CN114452399B - 一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,包括以下步骤:将待偶联物、聚合物单体、引发剂按照一定比例加入缓冲液中,于一定温度和一定时间条件下进行反应,得到含有聚合物偶联体的第一产物。其中,所述待偶联物选自苯酚类衍生物、蛋白质、细胞中的一种或多种的组合;所述聚合物单体选自N‑异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺或丙烯酸。与传统的偶联反应相比,本发明提供的制备聚合物偶联体的方法具有条件温和、反应快速、操作简便、成本低廉等优势;同时,由于避免了偶联剂的使用,能够减少其对蛋白质、细胞的生理功能和聚合物的理化性质的影响,为生物标记、分离纯化、药物递送以及生物传感等应用提供了新思路。
Description
技术领域
本发明属于聚合物纳米材料和生化分析技术领域,具体涉及一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法。
背景技术
聚合物的偶联与改性在生化领域有着广阔的应用前景,如荧光共轭聚合物被广泛应用于生物成像与光电材料等领域,蛋白质-聚合物偶联体在生物分离和药物递送等方面也发挥着重要的作用,而经聚合物修饰的细胞则可以调控细胞的相互作用及其理化性质。自上世纪以来,研究者们围绕着聚合物的偶联与改性做了大量的工作以制备具有所需性质的偶联体。
以蛋白质-聚合物偶联体的制备为例。目前,蛋白质-聚合物偶联体的制备一般采用“grafting-to”、“grafting-from”和“grafting-through”三种方式(I.Cobo et al,Nat.Mater.2015,14,143–159),如通过可逆加成-断裂链转移试剂将聚合物单体N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide,NIPAM)马来酰亚胺化,然后与蛋白质的巯基结合,来制备偶联体(C.S.Thomas et al,ACS Nano.2011,5,5697-5707);或将蛋白质与琥珀酰亚胺-四乙二醇-溴(succinimidyl-TEG-Br)反应生成酯基大分子引发剂,然后在铜催化作用下与丙烯酰胺类单体通过单电子转移-活性自由基聚合以获得偶联体(Q.Zhang et al,J.Am.Chem.Soc.2015,137,9344–9353);以及利用N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(N-acryloxysuccinimide,NAS)类偶联剂与蛋白质的氨基反应,进而和聚合物单体丙烯酰胺(acrylamide,AM)、丙烯腈(acrylonitrile,AN)共聚,以实现蛋白质的偶联(S.Zhang etal,Sci.Adv.2019,5,8)。
然而,上述这些方法都需要至少两步反应,过程繁琐,而且偶联剂的引入以及类似高温、有机溶剂介质等苛刻的合成条件,既增加了成本也会影响蛋白质的活性。进一步的,偶联剂的共聚效应会对聚合物本身的性质造成一定的影响:在以grafting through代表的两步法制备过程中,偶联剂的引入会使聚合物主链负载多个目标蛋白,从而大大增加了偶联体分子量从而限制了使用场景(如细胞摄取),且偶联剂的用量通常需要严格控制,偶联剂的过量加入会影响聚合物的部分性质,如和单体NIPAM共聚会改变该温敏性聚合物的相变性质,从而降低其相分离能力;在一些特殊的反应体系中,还需要增加一些后处理步骤以去除残余的偶联剂,为生物偶联带来了不便。
基于此,如何在将待偶联物与聚合物进行偶联的同时,减少反应过程对待偶联物活性的干扰,使反应更加绿色、便捷、高效,是亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种不需要额外使用偶联剂、操作简便、成本低廉、反应高效的制备聚合物偶联体的方法。
本发明的目的之二在于提供一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法制得的聚合物偶联体在生物标记、分离纯化、药物递送或生物传感等领域中的应用。
