DE69416860T2

DE69416860T2 - Nucleosideanaloge verfahren

Info

Publication number: DE69416860T2
Application number: DE69416860T
Authority: DE
Inventors: Carl Cleveland Heights Oh 44118 Fuller; Clifford Herts Hp23 5Pg Smith
Original assignee: Amersham Pharmacia Biotech UK Ltd
Current assignee: GE Healthcare UK Ltd
Priority date: 1993-12-01
Filing date: 1994-12-01
Publication date: 1999-07-01
Anticipated expiration: 2014-12-02
Also published as: EP0731846A1; US5702925A; JPH09505736A; WO1995015395A3; DE69416860D1; WO1995015395A2; DK0731846T3; CA2174942A1; ATE177151T1; EP0731846B1

Description

[α-³²P]-Didesoxyadenosintriphosphat ist im Handel erhältlich. Das derzeitige chemische Herstellungsverfahren ist sehr ineffizient. Die Erfindung liefert ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung, das die Effizienz verbessert. Das Verfahren ist für viele Verbindungen außer dieser einen, anwendbar.
In Gene, März 1984, Band 27, Nr. 3, Seiten 309 bis 313, beschrieben S. I. Yousaf et al. die Synthese von [α-³²P]ddATP und seine Verwendung bei Maxam/Gilbert-Sequenzierungsverfahren.
WO 93/24655 (Amersham) beschreibt die Verwendung von mit ³²P markiertem ddATP bei einer RNA-Fingerprinttechnik.
T4-Polynucleotidkinase (T4-PNK) wird gewöhnlich in Verbindung gebracht mit der Phosphorylierung an der 5'-OH-Gruppe eines Oligonucleotids, von DNA oder von 2-Desoxynucleosid-2-monophosphat (oder Ribo) durch Transfer der gamma-Phosphatgruppe von ATP. (Analytical Biochemistry 214, 338 bis 340, 1993). Es wird allgemein angenommen, daß das Nucleotid eine 5'-OH- und eine 3'-Phosphatgruppe enthalten muß, damit T4-PNK die 5'-OH- Gruppe des Nucleotids phosphorylieren kann. Da die 3'- Phosphatgruppe bei 2',3'-Didesoxynucleosiden und anderen bekannten Kettenabbruchmitteln eindeutig nicht vorhanden ist, wurde bisher die Verwendung von T4-PNK zur Katalysierung ihrer Phosphorylierung als unmöglich angesehen. Die Erfindung ergibt sich aus der überraschenden Erkenntnis, daß T4-PNK verwendet werden kann, um diese Reaktion zu katalysieren. Die Erfindung betrifft die Verwendung von T4-PNK und anderen Enzymen, um diese und verwandte Reaktionen zu katalysieren.
Bekannte Kits zur Sequenzierung von Nucleinsäuren umfassen Vorratsmengen aller vier Nucleotide und Vorratsmengen aller vier 2',3'-Didesoxynucleotide und einen Vorrat eines Nucleotids, das markiert wurde, im allgemeinen radioaktiv, um den Nachweis der Produkte nach der Sequenzierung durch Elektrophorese zuzulassen. Gemäß einem weiteren Aspekt basiert die Erfindung darauf, daß verbesserte Ergebnisse erhalten werden können durch radioaktive Markierung der Didesoxynucleotide.
Kits, die fluoreszenzmarkierte Kettenabbruchmittel (ddNTPs) enthalten, sind bekannt, aber mit Isotopen markierte ddNTPs haben Strukturen, die die Polymeraseaktivität und die Gelmobilität eher nicht stören und keine komplizierte Ausstattung zu ihrem Nachweis erfordern.
Gemäß einem Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nucleotids oder Nucleotidanalogs oder Nucleotidaddukts mit einer 5'-Phosphat- oder 5'-Thiophosphatgruppe, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Ausgangsnucleosid oder Nucleosidanalog oder Nucleosidaddukt mit einer 5'-OH-Gruppe aber keiner 3'-Phosphatgruppe mit einem Nucleotidphosphat- oder Thiophosphatdonator in Gegenwart eines Enzyms, das die Reaktion katalysiert, umsetzt. Das Nucleosid kann ein unmodifiziertes Ribo- oder Desoxyribonucleosid sein, z. B. 2'-Desoxyadenosin.
Es ist möglich, daß das Nucleosid, Nucleosidanalog oder Nucleosidaddukt nicht markiert ist und daß der Phosphatdonator auch nicht markiert ist. Dies erzeugt das entsprechende Nucleotid ohne die Notwendigkeit, chemische Phosphorylierungsmittel zu verwenden, die das Ausgangsmaterial in einigen Fällen schädigen könnten.
Alternativ kann das Nucleosid mit einem nachweisbaren Isotop markiert sein, z. B. einem Radioisotop, wie z. B. ³H oder ¹&sup4;C, und dann in das entsprechende markierte Nucleotid mit einem nicht markierten Phosphatdonator oder Thiophosphatdonator umgewandelt werden.
Bevorzugt ist der Nucleotidphosphat- oder Thiophosphatdonator mit einem nachweisbaren Isotop radioaktiv markiert, z. B. einem radioaktiven Isotop wie ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S, wodurch das erhaltene Nucleotid oder Nucleotidanalog oder Nucleotidaddukt radioaktiv markiert wird, da es eine 5'-Phosphat- oder 5'- Thiophosphatgruppe aufweist, die ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S enthält.
Der Ausdruck "Nucleosidanalog" bezieht sich auf eine Verbindung, die einem Nucleosid ähnlich ist und zumindest einige der biochemischen Funktionen eines Nucleosids liefern kann und Monomere und Multimere einschließt. Es folgt eine nicht erschöpfende Liste von Nucleosidanaloga.

