JP2023182676A - 核酸配列決定におけるシグナル対ノイズの増加 - Google Patents
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Abstract
【課題】核酸中のヌクレオチドを同定する方法を提供する。【解決手段】(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供することであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、提供すること、(b)その複数を、(i)3’末端にブロックされたヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するためのブロックされたヌクレオチド、及び(ii)三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させること、(c)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成すること、ならびに(d)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定することによって、テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するための方法。【選択図】なし
Description
本開示は概して、核酸の特徴付けに関し、核酸配列決定への特定の適用可能性を有する。
いくつかの商業的な核酸配列決定技術は、核酸アンサンブルを使用して実施される。アンサンブルは一般に、全体として操作及び検出される核酸コピーの局所的な集合体をもたらす増幅技術によって生成される。アンサンブルを作り出すための例示的な技術には、Illuminaプラットフォーム(カリフォルニア州サンディエゴ)によって使用されるブリッジ増幅技術、Ion Torrentプラットフォーム(Thermo Fisher、マサチューセッツ州ウォルサム)によって使用されるエマルジョンポリメラーゼ連鎖反応技術、及びComplete Genomicsプラットフォーム(BGI、中国深セン市)によって使用されるローリングサークル技術が含まれる。アンサンブルは、単一分子配列決定技術と比較して高いシグナル振幅、ならびに単一分子を操作及び検出する際に確率的ノイズから生じるアーチファクトの最小限化の利点を提供する。
アンサンブルベースの配列決定技術を広く採用しているにもかかわらず、いわゆる「フェージング」は、読み取り長さ、全体的なスループット、及び精度を制限する。フェージングは、アンサンブル内の個々の分子が互いとの同期を失う現象である。フェージングは、アンサンブル内の他のプライマー分子に後れを取る1つ以上のプライマー分子の伸長として、またはアンサンブル内の他のプライマー分子の先を越す1つ以上のプライマー分子の伸長として現れ得る。フェージングは、有害かつ累積的である。1サイクル当たりわずか0.5%のフェージング率は、120サイクル後に真のシグナルの約半分の累積損失をもたらす。この問題は、位相がずれているアンサンブルのメンバーから生じる誤ったシグナルによるバックグラウンドノイズの比例的な増加によって悪化する。シグナル対ノイズの累積損失は、読み取り長さに対する制限(これは、配列決定スループットの低減をもたらす)、及び特にノイズがシグナルを圧倒することによる後のサイクルの誤差の増加をもたらす。
したがって、アンサンブルベースの配列決定におけるフェージングを低減または防止する方法が必要である。本発明は、この必要性を満たしており、かつ他の利点も提供する。
本開示は、テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するための方法を提供する。方法は、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)その複数を、(i)3’末端にブロックされたヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するためのブロックされたヌクレオチド、及び(ii)三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させるステップと、(c)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(d)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、を含むことができる。任意に、ブロックされたヌクレオチドは、可逆的な終結ヌクレオチドであり得る。
(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットのプライマー(複数可)の3’末端にブロックされたヌクレオチドを組み込むステップと、(c)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットのプライマー(複数可)の3’末端に三元複合体阻害剤を組み込むステップと、(d)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(e)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、を含む、テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するための方法も提供される。任意に、ブロックされたヌクレオチドは、可逆的な終結ヌクレオチドであり得る。
本開示は、テンプレート核酸を配列決定するための方法を提供する。方法は、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)その複数を、(i)3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するための可逆的な終結ヌクレオチド、及び(ii)三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させるステップと、(c)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(d)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、(e)第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの3’末端において可逆的な終結ヌクレオチドを脱ブロックするステップと、(f)ステップ(b)~(e)を繰り返して、第1のサブセットのテンプレート核酸を配列決定するステップと、を含むことができる。
テンプレート核酸を配列決定するための方法は、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットのプライマー(複数可)の3’末端にブロックされたヌクレオチドを組み込むステップと、(c)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットのプライマー(複数可)の3’末端に三元複合体阻害剤を組み込むステップと、(d)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(e)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、(f)第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの3’末端において可逆的な終結ヌクレオチドを脱ブロックするステップと、(g)ステップ(b)~(f)を繰り返して、第1のサブセットのテンプレート核酸を配列決定するステップと、を含むことができる。
本開示は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含む装置をさらに提供し、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットは、プライマーの3’末端にブロックされたヌクレオチドを有し、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットは、プライマーの3’末端に三元複合体阻害剤を有する。任意に、ブロックされたヌクレオチドは、可逆的な終結ヌクレオチドであり得る。
本開示は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドにおける照合位置に存在するヌクレオチド塩基を同定するための方法を提供する。照合位置は、プライマーの3’末端にハイブリダイズするテンプレートの塩基のすぐ5’側に位置する塩基である。照合位置に存在するヌクレオチドは、照合位置の塩基について、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、ポリメラーゼ、及びヌクレオチド同族体の間で形成される三元複合体を検出するために使用される検査ステップで同定され得る。ポリメラーゼは、同族ヌクレオチドをテンプレートの次の塩基と対合させるように機能する。照合位置における塩基の同一性は、三元複合体中に存在するヌクレオチドのタイプを区別し、それがワトソンクリック塩基対合に従ってハイブリダイズするテンプレート塩基を推測することによって決定され得る。
特定の実施形態では、プライマーは、テンプレートに沿って照合位置をシフトするために増分的に伸長され得る。例えば、テンプレートの配列は、プライマーが単一のヌクレオチドによって伸長されて、照合のために次のテンプレート位置にシフトし、検査が新しい照合位置で行われる、一連のサイクルによって決定され得る。不完全な伸長は、配列決定エラーまたは配列決定プロセスの早期終了につながり得る。フェージング問題はまた、例えば、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの集団がアンサンブルとして配列決定される場合にも現れる。
本開示は、例えば、配列決定方法において、核酸中の塩基の同定を改善するのに有用であり得る方法及び組成物を提供する。改善は、その後に検出されないプライマーをキャップするプライマー修飾プロセスを含むことによって達成され得る。例えば、プライマー伸長ステップで伸長されていないプライマーは、伸長されていないプライマーが後続の検査ステップのエラーに寄与しないようにキャップされ得る。三元複合体の検査によってテンプレートヌクレオチドが同定される実施形態については、三元複合体阻害剤によって特に有用なキャップが提供される。三元複合体阻害剤は、プライマーに結合されると、ポリメラーゼ及び/または同族ヌクレオチドが修飾プライマーの末端での三元複合体の形成または維持に関与することを防止する部分であり得る。三元複合体阻害剤は、例えば、そうでなければ三元複合体を形成するであろう1つ以上の成分への立体ブロックを作り出す部分として、または成分のうちの1つ以上に反発する電荷を作り出す部分として、プライマーの末端に存在し得る。
一例として、三元複合体を形成するためにアクセス可能なテンプレート位置がないように、プライマーが完全に伸長されると、三元複合体の形成の阻害が生じ得る。完全伸長は、テンプレートの5’末端にアニールされている伸長したプライマーの3’末端として現れ得る。この構成では、二本鎖伸長生成物は、対合していない次のテンプレート塩基を含有しない。代替の構成では、完全伸長は、さらなる伸長が伸長生成物の環境中の因子によって防止されるまで伸長されるプライマーとして現れ得る。この構成では、テンプレートは、対合していない次のテンプレート塩基を含有し得るが、次のテンプレート塩基は、テンプレート及び伸長したプライマーの周囲の環境により、ポリメラーゼ(及び/または次の正しいヌクレオチド)にアクセスできない。例えば、ポリメラーゼが、さらなる伸長ができないだけでなく、三元複合体を形成するために結合することもできないように、テンプレートの5’末端は、固相表面に結合され得、伸長したプライマーの3’末端は、表面に非常に近い。これらの例の両方において、完全伸長は、伸長したプライマー上のキャップとして機能するオリゴヌクレオチド部分を生成した。
いくつかの構成では、三元複合体阻害剤部分は、第2の結合パートナー(例えば、抗体などの受容体)に対する結合親和性を有する第1の結合パートナー(例えば、リガンド)であり得る。第1の結合パートナーが三元複合体の形成を阻害することができるかどうかにかかわらず、阻害は、第2の結合パートナーが第1の結合パートナーに結合されたときに生じ得る。三元複合体阻害剤は、例えば、ヌクレオチド類似体でプライマーの3’末端を伸長する結果として、プライマーの3’末端に存在することができ、ヌクレオチド類似体は、第1の結合パートナーに結合される。この構成では、第1の結合パートナーと第2の結合パートナーとの間の複合体は、伸長したプライマー上のキャップとして機能する。
代替の実施形態では、プライマー修飾プロセスを使用して、プライマーが後続の検出ステップに関与しないようにプライマーを除去することができる。例えば、プライマー伸長ステップで伸長されていないプライマーは、化学的または酵素的に(例えば、エキソヌクレアーゼを介して)分解され得、その結果、伸長されていないプライマーは、後続の検査ステップでのエラーに寄与する三元複合体を形成しない。
本明細書で使用される用語は、別段の定めがない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味を有すると理解されるであろう。ここで使用されるいくつかの用語とその意味を以下に示す。
本明細書で使用されるとき、「アレイ」という用語は、1つのフィーチャーにある分子を他のフィーチャーにある分子と区別できるように、1つ以上の固体支持体に結合している分子の集団を指す。アレイは固体支持体上の異なるアドレス可能なフィーチャーにそれぞれ位置する異なる分子を含むことができる。代替的に、アレイは、それぞれが異なる分子を有するフィーチャーとして機能する別個の固体支持体を含むことができ、異なる分子は、固体支持体が結合する表面上の固体支持体の位置に従って、または流体流などの液体中の固体支持体の位置に従って同定され得る。アレイの分子は、例えば、ヌクレオチド、核酸プライマー、核酸テンプレート、またはポリメラーゼ、リガーゼ、エキソヌクレアーゼもしくはそれらの組み合わせなどの核酸酵素であり得る。
本明細書で使用されるとき、「ブロッキング部分」という用語は、ヌクレオチドに関して使用される場合、核酸重合反応の間にヌクレオチドの3’酸素が次の正しいヌクレオチドへの共有結合を形成することを阻害または防止するヌクレオチドの一部を意味する。「可逆的な終結」ヌクレオチドのブロッキング部分は、ヌクレオチド類似体から除去するか、そうでなければ修飾して、ヌクレオチドの3’-酸素を次の正しいヌクレオチドに共有結合することを可能にできる。そのようなブロッキング部分は、本明細書では「可逆的ターミネーター部分」と呼ばれる。例示的な可逆的ターミネーター部分は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,427,673号、同第7,414,116号、同第7,057,026号、同第7,544,794号、もしくは同第8,034,923号、またはPCT公開第WO 91/06678号もしくは同第WO 07/123744号に記載されている。ブロッキング部分または可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチドは、プライマーなどの核酸の3’末端にあってもよく、または核酸に共有結合されていないモノマーであってもよい。ブロッキング部分は、ブロッキング部分が結合される核酸の3’末端における三元複合体形成を妨害する必要も妨げる必要もない。特に有用なブロッキング部分は、三元複合体の形成に関与する核酸の3’末端に存在する。
本明細書で使用されるとき、「触媒金属イオン」という用語は、ポリメラーゼによる核酸(例えば、プライマー)の3’-酸素と入ってくるヌクレオチドのリン酸との間のホスホジエステル結合形成を促進する金属イオンを指す。「二価触媒金属カチオン」は、2価を有する触媒金属イオンである。触媒金属イオンは、ホスホジエステル結合形成が生じない限り、金属イオンの非触媒濃度と称される、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、及びプライムされたテンプレート核酸の間の複合体の形成を安定化する濃度で存在することができる。金属イオンの触媒濃度は、ポリメラーゼが核酸(例えばプライマー)の3’-酸素基と入ってくるヌクレオチドのリン酸基との間の反応を触媒するのに十分な金属イオンの量を指す。
本明細書で使用されるとき、「共通配列」という用語は、2つ以上の核酸分子について同じであるヌクレオチドの配列を意味する。2つ以上の核酸に共通である配列は、比較されている核酸の全てまたは一部を含むことができる。共通配列は、少なくとも5、10、25、50、100、250、500、1000またはそれ以上のヌクレオチドの長さを有することができる。代替的または追加的に、長さは、最大で1000、500、250、100、50、25、10、または5ヌクレオチドであり得る。
「含む(comprising)」という用語は、本明細書では、列挙された要素だけでなく、任意の追加の要素をさらに含む、無制限であることを意図している。
本明細書で使用されるとき、「脱ブロックする」という用語は、ヌクレオチドを伸長可能にするために、ヌクレオチドの可逆的ターミネーター部分を除去または修正することを意味する。例えば、ヌクレオチドは、脱ブロッキングがプライマーを伸長可能にするように、プライマーの3’末端に存在することができる。例示的な脱ブロッキング試薬及び方法は、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7,427,673号、同第7,414,116号、同第7,057,026号、同第7,544,794号、もしくは同第8,034,923号、またはPCT公開第WO 91/06678号もしくは同第WO 07/123744号に記載されている。
本明細書で使用されるとき、「アンサンブルとして検出する」という用語は、集団の1つの分子をその集団の他の分子と必ずしも区別しない条件下で、分子の集団の特徴を検出することを意味する。例えば、アレイのフィーチャーでアンサンブルとして検出される核酸の集団は、そのフィーチャーでの核酸の特徴の複合体である明らかな特徴をもたらすことができる。特徴は、アレイのフィーチャーにおける複数の発光団からの発光の平均である発光シグナルであり得る。
本明細書で使用されるとき、「各」という用語は、項目の集合体に関連して使用される場合、集合体内の個々の項目を特定することを意図しているが、必ずしも集合体内の全ての項目を指すとは限らない。明示的な開示またはコンテキストが明らかにそうでない場合、例外が発生する可能性がある。
本明細書で使用されるとき、「外因性」という用語は、分子の部分に関して使用される場合、分子の天然の類似体には存在しない化学的部分を意味する。例えば、ヌクレオチドの外因性標識は、天然に存在するヌクレオチドには存在しない標識である。同様に、ポリメラーゼに存在する外因性標識は、その本来の環境ではポリメラーゼには見られない。
本明細書で使用されるとき、「伸長」という用語は、核酸に関して使用される場合、少なくとも1つのヌクレオチドを核酸の3’末端に付加するプロセスを意味する。「ポリメラーゼ伸長」という用語は、核酸に関して使用される場合、核酸の3’末端に少なくとも1つのヌクレオチドを付加するポリメラーゼ触媒プロセスを指す。伸長により核酸に付加されるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、核酸に組み込まれると言われている。したがって、「組み込むこと」という用語は、ホスホジエステル結合の形成によってヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを核酸の3’末端に結合するプロセスを指すために使用することができる。