本发明实现目的之一采用的技术方案是:提供了一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,包括以下步骤:
将待偶联物、聚合物单体、引发剂按照一定比例加入缓冲液中,于一定温度和一定时间条件下进行反应,得到含有聚合物偶联体的第一产物;
所述待偶联物选自苯酚类衍生物、蛋白质、细胞中的一种或多种的组合;
所述聚合物单体选自N-异丙基丙烯酰胺、丙烯酰胺或丙烯酸。
本发明实现目的之一的总体思路如下:本案发明人经长期大量的研究发现,以N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为代表的聚合物单体,在聚合物链生长过程中会产生自由基中间体,该自由基中间体在一定的反应条件下能够与一些物质(包括但不限于苯酚类衍生物、蛋白质、细胞)相互作用直接生成偶联体。基于上述研究,本发明提出了一种无需偶联剂、通过自由基反应实现偶联体与聚合物相互偶联的方法。该方法主要以临界相变温度为32℃的温敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)作为聚合物模型,仅需一步反应,将偶联体、聚合物单体、引发剂按照一定比例混合,即可得到聚合物偶联体。进一步的,在同样不需要额外使用偶联剂的前提下,采用上述制备方法合成的聚丙烯酰胺和聚丙烯酸的蛋白质偶联物也验证该方法的通用性。由于上述反应过程中,避免了偶联剂的使用,不仅反应过程更加简便、快捷,而且能够有效的避免偶联剂的使用对聚合物和待偶联物的理化性质的干扰。
本发明所述的无需偶联剂,具体是指不加入琥珀酰亚胺活性酯类(如N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺),丙烯酸酯类等的偶联剂。
进一步的,在本发明中,所述引发剂选自过硫酸铵/四甲基乙二胺体系;所述待偶联物、聚合物单体、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.0025-5):(5-45):(10-30):(10-40)。这个上述比例范围内,合成得到的聚合物偶联体具有较高的偶联率,且反应过程不会对聚合物的相变性质造成较大影响。通过对待偶联物用量的限定,避免了合成的聚合物呈凝胶状而不利于分散或相分离;通过对引发剂用量的限定,能够避免引发剂加入量过低造成的引发困难,同时也避免了引发剂加入量过多导致生成的聚合物聚合度较低,并且以及和其他自由基活性物质发生副反应的情况。
在上述技术方案的基础上,所述聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺,所述偶联体为苯酚类衍生物或蛋白质。
其中,所述苯酚类衍生物包括带有苯酚基团(主要为一取代,二取代,三取代)的物质如生物素化酪氨和荧光素类分子(如荧光素、四氯荧光素、四溴荧光素、四碘荧光素、二氯二溴荧光素)等。所述苯酚类衍生物、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.01~1):4.5:1:2。
在一些较好的实施方式中,所述苯酚类衍生物为生物素化酪氨;所述生物素化酪氨、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.1~1):4.5:1:2。在上述反应条件下,能够实现生物素化酪氨与N-异丙基丙烯酰胺的成功偶联。更优选地,所述生物素化酪氨、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为0.2:4.5:1:2。
进一步的,所述蛋白质包括抗体、链霉亲和素、酶等。
在一些较好的实施方式中,所述蛋白质为人免疫球蛋白;所述人免疫球蛋白、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.05~1):4.5:1:2。在上述反应条件下,能够获得比较理想的偶联率,且反应产物的相变性质基本不变,可以更有效的应用于分离富集。优选地,所述人免疫球蛋白、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为0.5:4.5:1:2,在该条件下能够获得最佳的偶联率,且避免了蛋白质含量过高造成的偶联产物加热沉淀出现凝胶状固体的现象发生,更有利于后续的分散与分离操作。