Modifikationen der Base

2-Aminoadenosin
5-Bromcytosin
5-Methylcytosin
5-(1-Propinyl)cytosin
5-(1-Propinyl)uracil
5-Aminoallyluracil
5-Aminoallyluracil-"Markierung"
Thiouracil/Thiothymin/Thioguanidin
Aziridenderivate

Modifikation des Zuckers

2'-O-Alkyl (z. B. Allyl oder Methyl)
2'-Fluor
2'-Amino
2'-Desoxy
3'-Desoxy
3'-"Markierung"
3'-Fluor
3'-Amino
3'-Azido
2',3'-ungesättigt

Kombinationen von Basen- und Zuckermodifikationen Phosphatmocdifikationen

Phosphorthioat
Phosphordithioat
Hydrogenphosphonat
Methylphosphonat
Phosphortriester
Phosphoramidit
Derivate mit Methylenbrücke

Modifiziertes Gerüst

Polyamidnucleinsäure (PNA), die modifiziert wurde, um das Äquivalent einer 5'-Hydroxynucleinsäure zu ergeben, z. B. eine, die mit der Formel
(Bezüglich Polyamidnucleinsäuren (PNA) siehe P. E. Neilsen, Science, Band 254, 6. Dezember 1991, Berichte Seiten 1497 bis 1500). Antisense- und Antigenoligonucleotide liefern ein weiteres Beispiel für Nucleosidanaloga.
Die bevorzugten und wichtigsten Nucleosidanaloga, mit denen sich die Erfindung befaßt, sind die vier 2',3'-Didesoxynucleoside ddA, ddC, ddG und ddT.
Der Ausdruck Nucleosidaddukt bezieht sich auf eine Verbindung, die durch Wechselwirkung zwischen den reaktiven Einheiten und DNA oder RNA entsteht. Solche reaktiven Einheiten schließen karzinogene Verbindungen oder deren Metabolite und Radikale, die durch elektromagnetische Strahlung erzeugt werden, ein. Der hochempfindliche Nachweis von Nucleosidaddukten ist sehr wichtig bei der Auswertung des Kontaktes von Organismen mit Mitteln, die Nucleinsäuren modifizieren. Beispiele für Nucleosidaddukte schließen die Reaktionsprodukte von polycyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAH) an N2 von Guanosin, aromatischen Aminen und Sauerstoffresten an C8 von Guanosin, von Alkylierungsmitteln an N7 und 06 von Guanosin und von Mykotoxinen an N7 von Guanosin ein.
Ein bevorzugtes Enzym zur Verwendung bei dem Verfahren ist ein Polynucleotidkinaseenzym (PNK), wie T4-Polynucleotidkinase. Dieses Enzym wird häufig zur Herstellung von ³²P-5'- dNMP verwendet unter den Standardreaktionsbedingungen von 37ºC und pH 8,5, durch eine Reaktion, die die Phosphorylierung von 3'-dNMP mit [γ³²P]-ATP und PNK beinhaltet. Der Versuch der Erfinder, 2',3'-Didesoxyadenosin (dem 3'-Phosphat fehlt) mit [γ³²P]-ATP zu phosphorylieren unter Verwendung dieses Enzyms und dieser Reaktionsbedingungen, war nicht erfolgreich. Der Erfolg kann jedoch überraschenderweise erzielt werden unter Verwendung einer geringeren Temperatur und/oder eines niedrigeren pHs. Der bevorzugte Temperaturbereich ist 4 bis 30ºC, wobei 18 bis 30ºC bevorzugter ist. Der bevorzugte pH-Bereich ist 4,0 bis 9,0. Ein hoher Salzgehalt, z. B. bis zu 150 mM NaCl, kann nützlich sein, um die gewünschte Reaktion zu fördern. Die Inkubation der Reaktanten unter diesen Bedingungen über Zeiträume im Bereich von 10 Minuten bis 24 Stunden kann gute Ausbeuten liefern, die sich bei längeren Reaktionszeiten erhöhen. Die Verwendung einer phosphatasefreien T4-PNK, bei der die 3'-Phosphataseaktivität im wesentlichen entfernt wurde, kann vorteilhaft sein, um Nebenreaktionen auszuräumen, die die Nucleosidmonophosphatausbeute vermindern.
Ein weiteres Enzym, das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist ein Phosphotransferaseenzym, das aus Gerstensamen extrahiert wird (J. Biol. Chem., 257, Nr. 9, Seiten 4931 bis 9, 1982). Das Enzym hat zwei Aktivitäten: Eine ist die als Phosphotransferase, bei der das Phosphat von einem Nucleosid-5'-monophosphat zu der 5'-Hydroxylgruppe eines anderen Nucleosids übertragen wird, mit einer Bevorzugung für Purindesoxynucleosidphosphatakzeptoren. Das Enzym wurde bisher, soweit bekannt, nicht für die Phosphorylierung von 2',3'-Didesoxynucleosiden verwendet. Die andere Aktivität dieses Enzyms besteht darin, daß das Phosphorylenzymzwischenprodukt das Phosphat auf Wasser übertragen kann, statt auf den Nucleosidakzeptor, was ein anorganisches Phosphat erzeugt. Es ist möglich, die Enzymaktivität zu kontrollieren, indem der pH, das Verhältnis von Donator zu Akzeptor variiert wird und durch Zugabe von Salzen, um das für das Enzym zugängliche Wasser zu entfernen. Bevorzugte Bedingungen der Verwendung sind 5 bis 30ºC bei einem pH von 4 bis 9, insbesondere 7 bis 8,5. Das Verfahren erfordert die Einleitung von 5'-NMP, das dann als Phosphatdonator verwendet wird. 5'-UMP ist das bevorzugte 5'-NMP.
Ein weiteres Phosphotransferaseenzym ist eines, das aus Kälberthymus stammt.
