CN112051404A - 一种肌红蛋白检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种肌红蛋白检测试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肌红蛋白检测试剂盒，包括：肌红蛋白校准品、肌红蛋白质控品、包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂和抗肌红蛋白抗体‑碱性磷酸酶标记物试剂；包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，后与抗肌红蛋白抗体偶联；向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭，得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒；将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。本发明提供的试剂盒的检测线性范围较宽，具有较高的灵敏度以及优异的加速稳定性和长期稳定性。

Description

一种肌红蛋白检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种肌红蛋白检测试剂盒及其应用。
背景技术
肌红蛋白是一种氧结合血红蛋白，通常存在于心肌及骨骼肌的细胞质中，其分子量为17.8KD。血红蛋白可协助氧气进入细胞，并可储存部分氧气。
在急性心肌梗塞(AMI)病人中，肌红蛋白的含量水平在两小时内会发生异常，并在6～9小时内达到峰值，之后在发生急性心肌梗塞后的24～36小时内又回到正常水平。因此，肌红蛋白可作为心肌损伤等病症的早期标志物。
目前，国内通常采用的肌红蛋白检测方法或试剂盒虽然成本不高，但是其灵敏度较低，并且线性范围比较窄。中国专利CN109991425A公开的化学发光法检测肌红蛋白的线性范围为3.0～1200ng/ml。中国专利CN105403693A公开的化学发光法的线性范围为10.0～1500ng/ml。
因此，亟需一种肌红蛋白检测试剂盒，以克服现有技术中肌红蛋白检测方法的灵敏度低、线性范围窄以及稳定性差的缺陷。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种肌红蛋白检测试剂盒，以克服现有技术肌红蛋白检测方法的灵敏度低、线性范围窄以及稳定性差的缺陷。本发明提供的肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围可以达到1～3000ng/ml，具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，并具有优良的加速稳定性和长期稳定性。
本发明用于实现上述目的的技术方案如下：
在本发明的一个方面，提供了一种肌红蛋白检测试剂盒，包括：肌红蛋白校准品、肌红蛋白质控品、包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂和抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，得到活化磁珠微粒；
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物；
向所述偶联混合物(所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物)中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭(第一次封闭即为：向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min)；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭(第二次封闭即为：后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min)；得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒；
将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述肌红蛋白校准品中，肌红蛋白的浓度为0～3000ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，包括：
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为(450～550):1进行混合，并在18～31℃下混匀50～70min。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述肌红蛋白校准品的制备方法包括：
将肌红蛋白抗原用第二缓冲液稀释至浓度为0～3000ng/ml；
在本发明的一些优选实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，包括：
将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为1.5～2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；
将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合15～25min，得到所述活化磁珠微粒；
其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为(95～110):1。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述肌红蛋白质控品的制备方法包括：
将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂的制备方法包括：
将10mg的碱性磷酸酶与含有抗肌红蛋白抗体的1mL PBS缓冲液(pH为7.0)混合，后添加浓度为1％的戊二醛溶液，至所述戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，透析，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物；
将所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液中，所述抗肌红蛋白抗体的质量与所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液的体积的比例为1mg:1ml。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2.5。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:2，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:2。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述第一缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷25～100mmol/L、氯化钠150～300mmol/L、牛血清白蛋白0.5％～2％、ProClinTM300 0.03％～0.1％，pH为7.0～8.0。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述第二缓冲液包含：2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)、甘油1％～5％、蔗糖1％～5％、牛血清白蛋白0.5％～2％的、氯化钠150～300mmol/L和ProClinTM300 0.03％～0.1％，pH为6.0～8.0。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述第二缓冲液还可经孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述第三缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷25～100mmol/L、氯化镁0.001～0.01mol/L、氯化锌0.01～0.2mmol/L、氯化钠150～300mmol/L、牛血清白蛋白0.5％～2％、ProClinTM300 0.03％～0.1％和叠氮钠0.05％～0.1％，pH为6.0～7.5。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，包括：
