나타낸다(NP 대 tPA-NP). 그러나, IMX313으로의 융합은 NP의 단량체성 버전의 사용이 변형되지 않은 항원을 사용하는 것보다 면역원성이었다는 것을 나타냈다(tPA-NP-IMX313 대 tPA-NPm-IMX313). 그리고 IMX313T에 의한 IMX313의 치환이 NP의 면역원성을 추가로 향상시켰다(tPA-NPm-IMX313 대 tPA-NPm-IMX313T).
도 11은 상이한 분비된 버전의 NP에 대한 CD8+ 및 CD4+ 반응을 나타낸다. 도 10에서와 동일한 등급 순서가 관찰되고, 항원 단량체화의 유용성이 IMX313이 첨가될 때 다시 한 번 확인된다. 앞의 도에서 본 것과 같이, IMX313보다 IMX313T가 사용될 때 가장 큰 면역 반응이 관찰된다.
도 12는 항원 NP에 대한 총 IgG 반응을 나타내고 T 세포 반응에 대해 도 11과 동일한 결론을 이끌어낸다: 가장 큰 반응은 IMX313T가 사용될 때 관찰되지만, 분비(NP 대 tPA-NP) 및 단량체화(tPA-NP-IMX313 대 tPA-NPm-IMX313) 또한 중요하게 기여한다.
NP 단독(NP, tPA-NP 또는 tPA-NPm과 같이)으로 면역화된 마우스는 혈청 내의 항-NP IgG 항체가 없거나 매우 낮은 수준이었다(도 12). 반면 tPA-NP-IMX313, tPA-NPm-IMX313 또는 tPA-NPm-IMX313T로 면역화된 마우스는, 높은 수준의 전신성 NP-특이적 IgG 항체 반응을 나타냈다; 다시 한번, tPA-NPm-IMX313T 면역화된 마우스가 모든 다른 집단의 면역화된 마우스에 비해 현저히 높은(p < 0.001) IgG 항체 반응을 보였다. 이는 모든 변형(단량체화 돌연변이, tPA 및 IMX313T)의 조합이 부모 서열 또는 다른 조합에 비해 항원에 대한 현저히 향상된 면역원성을 부여한다는 것을 나타낸다.
도 13은 NP에 대한 B 세포 반응의 서브클래스 분석을 나타내고, NP 단독으로의 최초 Th2 편향이 IMX313에 의해 및 IMX313T에 의해 반전된다는 것을 나타낸다. 분비는 그 자체로 효과가 미미하지만(NP 대 tPA-NP), 단량체화(tPA-NP-IMX313 대 tPA-NPm-IMX313) 및 이어서 IMX313T에 의한 IMX313 대체(tPA-NPm-IMX313 대 tPA-NPm-IMX313T) 모두 향상된 Th1(IgG2a) 대 Th2(IgG1) 반응에 기여한다.
tPA-NPm-IMX313T 자체로 거의 동등하게 Th1 및 Th2 반응을 향상시킨다는 것은 매우 중요하다. NP의 IMX313로의 융합은 Th1 및 Th2 반응이 둘 다 증가되었다는 것을 나타내고, 반응 종류의 뚜렷한 이동은 없다. 그러나 IMX313T 및 단량체화 돌연변이가 조합되면, Th1 반응(IgG2a)이 우세해지기 시작한다. 면역학자들 사이에서 Th1 반응이 Th2 반응보다 바람직하다는 것에 의견이 일치한다(도 13).
이들 결과를 여기에 표로 나타낸다:
<표 3>
Figure pct00004
실시예 7 - 재조합 NPm - IMX313T 단백질 제조
C-말단 6-His-태그를 가진 균주 A/WSN/33(Tarus 2012b)의 야생형 H1N1 NP 단백질을 발현하는 pET22-유래 플라스미드를 박테리아 균주 C43R에서 발현했다. 이 균주는 C43(DE3)를 플라스미드 pRARE2(노바젠)를 발현하는 흔치 않은 코돈으로 형질변환함으로써 만들어진다. 발현은 TB(테리픽 브로스(terrific broth)) 배지 내에서 IPTG로 유도했다. 과발현된 단백질을 먼저 정화를 위해 예(Ye)에 의해 및 타루스(Tarus)에 의해 기술된 대로 및 이온-교환 단계에서 정제했지만, 마지막 단계에서 융합 단백질은 헤파린 세파로스 위에서 친화도에 의해, 그리고 2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에서 기술한 대로 겔 여과(하이 프렙(Hi Prep) 26/60 세파크릴 S-300)에 의해 정제했다.