Ein Nucleotidanalog ist ein Nucleosidanalog, das mindestens eine 5'-Phosphat- oder 5'-Thiophosphatgruppe aufweist.
Nucleotidphosphat- und Thiophosphatdonatoren sind auf diesem, Gebiet wohlbekannt. Bevorzugte Beispiele für Nucleotidphosphatdonatoren sind ATP, 5'-UMP, ATP-γS, 5'-UMP-αS. Diese Donatoren können radioaktiv markiert sein mit ³²P, ³³P und ³&sup5;S, sodaß die Markierung mit einer Phosphat- oder Thiophosphatgruppe auf das Nucleosidanalog übertragen wird. Ein bevorzugter Nucleotidphosphatdonator ist [γ-³²P]-ATP. Die Reaktion dieses Domtors mit einem 2',3'-Didesoxynucleosid unter Verwendung von PNK liefert ein 5'-[α-³²P]-Nucleosidmonophosphat.
Diese Nucleosidmonophosphate können leicht und effizient mit bekannten Mitteln in das entsprechende Triphosphat umgewandelt werden. Unter Verwendung von ³³P oder ³&sup5;S können die entsprechenden [α-³³P] - oder [α-³&sup5;S] -Didesoxynucleosidtriphosphate hergestellt werden.
Wenn ein Enzym verwendet wurde, um ein Nucleosid zu phosphorylieren, war es üblich und nützlich, einen großen Überschuß des ausgewählten Nucleotidphosphat-(oder Thiophosphat)-Donators bereitzustellen, was die Wirkung hat, daß die Reaktion in die gewünschte Richtung getrieben wird. Wenn der Nucleotidphosphat-(oder Thiophosphat)-Donator radioaktiv markiert ist, ist es nicht gut, einen großen Überschuß bereitzustel len. Daher sind die Reaktionsbedingungen viel kritischer, wenn eine gute Ausbeute eines gewünschten radioaktiv markierten Nucleotids erhalten werden soll.
Gemäß einem anderen Aspekt liefert die Erfindung einen Kit, um Nucleinsäuren zu sequenzieren, wobei der Kit einen Vorrat für jedes der vier kettenabbrechenden Nucleotide oder Nucleotidanaloga, die mit einem Radioisotop markiert sind, und auch einen Vorrat eines Polymeraseenzyms und einen Vorrat für jedes der vier dNTPs liefert. Bevorzugt umfaßt der Kit kettenabbrechende Nucleotidanaloga, mit [α-³²P] und/oder [α-³³P] und/oder [α-³&sup5;S], z. B. Didesoxynucleosidtriphosphate zusammen mit einem Polymeraseenzym, z. B. einer T7-DNA-Polymerase, einen Vorrat jedes der vier dNTPs und einen Puffer, der Mn²&spplus; enthält. Die Bereitstellung der markierten ddNTPs sollte ihre Verwendung bei der Sequenzierung mit verbesserter Genauigkeit zuverlässig machen durch einen verminderten Hintergrund und eine gleichmäßigere Bandenintensität.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ein Verfahren zur Sequenzierung einer Nucleinsäure mit einer Kettenabbruchtechnik, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine matrizenorientierte enzymatische Synthese bewirkt unter Verwendung von Kettenabbruchmitteln für jedes der vier verschiedenen Nucleotide oder Nucleotidanaloga, die mit einem Radioisotop markiert sind, und Produkte der enzymatischen Synthese mit Hilfe der Radioisotope nachweist.
Gemäß einem weiteren Aspekt liefert die Erfindung ddCTP und ddGTP und ddTTP, die mit ³³P radioaktiv markiert sind, wobei die radioaktive Markierung bevorzugt in einer α-Phosphatgruppe vorhanden ist.
Der Nachweis von Kettenabbruch-DNA-Sequenzierungsprodukten nach Auftrennung mit Gelelektrophorese wurde auf mehreren Wegen erzielt. Die ursprünglichen Methoden betrafen die Verwendung von [α-³²P]dATP, um die neu synthetisierte DNA intern zu markieren. In ähnlicher Weise können auch radioaktiv markierte Oligonucleotidsequenzprimer verwendet werden. Kürzlich wurden auch Primer und Nucleotide, die mit Fluoreszenzfarben markiert waren, in Verbindung mit teuren, empfindlichen Geräten verwendet, die die fluoreszierenden Produkte nachweisen. Diese Verfahren arbeiten nur dann gut, wenn sichergestellt wird, daß alle DNA-Ketten korrekt durch Didesoxynucleotide beendet werden. Alle Ketten, die mit Desoxynucleotiden am 3'- Ende enden, können zu einem Hintergrundsignal im endgültigen Elektrophetogramm beitragen. Solche Abbrüche können auftreten, wenn die Polymerase nicht sehr produktiv ist oder wenn die Matrize starke sekundäre Strukturen enthält. Solche nichtspezifischen Abbrüche treten häufig bei Sequenzierungsversuchen auf und führen gewöhnlich entweder zu Fehlern oder erfordern eine erneute Sequenzierung, um die betroffenen Basen korrekt zuzuordnen.