在一些较好的实施方式中,所述蛋白质为链霉亲和素,所述链霉亲和素、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.05~0.5):4.5:1:2。在上述反应条件下,制得的聚合物偶联体在溶液中呈均一的网状结构,更有利于与目标物碰撞结合,且对目标核酸的捕获效率达90%以上。优选地,所述链霉亲和素、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为0.05:4.5:1:2。
在一些较好的实施方式中,所述蛋白质为辣根过氧化物酶,所述辣根过氧化物酶、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(1~5):4.5:1:1。在上述反应条件下,反应过程对酶活性的影响较小,制得的聚合物偶联体中酶的活性可达游离酶的85%以上。
进一步的,当所述聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺,所述偶联体为苯酚类衍生物或蛋白质时,所述方法还包括纯化处理,所述纯化处理包括:将所述第一产物置于35~55℃的条件下加热1~5min,离心分离,弃去上清液,得到沉淀物;利用0~25℃的缓冲液对所述沉淀物进行溶解,重复上述操作多次,得到纯化后的聚合物偶联体。
优选地,离心分离的转速为13300r/min,离心分离的时间为3min。与常规离心分离参数相比,本发明选择了相对更高的转速和更短分离时间,能够更快地纯化粗产物,而不会对待偶联物产生影响。
在本发明中,当所述聚合物单体为N-异丙基丙烯酰胺,所述待偶联物为细胞时,所述细胞、聚合物单体、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(5~50):45:10:20。在上述反应条件下,能够在细胞与聚合物单体之间形成较好的偶联效果,提高偶联效率。在本发明中,所述细胞包括动物、植物、微生物细胞。
在一些较好的实施方式中,所述细胞选自酵母菌细胞。所述酵母菌细胞、聚合物单体、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为10:45:10:20。
在上述技术方案的基础上,所述方法还包括纯化处理,所述纯化处理包括:将所述第一产物进行离心分离,获得细胞沉淀;利用缓冲液对所述细胞沉淀进行洗涤,重复上述操作多次,得到纯化产物。优选地,所述离心分离的转速为500~2000r/min,离心分离的时间为5~20min。更优选地,所述离心分离的转速为1000r/min,离心分离的时间为5min。
在上述技术方案的基础上,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液,所述反应的温度为15~50℃,所述反应的时间为10~60min。优选地,所述反应温度为25℃,所述反应时间为30min。与常规的利用两步法反应生成聚合物偶联体相比,本发明提供的一步法耗时更短,能够显著提高实验效率。
本发明实现目的之二在于提供一种根据本发明目的之一所述的无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法在生物标记、分离纯化、药物递送或生物传感中应用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明提供的无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,相较于传统的多步偶联法,本方法无需将聚合物、聚合物单体或待偶联物功能化,仅一步反应即可得到聚合物偶联体,极大简化了操作步骤。该方法不需要引入其他偶联试剂或功能性标签,原料方便易得,节省了人力物力。其制备过程在室温下进行,不需要氮气保护、高温加热或引入有机溶剂,减小了苛刻条件对蛋白质结构与功能的影响,易于控制。
