DE3328937T1

DE3328937T1 - Verfahren zur Herstellung definierter Polyribonukleotide

Info

Publication number: DE3328937T1
Application number: DE19833328937
Authority: DE
Inventors: Hiroaki South Pasadena Calif. Shizuya
Original assignee: Innovax Laboratories, Ltd., Beverly Hills, Calif.
Priority date: 1982-02-01
Filing date: 1983-01-25
Publication date: 1984-10-18
Also published as: GB8324625D0; GB2123428A; EP0100353A1; WO1983002626A1; AU1334983A; FR2522682A1; GB2123428B; JPS59500081A

Description

-Ji -

Verfahren zur Herstellung definierter Polyribonukleotide

Die Herstellung eines Proteins mit Hilfe gentechnischer Methoden umfaßt drei generelle Verfahrensstufen: Der erste Schritt besteht in der Synthese oder in der Isolierung und Reinigung des gewünschten Gens, welches für ein bestimmtes Protein kodiert. Der zweite Schritt besteht in der Rekombination des Gens mit einem geeigneten Transfer-Vektor, z. B. einem Plasmid. Der dritte Schritt besteht in einer Übertragung des rekombinierten Vektors in einen bestimmten Mikroorganismus sowie darin, den Mikroorganismus zu veranlassen, das bestimmte Genprodukt zu produzieren.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Methode zur Durchführung der ersten Verfahrensstufe. Die gegenwärtig übliche Methodik zur in vitro Synthese von Genen durch sequentielles Aneinanderfügen von Nukleotiden umfaßt chemische Verfahren (Itakura, K. und Riggs, A., Science 109:1401 (1980), (Khorana, H.G., Science 203:614 (1979), enzymatische Verfahren (S. Gillam, P. Jahnke, C. Astell, S. Phillips, CA. Hutchinson, M. Smith, Nucelic Acids Res. 6,2973 (1979)) und "solid phase" Methoden, um gewünschte DNA oder RNA Moleküle zu produzieren. Die chemischen Verfahren sind langwierig, da die involvierten Reaktionen unspezifisch verlaufen, so daß nach jedem Syntheseschritt, eine aufwendige Reinigung des gewünschten Produkts erforderlich ist. Die Synthese von RNA und DNA mit Hilfe chemischer Methoden ist wesentlich ungünstiger als die Durchführung der Synthese mit enzymatischen Verfahren, da größere Mengen von Ausgangsmaterial eingesetzt werden müssen, um vergleichbare Ausbeuten zu erzielen. Die Kosten steigen hierdurch an. Die Reinigungsschritte sind zeitaufwendig und führen zu Verlusten von Produkt bei jedem Verfahrensschritt. Die große Zahl von Verfahrensschritten, die sich aufgrund der Blockierung und Deblockierung reaktiver

Dr.E/Z/Bu

Stellen ergibt, birgt zahlreiche Fehlermöglichkeiten sowie das Risiko einer Kontamination durch abbauende Enzyme in sich, welche das synthetisierte Produkt zerstören.

Über die enzymatische Synthese von RNA mit Hilfe von Polynukleotid-Phosphorylase und T4-RNA-Ligase ist berichtet worden. Die Polynukleotid-Phosphorylase-Methode ist beschränkt auf die Herstellung von Oligodeoxynukleotlden. Polynukleotid-Phosphorylase verknüpft unter kontrollierten Bedingungen ein einzelnes Nukleotid mit einem kurzen Oligodeoxynukleotid, welches dann mit Hilfe chromatographischer Methoden isoliert wird. Bei den "solid phase"-Methoden wird die Nukleotidkette an ein festes Trägermaterial gebunden; mit Hilfe der oben erwähnten chemischen Verfahren werden dann die Nukleotide schrittweise angefügt.

Die vorliegende Erfindung beschreibt das Mittel und Verfahren zur Herstellung einer Verbindung, die bei der Synthese einer definierten RNA-Sequenz mit Hilfe des Enzyms TA-RNA-Ligase von Nutzen ist. Verfahren zum "Umschreiben" der synthetisierten RNA in DNA sind im Stande der Technik bekannt; das synthetisierte Gen kann dann in ein Plasmid inkorporiert, in einen Mikroorganismus eingefügt und exprimiert werden.

