JPH0843389A - 血清アミロイドａの免疫学的測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】本発明は、炎症等のマーカーとなる血清アミロ
イドＡ（ＳＡＡ）の免疫学的測定において、次の問題を
解消することを課題としている。 （１）希釈直線性を改善する （２）試薬ロット間の測定値の変動を抑制する 【構成】本発明は、抗ＳＡＡ抗体とＳＡＡとの免疫反応
の場に、ＨＤＬを添加するＳＡＡの免疫学的測定法であ
る。 【効果】簡便な方法により経済的に希釈直線性を改善す
る。また試薬ロット間の測定値の変動を抑制する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、血清中のアミロイドＡ
（以下、ＳＡＡと省略する）の免疫学的測定法に関する
ものである。ＳＡＡはある種のアミロイドーシスにおい
て組織に沈着するアミロイド蛋白Ａ（以下、ＡＡ蛋白と
省略する）の前駆体蛋白とされる、分子量約１２０００
の血清蛋白である。（J.Clin.Invest.53:1054-1061,197
4） 近年になって、このＳＡＡの血清値がアミロイドーシス
以外の炎症性疾患で上昇することが明らかにされ、鋭敏
な炎症マーカーとして評価されている。（臨床検査32:
2,P168,1988）

【０００２】

【従来技術の問題点】臨床検査等の分野では、物質の測
定を簡便に行うためにしばしば免疫学的な測定が利用さ
れる。ＳＡＡについても例外ではなく放射免疫測定法
（以下ＲＩＡと省略する）や酵素免疫検定（Scand.J.Im
munol.18:P329,1983、以下ＥＩＡと省略する）、免疫沈
降測定法（Marker Proteins in Inflammation,3:P157,1
986、以下ＴＩＡと省略する）等、免疫学的測定法に関
する多くの報告がある。これらの測定法では、精製ＳＡ
Ａを免疫原として得た抗体をＳＡＡと反応させることに
よって測定を行っている。つまり一般的な免疫学的測定
技術を単にＳＡＡに適用したものにすぎない。これらの
従来技術では、次のような問題点が有る。

【０００３】１．希釈直線性が悪い ＳＡＡを免疫学的に測定する場合、比較的濃度が低い場
合には良好な希釈直線性を得られる。しかしたとえば３
００μg/mlを越えるような高値検体では、希釈直線性に
バラつきが生じる。つまり検体によって、あるいは試薬
ロットによって必要な希釈直線性を得られないケースが
出てくるのである。なお希釈直線性とは、検体を３／５
に希釈すれば測定値も３／５になり、１／５に希釈すれ
ば測定値も１／５というように理論的な値を取ることを
言う。したがって希釈直線性の良い測定系について横軸
に希釈倍率を、縦軸に測定値を取ったグラフを描けば、
グラフは原点０を通る直線となる。逆に希釈直線性が不
十分な場合には、このグラフが直線とならずにたとえば
上反りの曲線となるようなケースが出てくるのである。
このような検体は試料との反応性が標準物質と異なって
いることになり、したがって同じ標準を用いた検量線か
ら求めた測定値の信頼性は無くなる。言い換えれば、全
ての検体と同一の反応性（特異性）を備え良好な希釈直
線性を示す標準を選択しなければならないということで
ある。しかしあらかじめ検体の全てについて、標準との
間でどのような反応性を示すかを予測し品質を保証する
ことは現実には不可能である。高濃度のＳＡＡを含む試
料は希釈しなければ正確な測定ができない（抗原過剰
域）。しかし従来技術で希釈試料を測定する場合には、
希釈直線性が悪いため測定値のバラつきの原因となって
しまう。更に、標準試料によって検量線を得る場合にも
問題を生じる。希釈直線性が悪いので、検量線が直線と
ならず測定範囲が制限される場合が有る。多濃度の標準
試料をあらかじめ用意しておけば少なくとも検量線の作
成においては希釈直線性の問題を回避できる。しかし多
くの標準を用意するのは、試薬コストを上げる原因にな
りかねないうえに、実際の分析試料と異なる条件で得た
検量線の信頼性は低いといわざるをえない。

【０００４】２．ロット差が生じやすい 従来の測定法では、同じ試料について違うロットによる
試薬の測定値を比較した時に値が変動しやすい傾向が有
る。研究施設での小規模な利用では、１度作成した試薬
をかなりの期間にわたって使い続けることができるので
ロット差の問題は表面化しにくい。しかし商業ベースで
免疫学的測定試薬を供給する場合にはロット差が大きい
ことは致命的な問題である。本発明者らが確認したとこ
ろでは、ロット毎に検量線を用意した場合であってもた
とえばロットＡによる測定値を１００としたときに、ロ
ットＢでは８０前後、ロットＣでは１２０前後というよ
うに、複数の試料について常に同じ傾向に測定値が偏る
ことがある。このような現象は試料を希釈した場合に特
に顕著で、したがって試薬の測定範囲を越える高値試料
の測定において大きな問題となる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、ＳＡ
Ａの免疫学的測定法における希釈直線性の改善と、試薬
ロット差を小さくすることにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、第１に「ＳＡ
Ａを抗ＳＡＡ抗体と反応させるのにあたり、反応系に高
比重リポ蛋白質分画を添加することを特徴とするＳＡＡ
の免疫学的測定法」を提供する。