(2)本发明提供的无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,适用于多种可进行自由基聚合的聚合物单体和含苯酚基团的物质的偶联,具有普遍适用性及广阔的应用前景与实用价值。
(3)实验数据显示,本发明合成的聚合物偶联体可以在对目标物(如二抗、单链DNA)的选择性分离、酶的催化活性等方面均可达到常规两步法的相应水平,且可以对苯酚类衍生物进行偶联,从而获得定点标记的聚合物,为生物标记、分离纯化、药物递送以及生物传感等研究提供了新思路。
附图说明
图1为传统的grafting-through两步法制备蛋白质-聚合物偶联体的原理示意图:蛋白质的氨基首先和偶联剂的活性酯基反应生成酰胺键的同时使蛋白质乙烯基化,然后与其他聚合物单体进行共聚;
图2为本发明实施例提供的无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法的步骤示意图(2a)以及偶联荧光标记抗体的PNIPAM沉淀后拍摄的照片和测得上清液、沉淀、三次洗涤液的荧光信号图(2b);
图3为本发明实施例4制备的不同浓度的FITC-IgG-PNIPAM经荧光光谱测得其强度与浓度的关系图;
图4为本发明实施例5制备的IgG-PNIPAM和对比例3制备的IgG-NAS-PNIPAM的各类表征图:4a为紫外可见吸收光谱(UV-vis)图;4b为透射电镜图;4c为扫描电镜图;4d为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图(泳道1:marker,泳道2:PNIPAM,泳道3:IgG,泳道4:未纯化的IgG-PNIPAM,泳道5:未纯化的IgG-NAS-PNIPAM,泳道6:纯化后的IgG-PNIPAM,泳道7:纯化后的IgG-NAS-PNIPAM,泳道8:IgG+PNIPAM的物理混合);4e为差示扫描量热(DSC)图;
图5为本发明应用例1中利用实施例2制备的biotin-tyramide-PNIPAM(三号样品,右)和对比例1制备的biotin-PNIPAM(二号样品,中)以及对照组biotin-tyramide+PNIPAM混合样品(一号样品,左)结合SA-FITC后离心沉淀得到的荧光图片;
图6为本发明应用例2中利用实施例5制备的IgG-PNIPAM和对比例3制备的IgG-NAS-PNIPAM对荧光标记二抗(Rabbit anti Human IgG-FITC)的捕获效果图,以及应用例3中利用实施例6制备的SA-PNIPAM和对比例4制备的SA-NAS-PNIPAM对荧光标记生物素化单链DNA(B-DNA-F)的捕获效果图:6a为IgG-PNIPAM对不同浓度的二抗捕获后测得的荧光光谱;6b为IgG-PNIPAM和IgG-NAS-PNIPAM对二抗捕获效率的对比图;6c为SA-PNIPAM对不同浓度的单链DNA捕获后测得的荧光光谱;6b为SA-PNIPAM和SA-NAS-PNIPAM对单链DNA捕获效率的对比图;
图7为本发明应用例4中对实施例7制备的HRP-PNIPAM和对比例5制备的HRP-NAS-PNIPAM酶活性的比较图;
图8为本发明应用例5中利用实施例10制备Yeast-PNIPAM控制酵母菌聚集行为的原理示意图(8a)和明场显微图像(8b);
图9为本发明实施例8制备的IgG-PAM和实施例9制备的IgG-PAA的SDS-PAGE图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明,但不作为本发明的限定。
实施例1
PNIPAM的制备:
1)向1.5mL的离心管中依次加入4.5mg N-异丙基丙烯酰胺、1mg过硫酸铵、2mg四甲基乙二胺,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液至总体积为1mL,于25℃反应30min后得到聚合物体系。
2)将上述产物在37℃下水浴3min,然后以13300r/min的转速高速离心3min,弃去上清液,得到的沉淀用1mL冷的磷酸盐缓冲液重新溶解,重复2次后得到纯化产物,并置于4℃冰箱保存。
实施例2
