CN102539754A - 一种生物免疫传感器及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物免疫传感器及其检测方法，其主要是通过抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理来实现食品中致病菌电信号检测的新型传感技术，本发明方法是准确、快速；而且本发明产品廉价、便携、易于推广。

Description

一种生物免疫传感器及其检测方法

技术领域

本发明属于一项分析检测技术，涉及到纳米材料的合成以及检测应用，特别是涉及一种用于检测食品致病微生物的生物免疫传感器及其检测方法。

背景技术

食品安全问题一直是一个全球性的问题，是各国政府和人民群众最为关心的问题，它关系到消费者健康和安全。虽然各国政府都采取了相应的措施来控制和检测食源性致病菌，并以立法的形式来确保食品的安全，但由于天然的食物源生产的全球化、新的食品生产工艺的应用、人们饮食习惯的改变等各种因素在一定程度上降低了食品的安全性。据世界卫生组织(WHO)报道，病原微生物引起的食源性疾病是影响食品安全的最主要的因素之一，这主要是指食品原料或食品被有害的细菌、真菌、病毒、和寄生虫等污染。常见的食源性致病菌有以下几种：

1.金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。

2.单核细胞增生李斯特氏菌

单核细胞增生李斯特氏菌属于李斯特氏菌属，是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，该菌在4℃的环境中仍然可以生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。

3.沙门氏菌

沙门氏菌属于肠杆菌科，嗜温性细菌，在常温、中性PH、低盐和高水活度条件下生长最佳。最易感人群是年幼儿童、虚弱者、年长老人、免疫缺陷者等。

4.副溶血性弧菌

副溶血性弧菌属于弧菌属中致病菌之一，是近20年才被发现和重视的，其主要污染的食品有鱼类和贝类，主要能引起胃肠炎，常出现恶心、腹泻、腹部痉挛、呕吐、头痛等症状。

细菌性食物中毒每年的罹患人次数均位于食源性疾病的前列，对人群健康造成严重危害，因此，提高细菌性食物中毒的原因查明率，不仅有利于对细菌性食物中毒具体案例的调查处理和对重症患者的抢救治疗，而且对分析研究该地区细菌性食物中毒的发病率，针对性地采取有效措施，最大限度地预防和控制细菌性食物中毒的发生具有极为重要的意义。

当前对副溶血弧菌的检测方法有如下几种技术：

1.常规检验技术

目前细菌性食物中毒的检验仍以传统培养法为主，如霍乱弧菌的检测就以细菌培养作为“金标准”。

2.免疫血清方法

主要是采用单克隆抗体或多克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应，并结合生物化学或物理学方法而建立的免疫学检测方法。主要有琼脂扩散法、免疫荧光标记技术、反相乳胶凝集试验、ELISA等。其中免疫荧光标记技术是用荧光素标记已知抗原(或抗体)，再与特异性的抗体(或抗原)结合而产生荧光。

3.分子生物学方法包括基因探针、PCR技术和生物芯片检测技术。

基因探针是利用DNA碱基互补原理，从基因水平对细菌、病毒等进行检测和鉴定。具有很高的特异性，并且达到了相当的敏感性。PCR技术可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大增强了对DNA分子的分析和检测能力。PCR法因其特异性强、敏感度高，反应快速，被应用于细菌的快速诊断。生物芯片检测技术的出现，为在分子水平快速鉴别致病菌提供了可能。选择同一基因片段可同时进行多种致病菌的鉴别。

经调研国内外已有一些纳米器件的专利，关于纳米气体传感器件的专利主要有：2003年哈尔滨市卫生防疫站王世平申报发明的食品卫生微生物检测试剂盒，该试剂盒为一长方体、由无色无味透明材料制成的塑料盒，由盒体、盒盖及发酵瓶、吸管组成，盒体内含有四个菌落计数池、六个乳糖蛋白胨发酵池和两个致病菌增菌池，盒盖是保护盒内的检测试剂清洁、不受污染、水分不挥发，与其配套使用的还有三个发酵瓶和一个吸管，是根据食品卫生国家标准GB4789-84设计的集菌落计数、大肠菌群、致病菌增菌为一体的简单、实用、价廉的一种配套实用的检测用具。2004年，美国专利(United States Patent 6180335)食品污染物检测设备与技术，该纳米传感系统提出了利用抗体与抗原的特异性作用去检测致病菌。该设备包含三部分：预滤器，附有目标抗体的免疫吸附剂层和免疫吸附剂层相连的电极。该系统最终通过标签的吸附量而得以对污染物的检测。