【０００７】本発明の高比重リポ蛋白質分画（以下、Ｈ
ＤＬと省略する）は、ヒトのＳＡＡを測定する場合であ
っても任意の動物に由来するものを利用することができ
る。具体的には、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、およびブタ
等のＨＤＬでほぼ同等の効果を得られる。本発明におけ
るＨＤＬは、各種動物血清から精製したものを用いても
良いし、あるいはＨＤＬを含む動物血清をそのまま添加
することも可能である。ＨＤＬとしては、市販のヒトや
動物の血液から精製したＨＤＬを用いると良い。あるい
はＨＤＬの分離精製法は既に確立されているので、必要
な量を精製して用いることもできる。なおＨＤＬとは、
超遠心法によって血清から分離される比重１．０６３−
１．２１０g/mlを有するリポ蛋白質の総称である。その
後、超遠心法のみならず電気泳動的にα１グロブリン領
域に泳動されるα−リポ蛋白質画分で構成されるリポ蛋
白質や、ヘパリン−Ｍｎ2+で沈殿しない分画のリポ蛋白
質もＨＤＬと呼ばれるようになっている。これまでに得
られた知見によれば、健常人においてはＨＤＬの約５０
%は脂質から、そして残りの５０%がＨＤＬアポ蛋白質と
呼ばれる蛋白質から構成されている。コレステロール
（２０%）、リン脂質（２３%）、およびトリグリセライ
ド（５%）等が脂質を構成しており、一方アポ蛋白質は
ＡｐｏＡ−Ｉ、およびＡ−ＩＩが９０%を占める。

【０００８】ＨＤＬを純品ではなく粗精製状態で、ある
いは動物血清をそのまま添加する場合には、あらかじめ
ＨＤＬ値を確認して添加量を制御できるようにしておく
のが好ましい。なお動物血清はＳＡＡを含んでいるの
で、あらかじめこれを除去する必要が有る。ＳＡＡは、
測定に用いるのと同じ抗体で免疫学的に吸着することに
より簡単に除去することができる。もっとも動物種によ
っては、測定対象のＳＡＡとほとんど免疫学的に交差し
ないものもある。このような場合は共存ＳＡＡの影響は
受けないので除去する必要はない。たとえば、ヒトＳＡ
Ａを免疫原として得た抗体は、ウマやウシのＳＡＡとは
ほとんど反応しない。また本発明で必要なＨＤＬの使用
量は、一般的な血清試料を分析するのであれば、添加し
たＨＤＬのコレステロールを測定したときに反応液１ml
に対して少なくともおよそ０．３μg以上となるように
添加するのが好ましい。もちろんこの濃度は正常ヒト血
清や動物血清から超遠心法によって分離したＨＤＬを加
えた場合の値である。ＨＤＬに占める平均的なコレステ
ロールの構成比が２０%程度であるから、ＨＤＬの総量
としてはおよそ１．５μg/ml以上という値を示すことが
できる。また例えば市販のヒト精製ＨＤＬ（蛋白質１mg
あたりＨＤＬ−Ｃを２５μg以上含有、ＳＩＧＭＡ製）
をＨＤＬとして利用するのであれば、先にＨＤＬ−Ｃの
値で説明した使用量はその１０倍程度、すなわち３μg/
ml以上で良いことになる。この濃度に満たない添加量で
は、十分な効果を得られない可能性がある。他方、不必
要に多量に用いても期待できる効果に差は生じないし、
またＨＤＬを血清として添加する時には血清が含むＨＤ
Ｌの量には限りが有るため必然的に上限が存在すること
になる。

【０００９】これらの理由から、ＨＤＬのより実用的な
使用量として反応液１mlあたり約１．５〜２０００μg
という数字を示すことができる。この値はＨＤＬに占め
る蛋白の値であり、コレステロール濃度をＨＤＬの指標
とすれば反応液１mlあたり０．３〜３００μg、リン脂
質を指標とすれば０．４〜５００μg、ＡｐｏＡ−Ｉを
指標とすれば０．５〜６００μg、ＡｐｏＡ−ＩＩを指
標とすれば０．２〜２００μgという値となる。コレス
テロール濃度を指標とした場合、好ましい濃度は５μg
以上、更に幅広い試料について確実な効果を得るにはで
きれば１０μg以上とすると良い。これらの数値は平均
的なヒト血清における成分比をもとに算出したものであ
り、ＨＤＬとして他の動物種に材料を求める場合には各
動物種におけるＨＤＬの組成に基づいて適当な値を設定
することができる。もちろん髄液のようなＨＤＬをほと
んど含まない試料を分析するのであれば、ＨＤＬの添加
量を高めに設定しておいた方が好ましい。ＨＤＬは正常
血清中にも存在する蛋白質だが、本発明のＳＡＡ測定法
においては試料に由来するＨＤＬはほとんど影響を与え
ない。

