JP4459299B2 - 可溶性lr11の定量方法 - Google Patents
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Description
しかしながら、体液、たとえば血清成分が存在する系、すなわち血清や血漿を対象として、可溶性LR11と反応する抗体を用いて免疫学的測定を行った場合、何らかの妨害物質の影響により、可溶性LR11が正確に定量できないことが判明した。
従って、本発明の目的は、血清等の生体試料から、何ら煩雑な分離操作をすることなく、簡便かつ正確に免疫学的手段により、生体試料の可溶性LR11を定量する方法を提供することにある。
LR11の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るために、ヒトLR11全長遺伝子が入った構築物である全長LR11ベクターが最適な免疫用抗原遺伝子となるが、そのほか、前記LR11タンパク質の一部断片(ペプチド)をコードする遺伝子が挿入された構築物も免疫用抗原遺伝子として使用できる。DNA免疫法は、上記遺伝子構築物を単独または混合して、免疫動物に対して様々な遺伝子導入法(例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、又は遺伝子銃等)のいずれかを用いて、動物(マウス、又はラット等)の皮下に注入し、細胞内に取り込ませることにより実施できる。
(1)ハイブリドーマの調製
LR11の一部アミノ酸配列[432−447]の合成ペプチド(SMNEENMRSVITFDKG)(配列番号1)のC末端にシステイン残基を導入し、架橋剤のNBS(PIERCE社製)を用いて、KLH(Keyhole lympet hemocyanin)のリジン残基を介して両者を結合させ免疫原とした。この免疫原を完全フロイントアジュバンド(GIBCO社製)と1対1で混和乳化し、0.1mg/0.1mL(エマルジョン)で6週齢の雌BALB/Cマウスの皮下に1週間間隔で10回投与後、最終免疫の3日後に脾臓を摘出した。摘出した脾臓から得られた脾臓細胞と骨髄腫細胞SP2/O−Ag14とを6対1の割合で混合し、PEG/DMSO Solution(SIGMA社製)等の細胞凝集体存在下にて細胞融合させた。融合細胞は脾臓細胞として2.5×106/mLになるようにHAT培地に懸濁し、96穴培養プレート(CORNING社製)に0.2mLずつ分注した。これを5%CO2インキュベーター中で37℃にて培養し、おおよそ2週間後に、ハイブリドーマの生育してきた培養上清について、次に示すELISA法にしたがって、前記の合成ペプチド(配列番号1)に対する抗体の有無を確認し、抗体産生が有望なハイブリドーマ株を選択した。
2週間前にプリスタン0.5mLを腹腔内に注射しておいた12週齢の雌BALB/Cマウスに、上記で得られたハイブリドーマを細胞数0.5×106個の量で腹腔内に投与した。約14日後に腹水を採取し、遠心分離して上清を得た。該上清を等量の吸着用緩衝液(3mol/L NaCl−1.5mol/L Glycine-NaOH、pH8.5)と混和後、濾過した。この濾液を吸着用緩衝液で平衡化したプロテインAカラム(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)に通して抗体をカラムに吸着させた後、0.1mol/Lクエン酸緩衝液(pH3.0)でカラムより溶出させ、抗LR11モノクローナル抗体(A2−2−3抗体)を精製した。
(1)発現ベクターの構築
LR11の全長遺伝子(Q92673)を構成する一部分の遺伝子断片(LR11のアミノ配列〔1000−1550〕(配列番号2)からなるペプチドをコードする遺伝子)を、FLAGタグ付の哺乳動物発現ベクター(pcDNA3.1,Invitrogen社製)に組込んだ。発現ベクターはヒトアルカリフォスファターゼ由来GPIアンカー配列からなるペプチドをコードするDNAを含む。これをLR11[1000−1550]ベクターとした。