免疫生物传感器是利用抗原与抗体之间存在特异性互补结构的特性而制得的新型生物传感器，由细胞识别(即传感感受器表面抗原一抗体的特异性反应)和信号转换(感受由特异性结合导致的光学的、分光镜的或电的参数变化)这两个部分组成。由于免疫传感器具有分析灵敏度高、特异性强、使用简便等优点，目前它已广泛应用到临床诊断、微生物检测、环境监测及食品分析等诸多领域。

综上所述，随着科学技术的不断发展，越来越多的食品微生物检测技术被研制出来，但食源性致病菌的传统检测方法除操作繁琐外，检验时间也较长，一般需要5-7天的培养鉴定时间，时间上不能满足快速检测的要求。再者，细菌的鉴定是一项既耗时又复杂的工作，例如检测空肠弯曲菌要用15种培养基，20多个大小步骤，操作非常复杂。而且细菌的生化特征相对的不稳定性也给细菌的鉴定带来了很大的困难和不确定性，同时由于某些生化试剂、血清等质量不稳定特异性不好等因素，经常鉴定的结果不准确。目前国内外常用的细菌鉴定卡如API，尽管质量稳定，但鉴定时人为影响因素较多，往往不同的操作者结果不一，细菌的自动鉴定仪器重现性较好，但由于只是局限在几个生化反应，相似的菌株间鉴别特别困难，检出效率低。我国对于食源性疾病的病原检测、鉴定手段仍停留在培养、血清和生化水平，在相当大的程度上限制了对食品的快速检测鉴定能力，因此有必要建立起食源性致病菌的高通量、快速、准确的监测体系，利用抗原抗体免疫结合的新型生物传感器来检测食源性致病菌，以确保在相对较短的时间内正确判定食品的安全性，这是有效地预防和控制食源性疾病的重要前提和基础。只有这样才能在一定程度上提前消除由于食品中的致病菌所造成的危害，提高食源性疾病的检测和控制能力。

发明内容

针对背景技术中食源性致病菌检测方法的不足，本发明提出一种新型无标记的用于致病菌检测的生物传感器来实时检测致病菌的存在；通过此方法制备的生物传感器可在复杂环境中对副溶血弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特氏菌等致病细菌的快速检测方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

生物免疫传感器，其特征在于所述的生物免疫传感器将生物学免疫技术和纳米技术完美有机结合，利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理来实现食品中致病菌电信号检测的新型传感技术。

所述的生物免疫传感器的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)称取5gCNT，加入55-65mL，2.0mol/L的HCl，超声处理3.5-4.5h，用微孔滤膜过滤，然后采用双蒸水反复洗涤至中性，95-105℃下干燥成粉末待用，采用硝酸回流法对MWCNT进行羧基化处理，具体方法为：将3gMWCNTs至于在4M的硝酸中，然后在加热搅拌的条件下冷凝回流24h，回流结束后用孔径为0.2微米的微孔滤膜过滤，并用二次水反复洗涤，至其PH值为中性为止，所得产物于真空干燥箱中在55-65℃下干燥15-20h待用，将羧化的CNT在石英研钵中研磨成粉末，称取1.0g于100℃干燥50-70min，去除物理吸附水，冷却后，加入到100mL二氯甲烷中，超声9-11min，之后，再加入0.5gAPTMS，于氮气环境下搅拌回流反应过夜，然后，过滤出固体物质后，分别用二硫化碳、四氢吠喃和乙醇洗涤三次，以除去多余的有机物，再将制得的沉淀物质在58-62℃真空环境下干燥3.5-4.5h，得黑色的巯基修饰的碳纳米管(MWCNT-SH)备用；

(2)金纳米颗粒的制备采用柠檬酸钠还原氯金酸法实现，在洁净的三口烧瓶中加入90-110mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液，在冷凝回流条件下加热至沸腾，快速加入2.5-3.5mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，30min后停止加热，然后采用一次性离心管对产物进行离心14-16min，控制离心管的转速12000rpm，洗涤一次；

(3)量取100ml粒径为15nm的金溶胶于反应器中，并搅拌，随后称取MWCNT-SH 0.1g加入，常温搅拌反应3.5-4.5h，之后离心、洗涤，再经真空常温干燥，称量，备用；

(4)称取0.01mg Au-MWCNT杂合材料，加入1ml水中，超声50-70min，取1μl悬浊液滴于20μM间距的梳状电极表面，室温下干燥，然后置于管式炉中在280-320℃、高纯Ar气保护条件下烧结25-35min，制备好的Au-MWCNT修饰的电极在固定电压1V的条件下测量其电流信号；