Die Existenz, Reinigung und Wirkungsweise des Enzyms T4-RNA-Ligase, das aus mit T4-Bakteriophagen infizierten Escherichiacoli-Bakterien isoliert wird, ist beschrieben worden [Silber, R., Malathi, V.G. & Hurwitz, J., Proc. Natl. Acad. Sei. (1972) 69:3009]. Das Enzym katalysiert die Bildung einer Phosphodiester-Bindung zwischen der Phosphatgruppe am 5'-Ende eines Donor-Nukleotids und der Hydroxylgruppe am 3'-Ende eines Akzeptor-Oligonukleotids:

RNA H A-OH + H₂O PO-- LIQASE^ ΟΡΟ--- + H₂O

¹OH Die japanische Patent-Anmeldung 1980-19003 (veröffentlicht am

9.2.1980) beschreibt die Verwendung von TA-RNA-Ligase zur Verlängerung eines Polynukleotids durch Anfügung eines einzelnen Mononukleosid-Diphosphat.s (pNp) an das 3'-Ende einer Nukleotid-Sequenz ohne terminale Phosphatgruppen. Bei diesem Verfahren wird als Start-Substrat ein Trinukleotid benötigt, welches entweder käuflich erworben oder chemisch synthetisiert werden muß und Adenosin-Triphosphat (ATP) als Energiequelle für die Reaktion erfordert. Außerdem beinhaltet die Erfindung nur die Anfügung einer einzelnen Base. Die Herstellung von Oligo- oder Polynukleotiden, bei der eine sequentielle Verlängerung der Nukleotidkette erforderlich ist, ist damit nicht möglich.

HO-ApApA-OH + pCp + ATP ^ HO-ApApApCp + AMP + PPi

Die Abkürzungen, die bei dieser Anmeldung verwendet werden, sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

TABELLE 1

Abkürzung

N,X,Y,Z

Definition

Adenosin

Cytosin

Guanosin

Uridin

irgendein Ribonukleotid

Deoxyribonukleinsaure Ribonukleinsäure

bakterielle alkalische Phosphatase Venom-Phosphodiesterase

Cl 51 7 1

A ρ pN ρ (siehe Text für weitere Erklärung)

2¹ - 3' cyclischer Phosphodiester

Mikroliter

Nanometer

Triethylammonium-Bikarbonat-Puffer

DTT DL-Dithiothreitol (Cleland's Reagenz)

PNK Polynukleotid Kinase

nbzl o-Nitrobenzylgruppe

pnbzl o-Nitrobenzylphosphatgruppe

UV Ultraviolett-Licht

MOPS 3- [N-Morpholinö] -propansulfonsäure

HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure

Die hier beschriebene Erfindung beinhaltet die Synthese biologisch aktiver RNA- und DNA-Moleküle. Alle Nukleotid-Sequenzen werden durch die in Tabelle 1 angegebenen Abkürzungen bezeichnet. Alle Phosphodiester-Verknüpfungen zwischen Nukleotiden sind - wenn nicht anders angegeben - 3' —5' .

Die Erfindung beinhaltet Verfahren zur Herstellung von einzelstrangigen RNA-Molekülen mit definierter Basensequenz unter Verwendung des Enzyms T4-RNA-Ligase, welches spezifisch ein Mono-, Di-, Oligo- oder Polynukleotid (Donor) auf das 3'-Ende einer aus 2 oder mehr Basen bestehenden Ribonukleotidsequenz (Akzeptor) unter Ausbildung einer 5 '-3'-Verknüpfung überträgt. Der kürzeste Akzeptor, auf den die TA-RNA-Ligase katalytisch einwirkt, ist ein Dinukleotid, das in der 5¹-Position phosphoryliert ist. Ist der Akzeptor ein Trinukleotid oder länger, so kann das 5'-Ende entweder phosphoryliert oder hydroxyliert sein, damit eine spezifische Addition des Donors an das 3'-Ende des Akzeptors erfolgt. Entsprechend der Methode zur Anfügung einer einzelnen Base an das Ende eines Akzeptors - das Ausgangsmaterial für den Akzeptor ist hierbei ein Dinukleotid, das entweder käuflich erworben oder nach bekannten Methoden chemisch synthetisiert wird - besteht der erste Schritt in einer Phosphorylierung des freien 5'-Endes. Dieser Schritt wird in der Weise durchgeführt, daß das Dinukleotid mit ATP in Gegenwart des Enzyms Polynukleotid-Kinase (PNK) inkubiert wird (Richardson, CC, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 54, 158 (1965)). Dieses Enzym phosphoryliert in spezifischer Weise das 5'-Ende des Nukleotids wie in Gleichung 1