【００１０】本発明の免疫学的測定法としては、ＲＩ
Ａ、ＥＩＡ、粒子凝集免疫測定法、およびＴＩＡ等を例
示することができる。これらの測定法の中でも、粒子凝
集免疫測定法、およびＴＩＡは、特殊な機器を用いるこ
となく簡単な操作で測定が可能であり、しかも十分な感
度や再現性を期待できるため好ましい測定法である。粒
子凝集免疫測定法は抗ＳＡＡ抗体を固定した不活性粒子
のＳＡＡによる凝集を、またＴＩＡでは抗ＳＡＡ抗体と
ＳＡＡとの反応によって生成する沈降物を光学的に追跡
してＳＡＡの濃度を測定する。ＲＩＡやＥＩＡでは、Ｓ
ＡＡを複数の抗体でサンドイッチするサンドイッチ法
と、抗体に対して標識ＳＡＡを被測定ＳＡＡと競合させ
る競合法が可能である。いずれの方法においても免疫反
応の場にＨＤＬを加えることによって本発明の効果を得
ることができる。なおこれらの測定法に用いる抗ＳＡＡ
抗体は、ポリクローナル抗体であっても良いし、あるい
はモノクローナル抗体を用いることも可能である。また
両者を組み合せて利用しても良い。特に固相抗体を利用
するＲＩＡやＥＩＡでは、モノクローナル抗体をポリク
ローナル抗体と組合せることによって感度と特異性とを
同時に満足する優れた測定系を構成することが可能とな
る。ＳＡＡの抗体についてはこれまでにいくつかの報告
が有るが、本発明の免疫学的測定法においては公知の抗
体を利用することが可能である。たとえばＳＡＡのモノ
クローナル抗体としてT.L.McDonaldらの報告が有る(J.I
mmunol.Methods,144,149-155;1991)。この報告にもある
とおり、モノクローナル抗体によってサンドイッチ法を
行うためには、ＳＡＡ上の物理的に離れた位置にある複
数のエピトープを認識するものを用意する必要がある。
粒子凝集反応法やＴＩＡでも同様であり、モノクローナ
ル抗体を用いる時には複数の部位に反応することができ
るようにしてやらなければならない。

【００１１】本発明は、第２に「ＳＡＡを抗ＳＡＡ抗体
と反応させ、両者の結合の程度に基づいてＳＡＡを測定
する免疫学的測定法において、反応系にＨＤＬを添加す
ることを特徴とする測定値の変動を抑制する方法」を提
供する。本発明は先に述べたような条件に基づいて免疫
反応の場にＨＤＬを添加することによって、試薬ロット
の間で測定値が変動するのを抑制する方法を提供するも
のである。試薬ロット間の測定値の変動とは、同一の試
料を同じ条件のもとで測定した時に試薬ロットの間で違
う値を示すことをいう。一般的な試薬の品質管理法によ
れば、標準品やプールした試料について測定を行い得ら
れた値が一定の範囲内に入っていれば必要な品質を満た
しているものと判断される。ところがＳＡＡの免疫学的
な測定においては、あるプール血清ではロット間の測定
値の変動が見られない場合であっても、他の血清を試料
をとするときには大きなロット差が生じるという特殊な
傾向の有ることを確認した。本発明はこのようなＳＡＡ
に固有の試薬ロット間の測定値の変動を効果的に抑制す
る方法を提供するものである。

【００１２】本発明は、第３に「抗ＳＡＡ抗体、および
ＨＤＬとで構成されるＳＡＡの免疫学的測定用試薬」を
提供する。本発明の免疫学的測定用試薬とは、本発明に
よる測定法について説明したような幅広い測定技術のた
めの試薬に適用することができる。具体的には、ＲＩ
Ａ、ＥＩＡ、粒子凝集免疫測定法、およびＴＩＡ等のた
めの試薬とすることが可能である。ＲＩＡやＥＩＡで
は、固相上に固定した抗ＳＡＡ抗体（あるいは第二抗
体）、標識した抗ＳＡＡ抗体（あるいは標識ＳＡＡ）等
の成分と試料を適当な濃度に希釈する希釈液等で試薬が
構成される。一方粒子凝集免疫測定法、あるいはＴＩＡ
のための試薬は、抗ＳＡＡ抗体を不溶性粒子に固定した
（ＴＩＡでは遊離抗体をそのままの）成分と、適当な希
釈液等で構成される。本発明のＨＤＬは、これらの試薬
構成成分のいずれに加えても良い。抗体を含む成分にＨ
ＤＬを加えておけば、蛋白で構成される試薬をひとまと
めにできるので、防腐剤等を加えるうえで有利である。
一方、抗体溶液等と多量のＨＤＬを共存させることで沈
でん等の問題を生じる可能性があれば希釈液に加えてお
くことも可能である。いずれにせよ、ＨＤＬを用いない
ときにも必須の成分となるものに添加するようした方が
操作上の問題を生じない。