NPm-IMX313T 단백질을 발현하기 위해, NP를 발현하는 플라스미드를 두 단계로 변형시켰다. 먼저, 올리고뉴클레오티드 프라이머 IMX1287(5' ccattctgccgcatttgCagatctaagag 3' - 서열 14) 및 IMX1288(5' CAAAAGGGAGATTTGCCTGTACTGAGAAC 3' - 서열 15)을 사용하여, 단량체화 돌연변이를 실시예 3에서와 같이 도입했다 . 두번째 단계에서, 실시예 4에서와 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머: IMX1289(서열 10) 및 IMX051(5' GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3' - 서열 16)를 사용하여, 6-His-태그를 IMX313T 코딩 서열로 교체했다. 이어서 PCR 생성물을 가이저에 의해 기술된 대로 6-His-태그를 대신하여 삽입했다.
NPm-IMX313T 융합 단백질은 NP 단백질과 동일한 방식 및 균주에서 발현되었고, 동일한 크로마토그래피 단계를 사용하여 정제됐다.
실시예 8 - 면역화
이어서 아다백스 보조제(인비보젠)가 있는 제제가 있거나 없는 경우의 NPm-IMX313T의 면역원성을 비교하기 위해 마우스의 면역화를 수행했다. 아다백스 보조제가 있는 제제가 있거나 없는 NP 단백질을 대조물로 사용했다.
이를 위해, 4 집단의 (다섯 마리) 암컷 BALB/c 마우스를, 주사 당 20 ㎍의 각 단백질을 사용하여, 14 일 간격으로 피하로 2 회 면역화시켰다. 항원-특이적 T 세포 반응의 유도를 28 일째에 비장세포를 사용하여 ELISPOT에 의해 측정했다. 면역화된 마우스로부터 단리된 정제된 비장 CD4+, CD8+ 및 총 T 세포를 NP 단백질 또는 인플루엔자 A NP (366-374) 펩티드와 함께 공배양했다. 사전-면역 및 28 일째 항체 반응을 NP를 항원으로 하여 ELISA에 의해 측정했다.
실시예 9 - IMX313T는 분비 경로를 통한 통과에서 프로테아제에 의해 분해되지 않는다
IMX313T를 함유하는 플라스미드를 사용한 DNA 면역화에 의해 얻어진 결과는 분자가 프로테아제가 풍부한 분비 경로를 통과할 때 분자의 꼬리가 프로테아제에 의해 절단되지 않음을 강력하게 시사한다. 이 질문을 보다 직접적으로 확인하기 위해, 체 내 NPm-IMX313T를 발현하기 위해 사용되는 pcDNA3 플라스미드로 CHO K1 세포의 형질감염에 착수했다. 형질감염은 다른 곳에 기술된 대로 수행했다(Krammer).
2013년 12월 11일에 출원된 특허 출원 PCT/EP2013/076289에 기술된 대로, 18 내지 24 시간 후, 형질감염된 세포의 상청액을 원심분리에 의해 회수하고, 헤파린-세파로스 칼럼에 로딩하기 전에 여과했다.
SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에서 단백질 NPm-IMX313T를 함유하는 것으로 입증된 소형 "피크 C"가 관찰되었다.
실시예 10 - 재조합 NPm - IMX313P 단백질 제조
NPm-IMX313P 단백질을 발현하기 위해, NPM-IMX313T 단백질을 인코딩하는 플라스미드 내의 상응하는 단편 대신 IMX313P를 인코딩 하는 플라스미드로부터의 제한 단편(Pml I-Hind III)을 교환함에 의해 NPm-IMX313T를 발현하는 플라스미드를IMX313T 유전자 대신 IMX313P 유전자를 치환함으로써 변형했다. 이어서 실시예 7에서와 같이 융합 단백질을 발현하고 정제했다. 도 19는 정제된 단백질을 나타낸다; 주요 밴드는 단량체성이지만, 주요 밴드 위에(과부하된 겔 위에) 올리고머성 형태 또한 보인다.