(ο

dargestellt. Ist der Akzeptor ein Trinukleotid oder länger, so ist dieser Phosphorylierungsschritt nicht erforderlich.

□ MI/

(1) , HO-XpY-OH + ATP ----—-> pXpY-OH + ADP

Der zweite Schritt besteht darin, das den Akzeptor darstellen-

1 2

de Dinukleotid mit der chemischen Verbindung ρ -Adenosin-p (3 ' -nukleotidmonophosphat )-5'-pyrophosphat der Form (AppNp) zu mischen; N steht hier für ein Ribonukleotid aus der Gruppe Adenin, Cytosin, Guanin, Uracil und Inosin. Die'Verbindung AppNp und ihre Herstellung wird in der beiliegenden Anmeldung beschrieben. Die Reaktion des bekannten Akzeptor-Ribonukleotids mit AppNp in Gegenwart von RNA-Ligase ergibt ein Nukleotid wie in Gleichung 2 dargestellt. Die Reaktion erfordert kein ATP als Energiequelle.

(2) pXpY-OH + AppNp ^Ligase^ pXpY-Np + pA

Die hier beschriebene Erfindung umfaßt auch ein Verfahren, ein aus 2 oder mehr Basen bestehendes Donor-RNA-Molekül in der Weise an ein Akzeptor-Ribonukleotid zu addieren, daß die 5'-Phosphatgruppe des Donors in Gegenwart von ATP und RNA-Ligase spezifisch an der 3■-Hydroxylgruppe des Akzeptors bindet, wobei ein verlängertes Ribonukleotid entsteht (Gleichung 3). Die Phosphatgruppe am 3'-Ende des Donormoleküls bewirkt, daß diese Position gegenüber der RNA-Ligase nicht reaktiv ist, so daß eine weitere Addition von Donor-Molekülen verhindert wird. Stellt der Akzeptor ein Dinukleotid dar, so muß auch bei diesem Verfahren das 5'-Ende phosphoryliert werden; bei Tri- oder längeren Nukleotiden ist dagegen eine Phosphorylierung nicht erforderlich (Gleichung A)

(3 ) pXpY-OH ₊ pYpZp RNA-Ligase^ _ρΧρΥργ_ρΖρ

(4) pXpY-OH + Ap-pnbzl -^R-^N-^A—^LA9.^a_^s_^ pXpYp-nbzl

Um das 3'-Ende des Donor-Moleküls zu phosphorylieren, wird das am 5'-Ende phosphorylierte Dinukleotid mit der Verbindung Appnbzl in Gegenwart von RNA-Ligase zur Reaktion gebracht (Gleichung A). Der nbzl-Rest kann durch Einwirkung von starkem Licht vom gebildeten Nukleotid abgespalten werden (Gleichung 5).

(5) pXpYp-nbzl -—-^ pXpYp + nbzl

Das gebildete verlängerte Ribonukleotid kann dann mit bakte rieller alkalischer Phostphatase (BAP) behandelt werden; hierbei werden die terminalen Phosphatgruppen abgespalten, wobei ein Produkt entsteht, das als Akzeptor wirkt. Das verlängerte Ribonukleotid kann aber auch mit Polynukleotid Kinase (PNK) behandelt werden, welche in 5'-Position phosphoryliert und damit ein Donor-Molekül entstehen läßt.

nun ,
(6) XpXpXp ₊ pYpZp BNa-UQBSB^ XpXpXpYpZp ^ _{γ z}

Die oben beschriebenen Reaktionen sind Beispiele für eine Reihe von Verfahren zur Herstellung von Nukleotiden. Diese Verfahren können wirksam auch bei Oligonukleotiden sowie bei den in dieser Anmeldung beschriebenen Dinukleotiden angewandt werden. Auf diese Weise können komplette RNA-Moleküle hergestellt werden, die für bestimmte Proteine kodieren.