本明細書で使用されるとき、「伸長可能」という用語は、ヌクレオチドに関して使用される場合、ヌクレオチドが3’位に酸素またはヒドロキシル部分を有し、次の正しいヌクレオチドが核酸に組み込まれる場合及びそのときに、次の正しいヌクレオチドへの共有結合を形成できることを意味する。伸長可能なヌクレオチドは、プライマーの3’位にあってもよいし、単量体ヌクレオチドであってもよい。伸長可能なヌクレオチドは、可逆的ターミネーター部分などのブロッキング部分を欠いている。
本明細書で使用されるとき、「フィーチャー」という用語は、アレイに関して使用される場合、特定の分子が存在するアレイ内の場所を意味する。フィーチャーには、単一の分子のみを含めることも、同じ種のいくつかの分子の集団(すなわち、分子のアンサンブル)を含めることもできる。代替的に、フィーチャーは、異なる種である分子の集団(例えば、異なるテンプレート配列を有する三元複合体の集団)を含み得る。アレイのフィーチャーは通常、個別である。個別のフィーチャーは隣接していても、相互にスペースがあってもよい。本明細書で有用なアレイは、例えば、100ミクロン、50ミクロン、10ミクロン、5ミクロン、1ミクロン、または0.5ミクロン未満離れているフィーチャーを有することができる。代替的または追加的に、アレイは、0.5ミクロン、1ミクロン、5ミクロン、10ミクロン、50ミクロン、または100ミクロンを超えて離れている特徴を有することができる。フィーチャーはそれぞれ、1平方ミリメートル未満、500平方ミクロン、100平方ミクロン、25平方ミクロン、1平方ミクロンまたはそれ以下の面積を有することができる。
本明細書で使用されるとき、「標識」という用語は、検出可能な特性を提供する分子またはその部分を指す。検出可能な特性は、例えば、放射の吸収、蛍光発光、ルミネセンス発光、蛍光寿命、蛍光偏光などの光シグナル、レイリー及び/またはミー散乱、リガンドまたは受容体に対する結合親和性、磁気特性、電気特性、電荷、質量、放射能などであり得る。例示的な標識には、フルオロフォア、発光団、発色団、ナノ粒子(例えば、金、銀、カーボンナノチューブ)、重原子、放射性同位元素、質量標識、電荷標識、スピン標識、受容体、リガンドなどが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「人工容器」は、1つの化学プロセス(例えば、結合事象、組み込み反応など)を別の化学プロセスから分離するか、または化学プロセスが起こり得る空間を提供するように機能する、人間が作ったもしくは人間が修正した容器である。本開示の技術に関連して有用な人工容器の非限定的な例としては、フローセル、マルチウェルプレートのウェル、顕微鏡スライド、管(例えば、毛細管)などが挙げられる。検査または検出されるべきフィーチャーは、反応容器内に含まれ得る。
本明細書で使用されるとき、「次の正しいヌクレオチド」という用語は、プライマーがハイブリダイズするテンプレート鎖の塩基と相補的なプライマーの3’末端に結合及び/または組み込まれるヌクレオチドタイプを指す。テンプレート鎖の塩基は「次の塩基」と呼ばれ、プライマーの3’末端にハイブリダイズするテンプレートの塩基のすぐ5’側にある。次の正しいヌクレオチドは、次の塩基の「同族体」と呼ばれ、逆も同様である。三元複合体または二本鎖核酸において互いに相互作用するヌクレオチド同族体は、互いに「対となる」と言われる。次のテンプレート塩基に相補的ではない塩基を有するヌクレオチドは、「正しくない」、「ミスマッチ」、または「非同族体」ヌクレオチドと呼ばれる。
本明細書で使用されるとき、「非触媒金属イオン」という用語は、ポリメラーゼ酵素の存在下にあるとき、プライマーへのヌクレオチドの化学的組み込みに必要なホスホジエステル結合形成を促進しない金属イオンを指す。非触媒金属イオンは、例えば、触媒金属イオンと比較して、競合結合を介して、ポリメラーゼと相互作用し得る。したがって、非触媒金属イオンは、阻害金属イオンとして機能することができる。「二価非触媒金属イオン」は、2価を有する非触媒金属イオンである。二価非触媒金属イオンの例としては、Ca2+、Zn2+、Co2+、Ni2+及びSr2+が挙げられるが、これらに限定されない。三価のEu3+及びTb3+イオンは、3価を有する非触媒金属イオンである。
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」という用語は、天然のヌクレオチドまたはその類似体を指すために使用することができる。例には、リボヌクレオチド三リン酸(rNTP)、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)などのヌクレオチド三リン酸(NTP)、またはジデオキシリボヌクレオチド三リン酸(ddNTP)などの非天然類似体、または可逆的な終結ヌクレオチド三リン酸(rtNTP)が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「オリゴヌクレオチド部分」という用語は、少なくとも2つの隣接するヌクレオチドを含む核酸の一部分を指す。オリゴヌクレオチド部分は、例えば、少なくとも5、8、10、15、20、25、50、100またはそれ以上の隣接するヌクレオチドを含むことができる。代替的または追加的に、オリゴヌクレオチド部分は、最大で100、50、25、20、15、10、8、5、または2個の隣接するヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、プライマー-テンプレートハイブリッドに付加されるオリゴヌクレオチド部分は、次のテンプレートヌクレオチドからテンプレートの5’末端までのテンプレートの長さと同等である長さを有することができる。
本明細書で使用されるとき、「ポリメラーゼ」という用語は、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマーゼ、及びトランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない核酸合成酵素を指すために使用することができる。典型的には、ポリメラーゼは、ヌクレオチド結合及び/またはヌクレオチド重合の触媒作用が起こり得る1つ以上の活性部位を有する。ポリメラーゼは、二本鎖核酸分子の第1の鎖の3’末端へのヌクレオチドの重合を触媒することができる。例えば、ポリメラーゼは、ホスホジエステル結合を介して二本鎖核酸分子の第1の鎖の3’酸素基への次の正しいヌクレオチドの付加を触媒し、それによって二本鎖核酸分子の第1の鎖にヌクレオチドを共有結合的に組み込む。任意に、ポリメラーゼは、本明細書に記載される方法で使用される1つ以上の条件下でヌクレオチドを組み込むことができる必要はない。例えば、変異型ポリメラーゼは、三元複合体を形成することができるが、ヌクレオチドの組み込みを触媒することができない場合がある。
本明細書で使用されるとき、「プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド」または「プライマー-テンプレートハイブリッド」という用語は、鎖のうちの1つがプライマーであり、もう1つの鎖がテンプレートであるような二本鎖領域を有する核酸を指す。二本鎖は、隣接する核酸分子(例えば、ヘアピン構造)の一部であり得るか、または二本鎖は、互いに共有結合されていない分離可能な分子であり得る。
本明細書で使用されるとき、「プライマー」という用語は、テンプレート配列またはその近くの核酸に結合する配列を有する核酸を指す。一般に、プライマーは、例えば、プライマーのポリメラーゼ伸長を介して、テンプレートの複製を可能にする構成で結合する。プライマーは、核酸分子の第2の部分に結合する核酸分子の第1の部分であり得、第1の部分はプライマー配列であり、第2の部分はプライマー結合配列(例えば、ヘアピンプライマー)である。代替的に、プライマーは、テンプレート配列を有する第2の核酸分子に結合する第1の核酸分子であり得る。プライマーは、DNA、RNAまたはそれらの類似体からなることができる。プライマーは、伸長可能な3’末端、プライマー伸長からブロックされた3’末端、または三元複合体形成を妨害するかまたは妨げるようにキャップされた3’末端を有することができる。
本明細書で使用されるとき、「固体支持体」という用語は、水性液体に不溶性である剛性基材を指す。基材は、非多孔質であっても多孔質であってもよい。基材は任意に、(例えば、多孔質のため)液体を取り込むことができるが、典型的には、基材が液体を取り込むときに実質的に膨張せず、液体が乾燥によって除去されるときに実質的に収縮しないように、十分に剛性である。非多孔質固体支持体は一般に、液体またはガスに対して不透過性である。例示的な固体支持体としては、ガラス及び改質または官能化ガラス、プラスチック(アクリル、ポリスチレン、ならびにスチレン及び他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Teflon(登録商標)、環状オレフィン、ポリイミドなどを含む)、ナイロン、セラミック、樹脂、Zeonor、シリコン及び改質シリコンを含むシリカまたはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバー束、ならびにポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「サブセット」という用語は、1つ以上のものの集合体を意味し、それらの全ては、より大きいものの集合体に含まれる。より大きいものの集合体は、「セット」と呼ばれ得る。サブセットは、少なくとも1、2、10、100、1×103、1×106、1×109、またはそれ以上のものを含むことができる。ものは、例えば、本明細書に記載されるプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドなどの核酸、三元複合体、ポリメラーゼ、ヌクレオチドまたは他の組成物であり得る。
本明細書で使用されるとき、「三元複合体」という用語は、ポリメラーゼ、二本鎖核酸、及びヌクレオチドの間の分子間会合を指す。典型的には、ポリメラーゼは、次の正しいヌクレオチドとプライムされた核酸のテンプレート鎖との間の相互作用を促進する。次の正しいヌクレオチドは、ワトソンクリック水素結合を介してテンプレート鎖と相互作用することができる。「安定化三元複合体」という用語は、存在が促進または長期化された三元複合体、または破壊が阻害された三元複合体を意味する。一般に、三元複合体の安定化は、三元複合体のプライムされた核酸成分への三元複合体のヌクレオチド成分の共有結合による組み込みを妨げる。
本明細書で使用されるとき、「三元複合体阻害剤」という用語は、核酸中に存在するとき、核酸がポリメラーゼ及び/またはヌクレオチドに結合して三元複合体を形成することを妨害するか、または妨げる部分を指す。三元複合体形成に対する立体ブロックを作り出す部分は、特に有用であり、例えば、プライマーがハイブリダイズされるテンプレートの末端までプライマーを伸長する重合またはライゲーション生成物を含む。立体ブロックの別の例は、ミスマッチしたヌクレオチドである。三元複合体形成を妨害または防止する正電荷または負電荷を導入するための部分も使用され得る。部分は、ストレプトアビジン(またはその類似体)に結合するビオチン(またはその類似体)、抗体(またはその機能的フラグメント)に結合するエピトープ、レクチンに結合する炭水化物など、三元複合体形成を阻害または防止する受容体に結合するリガンドであり得る。したがって、三元複合体阻害剤は、三元複合体形成を阻害するリガンド-受容体複合体を形成するために、受容体(または他の分子)に結合することができるリガンド(または他の)部分であり得る。三元複合体阻害剤として使用され得る部分のさらなる例には、Turcatti et al.Nucl.Acids.Res.36(4)e25(2008)に記載される塩基修飾及びヌクレオチド類似体を含む。
本明細書で使用されるとき、「タイプ」という用語は、同じ化学構造を共有する分子を識別するために使用される。例えば、ヌクレオチドの混合物は、いくつかのdCTP分子を含み得る。dCTP分子は、互いに同じタイプであるが、dATP、dGTP、dTTPなどと比較して異なるタイプであると理解される。同様に、ヌクレオチドの同じ配列を有する個々のDNA分子は、同じタイプであるが、異なる配列のDNA分子は、異なるタイプである。「タイプ」という用語は、同じ化学構造を共有する部分を識別することもできる。例えば、テンプレート核酸におけるシトシン塩基は、テンプレート配列におけるそれらの位置とは無関係に、互いに同じタイプの塩基であると理解されるであろう。
以下に記載され、特許請求の範囲に記載される実施形態は、上述の定義を考慮して理解することができる。
本開示は、テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するための方法を提供する。方法は、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)その複数を、(i)3’末端にブロックされたヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するためのブロックされたヌクレオチド、及び(ii)三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させるステップと、(c)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(d)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、を含むことができる。任意に、ブロックされたヌクレオチドは、可逆的な終結ヌクレオチドであり得る。
本開示の方法は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのプライマー成分にヌクレオチドまたは他の部分が付加される、プライマー修飾プロセスを含むことができる。プライマー修飾プロセスを使用して、検査プロセスのためのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを調製することができ、それによって、テンプレート核酸の次の塩基が検出される。任意に、検査は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの次の塩基、ポリメラーゼ、及び次の塩基の同族ヌクレオチド(すなわち、同族ヌクレオチドは、次の正しいヌクレオチドとも呼ばれる)の間で形成される三元複合体を検出するために実施される。検査プロセスに関するさらなる詳細が、以下に記載される。
プライマー修飾プロセスに戻ると、1つ以上のヌクレオチドによるプライマーの伸長をもたらす修飾を使用して、次に検査されるテンプレート核酸の位置を変更することができる。例えば、伸長を使用して、1つのヌクレオチドをプライマーに付加し、それによって、三元複合体形成のための位置を1つのテンプレート位置によってシフトすることができる。テンプレート核酸は、プライマーの末端で(すなわち、次のテンプレート塩基で)三元複合体形成を検査し、次いで、プライマーを伸長して検査の位置をシフトさせる反復サイクルを使用して、配列決定され得る。
プライマー修飾プロセス中にプライマーを伸長することができない場合、例えば、テンプレートのどの位置が実際に任意の所与のサイクルで検査されているかについての混乱、または例えば、伸長が進行することができない場合の読み取り長さの低減により、精度の低下をもたらし得る。プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのアンサンブルを検出する場合、比較的小さい伸長の非効率性でさえ、読み取り精度及び読み取り長さに悪影響を与えるフェージング問題をもたらす可能性がある。
本明細書に記載される方法で使用されるプライマー修飾プロセスは、そうでなければ伸長の失敗及び非効率性から生じるであろうアーチファクトに対して軽減する手段を提供することができる。特定の実施形態では、プライマー修飾プロセスは、少なくとも2つのステップ:(i)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド及びポリメラーゼを可逆的な終結ヌクレオチドと接触させて、3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するステップと、(ii)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド及びポリメラーゼを三元複合体阻害剤と接触させて、三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するステップと、を含むことができる。ステップ(i)は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットが、配列情報の提供に引き続き関与することができるように、プライマーを伸長する利点を提供することができる。例えば、ステップ(i)で使用される可逆的な終結ヌクレオチドは、可逆的な終結プライマーのための三元複合体の後続の形成及び検査に対応するように選択され得る。ステップ(ii)は、プライマーが後続の検査ステップ中に三元複合体の形成に関与するのを防止するために、キャッピングプライマーの利点を提供することができる。このキャッピングは、フェージングを低減し、塩基呼び出しの精度を高め、配列決定読み取り長さを延長することができる。一般に、ステップ(i)は、ステップ(ii)の前に実施される。しかしながら、ステップは同時に、または逆の順序で実施され得る。連続して実施される場合、ステップのうちの1つが、もう1つのステップの直後に行われ得るか、ステップのうちの1つが、前のステップが終了する前に開始することができるか、または別のステップは、2つのステップの間に介入することができる。
伸長が可逆的な終結ヌクレオチドで実施される場合、特に有用なキャッピング化学物質は、伸長したプライマーの3’末端と比較して、伸長されていないプライマーの3’末端に対して選択的である。例えば、キャッピング化学物質は、ブロックされていないプライマーの3’末端に反応し、ブロックされたプライマーを修飾するのに不活性であり得る。この構成では、キャッピングが、伸長ステップを完了するように機能することができる。例えば、リガーゼ及びポリメラーゼを含む、プライマーの天然3’末端に特異的である酵素を使用する化学物質が、特に有用である。ブロックされたプライマーと比較して、天然3’プライマー末端の修飾においてより効率的であるキャッピング手順は、多くの用途において有益である。
特定の実施形態では、三元複合体阻害剤は、プライマーをキャップするために使用される。プライマーの3’末端の三元複合体の後続の形成を妨害または防止するために、様々な部分のいずれかがプライマーに付加され得る。例えば、プライマーは、それに結合されたオリゴヌクレオチド部分を有するように修飾され得る。オリゴヌクレオチド部分は、プライマーが修飾される前に一本鎖であったテンプレートの領域と少なくとも同じくらい長い長さを有することができる。例えば、オリゴヌクレオチド部分は、プライマーの3’末端からテンプレートの5’末端まで伸長することができる。別の例では、オリゴヌクレオチド部分は、プライマーの3’末端から、テンプレート領域に隣接する二本鎖領域の5’末端まで伸長することができる。この例では、二本鎖領域の5’末端は、テンプレート領域への境界を形成する。結合タンパク質、化学修飾、固体支持体への結合点などの他の境界が存在し得る。オリゴヌクレオチド部分は、プライマーと境界との間のテンプレートへの三元複合体の結合を防止する長さを有することができる。三元複合体阻害は、テンプレート領域の全体が二本鎖であり、それによって三元複合体が形成され得る一本鎖の位置を除去する場合に生じ得る。
