JP2007306816A - 修飾タンパク質及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 タンパク質の任意の部位に不飽和官能基を有する修飾タンパク質を用いて、その不飽和官能基を利用して共重合反応により、強固にタンパク質を担体に固定する方法を提供する。
【解決手段】タンパク質の構成成分として、非天然アミノ酸を使用し、そのアミノ酸に不飽和官能基を導入する。この不飽和官能基と重合性モノマーとを共重合することにより、基盤等へ強固にタンパク質を固定することができる。非天然アミノ酸へ導入される不飽和官能基としては、（メタ）アクリル基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。
【選択図】 なし

Description

本発明は、タンパク質の任意の部位に不飽和官能基が導入されたタンパク質修飾物及びその製造方法に関する。

近年、ゲノムプロジェクトの進展により、生物の膨大な遺伝子情報が明らかとなり、その機能の解析が進められている。その機能解析のツールとして、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）と呼ばれるデバイスを使用する方法が一般化しつつある。現在、ＤＮＡチップでは、例えば、ある生理的特徴を備えた細胞とコントロール細胞間で、細胞内で発現している遺伝子情報をｍＲＮＡ量で比較し、その生理的特徴と遺伝子発現の相関を解析している。

しかし、実際に細胞内で機能的に発現しているタンパク質とｍＲＮＡ量との相関は必ずしも高くないことから、タンパク質レベルを直接、解析する手法も注目されている。

例えば、タンパク質−医薬品の相互作用、タンパク質−タンパク質間の相互作用は、新規の医薬品開発、副作用の減弱化において重要な情報となる。

一方、直接、タンパク質を解析するには、適当な担体にタンパク質を固定する必要がある。タンパク質の固定化方法としては、担体にカルボキシル基の露呈させ、タンパク質のアミノ基とカップリングさせる方法（アミノカップリング法）、担体をチオール化し、カルボキシル基をＰＤＥＡ等で修飾したタンパク質とジスルフィド結合を通してカップリングさせる方法（チオールカップリング法）等が知られている。また、上記共有結合による固定ではなく、タンパク質にＨｉｓ−Ｔａｇを導入し、それをＮＴＡ（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）で処理した担体にＮｉ^２＋を通して結合させる方法も知られている。

しかし、上述のアミノカップリングによるタンパク質の固定化方法では、酸性タンパク質は固定することはできない。また、チオールカップリングによる固定化方法では、酸性タンパク質は固定化できるものの、多量のタンパク質を必要とする。さらには、Ｈｉｓ−Ｔａｇを用いる固定化方法では、最初は固定されるものの徐々に解離するという問題があった。

本発明は上記問題点を解決したタンパク質の固定化方法を提供する。

本発明者は、上述した問題点を解決するために鋭意検討を行った結果、タンパク質の特定の部位に不飽和官能基を有する修飾タンパク質を用いて、そのタンパク質の不飽和官能基を利用して共重合反応により、強固にタンパク質を担体に固定できることを見出し、本発明を完成させた。

即ち、本発明は、タンパク質の任意の部位に、不飽和官能基を有する非天然アミノ酸を含む修飾タンパク質、である。

本発明によれば、タンパク質をその種類に関係なく、共有結合により強固に担体に結合させることができる。

本発明は、「タンパク質の任意の部位に、不飽和官能基を有する非天然アミノ酸を含む修飾タンパク質」である。

ここで「タンパク質」とは、オリゴペプチド、ポリペプチドを含む意味で用いる。本発明では、タンパク質の任意の部位に不飽和官能基を有する非天然アミノ酸が導入されている。不飽和官能基を有する非天然アミノ酸をタンパク質の任意の部位に導入する方法としては、非天然アミノ酸をタンパク質の任意の部位に導入した後、非天然アミノ酸の側鎖部の官能基に対して化学的修飾を行い、不飽和官能基を導入する方法、又は予め非天然アミノ酸側鎖の官能基に対して化学的修飾を行い、不飽和官能基を導入した後、タンパク質の任意の部位に導入する方法が挙げられる。

タンパク質の任意の部位に非天然アミノ酸を導入する方法としては、プロテインスプライシング反応を利用したペプチド導入法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．，７，ｐ．２２５６−２２６４，１９９８等）、アミノ酸の種類に特異的な導入法（特願平３−２０８３２１、ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６，５８６，２０７等）、アミノ酸の部位に特異的な導入法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，ｐ．１８２−１８８，１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９２，ｐ．４９８−５００，２００１等）、４塩基認識を利用した位置特異的な導入法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８，ｐ．９７７８−９７７９，１９９６、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１，ｐ．３４−４０，１９９９等）などが挙げられ、上記方法のいずれの方法も採用できる。