Es gab auch mehrere erfolgreiche Methoden unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoffen, die an das kettenabbrechende Didesoxynucleotid gebunden sind (Prober et al., L. G. Lee, C. R. Connell, S. L. Woo, R. D. Cheng, B. F. McArdle, C. W. Fuller, N. D. Halloran und R. K. Wilson (1992), Nucleic Acis Res., 20, 2471 bis 2483). Diese Methoden haben den Vorteil, daß die Markierung direkt an das Molekül gebunden ist, was den Kettenabbruch verursacht. Falsche oder Hintergrundabbrüche, werden, wenn sie auftreten, nicht durch das Fluoreszenznachweisgerät nachgewiesen. Es gibt zwei Nachteile bei diesen Methoden. Einer besteht darin, daß die mit Farbstoff markierten Didesoxynucleosidtriphosphate im allgemeinen nicht so effiziente Substrate für die DNA-Polymerasen sind, wie nicht markierte Didesoxynucleotide. Sie müssen in relativ hohen Konzentrationen verwendet werden und ihre Reaktionsraten variieren je nach der lokalen Sequenzumgebung, was viel weniger gleichmäßige Banden-(oder Peak-)intensitäten entstehen läßt, als bei nicht markierten Nucleotiden. Der zweite besteht darin, daß die zum Nachweis von mit fluoreszierender Markierung versehener DNA verwendete Ausstattung kompliziert und teuer ist, verglichen mit der Ausstattung, die für den traditionellen autoradiographischen Nachweis erforderlich ist.
Die Erfindung liefert die Vorteile, daß man die nachweisbare Markierung an dem kettenabbrechenden Nucleotid anbringen kann, ohne die Nachteile einer teuren Nachweiseinrichtung oder einer verminderten Aktivität mit DNA-Polymerase. Dies geschieht, indem die kettenabbrechenden Nucleotide mit radioaktiven Isotopen markiert werden, insbesondere Schwefel oder Phosphor. Dies erfordert die effiziente Herstellung aller vier markierten Didesoxynucleosidtriphosphate und erfordert auch ein nacharbeitbares Verfahren, um sie zu verwenden.
Die ursprüngliche DNA-Polymerase, die für die kettenabbrechende Sequenzierung verwendet wurde (das große Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I oder Klenow-Enzym) verwertet die Didesoxynucleotide relativ ineffizient. Die meisten Sequenzierungsmethoden unter Verwendung dieser Polymerase erfordern die Verwendung von Didesoxynucleotiden in Konzentrationen, die bis zum 50- oder 100-fachen größer sind als die Konzentration des entsprechenden Desoxynucleotids. Ausgedrückt als Konzentrationsverhältnis ist ddNTP : dNTP bis zu 100 : 1. Die typische minimale Menge an dNTP für die praktische Sequenzie rung liegt im Bereich von jeweils 30 umol, um eine Verlängerung von 0,5 umol geprimter Matrize mit durchschnittlich 240 Basen zuzulassen. Somit können 3000 umol ddNTP erforderlich sein zur Sequenzierung mit Klenow-Polymerase. Die minimale spezifische Radioaktivität zum Nachweis von Extensionsprodukten von 0,5 umol Matrizen-DNA mit Röntgenfilm und Übernacht- Belichtung ist ungefähr 500 Ci/mol. Während dies für normale Sequenzierungsmethoden mit nicht markierten ddNTPs durchführbar ist, machen die hohen Mengen, die erforderlich sind, eine Sequenzierung mit ddNTPs und dieser Polymerase zu teuer, verschwenderisch und gefährlich, da 1,5 mCi pro Sequenzbahn erforderlich sind.
Ein Hauptmerkmal des neuen Sequenzierungsverfahrens ist die Verwendung einer DNA-Polymerase, die Didesoxynucleosidtriphosphate effizient verwendet, so daß das Konzentrationsverhältnis (und damit die erforderliche Menge) auf praktische Werte vermindert wird. Eine solche Polymerase ist die modifizierte T7-DNA-Polymerase, wenn sie in Gegenwart von Mn²&spplus; verwendet wird (Tabor und Richardson, J. Biol. Chem. 264, 6447 bis 6458). Mit dieser Polymerase reagieren Didesoxynucleosidtriphosphate fast so effizient wie Desoxynucleosidtriphosphate, was die Verwendung eines Konzentrationsverhältnisses von ddNTP : dNTP von 1 : 100 zuläßt. Dieses Verhältnis ist 10 000 Mal günstiger für die effiziente Verwendung von Didesoxynucleotiden, als das Verhältnis für die Klenow-Polymerase. Mit dieser Polymerase und den Mengen an Matrize, wie oben ausgeführt, sind nur 0,3 umol oder 0,15 uCi an markiertem Didesoxynucleosidtriphosphat für jede Bahn des Sequenzierungsversuchs erforderlich. Diese Menge kann leicht ökonomisch und sicher verwendet werden. Andere DNA-Polymeraseenzyme, die die Didesoxynucleosidtriphosphate effizient verwenden, können auch für dieses Sequenzierungsverfahren verwendet werden.
Ein weiterer Nutzen bei der Verwendung von modifizierter T7- DNA-Polymerase und Mn²&spplus; ist die gleichmäßige Bandenintensität, die erhalten wird. Dies macht die Interpretation des Sequenzierungsversuchs genauer.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
T4-Polynucleotidkinase = 5'-Dephosphopolynucleotid-5'-phosphotransferase EC 2.7.1.78
Polynucleotidkinase, 3'-phosphatesefrei = 5'-Dephosphopolynucleotid-5'-phosphotransferase EC 2.7.1.78 - aus mit T4 am N81 pse T1-Phagen infiziertem E. coli BB