構築したLR11[1000−1550]ベクターにより、目的とする遺伝子産物が、設計通りに細胞膜表面に発現するかどうかについて、免疫前にCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣由来)を用いた一過性導入発現実験により確認した。すなわち、前日に6-well plateのwellあたり1×106個の細胞をplatingした。5%CO2、37℃の条件下で一晩培養した。Transfection当日、ポリスチレンラウンドチューブ内でプラスミド希釈液(3μg plasmid DNA+500μL Dulbecco’s Modified Eagle Medium(D−MEM))とlipofectamine2000希釈液(9μLのLipofectamine2000+500μLのD−MEM)を良く混ぜ、室温で20分間インキュベート後、前日にplatingしてあった培養上清を捨て、細胞を剥がさないように静かに細胞に添加した。5%CO2,37℃で5時間インキュベート後、上清を取り除き、5%FCSを含むD−MEM培地を添加後24時間5%CO2,37℃で培養した。
翌日、細胞はDissociation buffer(Invitrogen社)でplateから剥がし、フローサイトメトリー(FCM)解析に使用された。FCM解析は以下のように実施した。すなわち、1次抗体反応は、細胞に3%FCS入りPBS中でANTI−FLAG(登録商標)M2抗体(SIGMA)を4℃、30分間反応させた。2次抗体は、細胞を3%FCS入りPBSで洗浄後、3%FCS入りPBS中でPE標識した抗マウスIgG抗体(Beckman)を4℃、30分間反応させた。細胞を3%FCS入りPBSで洗浄後、適量の3%FCS入りPBSに懸濁し、フローサイトメーターに供した。
この結果、構築したLR11[1000−1550]ベクターにより目的の遺伝子産物が細胞表面に発現していることが確認された。
DNA免疫法は、前記(1)のLR11[1000−1550]ベクターを単独または混合して金粒子に感作したものを、遺伝子銃で免疫動物(マウス又はラット)の皮下に打ち込み、細胞内に取り込ませた。具体的には、Helios(登録商標)Gene Gun Optimization Kit(Bio−Rad)を用い、該キットの使用説明書に従って、25mgの金粒子あたり200μgの前記LR11[1000−1550]ベクターを感作したものを投与した。免疫は2週間おきに4回実施した。4回目の免疫時に、少量の抗血清をサンプリングし、3%FCS入りPBSで1,000倍希釈した抗血清を1次抗体としてFCM解析を行った。この際、前記(2)の目的とする遺伝子産物を一過性発現させたCHO細胞(以下、強制発現細胞ともいう)を用いてFCM解析を行い、抗体価が上昇していることを確認した。また、モノクローナル抗体の作製は一般的な細胞融合法を用いて実施した。すなわち、最終ブースト(final boost)を2回行った後、免疫した動物を解剖し、定法に従い抗体産生細胞を単離してマウス骨髄腫細胞と細胞融合させて抗体産生ハイブリドーマ株を調製した。これらハイブリドーマ株を培養後、その培養上清の一部をとり、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法およびFCMを行った場合、抗原蛋白質に反応するが、非抗原蛋白質には反応しないハイブリドーマ株を選択した。
尚、強制発現細胞を用いた酵素免疫測定法は、次のようにして行った。強制発現細胞を96ウェルプレートにコートし、ハイブリドーマ培養上清を第一抗体として反応させ、第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗体を添加した。ここで、第二抗体とは、第一抗体のマウスイムノグロブリンまたはラットイムノグロブリンを認識できる抗体であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)で標識した抗体である。反応後、第二抗体を標識した酵素に応じた蛍光基質を添加し、蛍光測定プレートリーダーで解析した。
次に、腹水からのモノクローナル抗体の大量調製を次のようにして実施した。プリスタン0.5mLで前処理したヌードマウスに、1×106〜3×106クローン化ハイブリドーマ細胞を含む0.5mLのリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)を腹腔内注射した。およそ2週間後に、腹水を集め、モノクローナル抗体をプロテインAで親和精製した。
こうしてDNA免疫法により抗可溶性LR11マウスモノクローナル抗体(M3)及び(M5)、抗LR11ラットモノクローナル抗体(R14)及び(R23)を精製した。LR11に対する最終的な反応性は、後述する血清から精製した可溶性LR11との反応性により確認した。以上が、DNA免疫法によるモノクローナル抗体の作製例である。
該界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド、アシル−N−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる1種以上である。