ここで用いる非天然アミノ酸としては、側鎖部に不飽和官能基を導入することが可能な官能基を有するものであれば、その種類を問わない。側鎖部の官能基には、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、アルデヒド基、アセチル基等の官能基が挙げられる。

また、導入される不飽和官能基としては、（メタ）アクリル基、（メタ）アクリロイル基等が挙げられる。これら不飽和官能基の導入は、アクリル酸スクシンイミドエステル、メタクリル酸グリシジルエステル、メタクリル酸ヒドラジド化合物等を反応させることにより、導入することが可能となる。

例えばアクリル基を導入する場合であれば、非天然アミノ酸としてアミノフェニルアラニンを選択し、そのアミノ基にアクリル酸スクシンイミドエステル（以下、単に「ビニル化剤」と称す。）を反応させることにより、アクリル基を導入することが可能となる。

アミノフェニルアラニンを含むタンパク質を調製後に、アクリル基を導入する場合は、アミド結合形成反応をｐＨ５程度で行うことで、他にアミノ基が存在していても、アミノフェニルアラニンの側鎖のアミノ基に選択的に反応させることができる。他の方法としては、反応に関与させたくないアミノ基をＢｏｃ化等により保護し、反応後脱Ｂｏｃ化すればよい。この方法は、例えば、「新生化学実験講座１ 蛋白質ＶＩ 構造機能相関」の記載等を参照すればよい。

非天然アミノ酸を導入したタンパク質とビニル化剤との反応において、使用するビニル化剤は、反応率を考慮してその使用量を決定すればよい。経済性を考慮すると、アミノフェニルアラニン導入タンパク質に対して、等モル〜５０倍モルを使用することが好ましい。

反応温度は、反応速度、反応率等を考慮して任意に設定することができる。１０℃〜３０℃が好ましい。

上記の方法により調製された修飾タンパク質は、透析等の方法により単離・精製することができる。

タンパク質に不飽和官能基が導入されたことの確認は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーにより確認することができる。

このように調製された修飾タンパク質を、例えば、重合性モノマーと共重合することにより、タンパク質が固定（包含）された高分子材料を得ることができる。重合性モノマーとしては、特に制限されないが、例えば、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−アクリルロイルアミノエトキシエタノール、Ｎ−アクリルロイルアミノプロパノール、Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、ヒドロキシエチルメタクリレート、（メタ）アクリル酸、アリルデキストリン等から選ばれた少なくとも一種類以上の単量体と、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート等の多官能性単量体を、水性媒体中で共重合させ、タンパク質が固定（包含）されたゲルを得る。好ましくは、アクリルアミド系のゲルである。

上述の固定化方法は、様々なタンパク質検査装置に使用される。例えば、キャピラリー電気泳動法で使用するキャピラリーにおいて、その中空部にアクリルアミドモノマーと上述のタンパク質修飾物とを含む重合溶液を導入し、中空部内で重合反応を実施することにより、キャピラリーの中空部にタンパク質が固定されたアクリルアミドゲルが保持されたキャピラリーを得ることができる。

また、平面基板上にモノマー溶液と上述のタンパク質修飾物とを含む重合溶液を滴下し、平面基板上で重合反応を行うことにより、平面基板上に多数のタンパク質が固定されたタンパク質チップを作成することも可能である。

さらには、ＷＯ００／５３７３６号公報、特開２０００−６０５５４号に記載の複数の貫通孔が整然配置された基盤の各貫通孔に上述のモノマー溶液とタンパク質修飾物とを含む重合溶液を導入し、重合反応を行うことにより、貫通孔内部にタンパク質が固定されたタンパク質チップを作成することも可能である。

以上、本発明におけるタンパク質修飾物の使用の一例を示したが、使用方法はこれらに限定されるものではない。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。

[実施例１］
タンパク質の任意の部位にアミノフェニルアラニンを導入した後、アクリル酸スクシンイミドエステルを用いタンパク質の修飾する方法
（１） ペプチド：Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ（４−ＮＨＢｏｃ）−ＯＨ（いずれもＡｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入）を用い、固相合成法によりペプチドを合成した。合成法は一般的な方法による。（「新生化学実験講座１：蛋白質ＶＩ 合成および発現」等）
（２） プラスミドの調製
Ｔ７プロモーターを含むプラスミド（ｐＴＹＢ１）に、プラスミド（ｐＥＴ−２Ｔ）から得られるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、単に「ＧＳＴ」と称す、アミノ酸２２０ 残基、分子量２６ｋＤａ）のコーディング領域を遺伝子組換え法にて組込み、プラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）を作製した。ここでも用いたプラスミド遺伝子の組み換えは制限酵素を用いた一般的な方法による（羊土社 改定遺伝子工学実験ノート等）。プラスミド（ｐＴＹＢ１）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから、プラスミド（ｐＧＥＸ−２Ｔ）はアマシャムバイオサイエンスから、また制限酵素はタカラバイオから購入した。宿主には大腸菌のＸＬ−１株を用いた。作製したプラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）を有する大腸菌のＸＬ−１株を２×ＹＴ培地でアンピシリン（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）存在下、３７℃、１０時間培養し、遠心分離により菌体を採取した。プラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）ＤＮＡ はＱＩＡＧＥＮ製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔにより精製した。