Beispiel 1

Jeweils 3,5 umol 2',3'-Didesoxynucleosid (alle vier Basen) wurden einzeln mit 50 Einheiten von 3'-phosphatasefreier PNK und 5 nmol [γ-³²P]ATP in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM DTT und 30 mM Mg-Acetat, 150 mM NaCl, 0,1 mM Sperrain und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Die endgültigen Reaktionsvolumina waren 100 ul und die Ansätze wurden bei 18ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DC-Analyse auf PEI- Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Tabelle 1 zeigt die Umwandlungen von [³²P]ddNPMs mit der Zeit. Tabelle 1
Das DC-System wurde kalibriert unter Verwendung von ³²PO&sub4;, [³²P]ddAMP (chemisch hergestellt) und 5'-dAMP als Marker. Dies ermöglichte, daß die DC-Platten interpretiert werden konnten und die Peaks, die unter Verwendung eines β-Teilchen- Scanners erhalten wurden, identifiziert werden konnten.

Beispiel 2

Die [³²P]ddNMP-Produkte von Beispiel 1 wurden in größerem Maßstab synthetisiert.
Jeweils 35 umol 2',3'-Didesoxynucleosid (alle vier Basen) wurden einzeln mit 500 Einheiten 3'-phosphatasefreier PNK und 75 mCi (25 nmol) [γ-³²P]ATP in einem Puffer, der 50 mM Tris- HCl, pH 7,5, 2,5 mM DTT, 30 mM Mg-Acetat, 150 mM NaCl, 0,1 mM Sperrain und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Die endgültigen Reaktionsvolumina waren 2 ml und die Ansätze wurden bei 18ºC 2 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DC- Analyse auf PEI-Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Nach 2 Stunden wurden die Reaktionen gestoppt durch Zugabe von 2 ml absolutem Ethanol. Nach Filtration wurden die Ansätze mit HPLC-Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die DC- Analyse der gereinigten Monophosphate zeigte, daß das [³²P]ddAMP etwas anorganisches ³²PO&sub4; enthielt. Die anderen drei Monophosphate hatten alle eine Reinheit von mehr als 90%. Die Ausbeute der Reaktionen war im gleichen Bereich, wie bei den Tests im kleinen Maßstab in Tabelle 1.
Die [³²P]ddNMPs wurden in die entsprechenden [α-³²P] ddNTPs leicht und effizient mit Standardmethoden umgewandelt.
Nach der Reinigung mit HPLC-Ionenaustauschchromatographie wurden die [α-³²P]ddNTPs wieder mit ungefähr 4 mCi/ml in wäßriger Lösung suspendiert. Die endgültigen Ausbeuten an [γ-³²P]ATP waren:
ddATP 48%
ddCTP 46%
ddGTP 15%
ddTTP 24%
Es wurden Proben zur Identifikation mit analytischer HPLC gegenüber den jeweiligen nicht radioaktiven ddNTP-Markern und zur Verwendung für die DNA-Sequenzierung entnommen. Die Ergebnisse zeigten, daß bei allen vier ddNTPs das radioaktiv markierte [α-³²P]ddNTP und das nicht radioaktive ddNTP aus der HPLC-Säule exakt zur gleichen Zeit eluierten. Auch wurde in Abwesenheit anderer Kettenabbruchmittel oder radioaktiver Markierungen außer den oben synthetisierten die Sequenz einer M13-Matrize erfolgreich bestimmt, verglichen mit der Sequenz, die unter Verwendung einer inneren [α-³&sup5;S]dATP-Markierung und von nicht radioaktiven ddNTPs erzeugt wurde.
Dies beweist, daß [α-³²P]ddNTPs hergestellt wurden und daß PNK unter diesen Bedingungen 2',3'-Didesoxynucleoside phosphorylieren kann.

Beispiel 3: Phosphotransferase aus Gerstensamen

0,5 umol Uridin-5'-monophosphat (5'-UMP) wurde jeweils einzeln mit 0,5 umol 2',3'-Didesoxynucleosid (außer 2',3'-ddG, bei dem 0,15 umol 5'-UMP und 2',3'-ddG aufgrund von Löslichkeitsproblemen verwendet wurden, wobei 2',3'-ddG immer noch in einem Molverhältnis von 1 : 1 war) und 10 ul Phosphotransferase aus Gerstensamen (1,3 Einheiten/ml) in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM MgCl&sub2; und 0,002% Triton 100 vermischt. Das endgültige Reaktionsvolumen war 50 ul und der Ansatz wurde 4 Stunden lang bei 25ºC inkubiert. Proben mit 15 ul wurden zur Analyse mit Ionenaustauschchromatographie entnommen, die Proben wurden mit Wasser vor der Beladung auf 120 ul gebracht. Die Analyse mit diesem Verfahren zeigte, daß für alle vier Basen 2',3'-Didesoxynucleosid-5'-monophosphate erfolgreich hergestellt worden waren.
Ein zweiter Versuch, diesmal unter Verwendung von 5'-UMP, das mit [³²P]5'-UMP versetzt war, unter den gleichen Bedingungen, wie oben, außer, daß ein Molverhältnis von 5'-UMP:2',3'- Didesoxyadenosin von 24 : 1 verwendet wurde, ergaben einen radioaktiv markierten Peak von 2',3'-Didesoxyadenosin-5'-monophosphat bei einem analytischen HPLC-System, der exakt mit dem übereinstimmte, der mit dem PNK-Verfahren erzeugt wurde. Das HPLC-System wurde kalibriert unter Verwendung einer Mischung aus nicht radioaktivem 5'-UMP und 5'-dAMP (ddAMP im Handel nicht erhältlich). Es zeigte sich, daß diese durch das System gut getrennt wurden, wobei das 5'-dAMP etwas langsamer lief als das [³²P]-2',3'-Didesoxyadenosin-5'-monophosphat, was bei einem Ionenaustauschsystem zu erwarten ist aufgrund der 3'-OH-Gruppe. Als diese Reaktion bei pH 5,0 in 50 mM Natriumacetatpuffer wiederholt wurde, zeigte die HPLC-Analyse einen sehr schnell laufenden radioaktiv markierten Peak, der als anorganisches Phosphat identifiziert wurde. Dies zeigte, daß die Reaktion pH-abhängig ist. Die Zugabe hoher Konzentrationen an Salz kann auch nützlich sein und die Ausbeute an Monophosphat fördern, indem die Erzeugung von anorganischem Phosphat gehemmt wird.