【００１３】本発明による免疫学的測定用試薬の抗ＳＡ
Ａ抗体には、先に述べたように任意の抗体を利用するこ
とができる。すなわち、ポリクローナル抗体であっても
モノクローナル抗体であってもかまわない。また抗体
は、リウマチ因子や補体による非特異的な影響を抑制す
ることを目的として適当な酵素で消化した断片として用
いることもできる。抗体断片としては、ペプシンによる
Ｆ（ａｂ’）２断片等が知られている。抗ＳＡＡ抗体
は、目的とする測定技術に合せて様々な形態にすること
ができる。すなわち、ＲＩＡであればＲＩで、またＥＩ
Ａでは酵素により標識される。あるいは固相抗体として
用いる時には容器壁やビーズ担体等に固定される。また
粒子凝集免疫測定法であれば、ポリスチレンラテック
ス、リポソーム、金コロイド等の不活性粒子に固定され
る。固相や粒子への抗体の固定は、化学的な結合によっ
ても可能であるし、物理吸着を利用しても良い。本発明
のＳＡＡの免疫学的測定用試薬には、この他に公知の成
分を組合せることができる。すなわち、免疫反応に必要
なｐＨを与える緩衝剤、免疫反応を促進する反応増強
剤、非特異反応を抑制する反応安定剤やブロッカー、試
薬の保存性を高めるアジ化ナトリウムのような防腐剤等
を組合せても良い。緩衝剤としては、次のようなものを
利用できる。 ＧＯＯＤ緩衝剤 ２−モルホリノエタンスルホン酸（2-(N-Morpholino)et
hanesulfonic acid、ＭＥＳと省略する） ピペラジン−ビス（２−エタンスルホン酸）（Piperazi
ne-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid)、ＰＩＰＥＳと省
略する） （２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸
（N-(2-Acetamido)-2-aminoethanesulfonic acid、ＡＣ
ＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスル
ホン酸（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoehtanesulfo
nic acid、ＢＥＳと省略する） ビス（２−ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキ
シメチル）メタン（Bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hyd
roxymethyl)methane、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓと省略する） ３−［ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒ
ドロキシプロパンスルホン酸（3-[N,N-Bis(2-hydroxyet
hyl)amino]-2-hydroxypropanesulfonic acid、ＤＩＰＳ
Ｏと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−３−プロパンスルホ
ン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-3-propanesulfo
nic acid、ＥＰＰＳと省略する） ヒドロキシエチルピペラジン−２−エタンスルホン酸
（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic a
cid 、ＨＥＰＥＳと省略する） ２−ヒドロキシエチルピペラジン−２−ヒドロキシプロ
パン−３−スルホン酸（N-2-Hydroxyethylpiperazine-
N'-2-hydroxypropane-3-sulfonic acid、ＨＥＰＰＳＯ
と省略する） ３−（モルホリノ）プロパンスルホン酸（3-(N-Morphol
ino)propanesulfonic acid、ＭＯＰＳと省略する） ３−（モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸（3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid
、ＭＯＰＳＯと省略する） ピペラジン−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン
酸）（Pioerazine-N,N'-bis(2-hydroxypropanesulfonic
acid)、ＰＯＰＳＯと省略する） N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulfonic
acid 、ＴＡＰＳと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ヒドロキシ−
３−アミノプロパンスルホン酸（N-Tris(hydroxymethy
l)methyl-2-hydroxy-3-aminopropanesulfonic acid、Ｔ
ＡＰＳＯと省略する） トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−アミノメタン
スルホン酸（N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoeth
anesulfonic acid、ＴＥＳと省略する） その他の緩衝剤 ２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１、３−プロパン
ジオール（2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanedio
l） トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris(hydro
xymethyl)aminomethane）とも呼ばれる リン酸緩衝液 アンモニウム緩衝液 これらの緩衝剤の中でも、ＨＥＰＥＳやＰＩＰＥＳ等の
ＧＯＯＤ緩衝剤は、免疫反応に有利なｐＨを与えるのみ
ならず、蛋白質への影響が小さいので特に好ましい緩衝
剤として挙げられる。また反応増強剤としては、ポリエ
チレングリコールや硫酸デキストラン等が知られてい
る。更に反応安定剤やブロッカーとしては次のようなも
のが知られている。すなわち、ＢＳＡ、動物血清、Ｉｇ
Ｇ、ＩｇＧ断片（ＦａｂやＦｃ）、アルブミン、乳蛋
白、アミノ酸、ポリアミノ酸、コリン、ショ糖等の多糖
類、ゼラチン、ゼラチン分解物、カゼイン、グリセリン
等の多価アルコール等が免疫反応において反応の安定化
や非特異反応の抑止に有効なことが知られている。これ
らの各種成分を含む本発明によるＳＡＡの免疫学的測定
用試薬は、溶液状態で、あるいは乾燥状態で供給するこ
とができる。溶液状態で流通させるには、蛋白の安定性
を高めることを目的として、更に各種界面活性剤、糖、
不活性蛋白等を加えても良い。これらの安定化剤は、試
薬を乾燥するときにも安定剤として、あるいは賦形剤と
して有効である。