任意に、プライマーは、オリゴヌクレオチドの5’末端のプライマーの3’末端へのリガーゼ触媒結合の結果として、または一連のヌクレオチドでのプライマーのポリメラーゼ触媒伸長の結果として、オリゴヌクレオチド部分に結合され得る。プライマーを修飾するリガーゼ、ポリメラーゼ及び他の酵素が有用であり得る。しかしながら、本明細書に記載される方法でプライマーを修飾するための化学技術はまた、有用であり得る。プライマーに結合されたオリゴヌクレオチド部分は、テンプレートと天然ワトソン-クリック塩基対を形成する完全に天然のヌクレオチドから構成され得る。代替的に、オリゴヌクレオチドは、1つ以上の非天然ヌクレオチド類似体を含むことができる。これらの類似体は、テンプレートと塩基対を形成する能力に関して選択され得が、テンプレートと対合しない類似体も使用され得る。同様に、天然ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドとテンプレートとの間の塩基対合を破壊するミスマッチを形成するオリゴヌクレオチド部分の位置に存在し得る。ミスマッチまたは非天然ヌクレオチド類似体の特に有用な位置は、オリゴヌクレオチド部分の3’末端にあり、オリゴヌクレオチド部分は、後続の三元複合体形成を妨害するかまたは妨げるように機能することができる。
プライマーの3’末端の三元複合体の後続の形成を妨害または防止するためにプライマーに付加され得る有用な部分の別の例は、単一ヌクレオチド(例えば、天然ヌクレオチドまたは非天然ヌクレオチド類似体)である。例えば、ミスマッチしたヌクレオチドは、三元複合体形成を防止するためにプライマーの3’末端に結合され得る。ミスマッチを認識する能力に影響を受ける特に有用なミスマッチ及びポリメラーゼは、参照により本明細書に組み込まれる、Kwok et al.,Nucleic Acids Res.18(4):999-1005(1990)に記載されている。ミスマッチしたヌクレオチドは、プライマーに付加されたオリゴヌクレオチド部分を介して導入されたプライマーの3’末端に存在することができる。いくつかの実施形態では、一連の2つ以上のミスマッチしたヌクレオチドが、プライマーの3’末端またはその付近に存在して、三元複合体形成の阻害を達成することができる。プライマーの3’末端に付加されるヌクレオチドがテンプレートとマッチするかどうかにかかわらず、ヌクレオチドは、三元複合体阻害剤として機能する外因性部分を含むことができる。外因性部分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、またはその両方が三元複合体形成からブロックされる、立体ブロッキング効果を有することができる。部分は、ポリメラーゼまたは同族ヌクレオチドの電荷反発、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの構造の摂動、ポリメラーゼまたは同族ヌクレオチドに反発する極性などが挙げられるがこれらに限定されない、三元複合体形成に対する他の効果を有し得る。
特に有用な部分としては、ビオチン、あるいは3’末端にそれらが存在するため、またはストレプトアビジンもしくは他の受容体と相互作用し、これが三元複合体形成を防止するため、三元複合体形成を妨害または防止することができる他のリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。他のリガンド-受容体対としては、抗体(またはFabもしくはScFvなどのその機能的フラグメント)及びエピトープ、または炭水化物及びレクチン、または二次標識の文脈で本明細書に記載される結合パートナーが挙げられるが、これらに限定されない。プライマーキャップとしてリガンド-受容体を使用する利点は、リガンドが受容体に結合されるまで三元複合体形成を阻害する必要がないことである。例えば、リガンドに結合されるヌクレオチドは、ポリメラーゼ及びプライマー-テンプレート核酸に結合して三元複合体を形成することができ、ヌクレオチドは、プライマーに組み込まれて、プライマーの3’末端にリガンドを位置付けることができる。次いで、受容体は、プライマーの3’末端のリガンドに結合されて、プライマーの3’末端の三元複合体の形成を阻害することができる。
プライマーは、三元複合体が存在する場合であっても、三元複合体の検出を阻害する部分でキャップされ得る。例えば、発光ラベルを使用して三元複合体形成を検出する場合、キャップは、発光ラベルからのシグナルを低減または防止する消光剤であり得る。より具体的な例として、プライマーは、消光部分でキャップされ得、三元複合体は、キャップされたプライマー、ポリメラーゼ、及び発光標識ヌクレオチドの間で形成され得る。発光標識ヌクレオチドは、消光剤及び発光標識の近接により、発光シグナルを発生させることを防げられ得る。三元複合体の形成を必ずしも阻害することなく、三元複合体の検出を阻害するために使用され得る別の部分は、FRET対のもう1つのメンバーで標識される三元複合体に使用され得るFRET対の1つのメンバーである。FRET現象から生じるシグナルの結果として生じるシフトは、予想されるシグナルを効果的に低減し、したがって、キャップされていないプライマーから生じるであろうシグナルの明らかな阻害をもたらすことができる。FRETの場合、シフトしたシグナルを検出して、キャップされたプライマーの存在を同定することができる。場合によっては、シフトしたFRETシグナルを定量化して、検査されている試料中のキャップされたプライマーを定量化することができる。特定の標識か三元複合体の検出に使用される場合、特定の標識からのシグナルを消光または修飾する他の部分が、キャッピング部分として使用され得る。
いくつかの実施形態では、プライマー修飾プロセスは、ポリメラーゼを伸長されていないプライマーの3’末端に架橋するために使用され得る。条件は、天然3’ヒドロキシル部分を有するプライマーの3’末端にポリメラーゼを選択的に保持しながら、3’末端に可逆的ターミネーターを有するプライマーからポリメラーゼを除去するために使用され得る。保持されたポリメラーゼは、プライムされたテンプレート核酸ハイブリッドに架橋され、後にヌクレオチドに結合して三元複合体を形成することが阻害され得る。阻害は、保持されたポリメラーゼを変性させること、ポリメラーゼのヌクレオチド結合部位で架橋すること、またはポリメラーゼを不活性化するための当該技術分野で既知の他の化学的もしくは光化学的修飾の結果であり得る。
本明細書の教示に従って作製または使用される複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドは、可逆的な終結プライマーを有する種の第1のサブセットと、三元複合体阻害剤部分などのキャップを有する種の第2のサブセットを含むことができる。第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの99%、90%、80%、70%、60%または51%未満であり得る。代替的または追加的に、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または99%であり得る。いくつかの実施形態では、第2のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの最大で1%、10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上である。代替的または追加的に、第2のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの少なくとも50%、40%、30%、20%、10%、1%またはそれ以下であり得る。上記の例の各々において、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドは、例えば、核酸アレイの特定のフィーチャーに存在する固体支持体に結合され得る。
配列決定の実施形態では、第1及び第2のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの相対数は、配列決定が進行するにつれて変化し得る。そのような場合、配列決定は、一方または両方のサブセットについて特定の閾値集団サイズに達するまで進行することが許可され得る。閾値は、上記に記載されるものと同じであってもよく、または閾値は、方法の特定の使用に合うように異なってもよい。代替的に、配列決定は、所定数のサイクルにわたって、または同定を行うために適切な配列情報を取得することなど、異なる特徴の閾値が達成されるまで、もしくはシグナル対ノイズが特定のレベルまで低下するまで進行することができる。
プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1及び第2のサブセットは、他の方法で異なり得る。典型的には、第1のサブセットのプライマー(例えば、可逆的な終結ヌクレオチドの付加によって伸長されるプライマー)は、互いに同じ長さである。これは一般に、アンサンブルのテンプレート核酸の次の塩基を検出するとき、均一な相を提供するために有利である。しかしながら、第2のサブセットのプライマー(例えば、三元複合体阻害剤を有するプライマー)は、互いと比較して長さが異なり得る。そのような集団は、集団内の種が配列決定方法の異なるサイクルでのキャッピングから生じた場合に生じ得る。任意に、第2のサブセットのプライマーは、第1のサブセットのプライマーよりも短い。代替的に、第2のサブセットのプライマーは、第1のサブセットのプライマーよりも長くあり得る。
特定の実施形態では、プライマー修飾プロセスは、伸長されていないプライマーを除去または分解することによって、伸長の失敗及び非効率性から生じるアーチファクトに対して軽減することができる。例えば、プライマー修飾プロセスは、少なくとも2つのステップ:(i)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド及びポリメラーゼを可逆的な終結ヌクレオチドと接触させて、3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するステップと、(ii)プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを、プライマーを除去または分解する薬剤と接触させ、それによって機能的プライマーを欠くテンプレート核酸を含む第2のサブセットを生成するステップと、を含むことができる。ステップ(i)は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットが、配列情報の提供に引き続き関与することができるように、プライマーを伸長する利点を提供することができる。ステップ(ii)は、伸長されていないプライマーが、後続の検査ステップ中に三元複合体の形成に関与するのを防止する利点を提供することができる。伸長されていないプライマーが存在しないことにより、フェージングを低減し、塩基呼び出しの精度を高め、配列決定読み取り長さを延長することができる。一般に、ステップ(i)は、ステップ(ii)の前に実施される。しかしながら、ステップは同時に、または逆の順序で実施され得る。連続して実施される場合、ステップのうちの1つが、もう1つのステップの直後に行われ得るか、ステップのうちの1つが、前のステップが終了する前に開始することができるか、または別のステップは、2つのステップの間に介入することができる。
特定の実施形態では、伸長されていないプライマーを分解するために使用される試薬は、伸長したプライマー中に存在する可逆的ターミネーター部分などのブロッキング部分を欠くプライマーに対して選択的である。例えば、プライマー分解は、3’末端にブロッキング部分を欠くプライマー(例えば、ブロックされたヌクレオチドを付加することによって伸長されていないプライマー)の分解において活性であるが、他のプライマー(例えば、3’末端にブロックされたヌクレオチドを組み込むように伸長されているプライマー)上のブロッキング部分の存在によって阻害される、エキソヌクレアーゼまたは化学薬剤を使用して行われ得る。3’~5’エキソヌクレアーゼは特に有用であり得、その例には、3’エキソヌクレアーゼ活性、Exo IIIまたはExo VIIを有するポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。任意に、プライムされたテンプレート核酸ハイブリッドのテンプレート成分の3’末端は、例えば、固体支持体への結合を介して、またはブロッキング部分の存在を介してブロックされて、テンプレートの望ましくない分解を防止することができる。さらなる選択肢として、プライマー及び/またはテンプレートの5’末端が、望ましくない分解を防止するためにブロックされ得る。
複数のテンプレート核酸は、可逆的な終結プライマーにハイブリダイズされた種の第1のサブセットと、例えば、プライマーが除去または分解されたことにより、プライマーを有しない種の第2のサブセットとを含むことができる。第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のテンプレート核酸の99%、90%、80%、70%、60%または51%未満であり得る。代替的または追加的に、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数は、複数のテンプレート核酸の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または99%であり得る。いくつかの実施形態では、第2のサブセットのテンプレート核酸の数は、複数のテンプレート核酸の最大で1%、10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上である。代替的または追加的に、第2のサブセットのテンプレート核酸の数は、複数のテンプレート核酸の50%、40%、30%、20%、10%、1%未満またはそれ以下であり得る。上記の例の各々において、複数のテンプレート核酸は、例えば、核酸アレイの特定のフィーチャーに存在する固体支持体に結合され得る。
本明細書に記載される方法で使用されるプライマー修飾プロセスは、標識ポリメラーゼを使用する必要はない。例えば、伸長ステップまたはキャッピングステップに使用されるポリメラーゼは、外因性標識に(例えば、共有結合的またはその他の方法で)結合される必要はない。代替的に、プライマー伸長またはキャッピングに使用されるポリメラーゼは、外因性標識、例えば、前の検査ステップで使用された標識を含み得る。
典型的には、本明細書に記載される方法でプライマーに付加される可逆的な終結ヌクレオチドは、外因性標識を有しない。これは、本明細書に記載される方法では伸長したプライマーを検出する必要がないためである。しかしながら、必要に応じて、本明細書に記載される方法で使用される1種類以上のタイプの可逆的な終結ヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチドに結合した外因性標識を介して検出することができる。例示的な可逆的ターミネーター部分、それらをプライマーに組み込む方法、及びさらなる伸長のためにプライマーを修飾する方法(しばしば「脱ブロッキング」と呼ばれる)は、米国特許第7,544,794号、同第7,956,171号、同第8,034,923号、同第8,071,755号、同第8,808,989号、または同第9,399,798号に記載されている。さらなる例は、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、米国特許第7,057,026号、WO 91/06678、WO 07/123744、米国特許第7,329,492号、米国特許第7,211,414号、米国特許第7,315,019号、米国特許第7,405,281号、及びUS 2008/0108082に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
同様に、三元複合体阻害剤、または本明細書に記載される方法でプライマーに付加される他のプライマーキャップは、外因性標識を有する必要はない。これは、三元複合体阻害剤などのキャップを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、本明細書に記載される方法で検出される必要がないためである。しかしながら、必要に応じて、1種類以上のタイプの三元複合体阻害剤、または本明細書に記載される方法で使用される他のキャップは、例えば、キャップまたは三元複合体阻害剤に結合された外因性標識を介して検出され得る。
プライマーキャッピングプロセスは、プライマー伸長プロセスと同時に行われ得るか、または2つのプロセスは、本明細書に記載される他のプロセスによって分離され得る。例えば、プライマーキャッピングは、プライマー伸長の直後に起こり得る。別の例では、検査は、プライマー伸長プロセスとプライマーキャッピングプロセスとの間に行われ得る。いくつかの実施形態では、プライマーキャッピングは、検査と同時に起こり得る(例えば、プライマーキャッピング試薬は、三元複合体を形成するための試薬と共に反応容器に送達され得る)。
本開示の方法は、三元複合体が形成及び検出される検査ステップを含むことができる。方法の実施形態は、ポリメラーゼがプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド及び次の正しいヌクレオチドと共に安定化三元複合体を形成することができる特異性を利用する。次の正しいヌクレオチドは、安定化三元複合体に非共有結合で結合でき、非共有相互作用のみを介して複合体の他のメンバーと相互作用する。安定化三元複合体を形成するための有用な方法及び組成物は、以下でさらに詳細に、かつ共同所有の米国特許出願公開第2017/0022553 A1号もしくは米国特許出願第15/677,870号(米国特許出願公開第2018/0044727 A1号として公開)、米国特許出願公開第2018/0187245 A1号(米国特許出願第62/440,624号に対する優先権を主張)、または米国特許出願公開第2018/0208983 A1号(米国特許出願第62/450,397号の利益を主張)に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
典型的には、検査は、例えば、検査及び修飾に介入する試薬交換または洗浄により、プライマー修飾とは別々に、かつ個別に行われる。代替的に、いくつかの実施形態では、検査及び1つ以上のプライマー修飾ステップは、同じ混合物中で起こり得る。例えば、検査及びプライマーブロッキングは、同じ混合物中で起こり得る。代替的または追加的に、検査及びプライマーキャッピングは、同じ混合物中で起こり得る。
三元複合体は、特定の触媒金属イオン(例えば、Mg2+)が存在しない場合、ポリメラーゼ、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び次の正しいヌクレオチドの間で形成できるが、触媒金属イオンがない場合、ヌクレオチドの化学的付加が阻害される。触媒金属イオンのレベルが低いか不足していると、安定化三元複合体の次の正しいヌクレオチドが非共有結合で隔離される。本明細書に開示される他の方法もまた、安定化三元複合体を生成するために使用され得る。