Beispiel 4: Sequenzierungsprotokoll

Die Sequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Sequenase-Kits, Version 2.0 von US Biochemical Co., Cleveland, Ohio.
1 ul (0,5 umol) Primer, 2 ul Reaktionspuffer, 5 ul (1 ug) Kontrollmatrize und 2 ul Wasser wurden in einem sauberen sterilen Fläschchen vermischt. Dieses wurde 2 Minuten lang auf 65ºC erhitzt und dann langsam auf 30ºC gekühlt. Es wurde 1 ul einer DTT-(0,1 M)-Lösung, 2 ul Extensionsmarkierungsmischung (verdünnt 1 : 5), 1 ul Mn²&spplus;-Puffer, 2 ul Sequenase DNA- Polymerase (verdünnt 1 : 8) und 0,5 ul Wasser (dies wurde durch 0,5 ul [α-³&sup5;S]dATP bei der intern markierten Kontrolle ersetzt, es wurde auch die Standard-Kettenabbruchmischung verwendet und nicht die unten aufgeführte) zugegeben. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur 5 Minuten lang stehengelassen. 1 ul einer Mischung aller vier dNTPs (entweder 30 umolare oder 480 umolare Lösung), 1 ul der entsprechenden [α-³²P]ddATP-Verdünnung (die einen Bereich an Verdünnungen der spezifischen Aktivität mit variierendem chemischen Gehalt von 0,3, 4,8 oder 48 umol enthielt. Das ddNTP:dNTP-Verhältnis variierte von 1 : 10 bis 1 : 100) und 0,5 ul Wasser wurden zu 3,5 ul der obigen Lösung zugegeben. Diese Mischung wurde 5 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und dann wurden 4 ul Abbruchfarbstoff zu jedem Reaktionsröhrchen zugegeben. Alle Reaktionsröhrchen wurden 5 Minuten lang auf 70 bis 80ºC erhitzt. 4 ul aus jedem Ansatz wurden auf ein Standard-6%-Polyacrylamid- Sequenziergel gegeben, das 40 Minuten lang vorlauten gelassen worden war. Das Gel wurde mit 45 mA betrieben, bis der erste Farbstoff von dem Gel heruntergelaufen war, ungefähr 2 Stunden. Das Gel wurde dann vor der Belichtung des Amersham Hyperfilm MP über Nacht getrocknet. Die Ergebnisse zeigten eine stark verbesserte Sequenzierspur mit wenig Hintergrund und gleichmäßigen Bandenintensitäten.

Beispiel 5: Phosphorylierung von 2'-Desoxyadenosin

0,3 mg 2'-Desoxyadenosin wurden mit 30 Einheiten T4-PNK und 8 nmol [γ-³²P]ATP in 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM DTT und 14 mM MgCl&sub2; vermischt. Das endgültige Reaktionsvolumen war 100 ul und der Ansatz wurde bei 24ºC inkubiert. Die Reaktion wurde unter Verwendung des gleichen DC-Systems, wie in Beispiel 1, verfolgt.
Die Ergebnisse zeigten, daß der Einbau von [³²P]-5'dAMP wie folgt war:
Zeit 45 Minuten = 4%
Zeit 240 Minuten = 15%
über Nacht = 44%

Beispiel 6: Thiophosphorylierung

3,5 umol 2',3'-Didesoxyadenosin, Adenosin und 2'-Desoxyadenosin wurden einzeln mit 150 Einheiten 3'-phosphatasefreier PNK und 85 umol [γ-³&sup5;S]ATP in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM DTT, 20 mM Mg-Acetat, 0,1 mM Spermin und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Die endgültigen Reaktionsvolumina waren 100 ul und die Ansätze wurden bei 18ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DC-Analyse auf PEI- Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Nach 21 Stunden Inkubation enthielten die Ansätze:
8,3% Adenosin-5'-monothiophosphat [³&sup5;S]
11,2% 2'-Desoxyadenosin-5'-monothiophosphat [³&sup5;S]
2,8% 2',3'-Didesoxyadenosin-5'-monothiophosphat [³&sup5;S]

Beispiel 7: Modifizierte Zucker

3,5 umol 3'-Azidothymidin wurden mit 50 Einheiten 3'-phosphatasefreier PNK und 5 nmol [γ-³²P]ATP in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM DTT, 20 mM Mg-Acetat, 0,1 mM Sperrain und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Das endgültige Reaktionsvolumen war 100 ul und der Ansatz wurde bei 18ºC inkubiert. Die Reaktion wurde mit DC-Analyse auf PEI- Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Nach 3-stündiger Inkubation enthielt der Ansatz 22% 3'-Azidothymidin-5'-monophosphat [³²P].