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为500:1进行混合，并在18～31℃下混匀60min。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，包括：
将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；
将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合20min，得到所述活化磁珠微粒；
其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为100:1。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭；得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒，包括：向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭；再经磁分离以移除上清液，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒。
在本发明的另一个方面，提供了一种使用本发明所述肌红蛋白检测试剂盒检测血清中肌红蛋白含量的方法。
本发明所述的各个实施方式中，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液等词语，不表示任何顺序关系，可视为一般名词。
本发明所述的一个或多个技术实施方式，至少具有如下技术效果或优点：
(1)本发明所提供的试剂盒中，通过向所述偶联混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶，以进行两次封闭处理，因而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率高，并使得本发明所提供的肌红蛋白检测试剂盒具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，且具有优良的加速稳定性和长期稳定性。
(2)本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率进一步提高，并使得所述肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围达到1～3000ng/ml，具有更高的灵敏度，并具有更优良的加速稳定性和长期稳定性。
(3)本发明所提供的试剂盒中，对所述肌红蛋白校准品的浓度进行优化，限定了肌红蛋白的浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml，从而进一步提高了检测灵敏性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1示出了本发明所述肌红蛋白检测试剂盒的包被效率评价曲线图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
其中，所述抗肌红蛋白抗体购自海肽生物，其商品编号为4M23-7C3和4M23-4E2；
所述肌红蛋白抗原购自海肽生物，其商品编号8M50；
所述磁珠微粒购自JSR Life Sciences，其商品编号为MS160/Carboxyl；
所述2-吗啉乙磺酸(MES)购自Sigma-Aldrich，其商品编号为01404054；
所述ProClinTM300购自sigma，其商品编号为01376806；
所述EDC购自Adamas，其商品编号为01051900。
本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
在本发明的一个方面，提供了一种肌红蛋白检测试剂盒，包括：肌红蛋白校准品、肌红蛋白质控品、包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂和抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，得到活化磁珠微粒；
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物；
向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭；得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒；
将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
发明人认识到，如果所述第一次封闭和所述第二次封闭的时间过短，则未发生偶联的磁珠表面会发生非特异性吸附。如果所述第一次封闭和所述第二次封闭的时间过长，则会延长产品的生产周期，增加时间成本。发明人经过大量平衡优化试验，在本发明所提供的试剂盒中，通过向所述偶联混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶，以进行两次封闭处理，每次封闭时间为25～35min,因而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率高，并使得本发明所提供的肌红蛋白检测试剂盒具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，且具有优良的加速稳定性和长期稳定性。
此外，发明人还发现，在所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的制备过程中，为了避免非目标物吸附的出现，当得到所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物后，需要进行封闭处理以封闭所述磁珠微粒表面的剩余位点，以避免磁珠微粒对非抗原等其他物质的吸附作用。发明人经过大量平衡优化试验，发现仅通过BSA作为封闭剂进行一次封闭处理并不能完全消除这种非特异性吸附，因而本发明还包括进行第二次封闭处理的步骤，从而能够有效地封闭磁珠表面剩余位点，减少非特异性吸附，提高包被效率。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)。
发明人通过研究发现，在制备包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的过程中，如果包被抗肌红蛋白抗体的磁珠封闭不完全，可能会出现磁珠之间的非特异性吸附，在较长时间的储存过程中磁珠的构象容易发生改变，则抗体的活性就会受到影响，造成检测试剂盒中包被抗体的效率低且试剂盒稳定性下降。而本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率进一步提高，并使得所述肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围达到1～3000ng/ml，具有更高的灵敏度，并具有更优良的加速稳定性和长期稳定性。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，包括：
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为(450～550):1进行混合，并在18～31℃下混匀50～70min。
发明人认识到，所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的质量比例的选择会对对包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率并对试剂盒的长期稳定性和加速稳定性带来一定的影响；本发明通过选择优化，限定了活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的质量比为(450～550):1，从而进一步提高了检测灵敏度，并进一步提高了所述试剂盒的加速稳定性和长期稳定性。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，包括：