(5)把电极置于1×PBS稀释10倍的免疫血清溶液中吸附抗体，过夜，把电极取出，用双蒸水轻轻漂洗3-4次；

(6)用1％的牛血清白蛋白和1％的Tween 20作为封闭液，封闭免疫血清修饰的电极2-3h，于室温下干燥，制备得到免疫电极，然后测电流信号；

(7)把制备好的免疫电极置于5ng/ml的抗原蛋白溶液中培育过夜，然后取出用双蒸水轻轻漂洗3-4次，于室温下干燥，再次测量抗体抗原反应后的电流信号，即实现了抗原的检测。

所述的生物免疫传感器，其特征在于：所述的生物免疫传感器可以检测副溶血弧菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌食品致病微生物。

本发明的有益效果：

(1)该发明提出了准确、快速的分析方法

由于免除了PCR扩增、标记物的检测、或配对DNA的提取等所花费的时间，本方法直接利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理，进行电信号的测量，在几分钟内能准确检测出致病菌。

(2)本发明廉价、便携、易于推广

该传感器我们初步估算批量生产每个低于1.5元人民币，价格低廉，且无需特殊设备；整个装置估计不超过10千克，数字化、智能化，便于非专业人员的使用，易于推广，从而为数以万计中小型食品生产和加工企业或部分家庭提供一种新的食品安全的检测途径。

该项技术是集纳米技术、生化、食品、仪表、电子、软件等方面的技术，是很先进的食品致病菌快速检测方法，具有较高的技术含量和推广应用价值。该项技术可广泛应用于乳制品、饮料、焙烤食品、休闲食品、糖果、儿童食品、保食品、酒类、豆制品等食品生产企业以及各级食品检测中心、食品流通管理部门、卫生执法检测机构，也可推广到海关、污水处理及水质检测等。

附图说明

图1本发明中所采用的梳状电极，图中1为梳状电极。

图2本发明制备的金纳米颗粒。

图3表示本发明中对MWCNTs进行功能化处理的具体实施步骤为先氧化，然后巯基化。

图4本发明中所制备的MWCNTs的金纳米颗粒的透射电子显微镜图。

图5是本发明中所制备的MWCNTs的金纳米颗粒的电子能谱图。

图6是本发明中所制备的MWCNTs-Au的紫外吸收光谱图。

图7是本发明中所制备的MWCNTs-Au在梳状电极上铺展后的扫描电镜图。

图8所制备的传感器的微弱信号的信号采集与处理图。

图9功能化的MWCNTs结合金纳米颗粒后与抗体抗原之间的反应示意图

图10本发明的工艺流程图。

图11在干态条件下采用本发明对副溶血弧菌的检测的数据处理图。

图12BSA封闭的Au-MWCNT修饰电极对5ng抗原的响应

具体实施方式

实施例1：下面结合附图对本发明再做进一步说明

1、主要溶液配制

20×PBS缓冲液配制

加水溶解，定容至2000ml，121℃高压20min。

1×PBST缓冲液配制

充分混匀，保存于棕色瓶中。

封闭液配制

取0.01g牛血清白蛋白(BSA)溶于1ml 1×PBST缓冲液中，现配现用。

2、获得的抗原蛋白浓度为2.26mg/ml，分装于洁净无菌的Ep管中，冻存于-80℃。琼扩实验结果显示肠炎蛋白免疫血清的效价在1∶32，免疫血清同样分装至洁净Ep管中，冻存于-80℃。待后续检测分管取用。

3、金纳米颗粒的制备采用柠檬酸钠还原氯金酸法实现。在洁净的三口烧瓶中加入100mL质量分数为0.01％的氯金酸溶液，在冷凝回流条件下加热至沸腾，快速加入3mL质量分数为1％柠檬酸钠溶液，30分钟后停止加热，然后采用1.5mL的一次性离心管对产物进行离心(12000rpm，15min，4℃)，洗涤一次。

4、MWCNT的表面处理：称取5gCNT，加入60mL，2.0mol/L的HCl，超声4h，用微孔滤膜过滤，然后采用双蒸水反复洗涤至中性，100℃下干燥成粉末待用。本实验中采用硝酸回流法对MWCNT进行羧基化处理。具体方法为，将3gMWCNTs至于在4M的硝酸中，然后在加热搅拌的条件下冷凝回流24小时，回流结束后用孔径为0.2微米的微孔滤膜过滤，并用二次水反复洗涤，至其PH值为中性为止，所得产物于真空干燥箱中在60℃下干燥18小时待用。将羧化的CNT在石英研钵中研磨成粉末，称取1.0g于100℃干燥1h，去除物理吸附水。冷却后，加入到100mL二氯甲烷中，超声10min。之后，再加入0.5gAPTMS，于氮气环境下搅拌回流反应过夜。然后，过滤出固体物质后，分别用二硫化碳、四氢吠喃和乙醇洗涤三次，以除去多余的有机物。再将制得的沉淀物质在60℃真空环境下干燥4h，得黑色的巯基修饰的碳纳米管(MWCNT-SH)备用，实验流程如图3所示。