（３） 任意の部位にアミノフェニルアラニンを導入したタンパク質の調整
調整したプラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）ＤＮＡを、ホスト大腸菌ＥＲ２５６６に形質転換により導入した。本形質転換株をＬＢ培地中にて培養し、その際ＩＰＴＧの誘導によりインテインのＮ末端側にＧＳＴが付加されたタンパク質複合体を過剰発現させる。過剰発現させたタンパク質複合体を超音波処理により菌体外に可溶化させた後、Ｃｈｉｔｉｎ Ｂｅａｄｓを用いて捕捉させた状態で、緩衝液により精製する。その後、（１）で合成したＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）をビーズと混合させて、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）がＧＳＴのＣ末端側付加させると同時にビーズから溶出させられる。溶出液中に含まれる調製された目的タンパク質は、透析等の方法により単離・精製することができる。

ここで用いた方法は全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＩＭＰＡＣＴ^ＴＭ−ＣＮの取扱説明書に記載された方法により、必要な試薬類は全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。

得られた目的タンパク質がＧＳＴのＣ末端部に（１）Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）の修飾体であることは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーにより確認できる。ＧＳＴは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで ［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ ２６，０００に現れたが、上述の方法で得られたＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）修飾体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで ［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ ２６，２６５に現れた。本結果はＧＳＴが上述の方法によりＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）により修飾されたことを示唆する。

（４） アミノフェニルアラニンの導入されたタンパク質にビニル基を導入する方法
（３）で得られたアミノフェニルアラニンを導入したタンパク質と２倍モル当量のアクリル酸スクシンイミドエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｍｅｒｃｋ）をｐＨ＝５のクエン酸緩衝液中にて２５℃条件下で３０分間反応させる。反応後、未反応のアクリル酸スクシンイミドエステルは、透析等の方法により除去し、ＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）修飾体を単離・精製することができる。

[実施例２]
タンパク質の任意の部位に４−アセチルフェニルアラニンを導入した後、メタクリル酸ヒドラジドを用いタンパク質の修飾する方法
（１） ぺプチド：Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４−ａｃｅｔｙｌ）の合成
Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（Ａｄｖａｎｃｅｄ ＣｈｅｍＴｅｃｈより購入）、４−アセチルフェニルアラニン（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１１，ｐ．２２５−２２７，１９６８、Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，５４，ｐ．１３９５−１４００，１９７１、Ｌｉｅｂｉｇｓ．Ａｎｎ．Ｃｈｅｍ．，７５２，ｐ．１０９−１１４，１９７１等に従い合成）を用い、固相合成法によりペプチドを合成した。合成法は一般的な方法による。（「新生化学実験講座１ 蛋白質ＶＩ 合成および発現」等）
（２） プラスミドの調製
Ｔ７プロモーターを含むプラスミド（ｐＴＹＢ１）に、プラスミド（ｐＥＴ−２Ｔ）から得られるグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（以下、単に「ＧＳＴ」と称す、アミノ酸２２０ 残基、分子量２６ｋＤａ）のコーディング領域を遺伝子組換え法にて組込み、プラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）を作製した。ここでも用いたプラスミド遺伝子の組み換えは制限酵素を用いた一般的な方法による（羊土社 改定遺伝子工学実験ノート等）。プラスミド（ｐＴＹＢ１）はＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから、プラスミド（ｐＧＥＸ−２Ｔ）はアマシャムバイオサイエンスから、また制限酵素はタカラバイオから購入した。宿主には大腸菌のＸＬ−１株を用いた。作製したプラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）を有する大腸菌のＸＬ−１株を２×ＹＴ培地でアンピシリン（最終濃度４０μｇ／ｍｌ）存在下、３７℃、１０時間培養し、遠心分離により菌体を採取した。プラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）ＤＮＡ はＱＩＡＧＥＮ製ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔにより精製した。