将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为1.5～2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；
将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合15～25min，得到所述活化磁珠微粒；
其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为(95～110):1。
发明人通过研究还发现，在包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备过程中，如果磁珠微粒的活化处理与抗肌红蛋白抗体的包被是同时进行的，也就是将磁珠微粒、磁珠微粒活化处理所使用的EDC溶液以及抗肌红蛋白抗体同时混合，则其包被效率较低，并且所得的检测试剂盒的灵敏度较低且线性范围较窄。而如果先用EDC溶液活化所述磁珠微粒上的羧基，然后将经活化后的羧基再与抗肌红蛋白抗体的氨基结合，也就是采用如本发明所提供的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法，则有利于提高包被效率，并使得所述检测试剂盒具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，且具有优良的加速稳定性和长期稳定性。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2.5。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:2，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:2。
发明人经过大量试验证实，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行进一步优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2.5，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:2，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:2；从而使得所述肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围实现最优，具有显著优化的检测灵敏度。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，包括：
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为500:1进行混合，并在18～31℃下混匀60min。
本发明通过进一步选择优化，限定了活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的质量比为500:1，从而显著提高了检测灵敏度，并显著提高了所述试剂盒的加速稳定性和长期稳定性。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述的肌红蛋白检测试剂盒中，所述将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，包括：
将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；
将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合20min，得到所述活化磁珠微粒；
其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为100:1。
本发明通过进一步选择优化，限定了所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为100:1，从而显著提高了所述试剂盒的加速稳定性和长期稳定性。
下面将结合实施例、对照例及实验数据对本申请所述肌红蛋白检测试剂盒进行详细说明。
本发明以下实施例中，所述第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液等词语，不表示任何顺序关系，可视为一般名词。
其中，所述第一缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷25-100mmol/L、氯化钠150-300mmol/L、牛血清白蛋白0.5％～2％、ProClinTM300 0.03％～0.1％，pH为7.0～8.0。
所述第二缓冲液包含：2-吗啉乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)、甘油1％～5％、蔗糖1％～5％、牛血清白蛋白0.5％～2％的、氯化钠150～300mmol/L和ProClinTM300 0.03％～0.1％，pH为6.0～8.0。
所述第三缓冲液包含：三羟甲基氨基甲烷25～100mmol/L、氯化镁0.001～0.01mol/L、氯化锌0.01～0.2mmol/L、氯化钠150～300mmol/L、牛血清白蛋白0.5％～2％、ProClinTM300 0.03％～0.1％和叠氮钠0.05％～0.1％，pH为6.0～7.5。
实施例1：本发明所述肌红蛋白检测试剂盒
本发明所提供的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度为0～3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
(3-1)清洗和活化：将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为1.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合15min，得到所述活化磁珠微粒；其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为95:1。
(3-2)偶联：将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为450:1进行混合，并在18～31℃下混匀50min，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物。
(3-4)向步骤(3-2)得到的活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中添加BSA(所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2)，混合25min，进行第一次封闭；后向所述偶联混合物中添加酪蛋白(所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:1)和明胶(所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:1)，混合25min，进行第二次封闭；再经磁分离以移除上清液，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒。
(3-5)将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；包括：将10mg的碱性磷酸酶与含有抗肌红蛋白抗体的1mL PBS缓冲液混合，后添加浓度为1％的戊二醛溶液至所述戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，透析，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物；