Beispiel 8: Modifikation der Base

3,5 umol 7-Deazaadenosin (Tubercidin), 3-Nitropyrolnucleosid und 5-Nitroindolnucleosid (siehe D. Loakes und D. M. Brown, NAR, 1994, Band 22, Nr. 20, Seiten 4039 bis 4043) wurden einzeln mit 50 Einheiten 3'-phosphatefreier PNR und 5 nmol [γ-³²P]ATP in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM DTT, 20 mM Mg-Acetat und 0,1 mM Sperrain und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Die endgültigen Reaktionsvolumina waren 100 ul und die Ansätze wurden bei 18ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DC-Analyse auf PEI-Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Nach 3-stündiger Inkubation wurden weitere Peaks auf dem DC- Scan beobachtet. Diese beruhten wahrscheinlich auf dem Substrat, da sie ohne Substrat nicht gesehen wurden.
63,0% 7-Deazaadenosin-5'-monophosphat [³²P]*
16,1% 3-Nitropyrolnucleosid-5'-monophosphat [³²P]*
23,9% 5-Nitroindolnucleosid-5'-monophosphat [³²P]*
* Diese Produkte waren nur in Gegenwart des Substrats zu sehen und nicht bei Kontrollexperimenten ohne Substrat.

Beispiel 9

Jeweils 3,5 umol 2',3'-Didesoxynucleosid (alle vier Basen) wurden einzeln mit 1000 Einheiten 3'-phosphatasefreier PNK und 60 bis 100 mCi [γ-³³P]ATP (~ 3000 Ci/mmol) in einem Puffer, der 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 2,5 mM DTT, 20 mM Mg-Acetat, 150 mM NaCl, 0,1 mM Sperrain und 0,5 mM NH&sub4;Cl enthielt, vermischt. Die endgültigen Reaktionsvolumina waren 2 ml und die Ansätze wurden bei 18ºC 2 bis 6 Stunden lang inkubiert. Die Reaktionen wurden mit DC-Analyse auf PEI-Celluloseplatten, die mit 0,5 M LiCl und 1 M Ameisensäure entwickelt wurden, verfolgt.
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 2 ml absolutem Ethanol gestoppt. Nach Filtration wurden die Ansätze mit HPLC- Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Die DC-Analyse der gereinigten Monophosphate zeigte, daß [³³P]ddAMP etwas anorganisches ³³PO&sub4; enthielt. Die anderen drei Monophosphate hatten alle eine Reinheit von mehr als 90%. Die Ausbeuten der Reaktionen waren im gleichen Bereich, wie bei den Versuchen in geringerem Maßstab von Tabelle 1.
Die [³³P] ddNMPs wurden in die entsprechenden [α-³³P] ddNTPs leicht und effizient mit Standardmethoden umgewandelt.
Nach der Reinigung mit HPLC-Ionenaustauschchromatographie wurden die [α-³³P]ddNTPs wieder mit ~ 4 mCi/ml in wäßriger Lösung suspendiert. Die endgültige Ausbeute an [γ-³³P]ATP war:
ddATP 40%
ddCTP 30%
ddGTP 20%
ddTTP 16%
Es wurden Proben zur Identifizierung mit analytischer HPLC entnommen gegen die entsprechenden nicht radioaktiven ddNTP- Marker und zur Verwendung in der DNA-Sequenzierung. Die Ergebnisse zeigten, daß bei allen ddNTPs das radioaktiv markierte [α-³³P]ddNTP und das nicht radioaktive ddNTP aus der HPLC-Säule exakt zur gleichen Zeit eluierten.

Beispiel 10: Sequenzierung von DNA

unter Verwendung der in den Beispielen 1 bis 3 ausgeführten Methoden wurden [α-³²P] ddGTP, [α-³²P] ddATP, [α-³²P] ddTTP und [α-³²P]ddCTP mit einer spezifischen Aktivität von ungefähr 2000 Ci/mmol und einer Konzentration von 0,5 uM hergestellt. Diese wurden auf folgende Weise verwendet, um die Basensequenz von M13mp18-DNA zu bestimmen. Viele der hier beschriebenen Reagenzien finden sich in den von US Biochemical Co., Cleveland, Ohio hergestellten Sequenase DNA-Sequenzierkits.
Vier Nucleotidabbruchmischungen wurden hergestellt, indem 2 ul von 15 uM dATP, dTTP, dCTP, dGTP und 100 mM NaCl mit 0,6 ul (enthaltend 0,3 umol) jeder der radioaktiv markierten ddNTP-Lösungen vermischt wurden.
Matrizen-DNA (M13mp18, 1,0 ug in 5 ul) wurde mit 0,5 umol (1 ul) eines M13 "-40" 23-mer Oligonucleotidprimers, 1 ul MOPS- Puffer (400 mM Morpholinopropansulfonsäure-NaOH, pH 7,5, 500 mM NaCl, 100 mM MgCl&sub2;, 1 ul Mn-Puffer, 50 mM MnCl&sub2;, 150 mM Isocitrat, Natriumsalz) und 2 ul Wasser für ein Gesamtvolumen von 10 ul vermischt. Diese Mischung wurde 10 Minuten: lang auf 37ºC erwärmt, um den Primer und die Matrize zu hybridisieren. Die Mischung wurde auf Eis gekühlt und 1 ul 0,1 M Dithiothreitol und 2 ul Polymerasemischung (1,6 Einheiten/ul Sequenase Version 2.0 T7-DNA-Polymerase (US Biochemical Corp.), 2,0 Einheiten/ml anorganische Pyrophosphatase, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 2 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 50% Glycerin) zugegeben und gut gemischt. Dann wurde ein Anteil von 3 ul dieser DNA und der Polymerasemischung mit den oben beschriebenen vorgewärmten (auf 37ºC) Kettenabbruchmischungen (2,6 ul) vermischt. Die Mischungen wurden 10 Minuten lang bei 37ºC inkubieren ge lassen und dann wurden 4 ml Abbruchlösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenolblau, 0,05% Xylol Cyanol FF) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
Die Mischungen wurden kurz erhitzt und auf ein denaturierendes Polyacrylamid-Elektrophoresegel aufgetragen, das mit Tris-Taurin-EDTA-Puffer (US 5 134 595, D. Pisa-Williamson und C. W. Fuller (1992) Comments 19, 29 bis 36) gepuffert war. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Standardverfahren getrocknet und ein Film über Nacht belichtet. Das entstehende DNA-Sequenzierungsautoradiogramm war ungewöhnlich frei von Hintergrundrauschen und zeigte eindeutig die Identität des ersten Nucleotids, das am 3'-Ende des Primers angefügt worden war und hatte gleichmäßige Bandenintensitäten.