このうち、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシアルキレンアルキルフェニルエーテル、アルキルグリコシド、アルキルチオグリコシド及びアシル−N−メチルグルカミンがより好ましく、アシル−N−メチルグルカミンが特に好ましい。
界面活性剤の使用濃度は、用いる種類により適宜決定すれば良いが、例えば試料中0.1〜15質量%、さらに2〜10質量%が好ましい。処理温度は、5〜40℃、特に10〜30℃が好ましく、このときの反応時間は、界面活性剤処理並びに処理検体と抗体の結合を含めて、1〜24時間、更に6〜20時間が好ましい。
また、試料を、1(原液)〜50倍、特に4〜30倍に希釈することが好ましい。このとき、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液等のpH7〜10の中性〜アルカリ性の緩衝液で希釈するのが好ましい。
免疫学的定量方法としては、例えば免疫染色(ウエスタンプロット)、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、サンドイッチELISA法、免疫比濁法(TIAやLTIA)、エンザイムイムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ等が挙げられる。
このとき、抗可溶性LR11抗体と反応する可溶性LR11を、定量又は半定量的に評価する場合、基準となるLR11と比較することが好ましい。基準となるLR11としては、例えば、既知濃度の血清可溶性LR11、平滑筋細胞や神経芽細胞株の培養細胞若しくは培養上清より回収したLR11、リコンビナントLR11、又は抗体作製において免疫原として使用した合成ペプチド等を使用することが好ましい。
ビオチン標識抗体も公知の方法によって作製できるが、市販のビオチン化試薬(例えば、PIERCE社製、Sulfo-NHS-Biotinylation Kit)を用いることで更に容易に作製することができる。
酵素標識アビジンも公知の方法によって作製できるが、市販品(例えば、PIERCE社製、StreptAvidin, Horseradish Peroxidase Conjugated)を使用することもできる。
当該免疫学的測定用キットは、抗可溶性LR11抗体と、上記特定の界面活性剤とを含むが、これら成分が第一試薬と第二試薬として別々の状態、又は混合された状態であってもよい。また、当該キットには、可溶性LR11の検出に用いる任意の構成要素、例えば緩衝液、安定化剤や反応容器等を含んでいてもよい。
ここで、「動脈硬化性疾患」とは、動脈硬化病変の進展に付随して引き起こされる疾患を含む概念である。当該疾患としては、例えば、心筋梗塞、経皮的冠動脈形成術後の再狭窄、脳梗塞、脳出血、大動脈瘤、閉塞性動脈硬化症等が挙げられるが、これらに限定されない。
また、「存在・程度の評価」とは、既に動脈硬化性疾患に罹患している場合に限らず、将来的に罹患する可能性があるか否かを判定する場合も包含する概念である。
このときの判定は、可溶性LR11の濃度変化によってすることができ、例えば、増加傾向を示す場合は疾患(例えば動脈硬化性疾患)の進展、減少又は横ばい傾向を示す場合には疾患の進展が抑制されていると判定される。
ウサギ血清或いはヒト血清中の可溶性LR11の精製は次のようにして実施した。
(可溶性LR11の精製)
ヒトRAP遺伝子を組み込んだpGEX2T(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)ベクターにより形質転換した大腸菌DH5αを培養して、遠心分離により菌体を回収した。3Lの培養液から回収した菌体を、リゾチーム及び界面活性剤TritonX−100(登録商標)を含むリン酸緩衝液(pH7.2)に懸濁して超音波処理により菌体を破砕した。この破砕液の遠心上清中のRAP/GST融合タンパク質をGlutathione Sepharose 4 FF(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)10mLに通し吸着させた後、リン酸緩衝液(PBS,pH7.2)で洗浄しRAP−セファロース樹脂を調製した。