将所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液中，所述抗肌红蛋白抗体的质量与所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液的体积的比例为1mg:1ml。
实施例2：本发明所述肌红蛋白检测试剂盒
本发明所提供的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
(3-1)清洗和活化：将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合25min，得到所述活化磁珠微粒；其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为110:1。
(3-2)偶联：将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为550:1进行混合，并在18～31℃下混匀70min，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物。
(3-4)向步骤(3-2)得到的活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中添加BSA(所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:3)，混合35min，进行第一次封闭；后向所述偶联混合物中添加酪蛋白(所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:3)和明胶(所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:3)，混合35min，进行第二次封闭；再经磁分离以移除上清液，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒。
(3-5)将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；包括：将10mg的碱性磷酸酶与含有抗肌红蛋白抗体的1mL PBS缓冲液混合，后添加浓度为1％的戊二醛溶液至所述戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，透析，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物；
将所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液中，所述抗肌红蛋白抗体的质量与所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液的体积的比例为1mg:1ml。
实施例3：本发明所述肌红蛋白检测试剂盒
本发明所提供的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
(3-1)清洗和活化：将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合25min，得到所述活化磁珠微粒；其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为100:1。
(3-2)偶联：将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为500:1进行混合，并在18～31℃下混匀60min，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物。
(3-4)向步骤(3-2)得到的活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中添加BSA(所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2.5)，混合35min，进行第一次封闭；后向所述偶联混合物中添加酪蛋白(所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:2)和明胶(所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:2)，混合35min，进行第二次封闭；再经磁分离以移除上清液，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒。
(3-5)将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；包括：将10mg的碱性磷酸酶与含有抗肌红蛋白抗体的1mL PBS缓冲液混合，后添加浓度为1％的戊二醛溶液至所述戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，透析，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物；
将所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液中，所述抗肌红蛋白抗体的质量与所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液的体积的比例为1mg:1ml。对比例1：
该对比例的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度为0～3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：将磁珠微粒进行清洗；将清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液、抗肌红蛋白抗体直接混合，即将磁珠活化与磁珠包被同时进行，然后通过加入BSA、酪蛋白和明胶来进行一次性封闭，得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒，后经第一缓冲液稀释，得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液的质量比为95:1；磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为450:1；
BSA、酪蛋白和明胶的添加量如本发明实施例中的添加量可相同。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；该试剂的制备方法包括：将抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂。
对比例2：
该对比例的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
(3-1)清洗和活化：将磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合25min，得到所述活化磁珠微粒；其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为110:1。
(3-2)偶联：将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为550:1进行混合，并在18～31℃下混匀70min，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物。
(3-4)向步骤(3-2)得到的活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中添加BSA(所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:4)，混合35min，进行第一次封闭；后向所述偶联混合物中添加0.5％酪蛋白(所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:0.5)和明胶(所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:3.5)，混合35min，进行第二次封闭；再经磁分离以移除上清液，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒。