【００１４】本発明においては、血液、髄液、臍帯血等
に含まれるＳＡＡを測定対象とすることができる。血液
中のＳＡＡは、炎症の指標となることは先に紹介したと
おりである。またＳＡＡはヒト以外の哺乳動物において
も検出される物質だが、本発明の測定法はこのようなヒ
ト以外の哺乳動物のＳＡＡ測定にも応用することができ
る。

【００１５】

【作用】本発明のＨＤＬは、抗ＳＡＡ抗体とＳＡＡの免
疫反応の場に共存させることにより、希釈直線性を改善
し、更に試薬ロット間の測定値の変動を抑制する作用を
有する。ＨＤＬがどのような機構でこのような作用を示
すのかについては推測の域を出ない。ＳＡＡが血液中に
おいてはＨＤＬと複合化した状態で存在していることは
既に知られているが、免疫学的な反応においてどのよう
な影響を及ぼすのかについては報告が無い。本発明にお
けるＨＤＬの作用機序は不明であるが、本発明者らは次
のように推測している。ＳＡＡは生体内ではＨＤＬと複
合した状態で存在しているので、検体の希釈にともなう
ＨＤＬ濃度の低下はＨＤＬからのＳＡＡの脱着につなが
ることが予測される。標準品はＨＤＬと複合化したＳＡ
Ａの状態にあるので、脱着ＳＡＡとの間で反応特異性が
異なってくるのかもしれない。ここにＨＤＬを添加して
おいた場合には、検体を高度に希釈した場合であっても
ＨＤＬ濃度の低下が起こらない、あるいは脱着ＳＡＡが
再度ＨＤＬと会合するため、標準品と共通の反応特異性
を維持できていると説明することも可能である。もっと
も逆にＨＤＬが過剰に存在したときに本来のＳＡＡ−Ｈ
ＤＬ間のバランスに影響する可能性もあるので、ＨＤＬ
の補給が直ちに本発明の効果を与えると言うことはでき
ない。ＨＤＬの添加による本発明の効果は、従来の知見
からは容易に得ることのできないものである。

【００１６】本発明の大きな特徴は、免疫反応の場にＨ
ＤＬを加えることにある。ＨＤＬは血液中で脂質の輸送
にかかわっている蛋白質であり、他の脂質関連蛋白に比
べて大きい比重を持つことから高比重と呼ばれている。
この特徴から明らかなように、たとえば測定対象として
血液や血清を用いる場合には従来の免疫学的測定法にお
いても免疫反応の場には試料に由来するＨＤＬが存在し
ていたことになる。たとえば健常者の血清中には１８０
〜２２０mg/dlのＨＤＬが存在するとされており（現代
医療,12,523-529;1980）、この血清を後に述べる実施例
の条件で分析した場合には反応液中にはおよそ１０−１
４μg/ml程度のＨＤＬ（ＨＤＬ−Ｃではこの２０%程
度）が存在することになる。本発明では。このような試
料に由来するＨＤＬとは別に、人為的にＨＤＬを添加す
ることによって従来の方法では得られない希釈直線性の
改善と試薬ロット間の測定値の変動抑制を実現したもの
である。また免疫学的な反応に基づく測定法において
は、反応の場に正常動物の血清を加えておくことによっ
て非特異的な反応を効果的に抑制できることが知られて
いる。しかしこの場合の動物血清は、主として非特異的
な吸着をブロックすることで機能しており本発明のＨＤ
Ｌの作用を示唆するものではない。更に本出願人は、Ｈ
ＤＬと複合化したＳＡＡを標準に用いる技術を特許出願
している（特開平４−２５４７６９号公報）。この特許
は精製ＳＡＡを標準として用いる場合に生じる問題の解
消を目的とするものであり、やはり本発明のＨＤＬの作
用を示唆するものではない。

【００１７】

【発明の効果】本発明によるＳＡＡの免疫学的測定法、
あるいは免疫測定用試薬によれば、常に希釈直線性の良
好な測定が可能となる。本発明のＨＤＬの作用によっ
て、ＳＡＡと抗体との反応性が変動しにくくなる。結果
として、検体の種類、希釈程度、試薬ロット等の違いに
影響されることなく常に一定の希釈直線性を得ることが
でき、信頼性の高い測定が可能となる。希釈直線性を改
善したことによって、ＳＡＡを高い濃度で含む試料を希
釈して測定するときにも信頼性の高い値を得ることがで
きる。