このRAP−セファロース樹脂10mLとウサギ血清またはヒト血清1Lをそれぞれ混和し、4℃で穏やかに撹拌しながら一晩反応させた後、RAP−セファロース樹脂をそれぞれ回収してリン酸緩衝液(pH7.2)で洗浄した。次にクエン酸緩衝液(pH5.0)にてウサギ可溶性LR11またはヒト可溶性LR11をそれぞれ溶出して濃縮後、リン酸緩衝液(pH7.2)で透析して、精製ウサギ可溶性LR11または精製ヒト可溶性LR11とした。
1)血清から精製した可溶性LR11とモノクローナル抗体との反応性
固相化可溶性LR11に対する各モノクローナル抗体の反応性は、次のようにして確認した。まず、マイクロプレート(NUNC社製)に、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.061208)を20mMリン酸緩衝液、pH7.2(PBS)で100倍希釈した液、または精製ヒト可溶性LR11(Lot.061208)をPBSで20倍希釈した液を50μL/ウェル用いてそれぞれの可溶性LR11を一晩固相化した。これを0.05%Tween20(登録商標)含有20mMリン酸緩衝液、pH7.2(BSA−PBST)で洗浄後、1%BSA及び0.05%Tween20(登録商標)含有20mMリン酸緩衝液、pH7.2(BSA−PBST)を1ウェル当たり100μL添加し室温で1時間ブロッキングした。PBSTで洗浄後、これに、ビオチン化試薬(PIERCE社製)にてビオチン標識した各モノクローナル抗体A2−2−3、M3、及びR14をBSA−PBSTで希釈して10μg/mLとした抗体液50μLを添加し、室温で2時間反応させた。PBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)をBSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとした液50μLを添加し、室温で2時間反応させ、PBSTで洗浄後、次いでOPD基質溶液(20mMオルトフェニレンジアミン、12mM過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液pH5.0)50μLを加え、室温で10分間反応させ、1.5N硫酸50μLを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Abs.492nm)で測定した。尚、抗体の反応性の陰性コントロールとしてマウスIgGを用いた。
その結果(図1)、モノクローナル抗体A2−2−3、M3、M5、R14、及びR23は、陰性コントロールであるマウスIgGでは、反応が殆ど認められなかったのに対し、固相化ウサギ可溶性LR11及び固相化ヒト可溶性LR11にそれぞれ反応が認められた。
モノクローナル抗体A2−2−3、M3、M5、R14、またはR23をPBSでそれぞれ5μg/mLに希釈した後、マイクロプレート(NUNC社製)に1ウェル当たり50μLを添加し、一晩固相化した。尚、陰性コントロールとしてマウスIgGも固相化した。これをPBSTにて洗浄後、BSA−PBSTを1ウェル当たり100μL添加し、室温で1時間ブロッキングした。PBSTで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.061208)をBSA−PBSTで25倍希釈した液、または精製ヒト可溶性LR11(Lot.061208)をBSA−PBSTで25倍希釈した液を50μL添加し、室温で2時間反応させた。PBSTで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体A2−2−3、M3、M5、R14、またはR23をBSA−PBSTで希釈して10μg/mLとした抗体液50μL添加し、室温で2時間反応させた(陰性コントロールにはビオチン標識したマウスIgGを用いた)。PBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)をBSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとして50μL添加し、室温で2時間反応させた。PBSTで洗浄後、次いでOPD基質液を50μL添加し、室温で10分間反応させ、1.5N硫酸50μLを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Abs.492nm)で測定した。
固相側抗体M3 −液相側抗体A2−2−3、M5、R14、R23
固相側抗体M5 −液相側抗体A2−2−3、M3、R14、R23
固相側抗体R14 −液相側抗体A2−2−3、M3、M5、R23
固相側抗体R23 −液相側抗体A2−2−3、M3、M5
