CN112336852A - 全细胞疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫化学和细胞生物学的交叉技术领域,提供了一种全细胞疫苗及其制备方法与应用。其中,所述全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子,所述全细胞疫苗通过利用偶联链分子将TLR7小分子激动剂分子与肿瘤细胞偶联得到的全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗可有效增强在预防肿瘤发生的免疫治疗中的应用效果以及实用性,提高了肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
Description
技术领域
本申请属于免疫化学和细胞生物学的交叉技术领域,尤其涉及一种全细胞疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下,局部组织细胞增生所形成的新生物(neogrowth),因为这种新生物多呈占位性块状突起,也称赘生物。研究发现,肿瘤细胞会出现不同于正常细胞的代谢变化,同时肿瘤细胞自身可通过糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)之间的转换来适应代谢环境的改变。由于肿瘤细胞所具有的无限增殖、可转化和易转移三大特点,使得肿瘤的治疗一直是困扰人类健康的重大问题。
肿瘤的治疗方法很多,主要包括手术、放化疗、靶向药物以及免疫治疗等多种治疗手段,但是基于患者的具体状态以及肿瘤的分期,越来越多的治疗方法得到深入研究。其中,在肿瘤免疫治疗的技术领域中,主要集中在释放和激活免疫细胞的肿瘤靶向作用(如PD-1/PD-L1系统)和抗肿瘤抗体;以及肿瘤的预防和治疗性疫苗。
然而,这种免疫治疗方法目前研究开发的肿瘤疫苗大都以个别肿瘤相关抗原为主。现代测序技术大大推进了个体化新抗原疫苗的研究,但是仍然不能全面覆盖个体化的肿瘤细胞全抗原,而且由于缺乏免疫的识别机制,其临床应用的有效性非常有限,无法广泛进行使用。
发明内容
本申请的目的在于提供一种全细胞疫苗及其制备方法与应用,旨在解决现有技术肿瘤免疫治疗中,全细胞疫苗抗原不足且无法进行特异性识别的问题。
为实现上述申请目的,本申请采用的技术方案如下:
第一方面,本申请提供一种全细胞疫苗,所述全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子。
第二方面,本申请提供一种全细胞疫苗的制备方法,包括如下步骤:
根据所述的全细胞疫苗,提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子;
采用活化酯法将所述TLR7小分子激动剂分子和所述偶联链分子进行酯化得到TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或采用带NCS功能基的TLR7小分子激动剂;将所述肿瘤细胞进行消化处理得到肿瘤单细胞;
将所述TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或所述带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和所述肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞;
将所述偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理,得到所述全细胞疫苗。
第三方面,本申请提供一种全细胞疫苗的应用,其特征在于,所述全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用,其中,所述全细胞疫苗所述的全细胞疫苗或由所述的全细胞疫苗的制备方法制备得到的。
本申请第一方面提供的一种全细胞疫苗,所述全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子,由于TLR7在免疫细胞--抗原递呈细胞DC上高表达,内吞全细胞作为抗原,包括识别所有表面抗原和全部结构,因此通过利用偶联链分子将TLR7小分子激动剂分子与肿瘤细胞偶联得到的全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗可有效增强在预防肿瘤发生的免疫治疗中的应用效果以及实用性,提高了肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
本申请第二方面提供的全细胞疫苗的制备方法,该制备方法采用活化酯法或异硫氰基法将TLR7小分子激动剂分子与肿瘤细胞进行混合处理,并进行后处理即可得到全细胞疫苗,制备方法简单方便,不需要使用大型仪器设备,方便快捷且效率较高。
本申请第三方面提供的全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用,该全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗应用在抗肿瘤药物中,能够提高抗肿瘤药物的应用效果及实用性,进一步扩大肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例1提供的全细胞疫苗的图示。