【００１８】また本発明のＳＡＡの免疫学的測定法は、
従来技術では避けることのできなかった試薬ロット間の
測定値の変動を抑制することが可能となる。試薬ロット
間の測定値の変動は、特に商業ベースで試薬を供給する
ときに致命的な障害となるが、本発明ではこの問題を極
めて簡便な方法により解決した。本発明では試薬成分と
して調達の容易なＨＤＬを添加するだけで良いのでコス
トにもほとんど影響せず、一方操作上も特殊な操作や条
件は要求されない。このように、本発明はＳＡＡの免疫
学的な測定を商業的に行う上で障害となる大きな問題点
を簡便な方法で解消するものである。以下実施例に基づ
いて本発明を詳細に説明する。

【００１９】

【実施例】

１．ＳＡＡの免疫学的測定用試薬 １−１．精製ＳＡＡ ＳＡＡを多く含む患者腹水プール（１１８μg/ml）１L
を出発原料とし、まず超遠心法により比重１．２３g/l
の上層部を採取、次いで比重１．０６３g/l の下層部を
採取し、冷却下メタノール／エーテル (１：２）で脱脂
後、セファデックスＧ−２００カラム（６M 尿素、０．
５％Tween ２０を含む０．０１M トリス−塩酸緩衝液ｐ
Ｈ８．６で平衡化）にアプライし、更にブロムシアンで
活性化したセファロース４Ｂ（ファルマシア）に常法に
より、抗ＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＣIII 、ヒト血清アルブ
ミン抗体を結合させたカラムに通して夾雑蛋白を除去
し、１Lの患者腹水より精製ＳＡＡ３１mgが得られた。
精製ＳＡＡはＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分子量１２００
０の所に単一のバンドを示し、他のアポリポ蛋白抗体と
は反応しなかった。また、アミノ酸配列はＮ末端からSe
r Phe Phe Ser Phe Leu Gly Glu Ala Phe Asp Gly Ala
Arg Asp Met Trp Arg Ala Tyr であり、データベース検
索から、ダウレット他の報告（Biochem.27:P1677,198
8）によるＮ末端のArg を欠いたformII, IVと同一であ
ることがわかった。

【００２０】１−２．抗ＳＡＡ抗体の感作 １−１で得た精製ＳＡＡをフロイントのコンプリート・
アジュバントと等量混合し、充分乳化させた後に家兎に
免疫した。免疫は２週間毎に行い、４ケ月後に一部採血
してして得られる抗血清を、４０％硫安分画〜透析〜濃
縮し抗ＳＡＡ抗体（０．０１mg/ml）とした。この抗Ｓ
ＡＡ抗体をポリスチレンラテックス（平均粒径０．１１
９μm）に３７℃で１時間物理吸着させた後、０．１M
のＨＥＰＥＳ緩衝液を加えて遠心分離（１０，０００rp
m，２０分）した後上清を捨て、その沈でんを最終的に
ラテックス濃度０.４％となるように分散媒（１％ウシ
血清アルブミンを含む０．１M のＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ
７．４）に懸濁させてＳＡＡのラテックス凝集反応用試
薬（以下単に乳液と呼ぶ）を得た。

【００２１】２．血清ＳＡＡの測定１（従来法） ＳＡＡ高値の血清試料５例について、１００倍希釈を行
うと従来の技術ではロット差の生じることを確認した。
乳液として、ロットおよび免疫時期が異なる抗体を使用
した３種類のロットＡ、Ｂ、およびＣを用いた。操作は
次のとおりである。各血清試料を５０mMのＨＥＰＥＳ緩
衝液（ｐＨ７.４、以下単に希釈液と記載する）で１０
０倍に希釈して測定試料とした。希釈液２２５μlと測
定試料２０μlを測定セルに分注し、１３０秒後に乳液
７５μlを添加し４０秒後に１回目の散乱光を測定（波
長６６０nm）、ついで１３０秒後に２回目の散乱光測定
を行い散乱光強度の差を求めた。特開平４−２５４７６
９号公報のＨＤＬ−ＳＡＡを一次標準としてＳＡＡ濃度
を求めたヒトプール血清（ＳＡＡ濃度３０μg/ml）を段
階希釈した標準で検量線を設定し、散乱光強度の差から
ＳＡＡ濃度を決定した。検量線は試薬ロットごとに設定
した。測定には全自動免疫化学分析装置ＬＸ−３０００
（栄研化学・アナリティカルインスツルメント製、商品
名）を用いた。結果を表１に示した。試薬Ａの測定値を
１００としたときに、試薬Ｂによる測定値は常に８０前
後の低い値を示し、他方試薬Ｃでは１２０〜１５０とい
う高い値を示す現象がみられ、正確な測定ができていな
いことを確認した。