（３） 任意の部位に４−アセチルフェニルアラニンを導入したタンパク質の調整
調整したプラスミド（ｐＴＹＢ１−ＧＳＴ）ＤＮＡを、ホスト大腸菌ＥＲ２５６６に形質転換により導入した。本形質転換株をＬＢ培地中にて培養し、その際ＩＰＴＧの誘導によりインテインのＮ末端側にＧＳＴが付加されたタンパク質複合体を過剰発現させる。過剰発現させたタンパク質複合体を超音波処理により菌体外に可溶化させた後、Ｃｈｉｔｉｎ Ｂｅａｄｓを用いて捕捉させた状態で、緩衝液により精製する。その後、（１）で合成したＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ａｃｅｔｙｌ）をビーズと混合させて、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４− ａｃｅｔｙｌ）がＧＳＴのＣ末端側付加させると同時にビーズから溶出させられる。溶出液中に含まれる調製された目的タンパク質は、透析等の方法により単離・精製することができる。

ここで用いた方法は全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏｌａｂｓのＩＭＰＡＣＴ^ＴＭ−ＣＮの取扱説明書に記載された方法により、必要な試薬類は全てＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓより購入した。

得られた目的タンパク質がＧＳＴのＣ末端部に（１）Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４− ａｃｅｔｙｌ）の修飾体であることは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーにより確認できる。ＧＳＴは、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで ［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ ２６，０００に現れたが、上述の方法で得られたＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４− ａｃｅｔｙｌ）修飾体は、ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦマススペクトロメトリーで ［Ｍ＋Ｈ］＋の分子イオンがｍ／ｚ ２６，２８２に現れた。本結果はＧＳＴが上述の方法によりＣｙｓ−Ｐｈｅ（４− ａｃｅｔｙｌ）により修飾されたことを示唆する。

（４）４−アセチルフェニルアラニンの導入されたタンパク質にビニル基を導入する方法
（３）で得られたアミノフェニルアラニンを導入したタンパク質と２倍モル当量のアクリル酸スクシンイミドエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｍｅｒｃｋ）をｐＨ＝５のクエン酸緩衝液中にて２５℃条件下で３０分間反応させる。反応後、未反応のアクリル酸スクシンイミドエステルは、透析等の方法により除去し、ＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）修飾体を単離・精製することができる。

[実施例３、４]
本実施例では、実施例１により得られたアクリル基が導入されたＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）の修飾体、および実施例２により得られたメタクリル基が導入されたＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ａｃｅｔｙｌ）の修飾体をアクリルアミドゲルへの固定及び評価を行った。また、ＧＳＴのＣｙｓ−Ｐｈｅ（４−ＮＨ_２）の修飾体（比較例１）、Ｃｙｓ−Ｐｈｅ（４−ａｃｅｔｙｌ）の修飾体（比較例２）及び無修飾のＧＳＴ（比較例３）のアクリルアミドゲルへの固定及び評価も行った。

表１に示したゲル前駆体水溶液（３種類）を調製し、マイクロピペットにてガラススライド上に各０．１μｌ滴下した。

滴下したゲル前駆体水溶液は、室温、窒素ガス下にて１５分間静置することにより、ＧＳＴが固定されたアクリルアミドゲルとなる。上記のごとくＧＳＴが固定されたタンパク質チップを作成した。

上述のタンパク質チップは以下に示す方法で評価を行った。

ここで利用する評価法は、タンパク質チップに用いるタンパク質の相互作用の評価法として一般的に用いられる方法による（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，ｖｏｌ．２８９，ｐ．１７６０）。

はじめに、０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液にて、アクリルアミドゲル中に固定されずに存在するＧＳＴを洗浄、除去する。

続いて、蛍光標識化されたＣｙ５^ＴＭ Ｌａｂｅｌｅｄ ＧＳＴ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ（モレキュラープローブから購入）４０μｇ／ｍｌ溶液を上記タンパク質チップに供し、チップ上に固定されたＩＬ６抗体と結合させる。

さらに、０．１ｗｔ％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ緩衝液にて、未結合のＣｙ５^ＴＭ Ｌａｂｅｌｅｄ ＧＳＴ −Ａｎｔｉｂｏｄｙを洗浄、除去する。

最後に、各スポットに起因する蛍光量を蛍光スキャナー［ＧｅｎｅＴＡＣ ＬＳ ＩＶ（ＧＥＮＯＭＩＣ ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ製）］を使用し測定した。結果は表２に示す。

以上より、アクリル基またはメタクリル基が導入されたＧＳＴが固定されたスポットに起因する蛍光値は、アクリル基またはメタクリル基を導入していないＧＳＴが固定されたスポットに起因する蛍光値の約６０倍であった。

よって、アクリル基またはメタクリル基が導入されたＧＳＴをアクリルアミドモノマーと共重合により固定することで、活性中心が露呈した状態配向させ、且つその機能を保持したままで固定できていることが示唆される。

Claims (1)

1. タンパク質の任意の部位に不飽和官能基を有する非天然アミノ酸を含む、修飾タンパク質。