Bei jeder der im folgenden beschriebenen Reaktionen ist es erforderlich, die Identität der Reaktionsprodukte zu bestimmen. Die Identität der Reaktionsprodukte bei all diesen Beispielen wird durch Berechnung der Quotienten der Absorption bei 250, 260 und 280 nm und Vergleich der Werte mit bekannten Standards bestimmt. Eine Bestimmung der Identität und Reinheit erfolgt auch durch Papierelektrophorese bei pH 5.0 in Natriumcitrat-Puffer und bei pH 2.8 in Ammoniak-Ameisensäure-Puffer (800 V, Laufzeit 1 Stunde).

Beschreibung spezieller Beispiele

Die hier beschriebene Erfindung umfaßt die Verwendung von T4-RNA-Ligase zur Herstellung von Nukleotiden mit definierter Basensequenz. Wie weiter oben allgemein beschrieben, beinhaltet die Erfindung zwei Verfahren. Das eine Verfahren gestattet die Addition eines Donor-Mononukleotids auf ein aus mindestens zwei Basen bestehendes Ribonukleotid. Das andere Verfahren gestattet die Addition von aus zwei oder mehr Basen bestehenden Donor-Nukleotiden. Welches der beiden Verfahren angewandt werden soll, hängt ab von der gewünschten Basensequenz und der Verfügbarkeit kommerziell erhältlicher Nukleotide, die als Ausgangsprodukte dienen. Monoribonukleotid-Additionen

Bei der Synthese eines Trinukleotids mit definierter Basensequenz aus einem bekannten Dinukleotid und einer Verbindung des Typs AppNp ist es zunächst erforderlich, das freie 5'-Ende des Dinukleotids zu phosphorylieren. Dies wird erreicht durch Verwendung des Enzyms Polynukleotid Kinase unter Anwendung der wissenschaftlich bekannten Reaktionsbedingungen.

Nach dem Schritt der Phosphorylierung ist es erforderlich, das phosphorylierte Dinukleotid von den anderen Bestandteilen der Reaktionsmischung abzutrennen und zu isolieren. Dies wird erreicht durch Fraktionierung der Reaktionsmischung und Behandlung der vereinigten Fraktionen, welche das phosphorylierte Dinukleotid enthalten, mit ATPase. Dieses Enzym spaltet Phyrophosphat von ATP ab, welches den "pool" der phosphorylierten Dinukleotide kontaminiert. Danach ist eine Isolierung des phosphorylierten Dinukleotids durch Fraktionierung möglich. Die in Beispiel 1 (s. u.) verwendete ATPase wurde als Nebenprodukt bei der Reinigung der T4-RNA-Ligase erhalten und gereinigt; jede andere ATPase sollte jedoch ebenso wirksam sein.

Das phosphorylierte Dinukleotid oder eine andere Form des

Akzeptor-Nukleotids wird dann mit einer Verbindung des Typs AppNp inkubiert. N steht hier für das Nukleotid, das an das

3'-Ende des Dinukleotids addiert werden soll. Die bevorzugten Reaktionsbedingungen werden bei den Beispielen weiter unten beschrieben.

Das entstandene Nukleotid kann dann mit einer Phosphatase behandelt werden, welche terminale Phosphatgruppen abspaltet und an den 5'- und 3'-Enden Hydroxylgruppen zurückläßt. Die Bedingungen dieser Reaktion hängen von der Art der verwendeten Phosphatase ab und sind wissenschaftlich wohl bekannt. Das mit Phosphatase behandelte Nukleotid wird dann für nachfolgende Additionen vorbereitet, wie weiter unten beschrieben wird.

