CN114137227A - 一种血清淀粉样蛋白a抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒 - Google Patents
一种血清淀粉样蛋白a抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒，包括以下制备步骤：采用浓度为5mmol/L的2‑(N‑吗啉)乙磺酸作为缓冲液，调整缓冲液的pH为6.1～6.4；利用该缓冲液重悬、活化磁珠，并与血清淀粉样蛋白A抗体进行偶联、封闭制得R1，即完成血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联。通过控制缓冲液的pH，提高血清淀粉样蛋白A抗体氨基与羧基磁珠的偶联的效率，进而提高试剂测试抗原的信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及血清淀粉样蛋白A抗体偶联技术领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒。
背景技术
血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A，SAA)是组织淀粉样蛋白A的前体物质及敏感的正急性时相反应蛋白，在肝脏中合成，并与血浆高密度脂蛋白(HDL) 结合，正常情况下血浆含量很少，当机体受到病毒、细菌、支原体、衣原体等抗原刺激后，肝脏合成大量的SAA入血，当抗原清除后则迅速下降。目前，SAA 浓度的升高已成为炎症的临床标志物。SAA可以激活包括清道夫受体SR-BI、ATP 受体P2X7等多种受体。另外，SAA不仅可以激活转录因子NF-kB，还可以通过 MyD88-IRF4-Jmjd3途径在表观遗传调控中发挥作用，从而导致促炎因子的诱导表达和M2巨噬细胞表达的一部分蛋白质，使得SAA除了表征的炎性因子之外，还表明它可能在炎症过程中起稳态作用。
学发光免疫分析法中，需采用物理或化学的方法将抗体吸附或偶联到磁珠表面。其中物理吸附法存在稳定性不佳，抗体容易脱落下来的缺点，同时对样本中的干扰物质的抗性差，容易产生假阳性的测定结果。化学偶联法将抗体随机偶联到微球表面的羧基上，因抗体上的氨基和磁珠上的羧基通过生成酰胺键结合，其结合效率受溶液的pH影响，过高或过低的pH都会影响偶联效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒，以解决现有化学偶联法中，氨基和磁珠上的羧基结合效率不高，偶联效率低的问题。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，包括以下制备步骤：
S1:采用浓度为5mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液，调整缓冲液的 pH为6.1～6.4；
S2:用S1制备的缓冲液对磁珠进行清洗多次，并用该缓冲液重悬磁珠；
S3:将EDC和NHS分别溶于DMSO中制得EDC活化剂和NHS活化剂，并将混匀，得到混合活化剂；
S4:将S3制备的混合活化剂加入到S2处理过的重悬磁珠中，进行活化，之后再通过S1制备的缓冲液进行清洗、重悬经过活化的磁珠，得到活化磁珠缓冲液；
S5:将血清淀粉样蛋白A抗体加入到S4制得的活化磁珠缓冲液内，进行偶联反应；
S6:在S5经过偶联的磁珠内加入封闭剂进行清洗、重悬、封闭，之后用R1 稀释液对经过封闭的磁珠进行清洗，并在经过清洗的磁珠内加入R1稀释液进行稀释，制得R1，即完成血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联。
进一步优选，S1中的缓冲液pH为6.1。
进一步优选，S2中的磁珠为四氧化三铁磁珠。
进一步优选，S3中混合活化剂中，EDC活化剂和NHS活化剂的比例为1:1。
进一步优选，S6中的封闭剂为牛血清白蛋白和酪蛋白中的至少一种。
进一步优选，S6中R1稀释液的配比如下：0.05～0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，0.01～1g/L的牛血清白蛋白，0.5g～2g/L的Triton X-405，5～20g/L 的氯化钠，2～20％的蔗糖，0.5～2g/L的叠氮钠。
一种试剂盒，包括上述的抗体偶联磁珠试剂制备的R1，还包括R2和R3；
其中R2包括：吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体和R2缓冲液，且吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体与R2缓冲液的体积比为1:400；
其中R2缓冲液的配比如下：Tris-HCl缓冲液0.05～0.2mol/L，牛血清白蛋白0.05～2g/L，吐温20 0.1～2g/L，氯化钠5～20g/L，海藻糖2～20％，叠氮钠0.5～2g/L；
R3的配比如下：0.005～0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4，0.01～1g/L的牛血清白蛋白，0.5～2g/L的Triton X-405，5～20g/L的氯化钠，2～20％的海藻糖，0.5～2g/L的叠氮钠。
有益效果：血清淀粉样蛋白A抗体偶联磁珠试剂的制备方法及试剂盒，采用浓度为5mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液，调整缓冲液的pH为6.1～ 6.4；利用该缓冲液重悬、活化磁珠、并与血清淀粉样蛋白A抗体进行偶联、封闭制得R1。通过控制缓冲液的pH，不仅适宜整体的反应，而且提高血清淀粉样蛋白A抗体氨基与羧基磁珠的偶联的效率，进而提高试剂测试抗原的信噪比。
附图说明
图1是不同pH缓冲液制备试剂盒与不同浓度的血清淀粉样蛋白A的发光值条形对比图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例：
一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法及试剂盒，其中血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联包括以下步骤制备：
S1:采用浓度为5mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)作为缓冲液，并通过浓度为4mol/L的NaOH溶液调整其pH，使得pH为6.1；
S2:用S1制备的缓冲液对磁珠进行清洗多次，并用该缓冲液重悬磁珠,其中磁珠为四氧化三铁磁珠；
S3:将EDC和NHS分别溶于DMSO中制得EDC活化剂和NHS活化剂，之后将上述两种与DMSO溶解的活化剂按1:1的比例混匀，得到混合活化剂；