실시예 11 - IMX313P에 대한 과다면역 항혈청 제조
다섯 마리 암컷 BALB/C 마우스 집단을, 주사 당 50 ㎍을 사용한 IMX313P 단백질로, 14일 간격으로 6 회 근육내로 면역화했다.
수정된 ELISA 방법을 사용함으로써 IgG 항체에 대해 혈청을 시험했다. 항체를 포획하기 위해 프로타민 황산염 그레이드 X(시그마), IMX313 또는 IMX313P를 사용하여 마이크로플레이트의 웰을 코팅했다. 검출 항체는 염소-항-마우스 IgG-HRP(시그마)였고, 이는 과산화수소와 반응하여 405 nm에서 흡광 측정값을 나타냈다.
IMX313P로 면역화된 마우스의 모든 혈청은 IMX313P에 대한 고 타이터의 IgG 항체, 및 IMX313과 교차 반응한 일부 항체를 나타냈지만; 프로타민과 교차 반응한 것은 없었다(도 20).
참조문헌 (알파벳 순)
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
SEQUENCE LISTING <110> IMAXIO <120> INFLUENZA NUCLEOPROTEIN VACCINES <130> PC155321 <140> PCT/EP2014/055438 <151> 2014-03-18 <150> EP13305320.7 <151> 2013-03-18 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMX313 <400> 1 Lys Lys Gln Gly Asp Ala Asp Val Cys Gly Glu Val Ala Tyr Ile Gln 1 5 10 15 Ser Val Val Ser Asp Cys His Val Pro Thr Ala Glu Leu Arg Thr Leu 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ile Gln Lys Leu Lys Val Glu 35 40 45 Leu Gln Gly Leu Ser Lys Glu 50 55 <210> 2 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> monomeric NP <400> 2 Ala Thr Lys Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp Gly 1 5 10 15 Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Lys Met Ile 20 25 30 Asp Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Ile Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys Leu 35 40 45 Ser Asp Tyr Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Leu Thr Ile Glu Arg 50 55 60 Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu Glu 65 70 75 80 His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile Tyr 85 90 95 Arg Arg Val Asp Gly Lys Trp Arg Arg Glu Leu Ile Leu Tyr Asp Lys 100 105 110 Glu Glu Ile Arg Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Asp Asp Ala 115 120 125 Thr Ala Gly Leu Thr His Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn Asp 130 135 140 Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp Pro 145 150 155 160 Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser Gly 165 170 175 Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu Leu 180 185 190 Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg Gly 195 200 205 Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn Ile 210 215 220 Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Thr Met Val Asp Gln 225 230 235 240 Val Arg Glu Ser Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Phe Glu Asp Leu Ile 245 250 255 Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His Lys 260 265 270 Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Ser Ala Val Ala Ser Gly Tyr 275 280 285 Asp Phe Glu Arg Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe Arg 290 295 300 Leu Leu Gln Asn Ser Gln Val Tyr Ser Leu Ile Arg Pro Asn Glu Asn 305 310 315 320 Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala Ala 325 330 335 Phe Ala Asp Leu Arg Val Ser Ser Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val Val 340 345 350 Pro Arg Gly Lys Leu Ser Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn Glu 355 360 365 Asn Met Glu Thr Met Glu Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Arg Tyr 370 375 380 Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Asn Gln Gln Arg Ala 385 390 395 400 Ser Ser Gly Gln Ile Ser Ile Gln Pro Thr Phe Ser Val Gln Ala Asn 405 410 415 Leu Pro Phe Asp Arg Pro Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn Thr 420 425 430 Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Leu Met Glu 435 440 445 Ser Ala Arg Pro Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe Glu 450 455 460 Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Ser Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp Met 465 470 475 480 Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala Glu Glu Tyr Asp 485 490 495 Asn <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> positively-charged peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa is any amino acid or is absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa is any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(6) <223> Xaa is arginine (R) or lysine (K) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa is any amino acid or is absent <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 4 <211> 57 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMX313T <400> 4 Lys Lys Gln Gly Asp Ala Asp Val Cys Gly Glu Val Ala Tyr Ile Gln 1 5 10 15 Ser Val Val Ser Asp Cys His Val Pro Thr Ala Glu Leu Arg Thr Leu 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ile Gln Lys Leu Lys Val Glu 35 40 45 Leu Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser 50 55 <210> 5 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IMX313P <400> 5 Lys Lys Gln Gly Asp Ala Asp Val Cys Gly Glu Val Ala Tyr Ile Gln 1 5 10 15 Ser Val Val Ser Asp Cys His Val Pro Thr Ala Glu Leu Arg Thr Leu 20 25 30 Leu Glu Ile Arg Lys Leu Phe Leu Glu Ile Gln Lys Leu Lys Val Glu 35 40 45 Gly Arg Arg Arg Arg Arg Ser 50 55 <210> 6 <211> 1767 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene encoding tPA-NPm-IMX313T <400> 6 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc agaagagcta gccaaggcac caaacggtct 120 tacgaacaga tggagactga tggagaacgc cagaatgcca ctgaaatcag agcatccgtc 180 ggaaaaatga ttggtggaat tggacgattc tacatccaaa tgtgcacaga acttaaactc 240 agtgattatg agggacggtt gatccaaaac agcttaacaa tagagagaat ggtgctctct 300 gcttttgacg aaaggagaaa taaatacctg gaagaacatc ccagtgcggg gaaagatcct 360 aagaaaactg gaggacctat atacagaaga gtaaacggaa agtggatgag agaactcatc 420 ctttatgaca aagaagaaat aaggcgaatc tggcgccaag ctaataatgg tgacgatgca 480 acggctggtc tgactcacat gatgatctgg cattccaatt tgaatgatgc aacttatcag 540 aggacaaggg ctcttgttcg caccggaatg gatcccagga tgtgctctct gatgcaaggt 600 tcaactctcc ctaggaggtc tggagccgca ggtgctgcag tcaaaggagt tggaacaatg 660 gtgatggaat tggtcaggat gatcaaacgt gggatcaatg atcggaactt ctggaggggt 720 gagaatggac gaaaaacaag aattgcttat gaaagaatgt gcaacattct caaagggaaa 780 tttcaaactg ctgcacaaaa agcaatgatg gatcaagtga gagagagccg gaacccaggg 840 aatgctgagt tcgaagatct cacttttcta gcacggtctg cactcatatt gagagggtcg 900 gttgctcaca agtcctgcct gcctgcctgt gtgtatggac ctgccgtagc cagtgggtac 960 gactttgaaa gagagggata ctctctagtc ggaatagacc ctttcagact gcttcaaaac 1020 agccaagtgt acagcctaat cagaccaaat gagaatccag cacacaagag tcaactggtg 1080 tggatggcat gccattctgc cgcatttgca gatctaagag tattgagctt catcaaaggg 1140 acgaaggtgg tcccaagagg gaagctttcc actagaggag ttcaaattgc ttccaatgaa 1200 aatatggaga ctatggaatc aagtacactt gaactgagaa gcaggtactg ggccataagg 1260 accagaagtg gaggaaacac caatcaacag agggcatctg cgggccaaat cagcatacaa 1320 cctacgttct cagtacaggc aaatctccct tttgacagaa caaccgttat ggcagcattc 1380 actgggaata cagaggggag aacatctgac atgaggaccg aaatcataag gatgatggaa 1440 agtgcaagac cagaagatgt gtctttccag gggcggggag tcttcgagct ctcggacgaa 1500 aaggcagcga gcccgatcgt gccttccttt gacatgagta atgaaggatc ttatttcttc 1560 ggagacaatg cagaggagta cgacaatgga tccaagaagc aaggtgatgc tgatgtgtgc 1620 ggagaggttg cttatattca gagcgtcgtc tccgattgcc acgtgcctac agcggaactg 1680 cgtactctgc tggaaatacg aaaactcttc ctggagattc aaaaactgaa ggtggaactg 1740 cagtctccgc gtcgccgtcg ctcctaa 1767 <210> 7 <211> 1761 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene encoding tPA-NPm-IMX313P <400> 7 atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 tcgcccagcc aggaaatcca tgcccgattc agaagagcta gccaaggcac caaacggtct 120 tacgaacaga tggagactga tggagaacgc cagaatgcca ctgaaatcag agcatccgtc 180 ggaaaaatga ttggtggaat tggacgattc tacatccaaa tgtgcacaga acttaaactc 240 agtgattatg agggacggtt gatccaaaac agcttaacaa tagagagaat ggtgctctct 300 gcttttgacg aaaggagaaa taaatacctg gaagaacatc ccagtgcggg gaaagatcct 360 aagaaaactg gaggacctat atacagaaga gtaaacggaa agtggatgag agaactcatc 420 ctttatgaca aagaagaaat aaggcgaatc tggcgccaag ctaataatgg tgacgatgca 480 acggctggtc tgactcacat gatgatctgg cattccaatt tgaatgatgc aacttatcag 540 aggacaaggg ctcttgttcg caccggaatg gatcccagga tgtgctctct gatgcaaggt 600 tcaactctcc ctaggaggtc tggagccgca ggtgctgcag tcaaaggagt tggaacaatg 660 gtgatggaat tggtcaggat gatcaaacgt gggatcaatg atcggaactt ctggaggggt 720 gagaatggac gaaaaacaag aattgcttat gaaagaatgt gcaacattct caaagggaaa 780 tttcaaactg ctgcacaaaa agcaatgatg gatcaagtga gagagagccg gaacccaggg 840 aatgctgagt tcgaagatct cacttttcta gcacggtctg cactcatatt gagagggtcg 900 gttgctcaca agtcctgcct gcctgcctgt gtgtatggac ctgccgtagc cagtgggtac 960 gactttgaaa gagagggata ctctctagtc ggaatagacc ctttcagact gcttcaaaac 1020 agccaagtgt acagcctaat cagaccaaat gagaatccag cacacaagag tcaactggtg 1080 tggatggcat gccattctgc cgcatttgca gatctaagag tattgagctt catcaaaggg 1140 acgaaggtgg tcccaagagg gaagctttcc actagaggag ttcaaattgc ttccaatgaa 1200 aatatggaga ctatggaatc aagtacactt gaactgagaa gcaggtactg ggccataagg 1260 accagaagtg gaggaaacac caatcaacag agggcatctg cgggccaaat cagcatacaa 1320 cctacgttct cagtacaggc aaatctccct tttgacagaa caaccgttat ggcagcattc 1380 actgggaata cagaggggag aacatctgac atgaggaccg aaatcataag gatgatggaa 1440 agtgcaagac cagaagatgt gtctttccag gggcggggag tcttcgagct ctcggacgaa 1500 aaggcagcga gcccgatcgt gccttccttt gacatgagta atgaaggatc ttatttcttc 1560 ggagacaatg cagaggagta cgacaatgga tccaagaagc aaggtgatgc tgatgtgtgc 1620 ggagaggttg cttatattca gagcgtcgtc tccgattgcc acgtgcctac agcggaactg 1680 cgtactctgc tggaaatacg aaaactcttc ctggagattc aaaaactgaa ggtggaaggt 1740 cgccgtcgcc gtcgctccta a 1761 <210> 8 <211> 39 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ssRNA40 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(39) <223> s is a phosphothiotate linkage <400> 8 gscscscsgs uscsusgsus usgsusgsus gsascsusc 39 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ODN1826 <400> 9 tccatgacgt tcctgacgtt 20 <210> 10 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1289 <400> 10 caatgcagag gagtacgaca atggatccaa gaagcaaggt gatgctgatg 50 <210> 11 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1290 <400> 11 gtagaaacaa gggtattttt ctttattact ccttgctcag tccttgc 47 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1305 <400> 12 cactgagtga catcaaaatc atggatgcaa tgaagagagg gc 42 <210> 13 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1306 <400> 13 cgtaagaccg tttggtgcct tggctagctc ttctgaatcg ggcatggatt tcc 53 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1287 <400> 14 ccattctgcc gcatttgcag atctaagag 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX1288 <400> 15 caaaagggag atttgcctgt actgagaac 29 <210> 16 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide IMX051 <400> 16 gtagaaacaa gggtattttt ctttattagg agcgacggcg acgc 44

Claims (20)

  1. 핵단백질(NP) 항원의 하나 이상의 변종 및 닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종을 포함하는 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 하나 이상의 핵단백질 항원이 인플루엔자 균주 A, B 또는 C로부터 온 것인, 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 핵단백질 항원이 단량체성 항원인, 융합 단백질.