任意に、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのプライマーが、プライマーに入ってくるヌクレオチドの酵素的組み込みを妨げるブロッキング部分(例えば、可逆的ターミネーター部分)を含む場合、安定化三元複合体を形成することができる。相互作用は、安定剤の存在下で起こり得、それにより、ポリメラーゼ-核酸相互作用は、次の正しいヌクレオチドの存在下で安定化される。プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのプライマーは、任意に、伸長可能なプライマー、またはその3’末端で伸長からブロックされたプライマーのいずれかであり得る(例えば、ブロッキングは、プライマーの3’末端上の可逆的ターミネーター部分の存在によって達成され得る)。プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドは、同族ヌクレオチドの塩基がプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの次の塩基に相補的である場合、安定化三元複合体を形成することができる。
上記のように、三元複合体を支持または安定化する条件は、プライマーに入ってくるヌクレオチドの酵素的組み込みを妨げるブロッキング基(例えば、プライマーの3’ヌクレオチド上の可逆的ターミネーター部分)の存在によって、または触媒金属イオンの欠如によってもたらされ得る。他の有用な条件は、ヌクレオチド組み込みまたは重合を阻害する非触媒イオン(例えば、二価または三価の非触媒金属イオン)などの三元複合体安定剤の存在を含む。非触媒金属イオンには、カルシウム、ストロンチウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、ガリウム、ゲルマニウム、ヒ素、セレン、ロジウム、ユーロピウム及びテルビウムイオンが含まれるが、これらに限定されない。任意に、二元複合体(すなわち、ポリメラーゼとプライムされた核酸との間の複合体であるが同族ヌクレオチドを欠く)を不支持または不安定にする条件は、1つ以上の一価カチオン及び/またはグルタミン酸アニオンの存在によってもたらされる。さらなる選択肢として、触媒活性を防止するように、または二元複合体形成の傾向を防止するように操作されたポリメラーゼが使用され得る。
特定の実施形態では、三元複合体は、Li+、ベタインまたはその両方の存在によって安定化される。例えば、米国特許出願第16/355,361号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される試薬及び技術が使用され得る。例えば、米国特許出願第16/164,417号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものを含む非混和性流体を使用して、三元複合体を安定化することができる。
三元複合体安定化条件は、例えば、二元複合体を不安定化することによって、異なるヌクレオチドの存在下でのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドに対するポリメラーゼの親和性の差を際立たせるようにさらに構築され得る。任意に、条件は、異なるヌクレオチドの存在下で、プライマー-テンプレートに対するポリメラーゼの異なる親和性を引き起こす。例として、条件には、高塩及びグルタミン酸イオンが含まれるが、これらに限定されない。例えば、塩は水溶液に溶解して、一価金属カチオン(例えば、ナトリウムイオンまたはカリウムイオン)などの一価カチオンを生成することができる。任意に、一価カチオン(例えば、一価金属カチオン)を提供する塩は、グルタミン酸イオンをさらに提供する。任意に、グルタミン酸イオンの供給源は、グルタミン酸カリウムであり得る。場合によっては、プライマー-テンプレートハイブリッドのポリメラーゼ親和性を変更するために使用できるグルタミン酸カリウムの濃度は、10mM~1.6Mのグルタミン酸カリウム、または10mM~1.6Mの間の任意の量に及ぶ。上記に示されるように、高塩とは、50mM~1.5Mの塩の塩濃度を指す。
三元複合体を安定化するために本明細書に記載されている選択肢は、相互に排他的である必要はなく、代わりに様々な組み合わせで使用できることが理解されるであろう。例えば、三元複合体は、ポリメラーゼドメインの架橋;ポリメラーゼの核酸への架橋;三元複合体を安定化するポリメラーゼ変異;少分子によるアロステリック阻害;非競合的阻害剤、競合的阻害剤、非競合的阻害剤、触媒金属イオンの非存在、プライマー上のブロッキング部分の存在、及び本明細書に記載される他の手段が挙げられるがこれらに限定されない、手段の1つまたは組み合わせによって安定化され得る。
安定化三元複合体は、方法の特定の用途または構成に適合するように所望されるように、天然ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、または修飾ヌクレオチドを含むことができる。必要に応じて、ヌクレオチド類似体は、窒素塩基、五炭糖、及びリン酸基を有し、ヌクレオチドの任意の部分は、天然ヌクレオチドと比較して、改変、欠失及び/または置換され得る。ヌクレオチド類似体は、組み込み不可能なヌクレオチド(すなわち、プライマーの3’酸素と反応して共有結合を形成することができないヌクレオチド)であり得る。組み込むことができないそのようなヌクレオチドには、例えば、一リン酸及び二リン酸のヌクレオチドが含まれる。別の例では、ヌクレオチドは、ヌクレオチドを組み込み不可能にする三リン酸基への修飾(複数可)を含み得る。組み込み不可能なヌクレオチドの例は、米国特許第7,482,120号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載される。いくつかの実施形態では、組み込み不可能なヌクレオチドは、その後、組み込み可能になるように修飾され得る。組み込み不可能なヌクレオチド類似体には、アルファ-リン酸修飾ヌクレオチド、アルファ-ベータヌクレオチド類似体、ベータ-リン酸修飾ヌクレオチド、ベータ-ガンマヌクレオチド類似体、ガンマ-リン酸修飾ヌクレオチド、またはケージドヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ヌクレオチド類似体の例は、米国特許第8,071,755号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されている。
安定化三元複合体に関与するヌクレオチド類似体は、類似体がプライマーに組み込まれた後、プライマーの3’末端でのその後のヌクレオチド組み込みを可逆的に防止するターミネーターを含むことができる。例えば、U.S.7,544,794及びU.S.8,034,923(これらの特許の開示は参照により本明細書に組み込まれる)は、3’-OH基が3’-ONH2部分によって置き換えられている可逆的ターミネーターを記載している。別のタイプの可逆的ターミネーターは、例えば、U.S.8,808,989(その開示は参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、ヌクレオチドの窒素含有塩基に連結される。本明細書に記載される方法に関連して同様に使用できる他の可逆的ターミネーターには、本明細書の別の箇所に引用されている参考文献、またはU.S.7,956,171、U.S.8,071,755、及びU.S.9,399,798に記載されているものが含まれる(これらの米国特許の開示は参照により本明細書に組み込まれる)。ある特定の実施形態では、可逆的ターミネーター部分は、「脱ブロッキング」として知られるプロセスによってプライマーから修飾または除去され、後続のヌクレオチド組み込みを可能にすることができる。脱ブロッキングのための組成物及び方法は、可逆的ターミネーターとの関連で本明細書に引用される参考文献に示されている。
安定化三元複合体に関与するヌクレオチド類似体は、類似体がプライマーに組み込まれた後、プライマーの3’末端における後続の三元複合体形成を防止する三元複合体阻害剤を含み得る。ヌクレオチド類似体は、外因性標識を含むことができるが、本明細書で使用されるヌクレオチド類似体は、標識を含む必要はない。
代替的に、ヌクレオチド類似体は、それらが組み込まれているプライマーの3’末端でのヌクレオチドの組み込みを不可逆的に防止する。不可逆的なヌクレオチド類似体には、2’、3’-ジデオキシヌクレオチド(ddGTP、ddATP、ddTTP、ddCTPなどのddNTP)が含まれる。ジデオキシヌクレオチドは、そうでないときにポリメラーゼが介在するプライマー伸長に関与するdNTPの3’-OHグループを欠いている。したがって、3’位は、天然のヒドロキシル部分の代わりに水素部分を有する。不可逆的な終結ヌクレオチドは、遺伝子型決定用途、またはテンプレート核酸に沿ったプライマー伸長や逐次検出が望ましくない他の用途に特に有用である。
いくつかの実施形態では、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を含み得る。任意に、外因的に標識されたヌクレオチドは、可逆的または不可逆的なターミネーター部分を含み得、外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み不可能であり得、外因的に標識されたヌクレオチドは、ブロッキング部分を欠き得、外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み可能であり得るか、または外因的に標識されたヌクレオチドは、組み込み可能であるものと終結していないものの両方であり得る。外因的に標識されたヌクレオチドは、標識されていないポリメラーゼと安定化三元複合体を形成するために使用される場合に特に有用であり得る。代替的に、ヌクレオチド上の外因性標識は、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)対の一方のパートナーを提供することができ、ポリメラーゼ上の外因性標識は、対の第2のパートナーを提供することができる。このように、FRET検出は、両方のパートナーを含む安定化三元複合体を同定するために使用できる。代替的に、三元複合体の形成に関与するヌクレオチドは、外因性標識を欠き得る(すなわち、ヌクレオチドは「非標識」であり得る)。任意に、非標識ヌクレオチドは、可逆的または不可逆的なターミネーター部分を含み得、非標識ヌクレオチドは、組み込み不可能であり得、非標識ヌクレオチドは、ターミネーター部分を欠き得、非標識ヌクレオチドは、組み込み可能であり得るか、または非標識ヌクレオチドは、組み込み可能であるものと終結していないものの両方であり得る。非標識ヌクレオチドは、安定化三元複合体を検出するためにポリメラーゼ上の標識が使用される場合に有用であり得る。非標識ヌクレオチドはまた、本明細書に記載される方法の伸長ステップにおいて有用であり得る。ヌクレオチドの部分または機能がないことは、そのような機能または部分を持たないヌクレオチドを指すことが理解されるであろう。ヌクレオチドもしくはその類似体について本明細書に記載される、またはそうでなければヌクレオチドもしくはその類似体について当該技術分野で知られている機能または部分のうちの1つ以上は、本明細書に記載される方法または組成物において具体的に省略され得ることも理解されるであろう。
任意に、ヌクレオチド(例えば、天然ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチド類似体)は、安定化三元複合体の形成中に、混合物中に存在する。例えば、少なくとも1、2、3、4種類、またはそれ以上のヌクレオチドタイプが存在し得る。代替的または追加的に、最大で4、3、2、または1種類のヌクレオチドが存在し得る。同様に、存在する1種類以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸の少なくとも1、2、3、または4種類の塩基タイプに相補的であり得る。代替的または追加的に、存在する1種類以上のヌクレオチドタイプは、テンプレート核酸中の最大で4、3、2、または1種類の塩基タイプに相補的であり得る。
三元複合体への関与を防止しない任意のヌクレオチド修飾は、本明細書に開示される方法で使用され得る。ヌクレオチドは、永久的または一時的にポリメラーゼに結合することができる。任意に、ヌクレオチド類似体は、例えば、共有リンカーを介して、ポリメラーゼに融合される。任意に、複数のヌクレオチド類似体は複数のポリメラーゼに融合され、各ヌクレオチド類似体は異なるポリメラーゼに融合される。任意に、安定化三元複合体中に存在するヌクレオチドは、三元複合体が安定化される手段ではない。したがって、ヌクレオチド類似体を利用する反応において、様々な他の三元複合体安定化方法のいずれかを組み合わせることができる。
特定の実施形態では、安定化三元複合体中に存在するプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド分子のプライマー鎖は、本明細書に記載される方法の1つ以上のステップ中に存在するポリメラーゼによって化学的に変化しない。例えば、プライマーは、新しいホスホジエステル結合の形成によって伸長される必要はなく、安定化三元複合体を形成するためのステップ中、または安定化三元複合体を検出するためのステップ中に核酸分解によって短縮される必要もない。安定化三元複合体中に存在するプライマー-テンプレートハイブリッド分子のプライマー鎖は、化学的に修飾される必要はなく、例えば、プライマーは、三元複合体阻害剤部分または他のプライマーキャッピング部分を含むように修飾される必要はない。
本開示に従って作製または使用される三元複合体は、任意に、1つ以上の外因性標識を含み得る。標識は、三元複合体の形成前に、三元複合体の成分に結合(例えば、ポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー、及び/または同族ヌクレオチドに結合)され得る。例示的な結合には、共有結合または非共有結合、例えば、本明細書に記載されているか、本明細書で引用される参照文献に記載されるか、または当該技術分野で知られているものが含まれる。いくつかの実施形態では、標識された成分は、非標識成分に結合している固体支持体に溶液で送達され、それにより、安定化三元複合体を形成することにより、標識は固体支持体に動員される。そのため、支持体に結合した成分は、動員された標識の観察に基づいて検出または同定できる。外因性標識は、溶液相で使用する場合でも、固体支持体で使用する場合でも、検査ステップ中に、安定化三元複合体またはその個々の成分を検出するのに有用である。外因性標識は、安定化三元複合体を形成していた他の成分から成分が分離した後、成分に結合されたままとなり得る。例示的な標識、標識を結合するための方法、及び標識された成分を使用するための方法は、共同所有の米国特許出願公開第2017/0022553 A1号もしくは米国特許出願第15/677,870号(米国特許出願公開第2018/0044727 A1号として公開)、同第15/851,383号(米国特許出願公開第2018/0187245 A1号として公開)、同第15/873,343号(米国特許出願公開第2018/0208983 A1号として公開)、同第62/450,397号、または同第62/506,759号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
有用な外因性標識の例には、放射性標識部分、発光団部分、フルオロフォア部分、量子ドット部分、発色団部分、酵素部分、電磁スピン標識部分、ナノ粒子光散乱部分、及び当該技術分野で知られている他の様々なシグナル生成部分のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。適切な酵素部分には、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれる。例示的なフルオロフォア部分には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、緑色蛍光タンパク質、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、lucifer yellow(商標)、Cascade Blue(商標)、Texas Red(商標)、塩化ダンシル、フィコエリトリン、フィコシアニン、ユーロピウム及びテルビウムを含むものなどの蛍光性ランタニド錯体、Cy3、Cy5、Cy7、Alexa染料、ならびにPrinciples of Fluorescence Spectroscopy,Joseph R.Lakowicz(Editor),Plenum Pub Corp,2nd edition(July 1999)及び6th Edition of Molecular Probes Handbook by Richard P.Hoaglandに記載されるものなどの当該技術分野で既知の他のものが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の方法では二次標識を使用することができる。二次標識は、パートナー部分に特異的に結合できる結合部分である。例えば、リガンド部分をポリメラーゼ、核酸、またはヌクレオチドに結合させて、標識された受容体に対する特異的親和性を介した検出を可能にすることができる。二次標識は、本明細書に記載される方法で検出される必要はない。例えば、二次標識は、結合した分子が標識プライマーの3’末端の三元複合体形成を阻害するように、プライマーの3’末端にあり、かつ分子(例えば、受容体)に結合する、部分(例えば、リガンド)であり得る。使用することができる例示的な結合部分の対には、限定されないが、抗原と免疫グロブリンまたはそれらの活性フラグメント、例えばFAb、免疫グロブリンと免疫グロブリン(またはそれぞれ活性フラグメント)、アビジンとビオチン、またはアビジンに特異性を有するその類似体、ストレプトアビジンとビオチン、またはストレプトアビジンに特異性を有するそれらの類似体、または炭水化物とレクチンが含まれる。ヌクレオチドまたはプライマーに結合され得る特に有用なクラスのエピトープは、抗体(またはその機能的フラグメント)がもたらされて三元複合体阻害剤を作り出すことができるペプチドである。
いくつかの実施形態では、二次標識は、化学的に修飾可能な部分であり得る。この実施形態では、反応性官能基を有する標識を、安定化三元複合体に組み込むことができる。続いて、官能基を一次標識部分と共有結合的に反応させることができる。好適な官能基には、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、オキソ基、及びチオール基が含まれるが、これらに限定されない。クリック化学に使用される官能基、ならびにそれらの合成及び使用のための関連方法もまた有用であり得る。有用なクリック化学試薬及び方法は、米国特許第6,737,236号、同第7,375,234号、同第7,427,678号、及び同第7,763,736に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、三元複合体は外因性標識を欠く可能性がある。例えば、三元複合体及び三元複合体に関与する全ての成分(例えば、ポリメラーゼ、テンプレート核酸、プライマー及び/または同族ヌクレオチド)は、本明細書、または上記で組み込まれる参考文献に記載される外因性標識の1つ、いくつかまたは全てを欠き得る。そのような実施形態では、三元複合体は、質量、電荷、固有の光学特性などのような、安定化三元複合体の固有の特性に基づいて検出することができる。非標識三元複合体を検出するための例示的な方法は、共同所有の米国特許出願公開第2017/0022553 A1号、PCT出願第PCT/US 16/68916号(WO 2017/117243として公開)、または米国特許出願第62/375,379号もしくは同第15/677,870号(米国特許出願公開第2018/0044727 A1号として公開)に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