5、Au-MWCNT杂合材料的制备：量取100ml粒径为15nm的金溶胶于反应器中，并搅拌，随后称取MWCNT-SH 0.1g加入，常温搅拌反应4h。之后离心、洗涤，再经真空常温干燥，称量，备用。

6、免疫梳状微电极的制备及电学测试：称取0.01mg Au-MWCNT杂合材料，加入1ml水中，超声1h。取1μl悬浊液滴于20μM间距的梳状电极表面，室温下干燥，然后置于管式炉中在300℃，高纯Ar气保护条件下烧结30分钟。制备好的Au-MWCNT修饰的电极在固定电压1V的条件下测量其电流信号。然后，把电极置于1×PBS稀释10倍的免疫血清溶液中吸附抗体，过夜，把电极取出，用双蒸水轻轻漂洗三次，然后用封闭液封闭2h，于室温下干燥，制备得到免疫电极，然后测电流信号。把制备好的免疫电极置于5ng/ml的抗原蛋白溶液中培育过夜，然后取出用双蒸水轻轻漂洗三次，于室温下干燥，再次测量抗体抗原反应后的电流信号。原理示意图如图9所示。

实施例2：一种检测食源性副溶血弧菌的免疫传感器的检测方法，该方法的操作步骤为：

1、Au-MWCNT杂合材料的合成：图4分别给出了不同放大倍数下的制备的金包覆碳纳米管的形貌照片。Au具有强嗜硫性，所以Au颗粒和巯基之间很容易便能强烈地链接在一起。通过TEM和SEM可以观察到巯基修饰的MWCNT表面排布了许多球形的Au颗粒，可以观察到Au颗粒的形态和分布情况，Au颗粒排列比较紧密，但分布不是很均匀，测量出平均粒径为15nm。TEM和SEM图像显示Au颗粒沿MWCNT分布。因为Au-S键的形成，Au颗粒才得以在MWCNTs的表面排列。Au-S共价键很强，Au颗粒排布的很牢固，即使在反复的冲洗和超声之后也是如此，结果表明Au和CNT之间有较强的作用力。从而获得了Au-MWCNT复合材料。HRTEM实验显示，碳纳米管表面沉积了高密度的球形金颗粒，粒径分布均匀，约十几个纳米。

图5为EDX能谱分析，实验在200kV的电压下，在透射电镜卜完成。EDX能谱图可以证明金纳米粒子的存在，有一定的含量。S和Si的元素峰来源于APTMS的引入，Cu峰来源于铜网。由于制备的纳米复合材料上Au颗粒粒径大而且排列比较紧密，且量很大，因此EDX图中Au峰的相对强度较高。

2、Au-MWCNT杂合材料对抗体的吸附：为了验证所制备的Au-MWCNT复合材料对抗体蛋白是否具有吸附能力，我们利用紫外分光光度计分析了Au-MWCNT吸附抗体前后的紫外光谱(图6)。由于MWCNT的溶液浓度难于定量，所以图6中曲线的吸收强度是相对的。如图6所示，羧基化后的MWCNT(曲线1)具有很好的水溶性，在250nm处有一个宽的吸收峰。而MWCNT共价结合Au颗粒以后，550nm处出现一个明显的宽峰。在3ml用于紫外测试的该Au-MWCNT溶液中加入300ul免疫血清，培育1h，然后16000rpm离心30min，去掉上清，用双蒸水重悬沉淀至3ml，继续用于紫外吸收测试，得到曲线3。曲线3显示出明显的吸附在MWCNT上的Au纳米颗粒的峰，同时出现420nm处地吸收，该峰为肠炎免疫血清所独有的Soret band，如曲线4所示。综合上述实验结果，可以证明，所制备的Au-MWCNT对免疫球蛋白抗体具有较好的吸附能力，这为进一步制备免疫电极打下了基础。

3、免疫电极对肠炎沙门菌鞭毛蛋白的电学响应

图7给出了不同量的Au-MWCNT在电极上的铺展情况。量越多，测得的电流越大。实验过程中，可以通过测量Au-MWCNT修饰的电极的电流大小作为优化电极制备的指标，一般情况下，制得的电极在1V固定电压下的电流在μA量级，再经过300℃，Ar气氛保护烧结后电极比较稳定，并且在多次水漂洗后电流大小保持稳定。