  4. 제3항에 있어서, 단량체성 핵단백질 항원이 인플루엔자 균주 A로부터 온 것이고, 다음의 두 점 돌연변이: E339A 및 R416A 중 하나 이상을 나타내는, 융합 단백질.
  5. 제4항에 있어서, 단량체성 핵단백질 항원이 서열 2의 서열에 의해 인코딩되는, 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종이 IMX313인, 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, IMX313이 서열 1의 서열을 나타내는, 융합 단백질.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종이 서열 ZXBBBBZ(식 중, (i) Z는 아미노산이거나 부재이고, (ii) X는 아미노산이고 (iii) B는 아르기닌(R) 또는 리신(K)이다)를 갖는 하나 이상의 양으로 대전된 펩티드의 C-말단 치환을 포함하는 IMX313 운반 단백질의 변종인, 융합 단백질.
  9. 제8항에 있어서, IMX313 운반 단백질의 변종이 서열 4 또는 서열 5의 서열을 나타내는, 융합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, NP 항원이 신호 펩티드를 포함하는, 융합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  12. 제11항에 있어서, 닭 C4bp 올리고머화 도메인의 변종이 서열 4 또는 서열 5의 서열을 갖는 융합 단백질을 인코딩하는, 핵산.
  13. 제12항에 있어서, 서열 6 또는 서열 7의 서열을 나타내는, 핵산.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 포함하는 벡터.
  15. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 융합 단백질 또는 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 또는 제14항에 기재된 벡터, 및
    - 세포내 톨-유사 수용체(TLR)에 대한 핵산 리간드를 포함하는, 면역원성 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 세포내 TLR에 대한 핵산 리간드가 폴리 I:C인, 면역원성 조성물.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 백신 보조제를 추가로 포함하는, 면역원성 조성물.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 인플루엔자 질병의 예방 및 치료를 위한 백신 또는 면역요법으로의 용도를 위한, 면역원성 조성물.
  19. 서열 2에 나타낸 서열을 갖는 핵단백질 항원을 서열 4 또는 서열 5에 나타낸 서열을 갖는 운반 단백질에 융합하고 인체 또는 동물체에 투여함으로써, 인플루엔자의 핵단백질 항원에 대한 세포 면역 반응을 증가시키는 방법.
  20. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 면역원성 조성물을 인체 또는 동물체에 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 인간 또는 동물의 인플루엔자 질병의 예방 또는 치료 방법.
