KR100303641B1 - 알로에바아바덴시스로부터유리된신나모일-c-글리코시드크로모네 - Google Patents

Abstract

15중량% 이상의 8-C-β-D-[2-O-(E)-신나모일]글리코피라노실-2-[(S)-2-히드록시]프로필-7-메톡시-5-메틸크로모네 화합물을 포함하는 물질의 조성물. 알로에 바아바덴시스 식물의 잎에서 극소량으로 발견되는 이 화합물은, 소정의 양으로 농축되면, 항염작용을 나타낸다.

Description

[발명의 명칭]

알로에 바아바덴시스로부터 유리된 신나모일-C-글리코시드 크로모네

[도면의 간단한 설명]

제1도는 실험실용 생쥐로 실험할 때, 기타 알로에 바아바덴시스 추출물 및 히드로코오티조운(hydrocortisone)과 비교한 540 화합물의 항염 활성을 나타낸다. 데이터 수치는 3마리 생쥐에 대한 평균 ±sd를 나타낸다. "파두유 조절" 그룹에 대하여는 자극제만이 사용되었다. "대비-무처리" 그룹 데이터는 미처리 귀로부터 얻었다. 귀 두께는 오디테스트 캘리퍼(Oditest caliper)의 수단에 의하여 측정되었다.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경]

본 발명은 알로에 바아바덴시스(Aloe barbadensis) 식물로부터 유리된 생물학적 활성을 지닌 화합물에 관한 것이다. 조직적으로 8-C-β-D-[2-O-(E)-신나모일]글리코피라노실-2-[(S)-2-히드록시]프로필-7-메톡시-5-메틸-크로모네로 명명된, 지금까지 보고되지 않은 이 화합물은 541 Da의 분자량을 지니며, 다음과 같은 화학구조를 갖는다;

이 화합물은, 생체내 검정법으로 측정할 때, 효력있는 항염작용을 나타낸다. 이 화합물은 또한, 상피 세포주에서의 시험관내 실험에서 EGF-유도 DNA 합성을 억제하는 것으로 알려졌다.

알로에 식물로부터의 삼출물(渗出物)은, 화상, 종기 및 기타 상처의 처리를 위한 민속적 치료제로서 수세기 동안 사용되어 왔다. 근년에 있어서, 임상적 활성이 있는 알로에 성분을 식별하는데 많은 연구가 집중되고 있다. 이와같은 관심을 자극하는 2개의 요소는, 수확 직후에 무늬(lease) 부분에서 그 치료적 성능의 일부를 상실하는 경향 및 특정 안트라퀴논과 같이, 유해할 수도 있는 성분을 제거하려는 요망이다. 예를 들면 맥카날리(McAnally)의, 미국특허 제4,966,892호를 참조할 것. 이들 연구 노력의 결과는, 알로에 식물이 상처 치유성을 지니는 몇 가지 성분을 함유한다는 것을 암시한다.

연구문헌에는, 케이프 알로에(Cape Aloe)에서 식별된 5-메틸크로모네 C-글루코시드, 다시 말하면 2-아세토닐-7-0-β-D-글루코피라노실-8-C-β-D-[2'-0-(E)-p-쿠마로일]글루코피라노실-5-메틸-크로메에 관한 보고가 있다. 기오반나 스페란자(Giovamn Sperannza), 그라마티카(P. Gramatica), 다다(G. Dada), 마니토(P. Manitto)의 "알로에레진 C, 케이프 알로에로부터의, 고미 C,O -디클루코시드"("Aloeresin C, A Bitter C,O-Diglncoside"), 식물화학 (Phytochemistry), 1985, 24(7): 1571-1573 페이지. 이 종래 기술의 화합물은 분자량이 556.5 Da이고, 글루코실화 그룹이 쿠마르산이지, 신남산이 아니며 화합물에 속하는 생물학적 활성이 없다.