一般に、検出は、検査ステップにおいて、三元複合体またはそれに結合した標識部分に固有の特性を感知する方法によって達成することができる。検出の基礎となることができる例示的な特性には、質量、導電率、エネルギー吸収、ルミネセンスなどが含まれるが、これらに限定されない。発光の検出は、核酸アレイに関する当該技術分野で既知の方法を使用して実施することができる。発光団は、例えば、発光波長、励起波長、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)強度、消光、異方性、または寿命を含む、様々な発光特性のいずれかに基づいて検出することができる。本明細書に記載される方法で使用することができる他の検出技術には、例えば、質量を感知するために使用することができる質量分析、表面での結合を感知するために使用できる表面プラズモン共鳴、標識が吸収するエネルギーの波長を感知するために使用できる吸光度、標識の存在による温度の変化を感知するために使用できる熱量測定、標識の電気特性を感知するために使用できる電気コンダクタンスまたはインピーダンス、または他の既知の分析技術が含まれる。安定化三元複合体を作成、操作及び検出するために使用され得る試薬及び条件の例には、例えば、共同所有の米国特許出願公開第2017/0022553 A1号、PCT出願第PCT/US 16/68916号(WO 2017/117243として公開)、または米国特許出願第15/677,870号(米国特許出願公開第2018/0044727 A1号として公開)、米国特許出願第15/581,383号(米国特許出願公開第2018/0187245 A1号として公開)、米国特許出願第15/873,343号(米国特許出願公開第2018/0208983 A1号として公開)、米国特許出願第第62/450,397号、または米国特許出願第62/506,759号に記載されるものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態は、安定化三元複合体を互いに区別するため、及び/またはテンプレート核酸中の1種類の塩基タイプを別の塩基タイプから区別するために2つ以上の区別可能なシグナルを利用する。例えば、2つ以上の発光団は、励起のための固有の波長または発光の固有の波長などの固有の光学特性に基づいて互いに区別することができる。特定の実施形態では、方法は、発光強度の差に基づいて、異なる安定化三元複合体を区別することができる。例えば、第1の三元複合体は、第2の三元複合体よりも低い強度で発光する状態で検出することができる。このような強度スケーリング(しばしば「グレースケーリング」と呼ばれる)は、任意の識別可能な強度の差を利用できる。例示的な差には、検出される別の安定化三元複合体の強度と比較して、最大で10%、25%、33%、50%、66%または75%である強度を有する特定の安定化三元複合体が含まれる。
強度の差は、例えば、各々が異なる消衰係数(すなわち、異なる励起特性をもたらす)及び/または異なる発光量子収率(すなわち、異なる発光特性をもたらす)を有する、異なる発光団の使用に起因し得る。代替的に、同じ発光団タイプを使用することができるが、異なる量で存在することができる。例えば、三元複合体の第1の集団の全てのメンバーは、特定の発光団で標識することができるが、第2の集団は、発光団で標識されたそのメンバーの半分だけを有する。この例では、第2の集団は第1の集団のシグナルの半分を生成すると予想される。第2の集団は、例えば、標識されたヌクレオチドと非標識ヌクレオチド(主に標識されたヌクレオチドを含む第1の集団とは対照的)の混合物を使用することにより生成され得る。同様に、第2の集団は、例えば、標識されたポリメラーゼと非標識ポリメラーゼ(主に標識されたポリメラーゼを含む第1の集団とは対照的)の混合物を使用することにより生成され得る。代替的な標識スキームでは、三元複合体の第1の集団は、特定の発光シグナルを生成する複数の標識を有するポリメラーゼ分子を含むことができ、三元複合体の第2の集団は、発光シグナルを生成する標識のうちの1つのみをそれぞれ有するポリメラーゼ分子を含むことができる。
いくつかの実施形態では、検査ステップは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第9,951,385号または米国特許出願第15/922,787号(米国特許第10,161,003号として認められた)に記載されるように、少なくとも1種類のヌクレオチドタイプの同一性が帰属される方法で行われる。帰属を使用することの代わりに、またはそれに加えて、検査ステップは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、共同所有の米国特許第9,951,385号または米国特許出願第15/922,787号(米国特許第10,161,003号として認められた)に記載されるように、1種類以上のヌクレオチドタイプを同定するために曖昧性除去を使用することができる。
様々なポリメラーゼのいずれかが、例えば、安定化三元複合体を形成するために、またはプライマー修飾を行うために、本明細書に記載される方法または装置で使用され得る。使用され得るポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼ及びそれらの改変されたバリエーションを含み、変異体、組換え体、融合体、遺伝子改変体、化学的改変体、合成物、及び類似体を含むがこれらに限定されない。天然に存在するポリメラーゼ及びその改変されたバリエーションは、重合反応を触媒する能力を有するポリメラーゼに限定されない。任意に、天然に存在するポリメラーゼ及び/またはその改変されたバリエーションは、安定化三元複合体の形成または検査中に使用されない少なくとも1つの条件で重合反応を触媒する能力を有する。任意に、安定化三元複合体に関与する天然に存在するポリメラーゼ及び/または改変されたバリエーションは、改変された特性、例えば、核酸への強化された結合親和性、核酸への低減された結合親和性、ヌクレオチドへの強化された結合親和性、ヌクレオチドへの低減された結合親和性、次の正しいヌクレオチドへの強化された特異性、次の正しいヌクレオチドへの低減された特異性、低減された触媒速度、触媒不活性などを有する。変異型ポリメラーゼとしては、例えば、1つ以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えられたポリメラーゼ、または1つ以上のアミノ酸の挿入もしくは欠失が挙げられる。安定化三元複合体を形成するために使用され得る例示的なポリメラーゼ変異体としては、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第15/866,353号(米国特許出願公開第2018/0155698 A1号として公開)、または米国特許出願公開第2017/0314072号に記載されるものが挙げられる。
改変されたポリメラーゼは、ポリメラーゼを検出するために使用され得る、外因性標識部分(例えば、外因性フルオロフォア)を含有するポリメラーゼを含む。任意に、タンパク質単離技法を使用して、ポリメラーゼが少なくとも部分的に精製された後に、標識部分が結合され得る。例えば、外因性標識部分は、ポリメラーゼの遊離スルフヒドリルまたは遊離アミン部分を使用して、ポリメラーゼに共有結合され得る。これには、システイン残基の側鎖を介した、またはN末端の遊離アミノ基を介した、ポリメラーゼへの共有結合が含まれる。外因性標識部分はまた、タンパク質融合を介してポリメラーゼに結合され得る。タンパク質融合を介して結合できる例示的な標識部分には、例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、フィコビリタンパク質(例えば、フィコシアニン及びフィコエリトリン)、またはGFPまたはフィコビリタンパク質の波長シフトバリアントが含まれる。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼ上の外因性標識は、FRETペアのメンバーとして機能することができる。FRETペアの他のメンバーは、安定化三元複合体のポリメラーゼに結合するヌクレオチドに結合している外因性標識であり得る。したがって、安定化三元複合体は、FRETを介して検出または同定できる。
代替的に、安定化三元複合体に関与するか、またはプライマーを修飾するために使用されるポリメラーゼは、外因性標識に結合される必要はない。例えば、ポリメラーゼは外因性標識に共有結合する必要はない。その代わり、ポリメラーゼは、それが標識ヌクレオチド及び/または標識核酸(例えば、標識プライマー及び/または標識テンプレート)と会合するまで、標識を欠いていてもよい。
ポリメラーゼの異なる活性は、本明細書に示される方法において利用され得る。ポリメラーゼは、例えば、プライマー伸長ステップもしくはプライマーキャッピングステップなどのプライマー修飾プロセス、検査ステップ、またはそれらの組み合わせにおいて有用であり得る。様々な活性が、構造の差から得られ得る(例えば、天然の活性、変異、または化学修飾を介して)。それにもかかわらず、ポリメラーゼは、様々な既知の供給源から得ることができ、本明細書に記載されている教示及び認められているポリメラーゼの活性に従って適用することができる。有用なDNAポリメラーゼには、細菌DNAポリメラーゼ、真核生物DNAポリメラーゼ、古細菌DNAポリメラーゼ、ウイルスDNAポリメラーゼ、及びファージDNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。細菌DNAポリメラーゼには、E.coli DNAポリメラーゼI、II、III、IV、V、E.coli DNAポリメラーゼのクレノウフラグメント、Clostridium stercorarium(Cst)DNAポリメラーゼ、Clostridium thermocellum(Cth)DNAポリメラーゼ、及びSulfolobus solfataricus(Sso)DNAポリメラーゼが含まれる。真核生物DNAポリメラーゼには、DNAポリメラーゼα、β、γ、δ、ε、η、ζ、λ、σ、μ、及びk、ならびにRev1ポリメラーゼ(ターミナルデオキシシチジルトランスフェラーゼ)及びターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)が含まれる。ウイルスDNAポリメラーゼには、T4 DNAポリメラーゼ、phi-29 DNAポリメラーゼ、GA-l、phi-29様DNAポリメラーゼ、PZA DNAポリメラーゼ、phi-15 DNAポリメラーゼ、Cpl DNAポリメラーゼ、Cp7 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、及びT4ポリメラーゼが含まれる。その他の有用なDNAポリメラーゼには、Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ、Thermus filiformis(Tfi)DNAポリメラーゼ、Thermococcus zilligi(Tzi)DNAポリメラーゼ、Thermus thermophilus(Tth)DNAポリメラーゼ、Thermus flavusu(Tfl )DNAポリメラーゼ、Pyrococcus woesei(Pwo)DNAポリメラーゼ、Pyrococcus furiosus(Pfu)DNAポリメラーゼ及びTurbo Pfu DNAポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(Tli)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属GB-Dポリメラーゼ、Thermotoga maritima(Tma)DNAポリメラーゼ、Bacillus stearothermophilus(Bst)DNAポリメラーゼ、Pyrococcus Kodakaraensis(KOD)DNAポリメラーゼ、Pfx DNAポリメラーゼ、サーモコッカス属JDF-3(JDF-3)DNAポリメラーゼ、Thermococcus gorgonarius(Tgo)DNAポリメラーゼ、Thermococcus acidophilium DNAポリメラーゼ; Sulfolobus acidocaldarius DNAポリメラーゼ、サーモコッカス属N-7 DNAポリメラーゼ、Pyrodictium occultum DNAポリメラーゼ、Methanococcus voltae DNAポリメラーゼ、Methanococcus thermoautotrophicum DNAポリメラーゼ、Methanococcus jannaschii DNAポリメラーゼ、Desulfurococcus株TOK DNAポリメラーゼ(D.Tok Pol)、Pyrococcus abyssi DNAポリメラーゼ、Pyrococcus horikoshii DNAポリメラーゼ、Pyrococcus islandicum DNAポリメラーゼ、Thermococcus fumicolans DNAポリメラーゼ、Aeropyrum pernix DNAポリメラーゼ、及びヘテロダイマーDNAポリメラーゼDP1/DP2などの熱安定性及び/または好熱性DNAポリメラーゼが含まれる。操作及び改変されたポリメラーゼもまた、開示された技法に関連して有用である。例えば、高度に好熱性の海洋古細菌Thermococcus種9°Nの改変バージョン(例えば、New England BioLabs Inc.,Ipswich,MAからのTherminator(商標)DNAポリメラーゼ)を使用することができる。3PDXポリメラーゼを含むさらに他の有用なDNAポリメラーゼは、U.S.8,703,461に開示されており、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
有用なRNAポリメラーゼには、T7 RNAポリメラーゼ、T3ポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、及びKllポリメラーゼなどのウイルスRNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリメラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、及びRNAポリメラーゼVなどの真核生物のRNAポリメラーゼ、ならびに古細菌RNAポリメラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
別の有用なタイプのポリメラーゼは、逆転写酵素である。例示的な逆転写酵素には、ヒト免疫不全ウイルス1型(PDB 1HMV)由来のHIV-1逆転写酵素、ヒト免疫不全ウイルス2型由来のHIV-2逆転写酵素、モロニーマウス白血病ウイルス由来のM-MLV逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルスのAMV逆転写酵素、及び真核生物の染色体のテロメアを維持するテロメラーゼ逆転写酵素が含まれるが、これらに限定されない。
固有の3’-5’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼは、いくつかの実施形態に有用であり得る。3’-5’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているポリメラーゼはまた、いくつかの実施形態、例えば、ほとんどの遺伝子型決定及びシーケンシングの実施形態において有用である。エキソヌクレアーゼ活性の欠如は、野生型の特徴、またはバリアントもしくは操作されたポリメラーゼ構造によって付与される特徴であり得る。例えば、エキソマイナスクレノウフラグメントは、クレノウフラグメントの変異バージョンであり、3’-5’プルーフリーディングエキソヌクレアーゼ活性を欠く。クレノウフラグメント及びそのエキソマイナスバリアントは、本明細書に記載される方法または組成物において有用であり得る。
本明細書の方法または組成物で使用される核酸は、ゲノムDNA、合成DNA、増幅DNA、相補的DNA(cDNA)などのDNAであり得る。mRNA、リボソームRNA、tRNAなどのRNAも使用できる。本明細書では、核酸類似体もテンプレートとして使用できる。したがって、本明細書で使用されるテンプレート核酸は、生物学的供給源、合成供給源、または増幅産物に由来し得る。本明細書で使用されるプライマーは、DNA、RNA、またはそれらの類似体であり得る。
特に有用な核酸テンプレートは、各々がゲノムの一部分と同一の配列を含む、ゲノムフラグメントである。ゲノムフラグメントの集団は、特定のゲノムの配列の全部または一部をカバーすることができる。例えば、ゲノムフラグメントの集団は、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%のゲノムの配列を含むことができる。ゲノムフラグメントは、例えば、ゲノムの少なくとも約25、50、70、100、200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000、またはそれ以上の隣接するヌクレオチドと実質的に同一である配列を有することができる。代替的または追加的に、ゲノムフラグメントは、ゲノムの1×105、1×104、1×103、800、600、400、200、100、75、50、または25以上の隣接するヌクレオチドと実質的に同一である配列を有することができる。ゲノムフラグメントは、DNA、RNA、またはそれらの類似体であり得る。
核酸が由来し得る例示的な生物には、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトもしくは非ヒト霊長類などの哺乳動物;Arabidopsis thaliana、トウモロコシ、ソルガム、オート麦、小麦、米、キャノーラ、もしくは大豆などの植物;Chlamydomonas reinhardtiiなどの藻類;Caenorhabditis elegansなどの線虫;Drosophila melanogaster、蚊、ミバエ、ミツバチ、もしくはクモなどの昆虫;ゼブラフィッシュなどの魚;爬虫類;カエルもしくはXenopus laevisなどの両生類;dictyostelium discoideum;pneumocystis carinii、Takifugu rubripes、酵母、Saccharamoyces cerevisiaeもしくはSchizosaccharomyces pombeの真菌;またはplasmodium falciparumが含まれる。核酸は、細菌、大腸菌、ブドウ球菌、肺炎マイコプラズマなどの原核生物、古細菌、C型肝炎ウイルスもしくはヒト免疫不全ウイルスなどのウイルス、またはウイロイドからも誘導できる。核酸は、上記の生物の均質な培養物または集団から、または代替的に、例えば、コミュニティまたは生態系内のいくつかの異なる生物のコレクションから得ることができる。核酸は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)、またはAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)に記載される方法を含む、当該技術分野において既知の方法を使用して単離され得る。
テンプレート核酸は、ゲノム単離、ゲノム断片化、遺伝子クローニング及び/または増幅などの調製方法から取得することができる。テンプレートは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、多置換増幅(MDA)などの増幅技術から取得することができる。核酸を単離、増幅、及び断片化して、アレイ上で分析するためのテンプレートを生成する例示的な方法は、米国特許第6,355,431号または第9,045,796号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。増幅は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)、またはAusubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)に記載される方法を使用して行われ得る。
