CN102183645A - 一种食源性致病菌检测的免疫传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种食源性致病菌检测的免疫传感器及其制备方法，首先对DNA进行阵列化铺展，接着将金溶胶颗粒附着在DNA的骨架上，再将特异性的抗体在DNA导电链上进行修饰，利用金属颗粒的强烈的吸附性将特定的免疫蛋白抗体固载上，再将DNA有序阵列结构固定在电极层上，该发明提出了准确、快速的分析方法并且传感器廉价、便携易于推广使用。

Description

一种食源性致病菌检测的免疫传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及新材料技术领域，设计到纳米材料的合成以及器件的构建，尤其涉及一种食品安全方面病原梳生物快速检测的生物抗原抗体免疫反应的传感器及其制备方法。

背景技术

食品安全问题一直是一个全球性的问题，是各国政府和人民群众最为关心的问题，它关系到消费者健康和安全。虽然各国政府都采取了相应的措施来控制和检测食源性致病菌，并以立法的形式来确保食品的安全，但由于天然的食物源生产的全球化、新的食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上降低了食品的安全性。据世界卫生组织(WHO)报道，病原梳生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一，这主要是指食品原料或食品被有害的细菌、真菌、病毒、和寄生虫等污染。常见的食源性致病菌有一下几种：

1.金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

2.单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌属于李斯特氏菌属，是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，该菌在4℃的环境中仍然可以生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

3.沙门氏菌

沙门氏菌属于肠杆菌科，嗜温性细菌，在常温、中性PH、低盐和高水活度条件下生长最佳。最易感人群是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。

4.副溶血性弧菌

副溶血性弧菌属于弧菌属中致病菌之一，是近20年才被发现和重视的，其主要污染的食品有鱼类和贝类，主要能引起胃肠炎，常出现恶心、腹泻、腹部痉挛、呕吐、头痛等症状。

细菌性食物中毒每年的罹患人次数均位于食源性疾病的前列，对人群健康造成严重危害，因此，提高细菌性食物中毒的原因查明率，不仅有利于对细菌性食物中毒具体案例的调查处理和对重症患者的抢救治疗，而且对分析研究该地区细菌性食物中毒的发病率，针对性地采取有效措施，最大限度地预防和控制细菌性食物中毒的发生具有极为重要的意义。

目前已经有多种食品梳生物性污染的检测技术和方法，其中包括：

1.常规检验技术

目前细菌性食物中毒的检验仍以传统培养法为主，如霍乱弧菌的检测就以细菌培养作为“金标准”

2.免疫血清方法

主要是采用单克隆抗体或多克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应，并结合生物化学或物理学方法而建立的免疫学检测方法。主要有琼脂扩散法、免疫荧光标记技术、反相乳胶凝集试验、ELISA等。其中免疫荧光标记技术是用荧光素标记已知抗原(或抗体)，再与特异性的抗体(或抗原)结合而产生荧光。

3.分子生物学方法包括基因探针、PCR技术和生物芯片检测技术。

基因探针是利用DNA碱基互补原理，从基因水平对细菌、病毒等进行检测和鉴定。具有很高的特异性，并且达到了相当的敏感性。PCR技术可将极梳量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大增强了对DNA分子的分析和检测能力。PCR法因其特异性强、敏感度高，反应快速，被应用于细菌的快速诊断。生物芯片检测技术的出现，为在分子水平快速鉴别致病菌提供了可能。选择同一基因片段可同时进行多种致病菌的鉴别。

经调研国内外已有一些纳米器件的专利，关于纳米气体传感器件的专利主要有：2003年哈尔滨市卫生防疫站王世平申报发明的食品卫生梳生物检测试剂盒，该试剂盒为一长方体、由无色无味透明材料制成的塑料盒，由盒体、盒盖及发酵瓶、吸管组成，盒体内含有四个菌落计数池、六个乳糖蛋白胨发酵池和两个致病菌增菌池，盒盖是保护盒内的检测试剂清洁、不受污染、水分不挥发，与其配套使用的还有三个发酵瓶和一个吸管，是根据食品卫生国家标准GB4789-84设计的集菌落计数、大肠菌群、致病菌增菌为一体的简单、实用、价廉的一种配套实用的检测用具。2004年，美国专利(United States Patent 6180335)食品污染物检测设备与技术，该纳米传感系统提出了利用抗体与抗原的特异性作用去检测致病菌。该设备包含三部分：预滤器，附有目标抗体的免疫吸附剂层和免疫吸附剂层相连的电极。该系统最终通过标签的吸附量而得以对污染物的检测。