其中EDC为水溶性碳二亚胺，是1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐。1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)能够活化磁珠上的羧基，并与NHS形成活化中间产物，活化中间产物可以与抗体的氨基结合，形成稳定的酰胺键；
S4:将S3制备的混合活化剂加入到S2处理过的重悬磁珠中，并在25℃的恒温箱内进行活化2h，之后用S1制备的缓冲液进行清洗，并且用S1制得的缓冲液重悬磁珠，得到活化磁珠缓冲液；
S5:将血清淀粉样蛋白A抗体加入到S4制得的活化磁珠缓冲液内，并置于 25℃的恒温箱内进行偶联反应2h，使得抗体上的氨基与已活化的羧基结合，形成稳定的化学键；
S6:在S5制得的活化偶联磁珠内加入牛血清白蛋白或酪蛋白中的至少一种，进行清洗、重悬，并置于25℃恒温箱进行封闭2h，之后用R1稀释液清洗磁珠多次，之后在磁珠内加入该R1稀释液进行稀释，将磁珠浓度稀释至0.1～ 0.2mg/mL，即可制得R1。
其中R1稀释液的配比如下：0.05～0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，0.01～ 1g/L的牛血清白蛋白，0.5～2g/L的Triton X-405，5～20g/L的氯化钠，2～ 20％的蔗糖，0.5～2g/L的叠氮钠。
试剂盒用于检测血清淀粉样蛋白A，包括上述S6制备得到的R1，以及R2 和R3；
其中R2包括：吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体和R2缓冲液，且吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体与R2缓冲液的体积比为1:400；
R2缓冲液的配比如下：Tris-HCl缓冲液0.05～0.2mol/L，牛血清白蛋白 0.05～2g/L，吐温20 0.1g～2g/L，氯化钠5～20g/L，海藻糖2～20％，叠氮钠 0.5～2g/L；
R3的配比如下：0.005～0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4，0.01～1g/L的牛血清白蛋白，0.5～2g/L的Triton X-405，5～20g/L的氯化钠，2～20％的海藻糖， 0.5～2g/L的叠氮钠。
在其他实施例中通过浓度为4mol/L的NaOH溶液进行调整缓冲液的pH，使得其pH分别为5.5，5.8，6.4，6.7，并分别通过不同pH的缓冲液按照实施例 1的步骤制备不同的抗体偶联磁珠试剂。并将不同的抗体偶联磁珠试剂加入试剂盒的腔体内，制备不同的试剂盒。
实验数据：
将上述实施例制备的试剂盒与含有不同血清淀粉样蛋白A浓度的样本进行反应，样本中血清淀粉样蛋白A的浓度分别为：0、50、100、200、400(mg/L)，结果如下表1和图1所示：
表1不同pH缓冲液制备试剂盒与血清淀粉样蛋白A的发光值
根据表1和图1可以很清楚的得出在缓冲液的pH在6.1～6.4之间，对血清淀粉样蛋白A抗体和磁珠进行处理后，制得的血清淀粉样蛋白A测定试剂盒在测试血清淀粉样蛋白A时，具有较高的发光值，也就是偶联效率较高；尤其是在pH为6.1时，发光值最高，也就是说缓冲液的pH为6.1时，血清淀粉样蛋白A抗体和磁珠进行处理后，能大大提高抗体与磁珠的偶联效率。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：包括以下制备步骤：
S1:采用浓度为5mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸作为缓冲液，调整缓冲液的pH为6.1～6.4；
S2:用S1制备的缓冲液对磁珠进行清洗多次，并用该缓冲液重悬磁珠；
S3:将EDC和NHS分别溶于DMSO中制得EDC活化剂和NHS活化剂，并将其混匀，得到混合活化剂；
S4:将S3制备的混合活化剂加入到S2处理过的重悬磁珠中，进行活化，之后再通过S1制备的缓冲液进行清洗、重悬经过活化的磁珠，得到活化磁珠缓冲液；
S5:将血清淀粉样蛋白A抗体加入到S4制得的活化磁珠缓冲液内，进行偶联反应；
S6:在S5经过偶联的磁珠内加入封闭剂进行清洗、重悬、封闭，之后用R1稀释液对经过封闭的磁珠进行清洗，并在经过清洗的磁珠内加入R1稀释液进行稀释，制得R1，即完成血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联。
2.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：S1中的缓冲液pH为6.1。
3.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：S2中的磁珠为四氧化三铁磁珠。
4.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：S3中混合活化剂中，EDC活化剂和NHS活化剂的比例为1:1。
5.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：S6中的封闭剂为牛血清白蛋白和酪蛋白中的至少一种。
6.根据权利要求1所述的一种血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法，其特征在于：S6中R1稀释液的配比如下：0.05～0.2mol/L的Tris-HCl缓冲液，0.01～1g/L的牛血清白蛋白，0.5～2g/L的Triton X-405，5～20g/L的氯化钠，2～20％的蔗糖，0.5～2g/L的叠氮钠。
7.一种试剂盒，包括权利要求1-6任一项所述的血清淀粉样蛋白A抗体与磁珠的偶联方法所制备的R1，其特征在于：还包括R2和R3；
其中R2包括：吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体和R2缓冲液，且吖啶酯标记的血清淀粉样蛋白A抗体与R2缓冲液的体积比为1:400；
其中R2缓冲液的配比如下：Tris-HCl缓冲液0.05～0.2mol/L，牛血清白蛋白0.05～2g/L，吐温20 0.1～2g/L，氯化钠5～20g/L，海藻糖2～20％，叠氮钠0.5～2g/L；
R3的配比如下：0.005～0.02mol/L的Na2HPO4-NaH2PO4，0.01～1g/L的牛血清白蛋白，0.5～2g/L的Triton X-405，5～20g/L的氯化钠，2～20％的海藻糖，0.5～2g/L的叠氮钠。
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