图2是本申请实施例1提供的TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子活化酯进行ESI-MS分析图。
图3是本申请实施例1提供的偶联后的肿瘤细胞的流式荧光分析图。
图4是本申请实施例1提供的偶联后的肿瘤细胞的共聚焦荧光分析图。
图5是本申请实施例1提供的偶联后的肿瘤细胞的偶联度计算的标准曲线图。
图6是本申请实施例1提供的全细胞疫苗预防性实验的肿瘤抑制效果分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白,以下结合实施例,对本申请进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请,并不用于限定本申请。
本申请中,术语“和/或”,描述关联对象的关联关系,表示可以存在三种关系,例如,A和/或B,可以表示:单独存在A,同时存在A和B,单独存在B的情况。其中A,B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中,“至少一个”是指一个或者多个,“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达,是指的这些项中的任意组合,包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如,“a,b,或c中的至少一项(个)”,或,“a,b,和c中的至少一项(个)”,均可以表示:a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c,其中a,b,c分别可以是单个,也可以是多个。
应理解,在本申请的各种实施例中,上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后,部分或全部步骤可以并行执行或先后执行,各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定,而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的,而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式,除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量,也可以表示各组分间重量的比例关系,因此,只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地,本申请实施例说明书中所述的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的,用来将目的如物质彼此区分开,而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如,在不脱离本申请实施例范围的情况下,第一XX也可以被称为第二XX,类似地,第二XX也可以被称为第一XX。由此,限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种全细胞疫苗,全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子。
本申请第一方面提供的一种全细胞疫苗,全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子,由于TLR7在免疫细胞--抗原递呈细胞DC上高表达,内吞全细胞作为抗原,包括识别所有表面抗原和全部结构,因此通过利用偶联链分子将TLR7小分子激动剂分子与肿瘤细胞偶联得到的全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗可有效增强在预防肿瘤发生的免疫治疗中的应用效果以及实用性,提高了肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
优选的,全细胞疫苗采用偶联链分子连接肿瘤细胞及TLR7小分子激动剂分子,结构通式如下所示:
其中,n代表偶联度,选自1×102~1×107。控制TLR7小分子激动剂-偶联链分子的偶联度,能够保证制备得到的全细胞疫苗在应用过程中特异性强,且完整识别肿瘤细胞的表面全部抗原,提高作用效果。在本发明具体实施例中,n为3×105,控制偶联度为3×105,可更好地保证得到的全细胞疫苗的识别效果,更有利于提高疫苗在肿瘤免疫治疗中的应用。
其中,由于TLR7在免疫细胞--抗原递呈细胞DC上高表达,内吞全细胞作为抗原,包括识别所有表面抗原和全部结构,因此,在全细胞疫苗中,TLR7小分子激动剂分子的选择尤其重要。
优选的,TLR7小分子激动剂分子的结构通式如下所示:
其中,R1选自取代的芳香环基功能基团、芳香六元环或五元环中的至少一种;R2选自丁氧基、取代的丁氧基、丁胺基、取代的丁胺基、丁硫基基团中的至少一种。
进一步优选的,TLR7小分子激动剂分子的结构式选自以下结构式的任意一种,结构式如下:
选择以上结构式的任意一种TLR7小分子激动剂分子进行全细胞疫苗的制备,可保证得到的疫苗能够识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,使得到的疫苗可有效增强在肿瘤免疫治疗中的应用效果以及实用性,提高了肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