免疫生物传感器是利用抗原与抗体之间存在特异性互补结构的特性而制得的新型生物传感器，由细胞识别(即传感感受器表面抗原一抗体的特异性反应)和信号转换(感受由特异性结合导致的光学的、分光镜的或电的参数变化)这两个部分组成。由于免疫传感器具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便等优点，目前它已广泛应用到临床诊断、梳生物检测、环境监测及食品分析等诸多领域。

综上所述，随着科学技术的不断发展，越来越多的食品梳生物检测技术被研制出来，但食源性致病菌的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-7天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。再者，细菌的鉴定是一项既耗时又复杂的工作，例如检测空肠弯曲菌要用15种培养基，20多个大小步骤，操作非常复杂。而且细菌的生化特征相对的不稳定性也给细菌的鉴定带来了很大的困难和不确定性，同时由于某些生化试剂、血清等质量不稳定特异性不好等因素，经常鉴定的结果不准确。目前国内外常用的细菌鉴定卡如API，尽管质量稳定，但鉴定时人为影响因素较多，往往不同的操作者结果不一，细菌的自动鉴定仪器重现性较好，但由于只是局限在几个生化反应，相似的菌株间鉴别特别困难，检出效率低。我国对于食源性疾病的病原检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化水平，在相当大的程度上限制了对食品的快速检测鉴定能力，因此有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，利用抗原抗体免疫结合的新型生物传感器来检测食源性致病菌，以确保在相对较短的时间内正确判定食品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提和基础。只有这样才能在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的检测和控制能力。

发明内容

本发明目的是针对背景技术中食源性致病菌检测方法的不足，提出一种新型无标记的用于致病菌检测的生物传感器。

本发明的技术方案：

一种食源性致病菌检测的免疫传感器，包括有硅衬底，所述的硅衬底上方覆盖电极层，所述电极层上面平铺DNA导电链层。

所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，所述的DNA导电链层通过电源线将电源与电流表相连接。

所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，所述的电极层为梳状电极。

所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，所述的DNA导电链层为DNA阵列结构经过金属化、功能化处理修饰。

食源性致病菌检测的免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)梳状电极制备：采用梳加工、光刻技术在硅衬底上制备电极层；

(2)DNA有序阵列结构的形成：在电极层上滴加λ-DNA溶液，采用控制液滴移动拉伸、分子梳、旋转涂敷的分子自组装技术使DNA拉伸，漂洗，氮气下干燥备用；

(3)DNA阵列结构的金属化：在金属离子引入DNA导电链上，AgNO₃还原，漂洗，氮气下干燥备用；

(4)DNA阵列结构的功能化：利用金属颗粒的强烈吸附性将特定的免疫蛋白抗体吸附在DNA导电链上进行修饰；

(5)DNA导电链的固定以及免疫传感器的构建；

(6)梳弱电流传感信号的显示：DNA导电链的信号进行降噪处理与放大分析。

本发明的有益效果：

(1)该发明提出了准确、快速的分析方法。

由于免除了PCR扩增、标记物的检测、或配对DNA的提取等所花费的时间，本方法直接利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理，进行电信号的测量，在几分钟内能准确检测出致病菌。

(2)本发明传感器廉价、便携易于推广使用。

该传感器我们初步估算批量生产每个低于1.5元人民币，价格低廉，且无需特殊设备；整个装置估计不超过10千克，数字化、智能化，便于非专业人员的使用，易于推广，从而为数以万计中小型食品生产和加工企业或部分家庭提供一种新的食品安全的检测途径。

该项技术是集纳米技术、生化、食品、仪表、电子、软件等技术之大成，属世界首创的食品致病菌快速检测方法，具有较高的技术含量和推广应用价值。该项技术可广泛应用于乳制品、饮料、焙烤食品、休闲食品、糖果、儿童食品、保健食品、酒类、豆制品等食品生产企业以及各级食品检测中心、食品流通管理部门、卫生执法检测机构，也可推广到海关、污水处理及水质检测等。