生物素化酪胺-PNIPAM偶联体(biotin-tyramide-PNIPAM)的制备:
本实施例2除了在步骤1)中额外加入100μL biotin-tyramide(2mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
实施例3
四氯荧光素-PNIPAM偶联体(tetrachlorofluorescein-PNIPAM)的制备:
本实施例3除了在步骤1)中额外加入10μL tetrachlorofluorescein(2mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
本实施例3制备的tetrachlorofluorescein-PNIPAM经过离心沉淀后在紫外暗箱中以365nm激发可得到明亮的黄绿色荧光(参见图5e),证明其成功偶联。
实施例4
异硫氰酸荧光素标记的人免疫球蛋白G-PNIPAM偶联体(FITC-IgG-PNIPAM)的制备:
本实施例4除了在步骤1)中分别额外加入5、10、25、50、100、200、300、400、500μLFITC-IgG(50μg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
本实施例4加入500μL FITC-IgG(50μg/mL)所得产物,如图2b所示,经过水浴离心后在365nm紫外暗箱照射下可以观察到明显的绿色荧光沉淀物,证明成功偶联,在485nm激发下,用荧光光谱仪测得上清液、沉淀及三次洗涤液522nm处的荧光强度,可以通过沉淀所占的荧光百分比计算出蛋白质的偶联效率为4766/(22954+4766+1019+305+209)*100%=16.3%。
图3进一步验证了4.5mg NIPAM经聚合后,可结合超过25μg FITC-IgG,具有较高的蛋白质结合容量。
实施例5
人免疫球蛋白G-PNIPAM偶联体(IgG-PNIPAM)的制备:
本实施例5除了在步骤1)中额外加入10μL IgG(50mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
本实施例5所制备的产物,经过紫外-可见吸收光谱表征,如图4a所示,PNIPAM、APS+TEMED在260-340nm范围内基本无吸收,IgG在280nm处有个典型的蛋白吸收峰,而IgG-PNIPAM在280nm处也出现了吸收峰,且其吸收光谱恰好为PNIPAM和IgG的叠加所得,证明聚合物与蛋白质的成功偶联,并且根据其峰值比,进一步说明其偶联效率为0.18/0.69*100%=26.1%,与图3吻合。
本实施例5所制备的产物,经透射电镜与扫描电镜表征,如图4b和4c所示,呈网状结构,符合理论预期,这使得偶联体具有更大的比表面积,更易于与目标物结合,也预示着偶联体在生物分离领域具有巨大的潜力。
本实施例5所制备的产物,经SDS-PAGE表征,如图4d所示,可以看出IgG-PNIPAM较单独的IgG呈现为更高分子量的条带(参见图4d虚线小方框),而物理混合的IgG+PNIPAM与单独的IgG基本相同,证明偶联体为共价偶联而非特异性吸附作用产生。
实施例6
链霉亲和素-PNIPAM偶联体(SA-PNIPAM)的制备:
本实施例6除了在步骤1)中额外加入50μL SA(1mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
实施例7
辣根过氧化物酶-PNIPAM偶联体(HRP-PNIPAM)的制备:
本实施例7除了在步骤1)中额外加入100μL HRP(10mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
实施例8
人免疫球蛋白G-聚丙烯酰胺偶联体(IgG-PAM)的制备:
向1.5mL的离心管中依次加入10μL IgG(50mg/mL)、2.8mg丙烯酰胺、1mg过硫酸铵、2mg四甲基乙二胺,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液至总体积为1mL,室温反应30min后得到聚合物体系,并置于4℃冰箱内保存。