マイクロプレート(NUNC社製)にPBSで希釈して5μg/mLとしたモノクローナル抗体M3を1ウエルあたり50μL添加して室温で2時間固相化した。PBSTで洗浄後、BSA−PBSTを1ウエルあたり100μg/mL添加し室温で1時間ブロッキングした。PBSTで洗浄後、これに、参考例1で示した方法で精製したウサギ可溶性LR11またはヒト可溶性LR11をBSA−PBSTで希釈して反応させた。PBSTで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体R14をBSA−PBSTで希釈し5μg/mLとして反応させた。PBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)をBSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとして反応させ、PBSTで洗浄後、次いでTMB基質液(0.3mg/mL 3,3’−5,5’−Tetramethyl-benzidine dihydrochloride(SIGMA社製)、12mM過酸化水素を含む0.1Mクエン酸緩衝液、pH3.7)50μLを加え室温で30分間発色させた。その後、1.5N硫酸50μLを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Abs.450nm)で測定した。
その結果、図2及び図3に示すように、精製可溶性LR11を用いれば、抗原濃度すなわちウサギ可溶性LR11またはヒト可溶性LR11濃度を変動させた場合、抗原濃度依存的な反応を得られることが確認された。
まず、マイクロプレート(NUNC社製)にモノクローナル抗体M3をPBSで5μg/mLに希釈して1ウエルあたり50μL添加して室温で2時間固相化した。PBSTで洗浄後、BSA−PBSTを1ウエルあたり100μL添加して室温で1時間ブロッキングした。
PBSTで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.070601)をBSA−PBSTで100倍、200倍、又は400倍希釈したもの、或いは、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.070601)をヒト血清で100倍、200倍、又は400倍希釈したもの50μLをそれぞれ加え、室温で2時間反応させた。
PBSTで洗浄後、ビオチン標識したモノクローナル抗体R14をBSA−PBSTで希釈して5μg/mLとしたもの50μLを加え、室温で2時間反応させた。PBSTで洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)をBSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとしたもの50μLを添加し、室温で2時間反応させ、次いでTMB基質液50μLを加え、室温で30分間発色させた。
その後、1.5N硫酸50μLを加えて発色を停止させた後、マイクロプレートリーダー(Abs.450nm)で測定した。
その結果、図4に示すように、緩衝液ベースではウサギ可溶性LR11の濃度依存的反応が認められたのに対し、ヒト血清ベースでは血清成分の影響により反応阻害を受け検出できなかった。
また、2)で液相の精製ウサギ可溶性LR11及びヒト可溶性LR11を検出することが確認できた抗体のいずれの組み合わせにおいても、同様に血清成分の影響により検出できなかったことから、特定の抗体の組み合わせの場合に限らず、血清成分の影響が認められた。
マイクロプレート(NUNC社製)に、モノクローナル抗体M3をPBSで5μg/mLに希釈して1ウエルあたり50μL添加し、室温で2時間固相化した。
PBSTで洗浄後、BSA−PBSTを1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間ブロッキングした。PBSTで洗浄後、これに、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.070601)が反応時50倍、100倍、200倍希釈になるよう添加(BlankはPBS)したヒト血清(ヒト血清濃度は反応時10倍希釈)を、Tween20(登録商標)、Triton−X100(登録商標)、オクタノイル−N−メチルグルカミン(MEGA−8)、ノナノイル−N−メチルグルカミン(MEGA−9)、コール酸Na、及びn−オクチル−β−D−グルコピラノシドの各界面活性剤3.6%存在下で、1ウエルあたり50μLで室温(15℃〜25℃)で2時間反応させた。