KR1020157029403A 2013-03-18 2014-03-18 인플루엔자 핵단백질 백신 KR102379951B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP13305320.7 2013-03-18
EP13305320 2013-03-18
PCT/EP2014/055438 WO2014147087A1 (en) 2013-03-18 2014-03-18 Influenza nucleoprotein vaccines

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150131292A true KR20150131292A (ko) 2015-11-24
KR102379951B1 KR102379951B1 (ko) 2022-03-31

Family

ID=48044708

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157029403A KR102379951B1 (ko) 2013-03-18 2014-03-18 인플루엔자 핵단백질 백신

Country Status (11)

Country Link
US (2) US9243047B2 (ko)
EP (1) EP2976357B1 (ko)
JP (1) JP2016520534A (ko)
KR (1) KR102379951B1 (ko)
CN (2) CN105143251B (ko)
AU (1) AU2014234363B2 (ko)
BR (1) BR112015023738B8 (ko)
CA (1) CA2901888C (ko)
MX (1) MX363149B (ko)
RU (1) RU2662667C2 (ko)
WO (1) WO2014147087A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2677799C2 (ru) * 2012-12-11 2019-01-21 Озивакс Сас Модифицированные суперспиральные белки с улучшенными свойствами
CA3230305A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Osivax Belgique Immunogenic compositions and their use
WO2023117742A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Osivax Vaccine compositions and their use
WO2023180394A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Osivax Mrna vaccine compositions and their use
CN115779079A (zh) * 2022-10-01 2023-03-14 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种可增强与佐剂协同免疫效力的电荷调控型抗原蛋白
CN117659138A (zh) * 2023-12-25 2024-03-08 华中农业大学 一种流感病毒np蛋白突变体及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007062819A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Imaxio Multimeric complexes of antigens and an adjuvant
WO2011045612A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Isis Innovation Limited Mycobacterial vaccines

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL108915A0 (en) * 1993-03-18 1994-06-24 Merck & Co Inc Polynucleotide vaccine against influenza virus
AU9222598A (en) * 1997-09-04 1999-03-22 Stanford University Reversible immobilization of arginine-tagged moieties on a silicate surface
WO2004016283A2 (en) * 2002-08-14 2004-02-26 Avidis Sa Heteropolymeric compound comprising a scaffold, an adjuvant and an antigen, and its use
JP2007528210A (ja) * 2003-08-12 2007-10-11 アヴィディス エスアー Ｃ４ｂｐコアタンパク質及び単量体抗原を含む生成物及びその使用
EP2060586A1 (en) * 2007-11-14 2009-05-20 PharmaSurgics in Sweden AB New synthetic arginine substituted peptides and their use
RU2677799C2 (ru) * 2012-12-11 2019-01-21 Озивакс Сас Модифицированные суперспиральные белки с улучшенными свойствами

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007062819A2 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Imaxio Multimeric complexes of antigens and an adjuvant
WO2011045612A1 (en) * 2009-10-16 2011-04-21 Isis Innovation Limited Mycobacterial vaccines

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Q. Ye 등, Nature, Vol.444, p.1078-1082 (2006)* *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2662667C2 (ru) 2018-07-26
CN105143251B (zh) 2021-05-11
US9243047B2 (en) 2016-01-26
JP2016520534A (ja) 2016-07-14
MX363149B (es) 2019-03-11
AU2014234363B2 (en) 2018-02-15
BR112015023738B8 (pt) 2023-02-14
US9963490B2 (en) 2018-05-08
WO2014147087A1 (en) 2014-09-25
CN105143251A (zh) 2015-12-09
CA2901888A1 (en) 2014-09-25
RU2015140603A (ru) 2017-04-21
CN113307881A (zh) 2021-08-27
BR112015023738A2 (pt) 2017-11-21
KR102379951B1 (ko) 2022-03-31
AU2014234363A1 (en) 2015-09-03
EP2976357A1 (en) 2016-01-27
US20160215032A1 (en) 2016-07-28
EP2976357B1 (en) 2018-10-17
US20150098958A1 (en) 2015-04-09
MX2015013304A (es) 2015-12-15
CA2901888C (en) 2023-06-20
BR112015023738B1 (pt) 2023-01-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3166963B1 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
KR101983989B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
CA2952351C (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
KR102379951B1 (ko) 인플루엔자 핵단백질 백신
RU2677799C2 (ru) Модифицированные суперспиральные белки с улучшенными свойствами
US20110044982A1 (en) Multifunctional linker protein containing an antibody against hemagglutinin, a conserved influenza antigen and an immunostimulating carrier binding domain
JP7009625B2 (ja) Ｈ３ｎ２亜型インフルエンザウイルスのヘマグルチニンタンパク質の突然変異体及びその使用
JP5735121B2 (ja) インフルエンザウィルスの組換えヘマグルチニン蛋白質及びそれを含むワクチン
Wang et al. Influenza Inactive Virus Vaccine with the Fusion Peptide (rTα1-BP5) Enhances Protection Against Influenza Through Humoral and Cell-Mediated Immunity
JP2023525050A (ja) キメラインフルエンザワクチン
JP2020162607A (ja) インフルエンザウイルスワクチンおよびその使用

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right