Additionen von mehr als einem Nukleotid

Die Addition eines aus zwei oder mehr Basen bestehenden Donor-Ribonukleotids auf das 3'-Ende eines Akzeptor-Ribonukleotids kann erreicht werden durch Phosphorylierung des 5'- und 3'-Endes des erwähnten Donors und Inkubation des erwähnten phosphorylierten Donors mit dem erwähnten Akzeptor in Gegenwart von RNA-Ligase und ATP. Das Akzeptor-Ribonukleotid muß bei dieser Reaktion ein am 5'-Ende phosphoryliertes Dinukleotid oder ein Oligonukleotid mit phosphoryliertem oder freiem 5'-Ende sein.

Um das 3'-Ende des Donor-Ribonukleotids zu phosphorylieren, wird das Ribonukleotid mit Appnbzl in Gegenwart von RNA-Ligase inkubiert, wobei der pnbzl-Rest an das 3'-Ende bindet. Zur Inaktivierung der RNA-Ligase wird die Reaktionsmischung gekocht und dann mit ATP und Polynukleotid Kinase inkubiert, wobei das 5'-Ende des Donor-Moleküls phosphoryliert wird.

Der Donor wird isoliert und kann dann starkem Licht, z. B. dem Licht einer 300 Watt Quecksilber-Dampflampe, exponiert werden, um den nbzl-Rest abzuspalten; die 5'- und 3'-Enden des Donors bleiben dabei phosphoryliert zurück. Der Donor kann mit oder ohne Entfernung des nbzl-Restes an den Akzeptor addiert werden.

Nach der Addition des Donor-Ribonukleotids an den Akzeptor kann das gebildete verlängerte Nukleotid mit einer Phosphatase behandelt werden, um alle terminalen Phpsphatgruppen zu entfernen; das Nukleotid wird dadurch in eine Form überführt, in der es als Akzeptor wirken kann. Alternativ kann das Nukleotid mit PNK behandelt werden, wobei das 5'-Ende phosphoryliert wird und das entstehende Nukleotid als Donor verwendet werden kann.

Es sei vorweggenommen, daß alle Reinigungsschritte bei dem hier beschriebenen und bevorzugten Verfahren in einer Fraktionierung mittels DEAE-Sephadex-Säule bestehen; der gleiche Zweck kann aber auch durch Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie, Dünnschicht-Chromatographie, Gel- oder Papierelektrophorese erreicht werden, ohne daß sich dies vom Gegenstand der hier beschriebenen Erfindung entfernt.

BEISPIEL 1 Synthese von ApGpA

Adenyl (3¹ - 5')-Guanosin (ApG) wird in Gegenwart von PoIynukleotid Kinase zunächst mit ATP gemischt, um pApG herzustellen. Die Reaktionsmischung, bestehend aus 70 ul 15 mM AG (Sigma), 60 ul IM Tris-HCL (pH 8.1), 10 ul 2-Mercaptoethanol, 100 ul 100 mM MgCl₂, 150 ul 20 mM ATP, 50 ul H₃O und 100 ul PNK (1500 U/ml), wird eine Stunde bei 37° C inkubiert und dann über eine DEAE-Sephadex A-25 Säule mit linearem Gradienten (TEAB, pH 7.6, 0.2 bis 0.8 M) fraktioniert. Die Fraktionen des vierten Peaks, der, wie sich UV-spektroskopisch nachweisen läßt, ATP und pApG enthält, werden vereinigt, in Gegenwart von Methanol im Vakuum zur Trockene eingedampft und anschließend lyophilisiert.

Um das ATP vom pApG abzutrennen, werden die vereinigten Fraktionen mit ATPase behandelt und über eine Säule fraktioniert.

200 ul der pApG/ATP-Mischung (A260=49.2), 100 ul 100 mM DTT, 100 ul 1 M MOPS, pH 7.9, 150 ul 100 mM MgCl₂, 800 ul H₃O und 250 ul TA-RNA-Ligase (5000 UVmI) werden gemischt und 1 Stunde bei 37° C inkubiert. Dann wird über eine DEAE-Sephadex A-25 Säule mit linearem Gradienten (TEAB, pH 7.6, 0.2 bis 0.8 M) fraktioniert. Die Fraktionen des zweiten Hauptpeaks bei 260 nm, die pApG enthalten, werden vereinigt.