알로에의 크로모네에 관한 기타의 보고서가 문헌에서 발견된다. "개정된 알로에 -- 알로에레진 A의 구조"("Aloe Revisited -- The Structure of Aloeresin A"), 그라만카(P. Gramanca), 모누(D. Monu), 스페란자(G. Speranza), 마니토(P. Manito), 네라헤드론 레터스(Terrahedron Letters), 1982. 23(23): 2423 - 2424페이지; "알로에류 I부. 알로에신에 있어서의 크로모네.- C - 글루코실-7-히드록시-크로모네"("Chromones in Aloe Species Part 1. Aloesin-a C-glucosy1-7-hydroxy-chromone"), 홀드스워스(D.K. Holdsworth), PM, 19(4): 322-325 페이지; "알로에아보레센스 바아, 나랄렌시스에 있어서의 다량류의 구조결정"("Structure Determination of Polysaccharides in Aloe arbarescens var. naralensis"), 아키라 야기(Akira Yagi), 니시무라(H. Nishimura), 시다(T. Shida), 니시오카(I. Nishioka), Planta Meica, 1986, 213-218페이지: "알로에류 II부-알로에손에 있어서의 크로모네"("Chromones in Aloe Species Part Ii-Aloesone"), 홀드스워스, PM, 22(1): 54-58페이지 및 "케냐 알로에로부터의 C-글루코실화 5-메틸크로모네"("AC-Glucosylated 5-Methylchromone from Kenya Aloe" ), 기오반나 스페란자(Giovanna Speranza), 다다(G. Dada), 루나지(L. Lunazzi), 그라만카(P. Gramanca), 마니토(P. Manitto). 식물화학 1986. 25(9): 2219-2222 페이지가 있다.

[발명의 요약]

본 발명은, 8-C-β-D-[2-O-(E)-신나모일]글리코피라노실-2-[(S)-2-히드록시]프로필-7-메톡시-5-메틸크로모네 (이하 "540 화합물"이라 한다)를 15중량% 이상의 농도로 함유하고 있는 물질의 조성물에 관한 것이다. 생체내 데이터는 농도가 약 15중량중% 이하가 되면 통계적으로 현저한 항염작용을 나타내지 못한다고 지적하고 있다. 조성물의 잔여부분은, 알로에(주로 마노스(manoses)), 알로인(Aloin) 콘쥬게이트 안트라퀴논, 콘쥬게이트 크로모네 및 안트라퀴논 애글리코운에서 통상 발견되는 다당류를 함유할 수 있다. 조성물의 잔여분은 또한, 에멀션화 지방 알코올, 에톡실화 스테아릴 알코올, 지방 에테르 인산염(예를들면, 올레일 에테르 인산염), 에톡실화 라놀린 알코올, 밀랍, 글리세롤 모노스테아레이트, 에멀션화 폴리디 메틸실록산, 글리세린, 광유 및 계면활성제 등과 같은 연고 및 로션의 배합에 통상 이용되는 임의의 액상 캐리어 즉 운반체도 내포할 수 있다. 연고 및 로션을 배합하는데는 기타의 적절한 운반체도 있을 수 있다.

종래에는 확인되지 않은 540 화합물은, 알로에 바아바덴시스 식물에서 극소량으로 발견되는데; 탈색 겔(알로에의 가장 통상적인 사용 형태)형태로 ＜ ＞ 0.0001 중량%; 비탈색 겔 형태로 ＜0.001중량%; 탈색 전체 잎추출물 형태로 ＜0.0002중량%; 및 비탈색 전체 잎 추출물 형태로 ＜0.0025중량%이다. 따라서, 소정의 임상적 성능을 지니는 조성물을 제조하기 위해서는 540 화합물을 15% 이상의 요망 수준으로 농축하기 위하여, 용해된 또는 부유된 알로에 추출물을 함유하고 있는 액상 용액을 처리할 필요가 있다.

알로에 식물 추출물과 관련된 종래 기술의 경험은, 식물내의 생물학적 활성화합물의 대부분이 알로에 잎의 코아에서 발견되는 맑은 겔에 존재한다는 것을 보여주고 있다. 본 발명자들은 상기 겔에서 540 화합물을 발견하였으나, 540 화합물이 잎 껍질에서 보다 많은 양으로 존재한다는 것을 알아내었다.

540 화합물을 농축하기 위하여 2개의 공정이 개발되었다. 제1공정에서, 알로에 바아바덴시스 식물로부터 새로이 수확된 잎을 세척하고, 겔을 껍질로부터 분리하고 및 액상 슬러리를 함유하는 겔을 여과하여 고체 입자를 제거하였다.(잎 껍질의 보다 많은 540 화합물 때문에, 선택적으로, 바람직한 공정은 전체 잎을 빻아 슬러리를 만드는 것이다).

여과액을 투석(스팩트라포오#1(Spectraphor #) 튜빙,24시간× 3)한 결과 2개의 유분, 투석물 및 잔류물이 생겼다. 50Oml의 잔류물(-10g 고형분)에 2L의 80% 에탄올을 가하고, 샘플을 교반하고 20,000rpm으로 15분간 원심분리하고 및 침전물을 버렸다. 회전 증발기에서 상청액으로부터 에탄올을 제거하여, 1.31그람의 생성물을 얻었다. 이 생성물의 1.14그람을 CHCl₃및 물의 혼합물로 추출하여, 샘플을 각각 3:1의 비율로 수성상 및 유기상으로 분리하였다.