(3-5)将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；该试剂的制备方法包括：将抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂。
对比例3：
该对比例的试剂盒包括：
(1)肌红蛋白校准品；
其中，肌红蛋白校准品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
(2)肌红蛋白质控品；
其中，肌红蛋白质控品的制备方法包括：将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
(3)包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂；
其中，包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
(3-1)清洗和活化：将磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合25min，得到所述活化磁珠微粒；其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为110:1。
(3-2)偶联：将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为550:1进行混合，并在18～31℃下混匀70min，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物。
(3-4)向步骤(3-2)得到的活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中添加BSA(所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:1)，混合35min，进行第一次封闭；后向所述偶联混合物中添加酪蛋白(所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:4)和明胶(所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:0.5)，混合35min，进行第二次封闭。
(3-5)将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
(4)抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；该试剂的制备方法包括：将抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂。
实施例4：本发明所述肌红蛋白检测试剂盒的效果验证
将本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒分别进行如下测试：
(1)灵敏度评价
采用本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒分别检测空白样本以及肌红蛋白浓度分别为1.0ng/mL、1.2ng/mL、1.5ng/mL的待测样本，每个样本的检测次数为10次，并计算均值、偏差、变异系数。其中CV值小于10％且偏差值小于10％则符合标准。检测结果如表1所示。
表1：肌红蛋白检测试剂盒的灵敏度评价
Figure BDA0002675329720000161
Figure BDA0002675329720000162
Figure BDA0002675329720000171
由表1可以看出，对比例1得到的试剂盒的CV值和偏差值均较高，但是检测效果不好，具有较低的灵敏度；这表明“将BSA、酪蛋白和明胶直接混合”的一次性封闭工艺所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率低，其试剂盒的灵敏度较低。而对比例2和对比例3的试剂盒中，虽然采用了二次封闭的工艺(即向活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶)，实现了得以改善的CV值和偏差值，但是相比于本发明实施例1～3而言，对比例2和对比例3的试剂盒的检测灵敏度仍然显著较低。
可以看出，在本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率得到提高，使得所述肌红蛋白检测试剂盒的具有较高的灵敏度。
(2)线性评价
采用接近线性区间下限的低浓度样本稀释接近线性区间上限的高浓度样本，得到至少6个稀释浓度的待测样本。将本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒分别对该待测样本进行如下测试：将每个待测样本测定3次，分别求出每个待测样本的检测结果的均值。并以待测样本的浓度为自变量，以检测结果的均值为因变量，求出线性回归方程，并计算线性回归的相关系数(r)，其中r＞0.99符合检测标准。结果如表2所示。
表2：肌红蛋白检测试剂盒的线性评价
Figure BDA0002675329720000172
Figure BDA0002675329720000181
Figure BDA0002675329720000182
Figure BDA0002675329720000183
Figure BDA0002675329720000184
Figure BDA0002675329720000191
Figure BDA0002675329720000192
Figure BDA0002675329720000193
由表2可以看出，对比例1得到的试剂盒的线性相关系数小于0.99，并且相对偏差超过10％，表明“将BSA、酪蛋白和明胶直接混合”的一次性封闭工艺所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率低，其试剂盒的线性相关性较差。而对比例2和对比例3的试剂盒中，虽然采用了二次封闭的工艺(即向活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶)，实现了得以改善的线性相关系数和相对偏差，但是相比于本发明实施例1～3而言，对比例2和对比例3的试剂盒的线性相关性仍然较低。
可以看出，在本发明实施例1～3所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率得到提高，使得所述肌红蛋白检测试剂盒的试剂盒的线性相关性较优，线性相关系数均大于0.99。
(3)长期稳定性评价
分别取本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒在2℃～8℃条件下储存0个月、3个月、6个月、9个月、12个月，测试长期稳定性。结果如表3所示。
表3：肌红蛋白检测试剂盒的长期稳定性评价
长期稳定性 0个月 3个月 6个月 9个月 12个月
对比例1 98％ 91％ 90％ 87％ 72％
对比例2 98％ 90％ 91％ 85％ 72％
对比例3 98％ 91％ 90％ 87％ 72％
实施例1 98％ 96％ 98％ 97％ 98％
实施例2 98％ 96％ 98％ 97％ 98％
实施例3 98％ 97％ 98％ 98％ 98％
由表3可以看出，将本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒进行12个月长期稳定性测试。其结果显示，本发明发明实施例1～3得到的检测试剂盒具有显著较高的长期稳定性。
(4)加速稳定性评价
分别取本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒进行14天加速稳定性测试，测试加速稳定性。结果如表4所示。
表4：肌红蛋白检测试剂盒的加速稳定性评价
Figure BDA0002675329720000201
Figure BDA0002675329720000211
由表4可以看出，将本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒14天加速稳定性测试，其结果显示，本发明发明实施例1～3得到的检测试剂盒具有显著较高的加速稳定性。
(5)包被效率评价