优选的,偶联链分子选自C1~C20的直链烷基链分子、C1~C20的支链烷基链分子、含有氨基的可溶性C1~C20的直链烷基链分子、含有氨基的可溶性C1~C20的支链烷基链分子中的至少一种。提供的偶联链分子为能够与肿瘤细胞表面且与TLR7小分子激动剂分子同时偶联作用的,通过偶联链的作用,使TLR7小分子激动剂分子设置于肿瘤细胞表面,使制备得到的疫苗能够识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型。
进一步优选的,偶联链分子包括但不限于聚乙二醇、戊二醛、硅烷偶联剂KH-550、硅烷偶联剂KH-540中的至少一种。
优选的,肿瘤细胞选自任意一种肿瘤细胞。
本申请实施例第二方面提供了一种全细胞疫苗的制备方法,包括如下步骤:
S01.根据的全细胞疫苗,提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子;
S02.采用活化酯法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化得到TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或采用带NCS功能基的TLR7小分子激动剂;将肿瘤细胞进行消化处理得到肿瘤单细胞;
S03.将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞;
S04.将偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理,得到全细胞疫苗。
本申请第二方面提供的全细胞疫苗的制备方法,该制备方法采用活化酯法或异硫氰基法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化反应,再与肿瘤单细胞进行混合处理,并进行后处理即可得到全细胞疫苗,制备方法简单方便,不需要使用大型仪器设备,方便快捷且效率较高。
在步骤S01中,根据的全细胞疫苗,提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子;其中,肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子的选择均在上文已进行论述,为了节约篇幅,此处不再进行赘述。
在步骤S02中,采用活化酯法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化得到TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或采用带NCS功能基的TLR7小分子激动剂。优选的,根据TLR7小分子激动剂分子具体的化学结构,选择具体的方法进行酯化反应。
在一些实施例中,当TLR7小分子激动剂分子以酯基为功能基,则采用活化酯法进行酯化反应,得到TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子。
在一些实施例中,当TLR7小分子激动剂分子以异硫氰基为功能基,则得到带NCS功能基的TLR7小分子激动剂。
进一步的,将肿瘤细胞进行消化处理得到肿瘤单细胞。优选的,采用胰蛋白酶进行消化处理,利用胰蛋白酶在特定位置上降解蛋白,使细胞间结合处蛋白降解形成肿瘤单细胞,得到的肿瘤单细胞有利于进行后续反应。
优选的,肿瘤单细胞的细胞浓度为3×107~3.5×107/mL,控制肿瘤单细胞的细胞浓度,保证TLR7小分子激动剂-偶联链分子能够有效与肿瘤单细胞进行偶联,得到偶联度较佳的全细胞疫苗。在本发明具体实施例中,肿瘤单细胞的细胞浓度为3×107/mL。
在步骤S03中,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞。
优选的,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞进行混合处理的步骤中,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞于25~28℃、1400~1500rpm的条件下振荡反应1~1.5小时。
进一步优选的,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞进行混合处理的步骤中,控制TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂的溶液终浓度为50~60μM,肿瘤单细胞的细胞浓度为3×107~3.5×107/mL。通过协同控制反应物的浓度、反应过程的温度、反应的转速以及反应时间,能够保证TLR7小分子激动剂-偶联链分子与肿瘤单细胞牢固偶联。若反应过程中震荡转速过高,会导致反应液产生影响偶联效果。若反应时间过短,则会导致偶联效果较差,偶联度较低,不利于疫苗的应用。
在本发明具体实施例中,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞进行混合处理的步骤中,将TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和肿瘤单细胞于25℃、1400rpm的条件下振荡反应1小时。