本实施例8所制备的IgG-PAM经SDS-PAGE分析,由图9b可知,IgG-PAM较IgG条带分子量更大(白色虚线方框),证明其成功偶联。
实施例9
人免疫球蛋白G-聚丙烯酸偶联体(IgG-PAA)的制备:
本实施例9除了将2.8mg丙烯酰胺改为3mg丙烯酸外,其余步骤与实施例6相同
本实施例9所制备的IgG-PAA经SDS-PAGE分析,由图9a可知,IgG-PAA较IgG条带分子量更大(白色虚线方框),证明其成功偶联。
实施例10
酵母菌-PNIPAM偶联体(Yeast-PNIPAM)的制备:
1)向1.5mL的离心管中依次加入100μL酵母菌(10mg/mL)、4.5mg N-异丙基丙烯酰胺、1mg过硫酸铵、2mg四甲基乙二胺,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液至总体积为1mL,置于摇床上以600r/min室温反应30min后得到聚合物体系。
2)将上述产物以1000r/min转速低速离心,离心时间为5min,得到的细胞沉淀用缓冲液洗涤用缓冲液洗涤,重复3次得到纯化产物。
对比例1
生物素-PNIPAM(biotin-PNIPAM)的制备:
本对比例1除了在步骤1)中额外加入100μL biotin(2mg/mL)外,其余步骤与实施例1相同。
对比例2
异硫氰酸荧光素标记的人免疫球蛋白G-NAS-PNIPAM偶联体(FITC-IgG-NAS-PNIPAM)的制备:
1)先向离心管中加入5μL FITC-IgG(50μg/mL)、10μL NAS(2mg/mL),37℃下水浴反应20min,再向里面加入4.5mg N-异丙基丙烯酰胺、1mg过硫酸铵、2mg四甲基乙二胺,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液至总体积为1mL,室温反应20min后,得到偶联目标蛋白质的聚合物混合体系。
2)该步骤与实施例1步骤2)相同。
对比例3
人免疫球蛋白G-NAS-PNIPAM偶联体(IgG-NAS-PNIPAM)的制备:
本对比例3除了在步骤1)中将5μL FITC-IgG(50μg/mL)改为10μL IgG(50mg/mL)外,其余步骤与对比例2相同。
本对比例3所制备的IgG-NAS-PNIPAM经SDS-PAGE表征,如图4d所示,由于两步法制备的偶联体一条聚合物主链负载了多个蛋白质,IgG-NAS-PNIPAM条带较IgG-PNIPAM出现在更高的位置(从左数第2个和第4个虚线大方框),更多蛋白的负载意味着产物聚合物偶联体具有更高的分子量,这会对产物有些应用造成一定的限制,如需要进行邻位标记时,标记半径变大,识别时位阻效应更为明显。
实施例1、5与对比例3所得产物(分别为PNIPAM,IgG-PNIPAM,IgG-NAS-PNIPAM),经差式扫描量热仪(DSC)以1℃/min扫描测得数据如图4所示,其可见偶联人免疫球蛋白G对聚合物的相变温度基本没影响,而加入偶联剂NAS则会提高其相变温度,这说明聚合物性质被改变,不利于热分离。
对比例4
链霉亲和素-NAS-PNIPAM偶联体(SA-NAS-PNIPAM)的制备:
本对比例4除了在步骤1)中额外加入50μL SA(1mg/mL)外,其余步骤与对比例2相同。
对比例5
辣根过氧化物酶-NAS-PNIPAM偶联体(HRP-NAS-PNIPAM)的制备:
本对比例5除了在步骤1)中额外加入100μL HRP(10mg/mL)外,其余步骤与对比例2相同。
应用例1
本发明的biotin-tyramide-PNIPAM与biotin-PNIPAM对SA-FITC的结合实验
实验方法:
一号样品:向离心管中加入100μL PNIPAM,100μL biotin-tyramide,再加入10μgFITC-SA,加入磷酸盐缓冲液至500μL室温下反应10min后,37℃下水浴3min,然后以13300r/min的转速高速离心。
二号样品:向离心管中加入100μL PNIPAM-biotin,再加入10μg FITC-SA,加入磷酸盐缓冲液至500μL,室温下反应10min后,37℃下水浴3min,然后以13300r/min的转速高速离心。