PBSTで洗浄後、ビオチン標識した抗ヒト可溶性LR11モノクローナル抗体R14をBSA−PBSTで希釈して5μg/mLとした標準抗体液を、1ウエルあたり50μL添加して室温で4時間反応させた。これらをPBSTで洗浄後、BSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)を、1ウエルあたり50μL添加して室温で2時間反応させた。
次いで、PBSTで洗浄後、TMB基質液を1ウエルあたり50μL加え室温で30分間発色させた後、1.5N硫酸を1ウエルあたり50μL加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー(Abs.450nm)で測定した。
その結果、図5の如く、界面活性剤Tween20(登録商標)では血清成分の影響を回避できなかったが、Triton−X100(登録商標)、MEGA−8、MEGA−9、コール酸Na、n−オクチル−β−D−グルコピラノシドでは、血清成分の共存下においても、添加したウサギ可溶性LR11(Lot.070601)の濃度依存的な反応が得られ、その効果は、特にMEGA−8及びMEGA−9で顕著であることが判る。尚、図5は試薬Blank値を差し引いたものである。
(MEGA−9濃度変動)
実施例1の5)と同様にして、精製ウサギ可溶性LR11(Lot.070601)をPBSにて50倍、100倍に希釈したものをそれぞれ添加(BlankはPBS)したヒト血清(反応時8倍希釈)を、界面活性剤MEGA−9(0%、2.5%、5%、10%)存在下で反応させた。その結果(図6)、MEGA−9が2.5%〜10%ではほぼ同等の反応が得られ、血清成分の影響を回避して可溶性LR11の測定が可能であることが判る。
実施例2の固相側モノクローナル抗体M3と液相側モノクローナル抗体R14の組み合わせ以外のモノクローナル抗体の組み合わせについて、MEGA−9(0%、2%、4%、5%、7.5%)の効果を確認した。尚、試料はヒト血清(終濃度8倍希釈したもの)である。その結果(図7〜図11)、検討した何れの組み合わせにおいても、MEGA−9の添加により測定値の上昇が認められ、2%〜7.5%でほぼ一定の値が得られたことから、特定の抗体の組合わせに限らず、界面活性剤の添加により血清成分の影響を受けることなく、可溶性LR11の測定が可能であることが判る。
(ヒト血清中可溶性LR11の測定)
精製したウサギ可溶性LR11(Lot.071120)及び蛋白濃度既知の高純度ウシ血清アルブミンを、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動して銀染色しこの染色像をデンシトメトリーで解析して、精製したウサギ可溶性LR11(Lot.071120)のLR11濃度を算出したところ、3.0μg/mLであった。この値付けした精製ウサギ可溶性LR11を標準物質として、下記の方法により測定したヒト血清中の濃度を算出した。
マイクロプレート(NUNC社製)に、モノクローナル抗体M3をPBSで5μg/mLに希釈して1ウエルあたり100μL添加し、室温で2時間固相化した。PBSTで洗浄後、BSA−PBSTを1ウエルあたり200μL添加し、室温で1時間ブロッキングした。
PBSTで洗浄後、これに、3例のヒト血清をPBSで32倍、16倍、8倍、又は4倍にそれぞれ希釈したものを、5%MEGA−9存在下で、1ウエルあたり100μL添加して、室温(15℃〜25℃)で一晩反応させた。
その後、ビオチン標識したモノクローナル抗体R14をBSA−PBSTで希釈して0.4μg/mLとした標準抗体液を、1ウエルあたり100μL添加し、室温で4時間反応させた。これらをPBSTで洗浄後、BSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)を、1ウエルあたり100μL添加し、室温で1時間反応させた。
次いで、PBSTで洗浄後、次いでTMB基質液を1ウエルあたり100μL加え室温で30分間発色させた後、1.5N硫酸を1ウエルあたり100μL加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー(Abs.450nm)で測定した。
その結果(図12)、MEGA−9で処理した場合は、3例の血清全てにおいて血清希釈濃度、すなわち血清中LR11濃度依存的な反応を示し、得られたLR11濃度換算値について、血清希釈32倍から8倍の範囲で良好な希釈直線性が認められた。