Beispiel 11: Sequenzierung unter Verwendung von dITP, um Kompressionsartefakte zu eliminieren

Kompressionsartefakte treten auf, wenn die auf einem Sequenzierelektrophoresegel zu trennende DNA nicht vollständig denaturiert ist. Nucleotidanaloga, wie dITP (Desoxyinosintriphosphat), die dGTP in den Sequenzierungsreaktionen ersetzen, können Kompressionsartefakte eliminieren (S. Tabor und C. C. Richardson (1987) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 84, 4767 bis 4771). Die Sequenzierungsreaktionen wurden exakt, wie in Beispiel 10 beschrieben, durchgeführt, außer daß die vier Nucleotidabbruchmischungen hergestellt wurden, indem 2 ul 75 uM dITP, 15 uM dATP, dTTP, dCTP und 100 mM NaCl mit 0,6 ul (enthaltend 0,3 umol) jeder der radioaktiv markierten ddNTP- Lösungen vermischt wurden. Die Sequenzierung der M13mp18- Matrizen-DNA erfolgte unter Verwendung eines anderen Primers, der ausgewählt wurde, um einen Bereich zu sequenzieren, der anfällig ist für Kompressionsartefakte. Wenn die dITP-haltige Mischung verwendet wurde, wurden keine Kompressionsartefakte beobachtet, während Kontrollsequenzen, die mit dGTP-Mischungen durchgeführt wurden, komprimierte, nicht lesbare Regionen aufwiesen.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Nucleotids oder Nucleotidanalogs oder Nucleotidaddukts mit einer 5'-Phosphat- oder 5'-Thiophosphatgruppe, wobei das Verfahren umfaßt, daß man ein Ausgangsnucleosid oder Nucleosidanalog oder Nucleosidaddukt mit einer 5'-OH-Gruppe aber keiner 3'- Phosphatgruppe mit einem Nucleotidphosphat- oder -thiophosphatdonator in Gegenwart eines Enzyms, das die Reaktion katalysiert, umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Nucleotidphosphat- oder -thiophosphatdonator mit ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S radioaktiv markiert ist, wodurch das erhaltene Nucleotid oder Nucleotidanalog oder Nucleotidaddukt radioaktiv markiert ist, da es eine 5'-Phosphat- oder 5'-Thiophosphatgruppe aufweist, die ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Ausgangsnucleosidanalog ein 2',3'-Didesoxynucleosid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Ausgangsnucleosidanalog ein 3'-Fluor-, 3'-Amino- oder 3'-Azidonucleosid oder PNA oder ein Antisense-Oligonucleotid ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym eine Polynucleotidkinase ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Reaktion bei 4 bis 30ºC und pH 4 bis 9 durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der Nucleotidphosphat- oder Thiophosphatdonator [γ-³²P]ATP oder [γ-³&sup5;S]ATP oder [γ-³³P]ATP ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin ein 2',3'-Didesoxynucleosid mit [γ-³²P]ATP umgesetzt wird, um ein 5'-³²P-Nucleosidphosphat herzustellen.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das 5'-³²P-Nucleosidmonophosphat anschließend in das Di- oder Triphosphat umgewandelt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das Enzym ein Phosphotransferaseenzym ist, das aus Gerstensamen stammt.

11. Kit zur Sequenzierung von Nucleinsäuren, wobei der Kit einen Vorrat für jedes der vier kettenabbrechenden Nucleotide oder Nucleotidanaloga, die mit einem Radioisotop markiert sind, und auch einen Vorrat für ein Polymeraseenzym und einen Vorrat für jedes der vier dNTPs umfaßt oder enthält.

12. Kit nach Anspruch 11, worin die kettenabbrechenden Nucleotidanaloga Didesoxynucleotide sind.

13. Kit nach Anspruch 11 oder Anspruch 12, worin jedes der vier kettenabbrechenden Nucleotidanaloga mit ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S markiert ist.

14. Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 13, worin das Polymeraseenzym eine T7-DNA-Polymerase ist und der Kit auch einen Mn²&spplus;-haltigen Puffer enthält.

15. Verfahren zur Sequenzierung einer Nucleinsäure mit Kettenabbruchtechnik, wobei das Verfahren umfaßt, daß man eine matrizengerichtete enzymatische Synthese unter Verwendung jedes der vier verschiedenen Nucleotide oder Nucleotidanaloga, die mit einem Radioisotop markiert sind, als Kettenabbruchmittel verwendet und Produkte der enzymatischen Synthese mit Hilfe des Radioisotops nachweist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die enzymatische Synthesereaktion unter Verwendung eines T7-DNA-Polymeraseenzyms in Gegenwart aller vier dNTPs und des markierten kettenabbrechenden Nucleotids oder Nucleotidanalogs in einem Mn²&spplus;-haltigen Puffer durchgeführt wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder Anspruch 16, worin das Radioisotop ³²P oder ³³P oder ³&sup5;S ist.

18. ddCTP und ddGTP und ddTTP, die radioaktiv mit ³³P markiert sind.

19. ddCTP und ddGTP und ddTTP nach Anspruch 18, worin die radioaktive Markierung in einer α-Phosphatgruppe vorhanden ist.