三号样品:向离心管中加入100μL PNIPAM-biotin-tyramide,再加入10μg FITC-SA,加入磷酸盐缓冲液至500μL,室温下反应10min后,37℃下水浴3min,然后以13300r/min的转速高速离心。
将三组样品(依次对应左中右三个离心管)的产物在离心前后置于紫外暗箱中观察,在365nm紫外光照射下,由图5可以看出,只有三号样品管壁右侧出现了明显的荧光沉淀,即部分SA-FITC与PNIPAM-biotin-tyramide结合,并被离心至管壁,而一号和二号样品离心前后无明显变化,说明单纯的biotin无法通过该方法与PNIPAM偶联,而酪氨基团的存在能够实现biotin与PNIPAM之间的偶联,并且该偶联并非PNIPAM通过物理吸附biotin-tyramide所致。上述实验结果表明,在本发明中酪氨残基是实现偶联体(蛋白质、细胞等)与聚合物偶联的桥梁之一。
进一步的,上述实验也证明了本发明在无需使用偶联剂的前提下实现偶联体与聚合物的偶联的同时,还具有位点选择性的优势。传统的偶联方法无法特异性连接蛋白质的氨基酸位点,容易造成对其他生物分子(如核酸、糖类)的无差别标记。而采用本发明提供的方法,能够与带有赖氨酸残基的物质选择性的反应,这对生物标记领域的应用有着重要的意义。
应用例2
本发明的IgG-PNIPAM和IgG-NAS-PNIPAM对二抗的捕获效率实验
实验方法:向不同的1.5mL离心管中,分别加入50μL IgG-PNIPAM与IgG-NAS-PNIPAM,再各加入5、10、20、40、80、120ng/mL的FITC修饰兔抗人IgG(Rabbit anti HumanIgG-FITC),加入pH为7.4的磷酸盐缓冲至500μL,用旋涡混合仪充分混匀,室温下反应10分钟后,置于37℃水浴锅内反应3min,再迅速转移至40℃空气浴的高速离心机内,以13300r/min的转速离心3min,然后用移液枪将液体吸出弃掉,加入500μL冷的磷酸盐缓冲液重新溶解,重复水浴离心操作两次,以除去未结合的目标物。最后将沉淀溶解于500μL冷的磷酸盐缓冲液中,得到12组产物,每组数据重复3次。将产物进行荧光光谱分析,得到产物荧光强度,并除以初始荧光强度,得到目标二抗的捕获效率。
实验结果:从图6a可以看出,IgG-PNIPAM捕获的二抗荧光强度与二抗投入的初始浓度呈现良好的递增关系,从图6b可以看出,IgG-PNIPAM与IgG-NAS-PNIPAM对二抗的捕获效率基本一致,且两者的捕获效率近乎100%(注:超过100%的情况可能是偶联蛋白质的增敏效应和对目标物的非特异性吸附作用)。
应用例3
本发明的SA-PNIPAM、SA-NAS-PNIPAM、磁珠-SA(MBs-SA)对核酸的捕获效率实验
实验方法:
1)向不同的1.5mL离心管中,分别加入50μL SA-PNIPAM与SA-NAS-PNIPAM,再各加入0.05、0.1、0.2、0.5、1nmol/mL的3’端修饰生物素(Biotin)5’端修饰6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein,FAM)碱基序列为AAAAAAAAAAAAAAAAAA的单链DNA(B-DNA-F),加入pH为7.4的磷酸盐缓冲至500μL,用旋涡混合仪充分混匀,室温下反应10分钟后,置于37℃水浴锅内反应3min,再迅速转移至40℃空气浴的高速离心机内,以13300r/min的转速离心3min,然后用移液枪将液体吸出弃掉,加入500μL冷的磷酸盐缓冲液重新溶解,重复水浴离心操作两次以除去未结合的目标物。最后将沉淀溶解于500μL冷的磷酸盐缓冲液中得到10组产物,每组数据重复3次。
2)向不同的1.5mL离心管中,分别加入50μL MBs-SA(0.4mg/mL),再各加入0.05、0.1、0.2、0.5、1nmol/mL的B-DNA-F,加入pH为7.4的磷酸盐缓冲至500μL,用旋涡混合仪充分混匀,在800r/min的摇床上室温反应10分钟,之后用磁力架将捕获目标核酸的磁珠分离,收集上清液,对其进行荧光光谱分析,每组数据重复3次,以初始荧光强度减去上清液荧光强度,得到结合到磁珠上的核酸荧光强度,再除以初始荧光强度,得到目标核酸的捕获效率。