클로로포름상이 증발 및 동결 건조된 후,50% 에탄올에 흡수되어 20mg/ml의 농도로 되었다. 고성능 액상 크로마토그라피(HPLC)를 이용하여 샘플이 분석되었다. 0DS 1 칼럼으로부터 약 14분에 용출된 푸울은, NMuMG 상피세포에서 EGF에 의하여 유도된 DNA 합성을 억제한 성분을 함유하는 것으로 판명되었다. 계속된 분석결과 이것이 540 화합물인 것으로 밝혀졌다.

알로에 바아바덴시스의 공정에 채택된 몇가지 공업적 방법은 물질의 색을개선하기 위하여 활성탄을 이용한다. 이 처리 방법을 소위 "전잎 처리공정"으로서 특히 보편적인 것인데, 여기서 전체의 잎이 분쇄되어 처리된다. 전잎 처리공정은, 잎 껍질로부터 분리된 겔을 사용하여 제조된 것보다 어두운 색의 생성물을 제조한다. 그러나, 상술한 투석 분류 공정이 상기 활성탄 처리 물질에 반복 시행되면, 생성물은 동일한 수준의 생물학적 활성을 나타내지 못하였다.

하나의 가설은, 생물학적 활성과 관련된 인자가 활성탄에 포획된다는 것이다. 후속 시험결과 이 가설이 확인되었다. 분쇄된 알로에 바아바덴시스 잎의 슬러리를 처리하는데 사용된 유기 용매로 처리된 활성탄의 용출액은, 540 화합물을 함유한 용액을 생성하였다. 이와같은 처리 방법의 상세한 내용은 하기 실시예에 제시된다. 540 화합물의 시험관내 실험과 관련된 데이터는 제1도에 제시된다.

[실시예 I]

활성탄으로부터 540 화합물의 분리

알로에 바아바덴시스 전잎 추출의 공정에 사용된 활성탄 150g을, 환류하는 CH₂Cl₂중의 25% 아세톤으로 2 사이클의 용출처리 하였다. 제1 용출은 750ml로 수행되었다(건조 흡착된 활성탄의 "습윤" 필요 때문에). 저으면서 4시간 동안 추출한 후에, 액체는 셀루로오스 필터상에서 여과에 의하여 분리되고, 습기있는 케익은 250ml의 용출용매로 세척되었다. 다음에 습기있는 케익은 동일 용매 시스템(500ml)으로 7시간 추출되었다. 제2 용출액은 상기와 같이 제거된 후, 습기 있는 케익은 세척되었다. 아세톤/CH₂Cl₂용리액은 그들 각각의 세척액으로 결합되어 감압하에서의 회전 증발에 의하여 제거되었다. 오일성 잔류물을 불꽃 속으로 이동되어, 질소의 흐름 중에서 증발이 완료되었다. 잔류물은 100mg/ml의 농도로 무수 에탄올(EtOH)에 용해되었다. 제3 및 제4 용출은 환류하는 무수 에탄올로 수행되었다. 각 용출은 500ml을 채택하였다. 제3 용출후, 세척액은 용출액으로부터 분리되어 보관되고, 제4 용출후에는 세척이 없었다. 제3 용출액의 제거, 제3 용출후의 세척 및 제4 용출액은 시럽을 산출하였다. 이들은 고도의 진공 하에서 3일간 건조되었다. 잔류물은 물에 용해된 50% 에탄올에 용해되어 100mg/ml(제3 용출후의 세척액 및 제4 용출액) 또는 200mg/ml(제 3 용출액)로 되었다. 10mg/ml의 희석액은 분석용 재료로서 모든 용출액으로 제조된다.

제1 및 제2 용출액 (25% 아세톤/CH₂Cl₂)이 서로 매우 유사하며, 이들은 푸울A에 모아졌다. 유사한 양상으로, 제3 용출액, 제3 용출후의 세척액 및 제4 용출액은 서로 매우 유사하며 푸울 B에 담았다. A 및 B에 대하여 HPLC 분석이 수행되었다.

두가지 샘플의 조성물이 표 I에 제시된다:

[표 I]

2개 생성물의 샘플은 동결건조되어, 실험실용 생쥐로 항염작용에 대한 실험을 하였다. 또한 샘플은 활성 성분의 화학적 구조를 확인하기 위하여 분석되었다.