图11是Au-MWCNT在吸附抗体以及抗体抗原反应后的电流变化。在吸附抗体和抗原后，展现出电导的增强，我们推测信号是通过Au颗粒修饰的MWCNT传递的。而Au可以与带有大量氨基和羧基等基团的抗体分子强烈键合。吸附抗体后，抗体分子与金颗粒、碳纳米管之间相互作用，电荷在抗体分子与CNT之间发生转移，导致CNT中的载流子数目改变，引起电导的改变。从我们的实验结果看，可能抗体分子从CNT中获得电子，因而使CNT电阻降低。同样地，当抗原分子与抗体分子结合后，进一步导致电荷转移，引起CNT电阻降低，电流增加，从而实现对抗原分子的传感检测。

为了进一步验证所制的免疫电极的选择性，我们直接用1％的BSA封闭制得烧结好的电极，封闭过夜。然后测量对5ng抗原的响应，实验结果发现，电流些微降低，电流增加的现象消失，如图12所示。从而验证了所制得的免疫电极对抗体抗原反应的敏感性和选择性。

Claims (3)

1.一种生物免疫传感器，其特征在于所述的生物免疫传感器将生物学免疫技术和纳米技术完美有机结合,利用抗体和抗原之间特异性的免疫化学反应原理来实现食品中致病菌电信号检测的新型传感技术。

2.一种如权利要求1所述的生物免疫传感器的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）称取5g CNT，加入55-65mL, 2.0mol/L的HCl，超声处理3.5-4.5h，用微孔滤膜过滤，然后采用双蒸水反复洗涤至中性，95-105^oC下干燥成粉末待用，采用硝酸回流法对MWCNT进行羧基化处理，具体方法为：将3g MWCNTs至于在4M的硝酸中，然后在加热搅拌的条件下冷凝回流24h，回流结束后用孔径为0.2微米的微孔滤膜过滤，并用二次水反复洗涤，至其PH值为中性为止，所得产物于真空干燥箱中在55-65^oC下干燥15-20h待用，将羧化的CNT在石英研钵中研磨成粉末，称取1.0g于l00℃干燥50-70min，去除物理吸附水，冷却后，加入到100mL二氯甲烷中，超声9-11min，之后，再加入 0.5g APTMS，于氮气环境下搅拌回流反应过夜，然后，过滤出固体物质后，分别用二硫化碳、四氢吠喃和乙醇洗涤三次，以除去多余的有机物，再将制得的沉淀物质在58-62℃真空环境下干燥3.5-4.5h，得黑色的巯基修饰的碳纳米管(MWCNT-SH)备用；

（2）金纳米颗粒的制备采用柠檬酸钠还原氯金酸法实现，在洁净的三口烧瓶中加入90-110 mL 质量分数为0.01%的氯金酸溶液，在冷凝回流条件下加热至沸腾，快速加入2.5-3.5mL 质量分数为1%柠檬酸钠溶液，30min后停止加热，然后采用一次性离心管对产物进行离心14-16min，控制离心管的转速12000 rpm，洗涤一次；

（3）量取100ml粒径为15nm的金溶胶于反应器中，并搅拌，随后称取MWCNT-SH 0.1g加入，常温搅拌反应3.5-4.5h，之后离心、洗涤，再经真空常温干燥，称量，备用；

（4）称取0.01mg Au-MWCNT杂合材料，加入1ml水中，超声50-70min,取1μl悬浊液滴于20μM 间距的梳状电极表面，室温下干燥，然后置于管式炉中在280-320℃、高纯Ar气保护条件下烧结25-35min，制备好的Au-MWCNT修饰的电极在固定电压1V的条件下测量其电流信号；

（5）把电极置于1×PBS稀释10倍的免疫血清溶液中吸附抗体，过夜，把电极取出，用双蒸水轻轻漂洗3-4次；

（6）用1%的牛血清白蛋白和1%的Tween 20作为封闭液，封闭免疫血清修饰的电极2-3h，于室温下干燥，制备得到免疫电极，然后测电流信号；

（7）把制备好的免疫电极置于5ng/ml的抗原蛋白溶液中培育过夜，然后取出用双蒸水轻轻漂洗3-4次，于室温下干燥，再次测量抗体抗原反应后的电流信号，即实现了抗原的检测。

3.根据权利要求1所述的生物免疫传感器，其特征在于：所述的生物免疫传感器可以检测副溶血弧菌、沙门氏菌、李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌食品致病微生物。

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