在步骤S04中,将偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理,得到全细胞疫苗。优选的,将偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理的步骤中,将偶联后的肿瘤单细胞采用照射强度为6000~6500μW/cm2的254nm紫外线辐照灭活45~50min。在本发明具体实施例中,将偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理的步骤中,将偶联后的肿瘤单细胞采用照射强度为6000μW/cm2的254nm紫外线辐照灭活45min。
优选的,全细胞疫苗中的细胞浓度为1×107~1.5×107/mL。控制制备得到的全细胞疫苗中的细胞浓度,确保细胞浓度处于合适的浓度,保证有利于进行疫苗的使用。在本发明优选实施例中,全细胞疫苗中的细胞浓度为1×107/mL。
本申请第三方面提供了一种全细胞疫苗的应用,全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用,其中,全细胞疫苗为的全细胞疫苗或由的全细胞疫苗的制备方法制备得到的。
本申请第三方面提供的全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用,该全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗应用在抗肿瘤药物中,能够提高抗肿瘤药物的应用效果及实用性,进一步扩大肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
在一些实施例中,采用全细胞疫苗单独在制备抗肿瘤药物中进行应用。在另一些实施例中,采用全细胞疫苗负载树突状细胞(DC)的免疫细胞回输治疗进行应用。在又一些实施例中,采用全细胞疫苗与铝佐剂、乳化佐剂、纳米佐剂或与药物载体或其他药物活性成分组合,制成各种药学上可接受的制剂在制备抗肿瘤药物中进行应用。进一步优选的,铝佐剂包括但不限于Al(OH)3或铝盐佐剂,乳化佐剂包括但不限于角鲨烯佐剂。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
一种全细胞疫苗及其制备方法
制备方法包括如下步骤:
(1)提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子;
(2)采用活化酯法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化反应,得到TLR7小分子激动剂-偶联链分子;
具体为:称取0.97mgTLR7小分子激动剂化合物5、0.25mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.38mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDCI)溶于166μL二甲基亚砜(DMSO)中,室温振荡反应,反应式如下所示,每30min LC-MS监测一次,至原料反应完全,得到浓度为10mM的TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子的活性酯溶液,
(3)提供小鼠乳腺癌4T1细胞为肿瘤细胞,用用胰蛋白酶消化4T1细胞,PBS清洗2次后计数,得到4T1肿瘤单细胞;
(4)将TLR7小分子激动剂-偶联链分子的活性酯溶液和肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞;
具体为:在细胞浓度为3×107/ml的4T1肿瘤单细胞中加入TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子的活性酯溶液溶液至终浓度为50μM,于25℃、1400rpm条件下振荡反应1h后离心,弃除上清,用PBS溶液清洗2次,反应过程如下所示,得偶联后的肿瘤细胞,
(5)收集偶联后的肿瘤细胞,用照射强度为6000μW/cm2的254nm紫外线辐照灭活45min,再次收集细胞,使用细胞计数板计数,并调整细胞浓度为1×107细胞/mL,得到全细胞疫苗,于4℃保存待用。
实施例2
一种全细胞疫苗及其制备方法
(1)提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子2;
(2)采用异硫氰基法将TLR7小分子激动剂分子2和肿瘤细胞直接进行硫脲化反应;
(3)提供小鼠乳腺癌4T1细胞为肿瘤细胞,用用胰蛋白酶消化4T1细胞,PBS清洗2次后计数,得到4T1肿瘤单细胞;
(4)将TLR7小分子激动剂分子2和肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞;
具体为:在细胞浓度为3×107/ml的4T1肿瘤单细胞中加入TLR7小分子激动剂化合物2的DMSO溶液(10mM)至终浓度为50μM,加入等摩尔的三乙胺。于25℃、1400rpm条件下振荡反应1h后离心,弃除上清,用PBS溶液清洗2次,反应过程如下所示,得偶联后的肿瘤细胞;
(5)收集偶联后的肿瘤细胞,用照射强度为6000μW/cm2的254nm紫外线辐照灭活45min,再次收集细胞,使用细胞计数板计数,并调整细胞浓度为1×107细胞/mL,得到全细胞疫苗,于4℃保存待用。
性质测试:
以实施例1制备得到的全细胞疫苗为例,实施例1制备得到的全细胞疫苗的图示如附图1所示,并将其进行如下性质测试及分析
(1)对采用活化酯法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化反应,得到TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析。
(2)将实施例1制备得到的偶联后的肿瘤细胞进行偶联结果定性表征分析
具体包括如下分析流程:
采用荧光染料Azide-Fluor 488作为标记体系,如下式所示:
①荧光标记
Azide-Fluor488,叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(TBTA)分别用DMSO溶解配置成10mM的贮备液,其工作浓度分别为50μM和100μM;三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和硫酸铜分别用纯净水溶解配置成50mM的贮备液,其工作浓度均为1mM。按顺序混合好Azide-Fluor488,TCEP,TBTA和硫酸铜溶液后,加入偶联后的肿瘤细胞中,25℃,1400rpm下振荡反应1h。结束后离心,弃除上清,用PBS溶液清洗2次,得到的细胞继续进行后续的表征。
②流式荧光分析
采用流式细胞仪对上述偶联细胞进行Fluor488荧光检测,取与化合物5活性酯反应后和未反应的细胞,分别按照步骤①进行荧光标记,PBS清洗重悬后分别加入流式管中上样,再进行分析。
③共聚焦荧光分析
进一步采用共聚焦显微镜对上述偶联细胞进行Fluor 488荧光分析,具体实施步骤如下:在24孔板中放入细胞培养盖玻片,每孔加入1×105个4T1细胞,37℃,5%CO2培养箱中培养过夜;偶联组按照实施例2浓度加入化合物5活性酯反应液,37℃孵育30min后洗涤;按照步骤1进行荧光标记,最后加入5μg/mL细胞核染料DAPI以及5μM DiI细胞膜染料分别染色10min,洗涤后封片于共聚焦显微镜下拍摄并分析。
(3)将实施例1制备得到的偶联后的肿瘤细胞进行偶联度测算
采用生物素(Biotin)级联放大法进行偶联度测算,其反应式如下:
具体方法为:
①Biotin标记
Biotin-PEG3-Azide,叔丁基2,2,2-三氯乙酰亚胺酯(TBTA)分别用DMSO溶解配置成10mM的贮备液,其工作浓度分别为50μM和100μM;三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)和硫酸铜分别用纯净水溶解配置成50mM的贮备液,其工作浓度均为1mM。按顺序混合好Biotin-PEG3-Azide,TCEP,TBTA和硫酸铜溶液后,加入偶联后的肿瘤细胞中,25℃,1400rpm下振荡反应1h。结束后离心,弃除上清,用PBS溶液清洗2次,精确计数,得到的细胞继续进行后续的测试。
②Biotin定量试剂盒定量
采用商用竞争法的Biotin定量试剂盒进行定量。用生物素包被于酶标板上,实验时样品或标准品中的生物素与包被的生物素竞争辣根过氧化物酶标记的亲和素(Avidin-HRP)上的结合位点,生物素与亲和素特异性结合而形成复合物,游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB),TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处检测OD值,生物素浓度与OD450值之间呈反比,通过绘制标准曲线计算出样品中生物素的浓度。具体实施步骤如下:
a.用50μL样品稀释液重悬,加入预包被板(空白孔/标准孔/待测样品孔);
b.每孔加入配好的Avidin-HRP工作液50μL,轻轻晃动均匀,覆膜,37℃孵育30min;
c.弃去孔内液体,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2min,约350μL/孔,甩干并拍干;
d.每孔加底物溶液(TMB)90μL,覆膜,37℃避光孵育15min;
e.每孔加终止液50μL,用酶标仪在450nm波长测量每孔OD值。
(4)将实施例1制备得到的全细胞疫苗进行应用,分析预防性实验的肿瘤抑制效果
具体步骤为:以4T1小鼠乳腺癌模型为例:选用6~8周龄,16~18g的Balb/c雌鼠,分为3组,每组8只小鼠。具体分组为:1)空白组:100μL的PBS(Veh);2)实验组(Vac):按照实施例5制备的肿瘤疫苗,1×106细胞/100μL。
预防组动物模型:选用Balb/c小鼠,随机分成上述2组,于实验的第0天,第14天和第28天,在小鼠的腋下进行皮下免疫,于第35天,予小鼠乳房垫原位接种5×105 4T1细胞。待接种后小鼠肿瘤长出后,每隔3天测量一次肿瘤大小,肿瘤体积的计算公式为:长径×短径2×0.52。
进一步分析小鼠的肿瘤生长体积。
结果分析:
(1)对采用活化酯法将TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子进行酯化反应,得到TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链活化酯分子进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)分析,对得到的TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子进行ESI-MS分析,结果如图2所示,由图2可知,TLR7小分子激动剂化合物5-偶联链分子的ESI-MS为:m/z=679.3[M+H]+。