【００２２】

【表１】

【００２３】３．血清ＳＡＡの測定２（本発明法） ＳＡＡ高値の血清試料５例について、本発明によりロッ
ト間の測定値の変動を抑制できることを確認した。血清
試料を１と同じ希釈液で１０倍に希釈後、更に２０倍希
釈ヒトＨＤＬで１０倍に希釈することによって１００倍
希釈試料とする他、試薬や測定操作は２に準じた。この
操作によって、最終的な反応液中にはＨＤＬ−Ｃとして
６．８μg/mlとなるようにＨＤＬを添加したことにな
る。ＨＤＬは、次の操作によりＨＤＬとして分離したも
のを用いた。本実施例で用いた血清試料は２とは別のも
のである。ヒトプール血清に比重１．２３g/mlになるよ
うにＫＢｒを添加溶解後、遠心分離（４００００rpm、
４２時間）して浮上した脂質分画を回収した。回収した
脂質分画に精製水を加えて比重を１．０６３g/mlに調整
後１回目と同じ条件で遠心分離し、その下層分画を集め
て精製ＨＤＬとした。遠心分離には日立８５Ｐ-７２を
用いた。なおＨＤＬとしては、ＳＡＡ含有量を測定範囲
未満としたものを用いた。ＨＤＬ量は、ＨＤＬ−Ｃを指
標として測定した。ＨＤＬ−Ｃ含量の測定には、血清Ｈ
ＤＬコレステロール測定用ＨＤＬ−Ｃ５５５‘栄研’
（栄研化学製、商品名）を用いた。結果は表２に示し
た。ＨＤＬを含む希釈液を利用して免疫反応の場にＨＤ
Ｌを供給することにより、試薬ロット間の測定値の変動
を小さくすることができた。

【００２４】

【表２】

【００２５】４．ＨＤＬの使用量 ３で確認したＨＤＬの作用がどの程度の濃度範囲で得ら
れるのかを確認するために次のような実験を行った。表
３に示すようなＨＤＬ含有量を変化させた希釈液Ａ）と
Ｂ）で血清試料を１０倍希釈し、測定時に希釈液でさら
に１０倍希釈して測定値に与えるＨＤＬ濃度の影響を観
察した。希釈液に用いたヒト血清あるいはヒトＨＤＬ
は、ＳＡＡ含有量を測定範囲未満としたものを用いた。
実験に用いたヒト血清、脱脂ヒト血清、および精製ＨＤ
Ｌに含まれるＨＤＬ−Ｃは、それぞれ３０．４mg/dl、
０．６mg/dl、および１３６．５mg/dlである。Ａ）と
Ｂ）の組成については表３にまとめた。血清試料はＳＡ
Ａ高値血清１例を用い、その他の操作は２に準じた。 Ａ）ヒト血清＋脱脂ヒト血清でＨＤＬ−Ｃ含有量を０−
３０mg/dl（最終的な反応液中でＨＤＬ−Ｃとして０−
１．８μg/ml）、または Ｂ）ヒトＨＤＬ＋緩衝液でＨＤＬ−Ｃ含有量を５−５０
mg/dl（最終的な反応液中でＨＤＬ−Ｃとして０．３−
３．１μg/ml）

【００２６】

【表３】 結果を表４、および表５に示す。これらの結果から、ヒ
ト血清、あるいはヒトＨＤＬを免疫反応の場に添加する
ことで試薬ロット間の測定値の変動を抑制することがで
きる。ＨＤＬの効果は、反応液中でＨＤＬ−Ｃとして
０．３μg/ml以上であれば測定値の変動を２０%以内と
することができる。

【００２７】

【表４】

【００２８】

【表５】

【００２９】５．血清ＳＡＡの測定３（本発明法） ＳＡＡ高値の血清試料７例について、本発明によりロッ
ト間の測定値の変動を抑制できることを確認した。血清
試料を１と同じ希釈液で１０倍に希釈後、更に１０倍希
釈ヒト血清で１０倍に希釈することによって１００倍希
釈試料とする他、試薬や測定操作は２に準じた。ヒト血
清は正常ヒト血清を用い、ＨＤＬ−Ｃは３mg/dlであっ
た。本実施例で用いた血清試料は２とは別のものであ
る。この操作によって、最終的な反応液中にはＨＤＬ−
Ｃとして２μg/mlとなるようにＨＤＬを添加したことに
なる。結果を表６に示した。ヒト血清を反応系に添加す
ることによってＨＤＬを供給してやれば、試薬ロット間
の測定値の変動を精製ＨＤＬの添加と同じ様に抑制でき
ることを確認した。

【００３０】

【表６】

【００３１】６．血清ＳＡＡの測定４（本発明法） ＳＡＡ高値の血清試料４例について、本発明によりロッ
ト間の測定値の変動を抑制できることを確認した。血清
試料を１と同じ希釈液で１０倍に希釈後、更に１０倍希
釈動物血清で１０倍に希釈することによって１００倍希
釈試料とする他、試薬や測定操作は２に準じた。動物血
清は、正常なウサギ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ血清を用
いた。希釈液に用いたヒト血清あるいはヒトＨＤＬはＳ
ＡＡを含んでいるため、ＨＤＬからＳＡＡを吸収してＳ
ＡＡ含有量を測定範囲未満としたものを用いた。他の動
物血清やＨＤＬは、測定に用いたＳＡＡ試薬と反応しな
いためそのまま用いた。また比較のため２０倍希釈ヒト
精製ＨＤＬを加えた系を用意した。本実施例で用いた血
清試料は２とは別のものである。結果を表７に示した。
表中の％は、１／２０ヒトＨＤＬを加えたときの測定値
を１００とする数値である。動物の種類は問わず血清を
反応系に添加することによってＨＤＬを供給してやれ
ば、試薬ロット間の測定値の変動を精製ＨＤＬの添加と
同じように抑制できることを確認した。材料の供給に問
題の有るヒト血清に代えて調達の容易な動物血清でも同
じ作用を期待できることがわかった。