ポリメラーゼベースのプライマー伸長ステップに使用され得る試薬及び条件の例には、例えば、共同所有の米国特許出願公開第2017/0022553 A1号もしくは米国特許出願第15/677,870号(米国特許出願公開第2018/0044727 A1号として公開)、米国特許出願第15/851,383号(米国特許出願公開第2018/0187245 A1号として公開)、または米国特許出願公開第2018/0208983 A1号(米国特許出願第62/450,397号及び同第62/506,759号の優先権を主張)に記載されているものが含まれる。ポリメラーゼベースのプライマー伸長のための他の有用な試薬及び条件は、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、WO 91/06678、WO 07/123744、米国特許第7,057,026号、同第7,329,492号、同第7,211,414号、同第7,315,019号または同第7,405,281号、及び米国特許出願公開第2008/0108082 A1号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、プライマー修飾ステップ(例えば、ヌクレオチドの付加を介したプライマーの伸長、または三元複合体阻害剤部分の付加を介したプライマーのキャッピング)中に使用される試薬は、プライマー-テンプレートハイブリッドとの安定化三元複合体を形成するステップの前に、プライマー-テンプレートハイブリッドとの接触から除去される。例えば、混合物中の1種類以上のヌクレオチドのタイプがその後の検査ステップでの三元複合体の形成または検出を妨害する場合、伸長ステップに使用されたヌクレオチド混合物の除去が望ましい場合がある。同様に、プライマー修飾ステップで使用されたポリメラーゼまたは補因子を除去して、後続の検査ステップ中の望ましくない触媒活性を防止することが望ましい場合がある。除去に続いて洗浄ステップを行うことができ、不活性流体を使用して、プライマー修飾に使用された試薬混合物の残留成分のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドをパージする。
試薬除去または洗浄手順は、本明細書に記載される様々なステップのいずれかの間で実施され得る。そのような手順を使用して、反応容器内または固体支持体上に存在する試薬のうちの1つ以上を除去することができる。例えば、試薬除去または洗浄ステップは、三元複合体安定化条件下でプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドと接触した他の試薬から、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを分離するために有用であり得る。特定の実施形態では、試薬の分離は、プライマー-テンプレートハイブリッドなどの目的の試薬の固体支持体への結合、及び固体支持体との接触からの流体の除去によって促進される。本明細書に記載される試薬のうちの1つ以上は、本明細書に記載される方法または装置の特定の使用に適合するように、必要に応じて、固体支持体に結合され得るか、または溶液中で提供され得る。
試薬除去または洗浄手順は、混合物の検査を妨害することから、または以前に第1の混合物と接触していた基材上(または容器内)で形成される第2の混合物を汚染することから、1つ以上の試薬を取り除くことができる。例えば、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを、三元複合体安定化条件下でポリメラーゼ及び少なくとも1種類のヌクレオチドタイプと接触させて、第1の混合物を形成することができ、第1の混合物を検査することができる。任意に、検出の前に洗浄を行って、安定化三元複合体の形成に関与していない試薬を除去することができる。代替的または追加的に、検出ステップの後に洗浄を行って、プライマー-テンプレートハイブリッドから第1の混合物の1つ以上の成分を除去することができる。次いで、プライマー-テンプレートハイブリッドを、三元複合体安定化条件下でポリメラーゼ及び少なくとも1種類の他のヌクレオチドと接触させて、第2の混合物を形成することができ、第2の混合物を三元複合体形成について検査することができる。前と同様に、2回目の検査の前に任意の洗浄を行って、安定化三元複合体の形成に関与していない試薬を除去することができる。
特定の実施形態では、プライマーキャッピングステップは、プライマー伸長の後に行われる。プライマー伸長ステップに存在した試薬のうちの1つ以上は、プライマーキャッピングステップのための試薬を導入する前に除去され得る。例えば、固体支持体に結合されたプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを、ポリメラーゼ(複数可)とヌクレオチド(複数可)とを含む伸長混合物と接触させることができ、次いで、伸長混合物を固体支持体から除去することができ、次いで、プライマーをキャップするための試薬を固体支持体に送達することができる。洗浄液は、伸長プロセスとキャッピングプロセスとの間で固体支持体に送達され得る。これは、キャッピング試薬を送達する前に、伸長混合物の残留成分を除去するのを助けることができる。
代替の実施形態では、プライマー伸長及びプライマーキャッピングのための試薬は、互いと同時に接触していてもよい。例えば、固体支持体に結合されたプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを、ポリメラーゼ(複数可)、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド(複数可)(すなわち、プライマーを伸長するための)、及び三元複合体阻害剤部分(すなわち、伸長されていないプライマーをキャップするための)を含む、プライマー修飾混合物と接触させることができる。伸長及びキャッピング試薬は、固体支持体に同時に送達される必要はない。むしろ、試薬は、累積的な送達が行われた後にそれらが同時に存在するように、連続的な形式で送達され得る。伸長及びキャッピング試薬は、検査または脱ブロッキングステップなどの後続のステップの前に除去され得る。洗浄を任意に用いて、後続のステップの前に残留伸長及びキャッピング試薬を除去することができる。
検査ステップに存在するヌクレオチドは、プライマー伸長プロセスまたはプライマーキャッピングプロセスなどのプライマー修飾プロセスに持ち込まれた場合、ヌクレオチド組み込み反応などの不要な副反応を引き起こす可能性がある。したがって、試薬除去または洗浄ステップがプライマー修飾ステップの前に用いられ得る。任意に、遊離ヌクレオチドまたは他の検査試薬は、例えば、ホスファターゼなどの酵素によって、化学修飾によって、または物理的技術によって修飾または無効にされてもよい。
本明細書に記載される方法の特定の実施形態は、いくつかの成分を含む混合物を形成するステップを含む。例えば、混合物は、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、ポリメラーゼ、及び1種類以上のヌクレオチドタイプの間で形成され得る。混合物の成分は、任意の所望の順序で容器に送達され得るか、またはそれらは同時に送達され得る。さらに、いくつかの成分を互いに混合して、第1の混合物を形成し、その後、他の成分と接触させて、より複雑な混合物を形成することができる。プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、ポリメラーゼ及び複数の異なるヌクレオチドタイプを含む混合物を形成するステップを例にあげると、複数の異なるヌクレオチドタイプを、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドとの接触の前に互いと接触させることができることが理解されるであろう。代替的に、2種類以上のヌクレオチドタイプが、プライマー-テンプレートハイブリッド及び/またはポリメラーゼに別々に送達され得る。したがって、第1のヌクレオチドタイプを、第2のヌクレオチドタイプと接触させる前にプライマー-テンプレートハイブリッドと接触させることができる。代替的または追加的に、第1のヌクレオチドタイプは、第2のヌクレオチドタイプと接触させる前に、ポリメラーゼと接触させることができる。
安定化三元複合体、または三元複合体を形成する(すなわち、その形成に関与する)ことができる成分は、固体支持体に結合され得る。固体支持体は、生化学分析に使用される様々な材料のいずれかから作成できる。適切な材料には、ガラス、ポリマー材料、シリコン、石英(溶融シリカ)、ホウフロートガラス、シリカ、シリカベースの材料、炭素、金属、光ファイバーまたは光ファイバーの束、サファイア、またはプラスチック材料が含まれ得る。材料は、特定の用途に望まれる特性に基づいて選択され得る。例えば、所望の波長の放射線を透過する材料は、その波長の放射線を利用する分析技法に有用である。逆に、ある特定の波長の放射線を通過させない材料(例えば、不透明、吸収性、または反射性)を選択することが望ましい場合がある。利用できる材料の他の特性は、本明細書に記載されているものなどの下流プロセスで使用される特定の試薬に対する不活性または反応性、または操作の容易さ、または製造コストの低さである。
特に有用な固体支持体は、ビーズまたはミクロスフェアなどの粒子である。ビーズの集団は、安定化三元複合体の集団または複合体を形成することができる成分(例えば、ポリメラーゼ、テンプレート、プライマーもしくはヌクレオチド)の結合に使用され得る。いくつかの実施形態では、各ビーズが単一のタイプの安定化三元複合体または複合体を形成することができる単一のタイプの成分を有する構成を使用することが有用であり得る。例えば、個々のビーズは、単一タイプの三元複合体、単一タイプのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、単一タイプのプライマー、単一タイプのテンプレート、単一タイプのポリメラーゼ、または単一タイプのヌクレオチドに結合され得る。代替的に、異なるタイプの成分をビーズごとに分離する必要はない。したがって、単一のビーズは、複数の異なるタイプの三元複合体、テンプレート核酸、プライマー、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び/またはヌクレオチドを担持することができる。ビーズの組成は、例えば、使用される結合の形式、化学物質、及び/または方法に応じて異なり得る。例示的なビーズ組成物は、タンパク質及び核酸捕捉法で使用される、固体支持体、及びそれに付与された化学的機能性を含む。そのような組成物には、例えば、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メラミン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、またはSepharose(商標)、セルロース、ナイロン、クロスなどの架橋デキストラン、架橋されたミセル及びTeflon(登録商標)、ならびに参照により本明細書に組み込まれる、”Microsphere Detection Guide”from Bangs Laboratories,Fishers Ind.に記載されている他の材料が含まれる。
ビーズまたはミクロスフェアなどの粒子の形状も、多種多様な異なる形態及び形状に対応することができる。例えば、粒子は、対称的な形状(例えば、球形もしくは円筒形)、または不規則な形状(例えば、制御された細孔ガラス)であり得る。加えて、粒子は多孔性であり得、したがって、三元複合体またはその成分の捕捉に利用可能な表面積を増加させる。本明細書で使用されるビーズの例示的なサイズは、ナノメートルからミリメートル、または約10nm~1mmの範囲であり得る。
特定の実施形態では、ビーズは、配列され得るか、さもなければ空間的に区別され得る。使用され得る例示的なビーズベースのアレイには、Illumina,Inc.(San Diego,CA)から入手可能なBeadChip(商標)アレイ、あるいは米国特許第6,266,459号、同第6,355,431号、同第6,770,441号、同第6,859,570号、もしくは同第7,622,294号、またはPCT公開第WO 00/63437号(それぞれ参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるものなどのアレイが含まれるが、これらに限定されない。ビーズは、固相支持体上のウェルなどの別々の場所に配置することができ、それによって各場所は単一のビーズを収容する。代替的に、ビーズが存在する別個の場所は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第2004/0263923 A1号、同第2004/0233485 A1号、同第2004/0132205 A1号、または同第2004/0125424 A1号に記載されるような複数のビーズを各々含むことができる。
上述のビーズアレイの実施形態から認識されるように、本開示の方法は、本明細書に記載される方法で複数の異なるタイプの核酸が並行して検出される多重フォーマットで実行することができる。本明細書に記載される方法の1つ以上ステップを使用して異なるタイプの核酸を連続的に処理することも可能であるが、並行処理は、コストの節約、時間の節約、及び条件の均一性を提供できる。本開示の装置または方法は、少なくとも2、10、100、1×103、1×104、1×105、1×106、1×109、またはそれ以上の異なる核酸を含むことができる。代替的または追加的に、本開示の装置または方法は、最大で1×109、1×106、1×105、1×104、1×103、100、10、2またはそれ以下の異なる核酸を含むことができる。したがって、装置または方法において有用であるものとして本明細書に記載される様々な試薬または生成物(例えば、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドまたは安定化三元複合体)は、これらの範囲内の異なるタイプまたは種を有するように多重化され得る。アレイに存在する異なる核酸は、アレイの異なるフィーチャーに位置することができる。したがって、フィーチャーから取得されるシグナルは、フィーチャーに存在する特定の核酸配列を示す。
使用可能な市販のアレイのさらなる例には、例えば、Affymetrix GeneChip(商標)アレイが含まれる。いくつかの実施形態によれば、スポットアレイ基質も使用することができる。例示的なスポットアレイは、Amersham Biosciencesから入手可能なCodeLink(商標)アレイである。有用な別のアレイは、Agilent Technologiesから入手可能なSurePrint(商標)テクノロジーなどのインクジェット印刷方法を使用して製造されたものである。
他の有用なアレイには、核酸配列決定の用途で使用されるものが含まれる。例えば、ゲノムフラグメントのアンプリコン(しばしばクラスターと呼ばれる)を結合するために使用されるアレイは、特に有用であり得る。本明細書で使用され得る核酸配列決定アレイの例には、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)、PCT公開第WO 91/06678号、同第WO 04/018497号、または同第WO 07/123744号、米国特許第7,057,026号、同第7,211,414号、同第7,315,019号、同第7,329,492号もしくは同第7,405,281号、または米国特許出願公開第2008/0108082号に記載されるものが含まれる。
核酸は、単一分子レベルまたはアンサンブルレベルでの検出を提供する方法で支持体に結合させることができる。例えば、支持体上の1つの核酸分子上に形成される個々の安定化三元複合体が、支持体上の核酸分子上に形成される全ての隣接する三元複合体と区別できるように、複数の異なる核酸を固体支持体に結合させることができる。このように、1つ以上の異なるテンプレートは、各単一分子テンプレートが物理的に分離され、単一分子が固体支持体上の他の全ての分子から弁別されるように検出される形式で、固体支持体に結合させることができる。
代替的に、本開示の方法は、1つ以上の核酸アンサンブルについて行われ得、アンサンブルは、共通のテンプレート配列を有する核酸の集団である。アンサンブルは、例えば、共通のテンプレート配列を有する少なくとも2、10、50、100、500、1000またはそれ以上の核酸を含むことができる。代替的または追加的に、アンサンブルは、共通のテンプレート配列を有する最大で1000、500、100、50、10、または2個の核酸を含むことができる。アレイのフィーチャーに存在するアンサンブルは、フィーチャーの核酸の実質的に全てが共通のテンプレート配列を有するようにクローン性であり得る。しかしながら、フィーチャーは、核酸のクローン性集団を含有する必要はない。むしろ、フィーチャーは、核酸の混合集団を含むことができ、特定のテンプレート配列は、核酸の大部分に存在する。例えば、特定のフィーチャーにある核酸の集団は、特定のテンプレート配列を有する少なくとも51%、60%、75%、90%、95%、もしくは99%またはそれ以上の種を含むことができる。核酸の非クローン性集団を有するフィーチャーは、集団がアンサンブルとして検出されることを可能にする条件下で検出され得、それによって、フィーチャーから取得される合計シグナルは、非クローン性集団によって発生するシグナルの平均を表す。汚染核酸が目的のフィーチャーにおいて少数として存在する限り、平均シグナルは、フィーチャーにおけるテンプレート核酸の大部分を特徴付ける手段を提供することができる。
クラスター法を使用して、1つ以上のアンサンブルを固体支持体に結合させることができる。このように、アレイは複数のアンサンブルを有することができ、アンサンブルのそれぞれはそのフォーマットにあるクラスターまたはアレイフィーチャーと呼ばれる。クラスターは、ブリッジ増幅またはエマルジョンPCRなどの当該技術分野で公知の方法を使用して形成することができる。有用な架橋増幅方法は、例えば、米国特許第5,641,658号もしくは同第7,115,400号、または米国特許公開第2002/0055100 A1号、同第2004/0002090 A1号、同第2004/0096853 A1号、同第2007/0128624 A1号、もしく同第2008/0009420 A1号に記載されている。エマルジョンPCR方法には、例えば、Dressman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO 05/010145、または米国特許公開第2005/0130173 A1号もしくは同第2005/0064460 A1号に記載される方法が含まれ、これらはそれぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。表面上の核酸を増幅するための別の有用な方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998)、またはUS 2007/0099208 A1に記載されるようなローリングサークル増幅(RCA)である。