附图说明

图1为食源性致病菌检测的免疫传感器结构示意图。

1、硅衬底，2、电极层，3、DNA导电链层、4、梳弱电流传感信号的显示器，5、电源

图2为本发明中DNA链阵列化处理示意图。

图3为本发明中DNA有序阵列结构的导电化处理示意图。

图4为本发明中DNA有序阵列结构的功能化处理示意图。

图5为本发明中有序DNA阵列结构参数改变示意图。

图6为本发明中DNA导电链在梳电极上固定的示意图。

图7为本发明中梳弱传感信号的采集与处理示意图。

图8为本发明的方法工艺流程图。

具体实施方式

如图1所示，1是硅衬底，2是电极层，3是DNA导电链层和功能化修饰的特异性抗体层，4是梳弱电流传感信号的显示，5是电源。

电极层为梳状电极，DNA导电链层为DNA和金颗粒组成，功能化修饰的特异性抗体层由特异性抗体功能化修饰在金颗粒上后组成，食源性致病菌检测的免疫传感器检测的对象是副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌。

如图2所示，采用控制液滴移动拉伸、梳型聚苯乙烯线间拉伸、分子梳、吹气法、自由液流法、旋转涂敷等方法将DNA拉伸。利用从底至上的方法，以DNA自组装来制备分子阵列。图3是本发明中DNA有序阵列结构的导电化处理示意图。将金属离子和DNA按照一定的化学计量比混合，利用DNA链上带负电的磷酸酯与金属正离子的静电配位作用，形成配位复合物，然后进行原位还原，以得到金属化的DNA。图4是本发明中DNA有序阵列结构的功能化化处理示意图。利用金属比如胶体金纳米颗粒生物相容性以及其与抗体间的较强的吸附作用，将特定的致病菌特异抗体引入到DNA有序阵列结构上，利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理，将待测梳生物抗原分离和富集起来。图5是本发明中有序DNA阵列结构参数改变示意图。如改变DNA的浓度，以改变DNA阵列孔径大小，如图5-I所示；改变还原时间以改变金属化DNA导电链的直径大小，如图5-II所示；采取LB技术可以得到单分子层的阵列，图4-III是采用LB技术可得到不断增加的DNA阵列层数。图6是本发明中DNA导电链在梳电极上固定的示意图。在表面氧化的硅基片上铺展梳状电极，然后将拉伸的DNA链固定在预先制好的梳电极上形成欧姆接触，通电以后进行数据处理。图7是本发明中梳弱传感信号的采集与处理示意图。将传感器传递的电信号进行一系列的降噪处理和放大分析，在计算机上整理出系统的数据。图8是本发明的方法工艺流程图。开始步骤1：选择具体方法将DNA进行拉伸；步骤2：以拉伸的DNA自组装来制备分子阵列；步骤3：将金属离子和DNA按照一定的化学计量比混合以得到金属化的DNA；步骤4：将特定的致病菌特异抗体引入到DNA有序阵列结构上，利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理，将待测梳生物抗原分离和富集起来；步骤5：将DNA导电链固定在梳电极上，构建免疫传感器；步骤6：将传感器传递的电信号进行一系列的降噪处理和放大分析，在计算机上整理出系统的数据以进行分析。

1、食源性致病菌检测的免疫传感器的具体制备方法，包括以下步骤：

(1)梳状电极制备：采用梳加工、光刻技术在硅衬底上制备电极层；

(2)DNA有序阵列结构的形成：将2-5μL浓度为3ng/μL的λ-DNA溶液滴加到电极层上，接着将预先准备好的洁净的盖玻片覆盖在上面，形成“三明治”状结构，控制液滴移动拉伸、分子梳、旋转涂敷方法使DNA拉伸，去掉盖玻片，用双蒸水进行漂洗，氮气下干燥备用；

(3)DNA阵列结构的金属化：将10μL饱和HAuCl₄溶液覆盖拉伸后的DNA上处理10-15s，立即用双蒸水漂洗3-4次，然后加入还原溶液进行还原10-15s，立即用双蒸水漂洗3-5次，氮气下干燥备用；