实验结果:从图6c可以看出,SA-PNIPAM捕获的单链DNA荧光强度与单链DNA投入的初始浓度呈现良好的递增关系,从图6d可以看出,SA-PNIPAM和SA-NAS-PNIPAM对单链DNA的捕获效率基本相同,都大于90%,而商业化的SA-MBs在低浓度下捕获效率远低于聚合物,可能是聚合物在溶液中呈现均一的网状结构(图4b,4c),与固相载体磁珠相比,更有利于与目标物碰撞结合。
应用例4
本发明的HRP-PNIPAM、HRP-NAS-PNIPAM的催化活性实验
实验方法:向1.5mL离心管中,分别加入含相同浓度(1ng/mL)酶的HRP、HRP-PNIPAM与HRP-NAS-PNIPAM,加入20μL 3,3’,5,5’-四甲基联苯二胺(TMB)基底液,加入磷酸盐缓冲至体积为500μL,室温下反应10min,加入100μL 6mol/L硫酸终止反应,用紫外可见发光光谱仪测得其在450nm处的峰值,以游离HRP吸收值为参照,用偶联体吸收值除以游离吸收值,得到其相对活性,如图8所示。
实验结果,由图8可知,HRP-PNIPAM与HRP-NAS-PNIPAM的酶活性相近,约为游离酶活性的85%。
应用例5
本发明的Yeast-PNIPAM的偶联效果实验
实验方法:分别取同浓度的Yeast溶液、Yeast-PNIPAM溶液、PNIPAM+Yeast混合液5μL,滴于载玻片上,盖好盖玻片后在室温下,利用光学显微镜进行观察;再将上述三种溶液在37℃下水浴2min,调节室温至30℃,并将载玻片和盖玻片用吹风机加热,然后各取5μL滴于载玻片上,盖好盖玻片后,立即在光学显微镜下观察,对前后6个样品进行明场拍摄成像,得到图9。
实验结果:如图9所示,其中左列三张分别为室温下Yeast溶液、Yeast-PNIPAM溶液、PNIPAM+Yeast物理混合液的聚集状态图像;右列三张分别为加热后Yeast溶液、Yeast-PNIPAM溶液、PNIPAM+Yeast物理混合液的聚集状态图像。Yeast溶液和PNIPAM+Yeast混合液加热前后(a-b、c-d)并未出现明显细胞聚集现象,而经一步偶联反应的Yeast-PNIPAM溶液,则在加热后出现了大片细胞聚集,证明了细胞与PNIPAM的成功偶联。
综上可知,本发明提供的无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,不论在对目标物(如二抗,单链DNA)的分离富集、酶的催化活性等方面,均能达到与两步法制备的偶联体相当的效果,同时本方法还具有步骤简单、成本低廉的优势,同时具备位点选择性和普遍适用性;特别的是,由于本发明无需偶联剂的使用,能够有效避免偶联剂的使用及其对聚合物和待偶联物的理化性质的干扰。该方法不仅可以适用于聚合物单体与蛋白质的偶联,也可用于小分子标记乃至细胞标记,在生物标记、分离纯化、药物递送或生物传感等领域具有广阔的应用前景。
以上仅为本发明较佳的实施例,并非因此限制本发明的实施方式及保护范围,对于本领域技术人员而言,应当能够意识到凡运用本发明说明书内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案,均应当包含在本发明的保护范围内。
Claims (3)
1.一种无需偶联剂一步制备聚合物偶联体的方法,包括以下步骤:
将待偶联物、聚合物单体、引发剂按照一定比例加入缓冲液中,于一定温度和一定时间条件下进行反应,得到含有聚合物偶联体的第一产物;
所述待偶联物选自苯酚类衍生物;所述聚合物单体选自N-异丙基丙烯酰胺;所述引发剂选自过硫酸铵/四甲基乙二胺体系;
所述苯酚类衍生物、N-异丙基丙烯酰胺、过硫酸铵与四甲基乙二胺的质量比为(0.01~1):4.5:1:2;
所述苯酚类衍生物为生物素化酪氨。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述缓冲液为磷酸盐缓冲液,所述反应的温度为15~50℃,所述反应的时间为10~60min。
3.一种根据权利要求1或2所述的方法制备得到的聚合物偶联体在制备生物标记、分离纯化、药物递送或生物传感的产品中应用。
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