(ヒト以外の哺乳動物血清中可溶性LR11の測定)
実施例4の測定方法に準じて、ウサギ、サル、ヤギ、ブタの各血清をMEGA-9で処理した後、サンドイッチELISAで測定した。
その結果、いずれの場合もヒト血清と同様に良好な希釈直線性が認められた(図13A)。これに対し、MEGA-9で処理しなかった場合、サル、ヤギ、ブタの血清では殆ど吸光度増加が認められず、ウサギ血清では吸光度増加が認められるものの、MEGA−9で処理した場合に比べ著しく吸光度の増加割合が小さかった(図13B)。
(ヒト脳髄液中可溶性LR11の測定)
実施例4で使用した値付けした精製ウサギ可溶性LR11を標準物質として、下記の方法により、希釈したヒト脳髄液中の可溶性LR11濃度を算出した。
マイクロプレート(NUNC社製)にモノクローナル抗体M3をPBSで10μg/mLに希釈して、1ウエルあたり100μL添加し、室温で2時間固相化した。PBSTで洗浄後、10%シュークロースを含むBSA−PBSTを、1ウエルあたり200μL添加し、室温で1時間ブロッキングした。このブロッキング液を吸引除去後、プレートを乾燥させた。
これに、3例のヒト脳髄液をPBSで32倍、16倍、8倍、4倍、および2倍にそれぞれ希釈したものを、5%MEGA−9存在下で、1ウエルあたり100μL添加して、室温(15℃〜25℃)で一晩反応させた。
その後、ビオチン標識したモノクローナル抗体R14をBSA−PBSTで希釈して0.4μg/mLとした標識抗体液を、1ウエルあたり100μL添加して室温で4時間反応させた。これらをPBSTで洗浄後、BSA−PBSTで希釈して0.2μg/mLとしたペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン(PIERCE社製)を、1ウエルあたり100μL添加して室温で1時間反応させた。
次いで、PBSTで洗浄後、TMB基質液を1ウエルあたり100μL加えて室温で30分間発色させた後、1.5N硫酸を1ウエルあたり100μL加えて発色を停止させた。これを、マイクロプレートリーダー(Abs.450nm)で測定した。
その結果、MEGA-9で処理した場合は、3例の脳髄液全てにおいて、脳髄液希釈濃度すなわち脳髄液中LR11濃度依存的な反応を示し、得られたLR11濃度換算値について、脳髄液希釈32倍から2倍の範囲で良好な希釈直線性が認められた(図14A)。
これに対し、MEGA-9で処理しなかった場合は、何れの脳髄液でも十分な吸光度増加は見られなかったため、LR11濃度換算値が著しく小さい値となり(図14B)、正確な測定ができていないと考えられた。
Claims (5)
- 哺乳動物由来の血液、血漿、血清又は髄液の試料中の可溶性LR11の免疫学的定量方法であって、試料をポリオキシエチレンC 8 −C 24 アルキルフェニルエーテル、C 8 −C 24 アルキルグリコシド、C 8 −C 24 アルカノイル−N−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤で処理することを特徴とする可溶性LR11の免疫学的測定方法。
- 免疫学的定量方法が、少なくとも2種の異なる抗原認識部位を有する抗体を用いて免疫複合体を形成する工程を含むものである請求項1記載の免疫学的定量方法。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル、n−オクチル−β−D−グルコシド、オクタノイル−N−メチルグルカミン、ノナノイル−N−メチルグルカミン、及びコール酸ナトリウムから選ばれるものである請求項1又は2項記載の免疫学的定量方法。
- 抗可溶性LR11抗体と、ポリオキシエチレンC 8 −C 24 アルキルフェニルエーテル、C 8 −C 24 アルキルグリコシド、C 8 −C 24 アルカノイル−N−メチルグルカミン、及びコール酸塩から選ばれる界面活性剤とを含むことを特徴とする哺乳動物由来の血液、血漿、血清又は髄液を試料とする可溶性LR11免疫学的測定用キット。
- 界面活性剤が、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル、n−オクチル−β−D−グルコシド、オクタノイル−N−メチルグルカミン、ノナノイル−N−メチルグルカミン、及びコール酸ナトリウムから選ばれるものである請求項4項記載の可溶性LR11免疫学的測定用キット。
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