分别采用本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂来检测肌红蛋白校准品。具体步骤为：分别将本发明实施例1～3和对比例1～3得到的肌红蛋白检测试剂盒中的肌红蛋白校准品中的肌红蛋白抗原、包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂和抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂结合形成“三明治”结构复合物，然后向该结构复合物中加入发光底物，该发光底物被碱性磷酸酶分解可产生光子数，可通过发光信号来评价本发明实施例1～3和对比例1～3得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的包被效率，参加图1。
从图1可以看出，对比例1得到的试剂盒测得校准品的发光信号最低；这表明“将BSA、酪蛋白和明胶直接混合”的一次性封闭工艺所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率低。而对比例2和对比例3的试剂盒中，虽然采用了二次封闭的工艺(即向活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶)，发光信号略高于对比例1，但是相比于本发明实施例1～3，对比例2和对比例3的试剂盒的检测发光信号相对较低，包被效率低。而在本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)，从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率最高。
从以上本发明各个实施例可以看出，本发明所述试剂盒至少具有以下有益效果：
(1)本发明所提供的试剂盒中，通过向所述偶联混合物中先添加BSA然后添加酪蛋白和明胶，以进行两次封闭处理，因而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率高，并使得本发明所提供的肌红蛋白检测试剂盒具有较高的灵敏度和较宽的线性范围，且具有优良的加速稳定性和长期稳定性。
(2)本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率进一步提高，并使得所述肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围达到1～3000ng/ml，具有更高的灵敏度，并具有更优良的加速稳定性和长期稳定性。
(3)本发明所提供的试剂盒中，对所述两次封闭处理所使用的BSA以及酪蛋白、明胶的添加量进行进一步优化，限定了所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:2.5，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:2，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:2；从而所得到的包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒的包被效率显著提高，并使得所述肌红蛋白检测试剂盒的检测线性范围达到1～3000ng/ml，具有显著更高的灵敏度，并具有显著优良的加速稳定性和长期稳定性。
(4)本发明通过选择优化，限定了活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的质量比为(450～550):1，并最优选500:1，从而进一步提高了检测灵敏度，并进一步提高了所述试剂盒的加速稳定性和长期稳定性。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：肌红蛋白校准品、肌红蛋白质控品、包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂和抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂的制备方法包括：
将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，得到活化磁珠微粒；
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，得到活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体的偶联混合物；
向所述偶联混合物中添加BSA，混合25～35min，进行第一次封闭；后向经所述第一次封闭的所述偶联混合物中添加酪蛋白和明胶，混合25～35min，进行第二次封闭；得到包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒；
将所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒和第一缓冲液混合，得到所述包被抗肌红蛋白抗体的磁微粒试剂。
2.根据权利要求1所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠微粒与所述BSA的质量比为1:(2～3)。
3.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠微粒与所述酪蛋白的质量比为1:(1～3)，所述磁珠微粒与所述明胶的质量比为1:(1～3)。
4.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述肌红蛋白校准品中，肌红蛋白的浓度为0～3000ng/ml。
5.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体混合，包括：
将所述活化磁珠微粒和抗肌红蛋白抗体以质量比为(450～550):1进行混合，并在18～31℃下混匀50～70min。
6.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述肌红蛋白校准品的制备方法包括：
将肌红蛋白抗原用第二缓冲液稀释至浓度为0～3000ng/ml；
优选地，将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为0ng/ml、70ng/ml、150ng/ml、750ng/ml、1500ng/ml、3000ng/ml。
7.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述将磁珠微粒依次进行清洗和活化处理，包括：
将所述磁珠微粒用浓度为0.1mol/L的MES清洗3次，后用浓度为0.1mol/L的MES重悬，至所述磁珠微粒的浓度为1.5～2.5mg/ml，得到清洗后的磁珠微粒；
将所述清洗后的磁珠微粒与浓度为10mg/ml的EDC溶液混合15～25min，得到所述活化磁珠微粒；
其中，所述磁珠微粒与所述EDC溶液的质量比为(95～110):1。
8.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述肌红蛋白质控品的制备方法包括：
将肌红蛋白抗原用所述第二缓冲液稀释至浓度分别为60ng/ml和750ng/ml。
9.根据权利要求1或2所述的肌红蛋白检测试剂盒，其特征在于，所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂的制备方法包括：
将10mg的碱性磷酸酶与含有抗肌红蛋白抗体的1mL PBS缓冲液混合，后添加浓度为1％的戊二醛溶液至所述戊二醛溶液的最终浓度为0.2％，透析，得到抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物；
将所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物用第三缓冲液稀释250倍，得到所述抗肌红蛋白抗体-碱性磷酸酶标记物试剂；
其中，所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液中，所述抗肌红蛋白抗体的质量与所述含有抗肌红蛋白抗体的PBS缓冲液的体积的比例为1mg:1ml。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的肌红蛋白检测试剂盒在检测血清或血浆中肌红蛋白含量中的应用。
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