【００３２】

【表７】

【００３３】７．血清ＳＡＡの測定５（本発明法） ＳＡＡ高値の血清試料５例について、本発明によりロッ
ト間の測定値の変動を抑制できることを確認した。先の
実施例ではいずれも希釈液側にＨＤＬを加えたが、本実
施例では第１試薬にウマ血清を加えて効果を確認した。
血清試料を１と同じ希釈液で１００倍に希釈し、第１試
薬として用いる希釈液にウマ血清を加えておく他、試薬
や測定操作は２に準じた。ウマ血清により免疫反応の場
にはＨＤＬ−Ｃとして０．７μg/mlのＨＤＬが供給され
るようにした。結果を表８に示した。試薬ロット間の測
定値の変動は、第１試薬にＨＤＬを加えることによって
も抑制できることが確認された。すなわちＳＡＡとＨＤ
Ｌ必ずしもインキュベーションする必要はなく、免疫反
応の直前にＨＤＬを供給して免疫反応の場に共存しさえ
すれば良いということができる。

【００３４】

【表８】

【００３５】８．血清ＳＡＡの測定６（本発明法） ＳＡＡ高値の血清試料について、本発明により希釈直線
性が改善されることを確認した。血清試料を単なる希釈
液、または１０倍希釈ウマ血清で１−５倍に希釈し、Ｓ
ＡＡ濃度を測定した。希釈操作の他、試薬や操作は２に
準じた。結果を図１（希釈液）、および図２（ウマ血
清）に示した。ウマ血清で希釈した場合には、明らかに
希釈直線性が改善されている。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、従来法によって得られるＳＡＡの希釈
直線性を示すグラフである。縦軸はＳＡＡ濃度(μg/m
l)、横軸は血清試料の希釈倍率（１／ｎ）を示す。

【図２】図２は、本発明法によって得られるＳＡＡの希
釈直線性を示すグラフである。縦軸はＳＡＡ濃度(μg/m
l)、横軸は血清試料の希釈倍率（１／ｎ）を示す。

Claims (11)

【整理番号】 Ｐ−０００３０３ 【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血清アミロイドＡを抗血清アミロイドＡ抗
   体と反応させるのにあたり、反応系に高比重リポ蛋白質
   分画を添加することを特徴とする血清アミロイドＡの免
   疫学的測定法
2. 【請求項２】血清アミロイドＡが、ヒト血液中に含まれ
   るものである請求項１の血清アミロイドＡの免疫学的測
   定法
3. 【請求項３】高比重リポ蛋白質分画が、ヒト、ウマ、ウ
   シ、およびブタからなる群から選択される動物に由来す
   るものである請求項１の血清アミロイドＡの免疫学的測
   定法
4. 【請求項４】添加する高比重リポ蛋白質分画の高比重リ
   ポ蛋白質分画コレステロールを測定した値が、反応液中
   で０．３〜３００μg/ml以上である請求項１の血清アミ
   ロイドＡの免疫学的測定法
5. 【請求項５】添加する高比重リポ蛋白質分画の高比重リ
   ポ蛋白質分画コレステロールを測定した値が、反応液中
   で１０μg/ml以上である請求項４の血清アミロイドＡの
   免疫学的測定法
6. 【請求項６】高比重リポ蛋白質分画として精製した高比
   重リポ蛋白質分画を添加する請求項１の血清アミロイド
   Ａの免疫学的測定法
7. 【請求項７】抗血清アミロイドＡ抗体が、ポリクローナ
   ル抗体、またはモノクローナル抗体である請求項１の血
   清アミロイドＡの免疫学的測定法
8. 【請求項８】免疫学的測定法が、放射免疫測定法、酵素
   免疫検定、粒子凝集免疫測定法、および免疫比濁測定法
   からなる群より選択される請求項１の血清アミロイドＡ
   の免疫学的測定法
9. 【請求項９】血清アミロイドＡを抗血清アミロイドＡ抗
   体と反応させ、両者の結合の程度に基づいて血清アミロ
   イドＡを測定する免疫学的測定法において、反応系に高
   比重リポ蛋白質分画を添加することを特徴とする測定値
   の変動を抑制する方法
10. 【請求項１０】抗血清アミロイドＡ抗体、および高比重
    リポ蛋白質分画とで構成される血清アミロイドＡの免疫
    学的測定用試薬
11. 【請求項１１】抗血清アミロイドＡ抗体が、不溶性粒子
    担体に結合したものである請求項１０の血清アミロイド
    Ａの免疫学的測定用試薬