特定の実施形態では、安定化三元複合体、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドまたはヌクレオチドは、フローセル表面またはフローセル内の固体支持体に結合される。フローセルは、支持体に結合した三元複合体に接触する流体チャンバーに溶液を出し入れすることにより、便利な流体操作を可能にする。フローセルはまた、流体で操作される成分の検出を提供する。例えば、検出器は、安定化三元複合体の形成により固体支持体に動員される標識からのシグナルなどの固体支持体からのシグナルを検出するように配置することができる。使用され得る例示的なフローセルは、例えば、米国特許出願公開第2010/0111768 A1号、WO 05/065814、または米国特許出願公開第2012/0270305 A1号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、テンプレート核酸を配列決定するための方法を提供する。方法は、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供するステップであって、プライマーが伸長可能な3’末端を有する、ステップと、(b)その複数を、(i)3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するための可逆的な終結ヌクレオチド、及び(ii)三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させるステップと、(c)各々がポリメラーゼ、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成するステップと、(d)三元複合体を検出し、それによってテンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するステップと、(e)第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの3’末端において可逆的な終結ヌクレオチドを脱ブロックするステップと、(f)ステップ(b)~(e)を繰り返して、第1のサブセットのテンプレート核酸を配列決定するステップと、を含むことができる。
脱ブロッキングプロセスは、本明細書に記載される方法に含まれる場合、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの配列決定を容易にすることができる。脱ブロッキングプロセスを使用して、可逆的な終結プライマーを伸長可能プライマーに変換することができる。次いで、プライマー伸長を使用して、三元複合体形成の部位をテンプレート核酸に沿った異なる位置に移動させることができる。伸長、検査及び脱ブロッキングの反復サイクルを使用して、テンプレート核酸の配列を明らかにすることができる。各サイクルは、テンプレート核酸中の後続の塩基を明らかにする。例示的な可逆的ターミネーター部分、それらをプライマーに組み込む方法、及びさらなる伸長のためにプライマーを修飾する方法(しばしば「脱ブロッキング」と呼ばれる)は、米国特許第7,427,673号、同第7,414,116号、同第7,544,794号、同第7,956,171号、同第8,034,923号、同第8,071,755号、同第8,808,989号、または同第9,399,798号に記載されている。さらなる例は、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)、WO 04/018497、米国特許第7,057,026号、WO 91/06678、WO 07/123744、米国特許第7,329,492号、米国特許第7,211,414号、米国特許第7,315,019号、米国特許第7,405,281号、及びUS 2008/0108082に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
三元複合体の後続の形成を妨害するか、または妨げるように修飾されたプライマーは、修飾を逆にするように処理される必要はない。したがって、キャップされたプライマーは、配列決定方法などの循環的方法のいくつかのサイクル(場合によっては全てのサイクル)全体にわたってキャップされたままであり得る。例えば、循環的プロセスは、可逆的な終結プライマーを脱ブロックするプロセスを含むことができ、キャップされたプライマーは、脱ブロッキングプロセスに対して不活性であり得る。
配列決定方法は、本明細書に記載されるサイクルまたはサイクル内のステップの複数の繰り返しを含むことができる。例えば、検査及びプライマー修飾ステップは、様々なステップの間にプライマーを脱ブロックするか、または不要な反応物もしくは生成物を洗浄する任意のステップと同様に、複数回繰り返すことができる。したがって、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドは、本明細書に記載の方法の少なくとも2、5、10、25、50、100、150、200またはそれ以上の反復サイクルに供され得る。より短い読み取り長さが望ましい場合、より少ないサイクルが行われ得る。したがって、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドは、本明細書に記載の方法の最大で200、150、100、50、25、10、5または2回のサイクルに供され得る。
いくつかの実施形態では、配列決定方法は、所定数の反復サイクルで行われ得る。代替的に、特定の経験的に観察された状態に達するまで、サイクルが繰り返され得る。例えば、シグナルが観測可能な閾値を上回るか、ノイズが観測可能な閾値を下回るか、またはシグナル対ノイズ比が観測可能な閾値を上回る限り、サイクルが繰り返され得る。
別の例では、1つ以上のアンサンブル(例えば、アレイ中の1つ以上のクラスターまたはフィーチャー)が所望の組成を有する限り、サイクルが繰り返され得る。1つ以上のアンサンブルが配列決定サイクルを経るにつれて、それらの組成は変化し得る。単一のアンサンブルをテンプレート核酸のセットとみなすと、各々が3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを有するプライマーを有するテンプレートの第1のサブセットは、サイクルが進むにつれて数が減少し得、各々が三元複合体阻害剤を有するプライマーを有する(または各々がプライマーを有しない)テンプレート核酸の第2のサブセットは、サイクルが進むにつれて数が増加し得る。配列決定方法は、第1のサブセットが特定の閾値に達するまで、かつ/または第2のサブセットが特定の閾値に達するまで継続することができる。より具体的には、サイクルは、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、検出されている複数のテンプレート核酸の99%、90%、80%、70%、60%または51%未満になるまで繰り返され得る。代替的または追加的に、サイクルは、第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、検出されている複数のテンプレート核酸の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%または99%である限り、繰り返され得る。いくつかの実施形態では、サイクルは、第2のサブセットのテンプレート核酸の数が、検出されている複数のテンプレート核酸の最大で1%、10%、20%、30%、40%、50%またはそれ以上になるまで繰り返され得る。代替的または追加的に、サイクルは、第2のサブセットのテンプレート核酸の数が、検出されている複数のテンプレート核酸の少なくとも50%、40%、30%、20%、10%、または1%である限り、繰り返され得る。
本明細書に記載されるステップの全てが繰り返される必要も、繰り返されるステップが各繰り返しで同じ順序で起こる必要もないことが理解されるであろう。
本開示は、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含む装置をさらに提供し、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットは、プライマーの3’末端にブロックされたヌクレオチドを有し、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットは、プライマーの3’末端に三元複合体阻害剤を有する。任意に、ブロックされたヌクレオチドは、可逆的な終結ヌクレオチドであり得る。
任意に、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、本開示の装置内の固体支持体に結合される。固体支持体は、例えば、核酸アレイの文脈で本明細書に記載される材料を含む、本明細書に記載される様々な材料のいずれかを含むことができる。複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドは、アレイのフィーチャーに結合され得、任意に、フィーチャーに結合されたテンプレートは、同じ配列を有することができる。本明細書に記載される様々な試薬のいずれも、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの代わりに、または代替的に、結合されたプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドに加えて、固体支持体に結合され得る。特定の実施形態では、本開示の装置は、任意のタイプの結合された試薬を含む必要はない。
特定の実施形態では、本開示の装置は、人工容器などの容器を含む。容器は、本明細書に記載される方法に関与する他の試薬または反応生成物と共に複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含有することができる。特に有用な人工容器はフローセルであり、その例は本明細書で上記に記載されている。
本開示の装置は、より大きいシステムの一構成要素であり得る。例えば、システムは、(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含む装置であって、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットが、プライマーの3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを有し、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットが、プライマーの3’末端に三元複合体阻害剤を有する、装置と、(b)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを検出するように構成された検出器と、を含むことができる。任意に、システムは、(c)ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含むリザーバを含む流体システムをさらに含むことができ、リザーバは、複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドと流体連通している。
本開示のシステムは、例えば、本明細書に記載される方法を使用して、核酸を検出するように構成され得る。例えば、システムは、ヌクレオチドの存在下でのポリメラーゼとプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドとの間に形成された三元複合体を生成及び検出して、テンプレート核酸配列における1つ以上の塩基を同定するように構成され得る。任意に、システムは、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、ポリメラーゼ、及び次の正しいヌクレオチドの間に少なくとも1つの安定化三元複合体を形成するステップ、安定化三元複合体(複数可)を検出するステップ、各プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのプライマーを、例えば、プライマーキャッピングもしくはプライマー伸長プロセスを介して修飾するステップ、可逆的な終結プライマーを脱ブロックするステップ、ならびに/またはテンプレートに存在するヌクレオチド、ヌクレオチドの配列、もしくは塩基多重項の連続を同定するステップを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載される1つ以上のステップを実施するための成分及び試薬を含む。
本開示のシステムは、核酸検出方法を行うための容器、固体支持体または他の装置を含み得る。例えば、システムは、アレイ、フローセル、マルチウェルプレート、または他の便利な装置を含み得る。装置は取り外し可能であり得、それにより、それをシステムに配置すること、またはシステムから取り外すことを可能にする。したがって、システムは、複数の装置(例えば、容器または固体支持体)を順次に、または並行して処理するように構成され得る。システムは、本明細書に記載される試薬のうちの1つ以上(例えば、ポリメラーゼ、プライマー、テンプレート核酸、三元複合体形成用のヌクレオチド(複数可)、プライマー伸長用のヌクレオチド、脱ブロッキング試薬、三元複合体阻害剤、またはそのような成分の混合物)を含むためのリザーバを有する流体成分を含むことができる。流体システムは、例えば、チャネルまたは液滴移送装置(例えば、エレクトロウェッティング装置)を介して、試薬を容器または固体支持体に送達するように構成され得る。様々な検出装置のいずれも、試薬が相互作用する容器または固体支持体を検出するように構成することができる。例には、発光検出器、表面プラズモン共鳴検出器、及び当該技術分野で知られている他のものが含まれる。本明細書のシステムで使用するために容易に修正され得る流体及び検出成分を有する例示的なシステムには、米国特許出願公開第2018/0280975 A1号(米国特許出願第第62/481,289号、米国特許第8,241,573号、同第7,329,860号もしくは同第8,039,817号、または米国特許出願公開第2009/0272914 A1号もしくは同第2012/0270305 A1号に記載されているものが含まれるがこれらに限定されず、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
任意に、本開示のシステムは、システム成分を動作させるように構成されたコンピュータ処理ユニット(CPU)をさらに含む。同一または異なるCPUがシステムと対話して、シグナル(例えば、本明細書に記載される方法で検出されたシグナル)を取得、保存、及び処理することができる。特定の実施形態では、CPUを使用して、シグナルから、テンプレート核酸の特定の場所に存在するヌクレオチドの同一性を決定することができる。場合によっては、CPUは、検出されたシグナルからテンプレートのヌクレオチドの配列を特定する。
有用なCPUには、例えば、パーソナルコンピュータシステム、サーバーコンピュータシステム、シンクライアント、シッククライアント、ハンドヘルドもしくはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサベースのシステム、セットトップボックス、プログラマブルコンシューマエレクトロニクス、ネットワークPC、ミニコンピュータシステム、メインフレームコンピュータシステム、スマートフォン、または上記のシステムもしくはデバイスのいずれかを含む分散クラウドコンピューティング環境などのうちの1つ以上が含まれる。CPUは、1つ以上のプロセッサまたは処理ユニット、RAM及び不揮発性メモリを含み得るメモリアーキテクチャを含むことができる。メモリアーキテクチャは、取り外し可能/取り外し不能、揮発性/不揮発性のコンピュータシステム記憶媒体をさらに含むことができる。さらに、メモリアーキテクチャには、ハードドライブなどの取り外し不能な不揮発性の磁気メディアを読み書きするための1つ以上のリーダー、リムーバブル、不揮発性磁気ディスクから読み取りまたは書き込みを行う磁気ディスクドライブ、及び/またはCD-ROMもしくはDVD-ROMなどの取り外し可能な不揮発性光ディスクから読み取りまたは書き込みを行う光ディスクドライブを含んでもよい。CPUはまた、様々なコンピュータシステム可読媒体を含むことができる。このようなメディアは、揮発性及び不揮発性メディア、取り外し可能及び取り外し不能メディアなど、クラウドコンピューティング環境からアクセス可能な任意の利用可能なメディアであり得る。
メモリアーキテクチャは、本明細書に記載される方法の1つ以上のステップを実行するように構成された実行可能命令として実装された少なくとも1つのプログラムモジュールを有する少なくとも1つのプログラム製品を含み得る。例えば、実行可能な命令には、オペレーティングシステム、1つ以上のアプリケーションプログラム、他のプログラムモジュール、及びプログラムデータが含まれる場合がある。一般に、プログラムモジュールは、本明細書に記載されている特定のタスクを実行するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、ロジック、データ構造などを含み得る。
CPUの構成要素は、メモリバスまたはメモリコントローラ、周辺バス、高速グラフィックスポート、及び様々なバスアーキテクチャのいずれかを使用するプロセッサまたはローカルバスを含む、いくつかの種類のバス構造の1つ以上として実装できる内部バスによって結合できる。限定ではなく例として、このようなアーキテクチャには、業界標準アーキテクチャ(ISA)バス、マイクロチャネルアーキテクチャ(MCA)バス、拡張ISA(EISA)バス、ビデオエレクトロニクス標準協会(VESA)ローカルバス、及び周辺機器相互接続(PCI)バスが含まれる。
CPUは、キーボード、ポインティングデバイス(例えば、マウス)、グラフィカルユーザインターフェイス(GUI)などのディスプレイ、または核酸検出システムとの使用の相互作用を促進する他のデバイスなど、1つ以上の外部デバイスと任意に通信することができる。同様に、CPUは(ネットワークカード、モデムなどを介して)他のデバイスと通信できる。このような通信は、I/Oインターフェースを介して発生し得る。さらに、本明細書のシステムのCPUは、ローカルエリアネットワーク(LAN)、一般的なワイドエリアネットワーク(WAN)、及び/または適切なネットワークアダプタを介したパブリックネットワーク(例えば、インターネット)などの1つ以上のネットワークと通信できる。
本開示は、核酸を特徴付けるためのキットをさらに提供する。任意に、キットは、本明細書に記載される方法のうちの1つ以上を行うための試薬を含むことができる。例えば、キットは、1つ以上のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドと混合されたときに安定化三元複合体を生成するための試薬を含むことができる。ヌクレオチド混合物に加えて、キットは、安定化三元複合体を形成することができるポリメラーゼ、及び/またはプライマー修飾ステップに使用されるポリメラーゼを含むことができる。可逆的な終結ヌクレオチドまたは三元複合体阻害剤などの、プライマー修飾に使用される他の試薬もキットに含まれ得る。ヌクレオチド(複数可)、ポリメラーゼ(複数可)、またはその両方などのキット内に含まれる試薬は、例えば、様々な方法の文脈で本明細書に記載されるように、外因性標識を含み得る。
したがって、本明細書に記載される方法を実行する際に使用される成分または物品のいずれも、キットに有用にパッケージ化することができる。例えば、キットは、本明細書に記載される方法を実施する際に使用される成分または物品の一部、多く、または全てを含むように梱包することができる。例示的な成分としては、例えば、本明細書及び本明細書で引用される参考文献に記載される標識ヌクレオチド(例えば、伸長可能な標識ヌクレオチド)、ポリメラーゼ(標識または非標識)、ターミネーター部分を有するヌクレオチド(例えば、非標識、可逆的な終結ヌクレオチド)、脱ブロッキング試薬、三元複合体阻害剤などが挙げられる。そのような試薬のいずれかは、例えば、プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの分析のための後続のステップのうちの1つ以上を実施するために使用される緩衝液、成分及び/または物品のうちの一部、多く、または全てを含むことができる。キットはプライマーまたはテンプレート核酸を含む必要はない。むしろ、キットのユーザは、ユーザによってキットの成分と組み合わされる1つ以上のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供することができる。