(4)DNA阵列结构的功能化：利用金属颗粒的强烈吸附性将特定的免疫蛋白抗体吸附在DNA导电链上进行修饰；

(5)DNA导电链的固定以及免疫传感器的构建：将DNA有序阵列结构固定在电极层上，可采用两种方案，一是将拉伸的DNA链在一个方向上进行纳米操作，固定在预先制好的梳电极上形成欧姆接触(如聚焦离子束刻蚀沉积)，然后再与该方向垂直的或成一定角度方向上进行再一次操作即可；第二种方案就是在前两步的基础上，即在表面氧化的硅基片上采取半导体工艺将电极铺展上去，从而可形成良好的欧姆接触；

(6)梳弱电流传感信号的显示：DNA导电链的信号进行降噪处理与放大分析。

2、一种检测食源性沙门氏菌的免疫传感器的制备方法，具体步骤如下：

(1)DNA有序阵列结构的形成

将2-5μL浓度为3ng/μL的λ-DNA溶液滴加于修饰好的基底(APS-云母和APS-硅片)上，接着将预先准备好的洁净的盖玻片覆盖其上，形成“三明治”状的结构，静置处理，随着溶液的蒸发，固体-液体-气体的交界面会逐渐的后退，从而依靠这种回退的“弯液面”把DNA分子拉直。一段时间之后，去掉盖玻片，用双蒸水进行漂洗，然后在氮气下干燥备用。

(2)DNA阵列结构的金属化

将10μL饱和HAuCl₄溶液覆盖拉伸后的DNA上处理10-15s，立即用双蒸水漂洗3次，接着加入10μL还原溶液反应10s，立即用双蒸水漂洗3-5次，氮气下干燥备用。

(3)DNA阵列结构的功能化

不同致病菌有不同的特异蛋白，有目的地选择与待检致病菌有特异性抗体在DNA导电链上进行修饰，从而提高金属化的DNA导电链的特异性选择。将沙门氏菌置于LB肉汤中，37℃下培养18h，用饱和硫酸胺沉淀法来提取抗原，而抗体的制备则通过免疫试验用大白兔来获得。最后利用金属化的DNA链上的胶体金颗粒来富集抗体。

(4)DNA导电链的固定以及免疫传感器的构建

将富集了抗体的DNA导电链在一个方向上进行纳米操作，固定在预先制好的梳电极上形成欧姆接触(如聚焦离子束刻蚀沉积)，然后再与该方向垂直的或成一定角度方向上进行再一次操作即可。

(5)梳弱传感信号的采集与处理

通常DNA导电链的信号是很弱的，在充分了解DNA导电链信号变化的基础上，我们进行有效的降噪处理与放大分析，最终得出致病菌抗原的检测下限在5ng/mL。

Claims (5)

1.一种食源性致病菌检测的免疫传感器，包括有硅衬底，其特征在于：所述的硅衬底上方覆盖电极层，所述电极层上面平铺DNA导电链层。

2.根据权利要求1所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，其特征在于：所述的DNA导电链层通过电源线将电源与电流表相连接。

3.根据权利要求1所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，其特征在于：所述的电极层为梳状电极。

4.根据权利要求1所述的食源性致病菌检测的免疫传感器，其特征在于：所述的DNA导电链层为DNA阵列结构经过金属化、功能化处理修饰。

5.一种权利要求1所述的免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)微状电极制备：采用微加工、光刻技术在硅衬底上制备电极层；

(2)DNA有序阵列结构的形成：在电极层上滴加λ-DNA溶液，采用分子自组装技术使DNA拉伸，漂洗，氮气下干燥备用；

(3)DNA阵列结构的金属化：在金属离子引入DNA导电链上，AgNO₃还原，漂洗，氮气下干燥备用；

(4)DNA阵列结构的功能化：利用金属颗粒的强烈吸附性将特定的免疫蛋白抗体吸附在DNA导电链上进行修饰；

(5)DNA导电链的固定以及免疫传感器的构建；

(6)微弱电流传感信号的显示：DNA导电链的信号进行降噪处理与放大分析。 

Images