[실시예 II]

화학구조의 확인

실시예 I에 따라 제조된 샘플, 용출액 A에서 발견된 신나모일-C-글리코시드크로모네의 구조적 설명이, 핵자기 공명('H) 분광학 및 질량 분석법, 자외선 흡수의 평가, 융점 및 박막 크로마토그라피 작용을 이용하여 완수되었다. 그 결과는 다음과 같다:

(1) 분석 데이터 및 방법

융점: 극치＞90℃

질량 스팩트럼 분석

기구: 피니간(Finnigan)MAT 4615 4중극 질량 스팩트로메타

이온화: 전자 충격(70 eV)

출소(出所)온도: 160℃

샘플도입: 직접 삽입 프로우브

샘플가열: 포물곡선:약 250℃에서 최대 증발

스팩트럼 데이터(괄호내에 상대적 강도):

⁽¹⁾2-히드록시 측쇄의 α -분열

⁽²⁾수소 이전을 포함한다.

⁽³⁾시험적 연구과제

⁽⁴⁾133은 C-글리코시드의 C₂-C₆를 나타낸다·

⁽⁵⁾히드록시-프로필 측쇄를 내포하는 레트로-디엘스-알더 조각화(retro-Diels-Alder fragmentation)

[실시예 III]

생물학적 활성

실시예 I에 따라 제조된 용출액 A 및 용출액 B의 샘플을 에탄올(100mg/㎖)에 용해하고, 하기 공정에 따라 생쥐로 시험하였다.

귀의 팽창을 유도하기 위하여 실험실용 생쥐의 귀 내부에 파두유를 발랐다. 파두유 처리 30분 후, 동일 장소에 시험물질을 발랐다. 처리 18시간 후, 귀의 두께를 측정하였다. 그 결과는 표 II에 제시한다.

[표 II]

¹. 알로에코포레이션 이르빙, 텍사스(Aloecorp. Irving, Texas)에서 공급한 알로에바아바덴시스 겔

². 실험용 귓불(ear punch)의 밀리그람-대비 귓불의 밀리그람

³. 25㎍의 파두유로 상처입은 미처리 귀. 팽창은 7.3± 0.3㎎이었다.

[실시예 IV]

항염 활성의 측정

실시예 I의 용출액 A에 따라 제조된 생성물의 동결 건조된 샘플이 메탄올로 추출되고, 진공에서 용매가 증발되었다. 잔류물은 물에 용해되어 물 및 아세트산에틸로 분리되었다. 각 용매는 진공에서 제거되고, 잔류하는 고체는 540 화합물과 동시에 항염활성에 관한 시험이 수행되었다. 이 실험결과는 제1도에서 그라프로 재표현된다. 이 실험으로부터, 540 화합물이 동일 투여량의 히드로코오티조운에 비견할 수 있는 유효한 항염작용을 나타내고 있다는 것을 알 수 있다. 540 화합물로 처리한 후의 귀 두께는 파두유 조절그룹보다 현저히 작은데; 피셔(Fisher)의 PLSD에 의하여 평가된 다중 비교로, 변방 편차의 일방향 분석(one-way analysis of variance)에 의하여, 통계적 현저성을 측정하였다. 또한, 처리 6시간 후에 500-㎍ 부의 아세트산 에틸상 성분도 유사하게 활성적이었으나, 24시간에서 유효성이 소멸되는 현상을 보였다. 수상 성분이 처리 24시간 후 오직 약간 활성이 있었다.

이들 실험용으로, 중량이 20∼25g되는 발브(Balb)/c 숫생쥐가 이용되었다. 각 그룹에 3마리의 동물이 사용되었다. 귀팽창을 유도하기 위하여, 에펜도르프(Eppendorf) 피펫을 이용하여 각 생쥐의 좌측 귀 내부에 10μL의 파두유 용액(운반체인 피리딘/물/디에틸에테르(4:1:5, v/v/v)에 용해된 25㎎의 파두유)을 발랐다. 각 시험물질은 동일 운반체에 용해되어, 파두유 처리 30분후 좌측 귀의 동일 장소에 적용되었다. 히드로크오티조운으로 처리된 동물은, 유효한 항염작용의 모델로서 나란히 평가되었다. 동물들이 파두유 만으로 처리된 대조 그룹의 귀팽창도 평가되었다. 귀두게는 오디테스트 캘리퍼로 측정되었다. 측정은 파두유 처리 전,및 시험 용액으로 처리후 6 및 24시간에 수행되었다.

이 시험결과는 제1도에 도시된다.

Claims (4)

1. 8-C-β-D-[2-0-(E)-신나모일]글리코피라노실-2-[(S)-2-히드록시]프로필-7-메톡시-5-메틸크로모네 화합물을 포함하는 염증치료제.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 국부적으로 투여되는 상기 염증치료제.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 염증 치료용 조성물이 또한 액상 캐리어를 내포하는 상기 염증치료제.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 염증치료제가 또한 다당류, 알로인, 콘쥬게이트 안트라퀴논, 콘쥬게이트 크로모네 및 안트라퀴논 애글리코운으로 구성되어 있는 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 내포하는 상기 염증치료제.

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