(2)将实施例1制备得到的偶联后的肿瘤细胞进行偶联结果定性表征分析,分析结果如下:
①采用流式荧光分析结果如图3所示,从图3中可以看出,偶联化合物5的细胞Fluor 488荧光强度远高于未偶联细胞,表明肿瘤细胞已成功偶联化合物5。
②采用共聚焦荧光分析结果如图4所示,从图4中可以看出,偶联化合物5的细胞上能观察到明显的Fluor 488产生的绿色荧光(图4-C2),且定位于细胞膜上,而未偶联细胞(图4-C1)并未观察到此现象,表明偶联化合物5已成功偶联在肿瘤细胞膜上。
(3)将实施例1制备得到的偶联后的肿瘤细胞进行偶联度测算,以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线,如图5所示。根据曲线公式可测算出测试样品中Biotin浓度,并通过以下公式计算偶联度:
经测算,小鼠乳腺癌4T1细胞偶联化合物5后,偶联度约为每1个4T1细胞上成功偶联3×105个化合物5分子。
(4)将实施例1制备得到的全细胞疫苗进行应用,分析预防性实验的肿瘤抑制效果,如图6所示,从图6可以看出,实验组小鼠的肿瘤生长体积较空白组明显缓慢,具有显著的统计学差异(p<0.001;ANOVA)。表明偶联化合物5并辐照后的肿瘤细胞具有预防性的抗肿瘤作用,对原位移植实体瘤的生长有抑制作用。
综上,本申请提供的一种全细胞疫苗,全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子,由于TLR7在免疫细胞--抗原递呈细胞DC上高表达,内吞全细胞作为抗原,包括识别所有表面抗原和全部结构,因此通过利用偶联链分子将TLR7小分子激动剂分子与肿瘤细胞偶联得到的全细胞疫苗既可识别肿瘤细胞的表面全部抗原,又可特异性识别全肿瘤细胞的三维空间构型,该疫苗可有效增强在预防肿瘤发生的免疫治疗中的应用效果以及实用性,提高了肿瘤免疫治疗方法的广泛应用。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已,并不用以限制本申请,凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种全细胞疫苗,其特征在于,所述全细胞疫苗包括:肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子以及偶联链分子。
5.根据权利要求1所述的全细胞疫苗,其特征在于,所述偶联链分子选自C1~C20的直链烷基链分子、C1~C20的支链烷基链分子、含有氨基的可溶性C1~C20的直链烷基链分子、含有氨基的可溶性C1~C20的支链烷基链分子中的至少一种。
6.一种全细胞疫苗的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
根据权利要求1~5任一所述的全细胞疫苗,提供肿瘤细胞、TLR7小分子激动剂分子和偶联链分子;
采用活化酯法将所述TLR7小分子激动剂分子和所述偶联链分子进行酯化得到TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或采用带NCS功能基的TLR7小分子激动剂;将所述肿瘤细胞进行消化处理得到肿瘤单细胞;
将所述TLR7小分子激动剂-偶联链活化酯分子或所述带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和所述肿瘤单细胞进行混合处理,得到偶联后的肿瘤单细胞;
将所述偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理,得到所述全细胞疫苗。
7.根据权利要求6所述的全细胞疫苗的制备方法,其特征在于,所述肿瘤单细胞的细胞浓度为3×107~3.5×107/mL;和/或,所述全细胞疫苗中的细胞浓度为1×107~1.5×107/mL。
8.根据权利要求6所述的全细胞疫苗的制备方法,其特征在于,将所述TLR7小分子激动剂-偶联链分子活化酯或所述带NCS功能基的TLR7小分子激动剂和所述肿瘤单细胞进行混合处理的步骤中,将所述TLR7小分子激动剂-偶联链分子和所述肿瘤单细胞于25~28℃、1400~1500rpm的条件下振荡反应1~1.5小时;和/或,将所述偶联后的肿瘤单细胞进行灭活处理的步骤中,将所述偶联后的肿瘤单细胞采用照射强度为6000~6500μW/cm2的254nm紫外线辐照灭活45~50min。
9.一种全细胞疫苗的应用,其特征在于,所述全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用,其中,所述全细胞疫苗为权利要求1~5任一所述的全细胞疫苗或由权利要求6~8任一所述的全细胞疫苗的制备方法制备得到的。
10.根据权利要求9所述的全细胞疫苗的应用,其特征在于,所述全细胞疫苗在制备抗肿瘤药物中的应用包括:采用所述全细胞疫苗单独应用;和/或,
采用所述全细胞疫苗负载树突状细胞的免疫细胞回输治疗的应用;和/或,
采用所述全细胞疫苗与铝佐剂、乳化佐剂、纳米佐剂或与药物载体或其他药物活性成分组合,制成各种药学上可接受的制剂进行应用。
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