1つ以上の補助試薬もキットに含めることができる。そのような補助試薬は、上記で例示された試薬のいずれか及び/または本明細書に記載される方法を実施するのに有用な他のタイプの試薬を含み得る。説明書をさらにキットに含めることができる。説明書は、例えば、本明細書に記載される方法で使用される任意の成分または物品を作製し、本明細書に記載される方法の任意の実施形態の1つ以上のステップを実施するための手順、及び/またはプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを用いる後続の分析ステップのいずれかを実施するための説明を含むことができる。
特定の実施形態では、キットは、フローセルまたは固体支持体など、本明細書に記載される装置を含むことができる。任意に、キットは、試薬を含むためのリザーバを有し、かつ試薬をリザーバから検出機器に移送するための流体成分をさらに有する、カートリッジを含む。例えば、流体成分は、安定化三元複合体が検出されるフローセルに試薬を移送するように構成され得る。本開示のキット(またはシステム)に含まれ得る例示的な流体カートリッジは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第15/922,661号(米国特許出願公開第2018/0280975 A1号として公開)に記載されている。
実施例I
ランオフプライマー伸長を使用したプライマーキャッピング
本実施例は、プライマーの集団を伸長するときのフェージングを改善するための技術を実証する。フェージングは、キャップされたプライマーが後続の検査ステップで三元複合体を形成することを防止するために、伸長されていないプライマーをキャップすることによって改善される。
ランオフプライマー伸長を使用したプライマーキャッピング
本実施例は、プライマーの集団を伸長するときのフェージングを改善するための技術を実証する。フェージングは、キャップされたプライマーが後続の検査ステップで三元複合体を形成することを防止するために、伸長されていないプライマーをキャップすることによって改善される。
バイオレイヤー干渉法を用いて光ファイバー先端の表面における結合反応を測定するFORTEBIO(登録商標)(カリフォルニア州メンローパーク)Octet機器を、マルチウェルプレート形式で使用した。テンプレート核酸を、37℃で5分間、5’ビオチン化テンプレート核酸を含むウェルでインキュベートすることによって、ストレプトアビジン官能化先端に結合した。結合されていないテンプレート核酸を、先端を0.1M NaOHと接触させ、先端を吸い取って乾燥させ、次いで、先端をPRE(50mM KCl、50mMトリシン、pH 8.42、0.1% Tween-80、0.1%ヒドロキシルアミン、0.1mM EDTA)中で洗浄することによって除去した。プライマーを、PRE中で37℃において5分間インキュベートすることによって、先端結合テンプレートにハイブリダイズした。
次いで、先端をOctet機器上で30回のプライマー伸長サイクルに供した。各サイクルには、以下のインキュベーション時間、先端を以下の試薬に移すステップを含んだ。(1)PRE、5秒間、(2)RTS(PRE、5mM MgCl2、10U/mL Therminator、25μM rtNTP(3’位にアミノオキシ可逆的ターミネーター部分を有する可逆的な終結デオキシヌクレオチド))、10秒間、(3)可変溶液、30秒間、(4)ESB(1M GdSCN、0.1mM HEPES、pH 7.5、0.1% Tween-80、0.1%ヒドロキシルアミン、2mM EDTA)、5秒間、(5)PRE、5秒間、(6)CLV(0.25M酢酸ナトリウム、pH 4.8、0.7M亜硝酸ナトリウム)、5秒間、(7)PRE、5秒間。可変溶液は、以下の試薬を含有した。
a)PRE
b)PRE+10u/mL Therminator
c)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2
d)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+100μM dNTP
e)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+30μM dNTP
f)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+10μM dNTP
g)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+3μM dNTP
h)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+1μM dNTP
a)PRE
b)PRE+10u/mL Therminator
c)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2
d)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+100μM dNTP
e)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+30μM dNTP
f)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+10μM dNTP
g)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+3μM dNTP
h)PRE+10u/mL Therminator+5mg Mg+2+1μM dNTP
Octetサイクルの後、プライマー鎖を先端結合テンプレートから剥離し、キャピラリー電気泳動(CE)染料と共にインキュベートした。次いで、CE分析を使用してプライマーの長さを決定した。各ピークをチェックし、n及びn-1ピーク面積を記録することによって、CE結果を分析した。プライマー伸長の効率を、以下の式を使用して評価した。[(サイクル数)×(n/n-1比)]÷[(サイクル数)×(n/n-1比)+1]。
結果が表1に要約される。伸長したプライマーは、予想される長さ(n=59ヌクレオチド)と一致したCE移動度を有した。n/n-1の比率は、対照条件(すなわち、a)、b)及びc))において最も低く、ヌクレオチドが存在した場合に増加した。プライマー伸長に必要な全ての成分が存在した場合、全長伸長の効率も増加した。
結果は、可逆的な終結ヌクレオチド(RTS中)での伸長後に、プライマー伸長に必要な全ての成分(dNTP、Therminator、及びMg)が存在した場合のみ、さらなるプライマー伸長が起こったことを実証した。これは、ブロックされていない3’末端が残り、RTS後のランオフ伸長を使用して、テンプレート領域を通ってプライマーを完全に伸長することができることを示す。
完全に伸長したプライマーは、後続の検査ステップ中に三元複合体の形成に利用できないことが予想され、シグナル対ノイズの改善、より長い読み取り長さ、及びより高い配列決定精度をもたらす。
この出願を通して、様々な出版物、特許及び/または特許出願が参照されている。これらの文書の開示全体は、参照により本出願に組み込まれている。
多くの実施形態が説明された。それにもかかわらず、様々な修正が行われ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
Claims (49)
- テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定するための方法であって、
(a)複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを提供することであって、前記プライマーが伸長可能な3’末端を含む、前記提供することと、
(b)前記複数を、
(i)各々が3’末端にブロックされたヌクレオチドを含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットを生成するためのブロックされたヌクレオチド、及び
(ii)各々が三元複合体阻害剤を含むプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットを生成するための三元複合体阻害剤と接触させることと、
(c)各々がポリメラーゼ、前記第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッド、及び同族ヌクレオチドを含む三元複合体を形成することと、
(d)前記三元複合体を検出し、それによって前記テンプレート核酸中のヌクレオチドを同定することと、を含む、前記方法。 - 前記ブロックされたヌクレオチドが、可逆的な終結ヌクレオチドを含み、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第1のサブセットが各々、前記3’末端に可逆的な終結ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- (e)前記第1のサブセットの前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記3’末端における前記可逆的な終結ヌクレオチドを脱ブロックすることをさらに含む、請求項2に記載の方法。
- (f)ステップ(b)~(e)を繰り返して、前記第1のサブセットのテンプレート核酸を配列決定することをさらに含む、請求項3に記載の方法。
- ステップ(f)の前に、前記第1のサブセットの前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドから、前記ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドを除去することをさらに含む、請求項4に記載の方法。
- 前記第1のサブセットの前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの50%を超える限り、ステップ(b)~(f)が繰り返される、請求項4または5に記載の方法。
- 前記第2のサブセットの前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの50%未満である限り、ステップ(b)~(f)が繰り返される、請求項4または5に記載の方法。
- ステップ(b)~(f)が、少なくとも100回繰り返される、請求項4~7のいずれか1項に記載の方法。
- プライマー-テンプレート核酸の前記第2のサブセットが、1つのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドから本質的になる、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- プライマー-テンプレート核酸の前記第2のサブセットが、少なくとも2つのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第2のサブセットが、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの1%未満を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、固体支持体に結合される、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、アレイのフィーチャーに結合される、請求項12に記載の方法。
- 前記フィーチャーに結合された前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、共通の配列を有する少なくとも100コピーを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記フィーチャーに結合された前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、アンサンブルとして検出される、請求項13または14に記載の方法。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、アレイの異なるフィーチャーに結合された異なるテンプレートを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記三元複合体阻害剤が、オリゴヌクレオチド部分を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド部分が、ステップ(b)でオリゴヌクレオチドを前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドにライゲーションすることによって生成される、請求項17に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチド部分が、ステップ(b)で、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドのポリメラーゼ触媒伸長によって生成される、請求項18に記載の方法。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端でポリメラーゼが結合することを阻害する部分を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端で同族ヌクレオチドがポリメラーゼに結合することを阻害する部分を含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端にミスマッチしたヌクレオチドを含む、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 未反応のブロックされたヌクレオチドが、ステップ(b)(i)の後に、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドから分離される、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 未反応のブロックされたヌクレオチドが、ステップ(b)(ii)の前に、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドから分離される、請求項23に記載の方法。
- ステップ(b)(i)が、ステップ(c)の前に起こり、ステップ(b)(ii)が、ステップ(d)の後に起こる、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを含む、装置であって、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第1のサブセットが、前記プライマーの3’末端にブロックされたヌクレオチドを含み、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの第2のサブセットが、前記プライマーの前記3’末端に三元複合体阻害剤を含む、装置。
- 前記ブロックされたヌクレオチドが、可逆的な終結ヌクレオチドを含む、請求項26に記載の装置。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、固体支持体に結合される、請求項26または27に記載の装置。
- 前記固体支持体が、核酸アレイを含む、請求項28に記載の装置。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、前記アレイのフィーチャーに結合され、前記フィーチャーに結合された前記テンプレートが、同じ配列を含む、請求項28または29に記載の装置。
- 前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが、人工容器内にある、請求項26~30のいずれか1項に記載の装置。
- 前記人工容器が、フローセルを備える、請求項31に記載の装置。
- 前記第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドが各々、ポリメラーゼ及び同族ヌクレオチドに結合され、それによって三元複合体を形成する、請求項26~32のいずれか1項に記載の装置。
- 前記ポリメラーゼが、外因性標識に共有結合される、請求項33に記載の装置。
- 前記同族ヌクレオチドが、外因性標識に共有結合される、請求項33に記載の装置。
- 前記外因性標識が、フルオロフォアを含む、請求項33、34、または35のいずれか1項に記載の装置。
- 前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第1のサブセットの前記プライマーが、同じ長さである、請求項26~36のいずれか1項に記載の装置。
- 前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第2のサブセットの前記プライマーが、長さが異なる、請求項37に記載の装置。
- 前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第2のサブセットの前記プライマーが、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第1のサブセットの前記プライマーよりも短い、請求項37または38に記載の装置。
- 前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第2のサブセットの前記プライマーが、前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第1のサブセットの前記プライマーよりも長い、請求項37または38に記載の装置。
- 前記プライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの前記第2のサブセットの前記プライマーが、完全に伸長されている、請求項37に記載の装置。
- 前記第1のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数の50%未満である、請求項26~41のいずれか1項に記載の装置。
- 前記第2のサブセットのプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数が、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドの数の50%を超える、請求項26~41のいずれか1項に記載の装置。
- 前記三元複合体阻害剤が、オリゴヌクレオチド部分を含む、請求項26~43のいずれか1項に記載の装置。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端でポリメラーゼが結合することを阻害する部分を含む、請求項26~44のいずれか1項に記載の装置。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端で同族ヌクレオチドがポリメラーゼに結合することを阻害する部分を含む、請求項26~44のいずれか1項に記載の装置。
- 前記三元複合体阻害剤が、前記プライマーの前記3’末端にミスマッチしたヌクレオチドを含む、請求項26~44のいずれか1項に記載の装置。
- (a)請求項26~47のいずれか1項に記載の装置と、
(b)前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドを検出するように構成された検出器と、を備える、システム。 - (c)ポリメラーゼ及びヌクレオチドを含むリザーバを備える流体システムをさらに備え、前記リザーバが、前記複数のプライマー-テンプレート核酸ハイブリッドと流体連通している、請求項48に記載のシステム。
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