Das so erhaltene pApG wird dann zur Synthese von pApGpAp verwendet. TA-RNA-Ligase wurde nach dem Verfahren von Silber et al. präpariert. 112 ul pApG (0.87 mM), 58 ul AppAp (3.4 mM), 15 ul IM HEPES, pH 7.5, und 50 ul RNA-Ligase (1500 U/ml) werden gemischt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionsmischung wird dann über eine DEAE-Sephadex A-25 Säule fraktioniert und der pApGpAp-Peak durch Papierelektrophorese bei pH 5.0 in 50 mM Natriumcitrat-Puffer identifiziert. Die vereinigten pApGpAp enthaltenden Fraktionen werden in Gegenwart von Methanol im Vakuum zur Trockene eingedampft und lyophilisiert.

Die Probe wird dann mit bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP) behandelt. 40 ul pApGpAp (ca. 1 Einheit bei 260 nm), 5 ul 1 M Tris-HCl,pH 8.1, 5 ul BAP (200 U/ml; Worthington Biochemical) und 50 ul Wasser werden 30 min. bei 65 C inkubiert und anschließend über eine DEAE-Sephadex A-25 Säule mit linearem Gradienten (TEAB, pH 7.6, 0.1 bis 1.0 M) fraktioniert. Die ApGpA enthaltenden Fraktionen werden vereinigt.

BEISPIEL 2 Synthese von pGUp aus GAU

Die Reinheit des Trinukleotids GAU (Collaborative Research) wurde durch Elektrophorese geprüft. Die Reaktionsmischung, bestehend aus 225 ul 26 mM Appnbzl, 300 ul 3.3 mM GpApU, 75 ul 1 M MOPS, pH 7.9, 300 ul 0.1 M MgCl₃, 150 ul 100 mM DTT, 120 ul HLO, 180 ul RNA-Ligase und 150 ul Dimethylsulfoxid

(100 %), wird 20 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wird die Reaktionsmischung 2 Minuten gekocht. Nach dem Abkühlen werden 1400 ul dieser Lösung mit 300 ul 20 mM ATP, 200 ul 100 mM DTT und 100 ul PNK (1500 U/ml) gemischt und 90 Minuten bei 37° C inkubiert.

Die Reaktionsmischung wird dann über eine DEAE-Sephadex-A25 Säule mit linearem Gradienten (TEAB, pH 7.6, 0.1 bis 1.0 M) fraktioniert. Die Franktionen des vierten Peaks, die pGpApUpnbzl enthalten, werden vereinigt und anschließend in einer von Wasser umströmten Kühlkammer 15 Minuten lang auf 5 cm Entfernung dem Licht einer 300 Watt Quecksilberdampflampe ausgesetzt.

BEISPIEL 3 ApApA + pGpApnbzl -> AAAGA

Die Reaktionsmischung, bestehend aus 34 ul 3.3 mM AAA (Boehringer), 70 ul 1.0 mM pGpApnbzl (synthetisiert nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren), 40 ul 1.0 M HEPES, pH 7.83, 5 ul 1.0 M MgCl₂, 25 ul 20 mM ATP (Sigma), 2 ul Rinderserum-Albumin (BSA, 1 mg/ml), 40 ul RNA-Ligase (1500 U/ml) und 20 ul Dimethylsulfoxid (100 %), wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend über eine DEAE-Sephadex-A25-Säule fraktioniert. Der sechste Haupt· peak (E₂50 ^{: E}260 ⁼ ^*¹⁷' ^E280 ^{: E}260 ⁼ 0·⁶⁽^7) enthält das Produkt AAAGApnbzl. Das Oligounkleotid wird dann - wie in Beispiel 2 beschrieben - dem Licht einer Quecksilberdampflampe ausgesetzt, um die nbzl-Gruppe zu entfernen.

BEISPIEL 4 ApCpCpU + pCpCpGpAp -> ApCpCpüpCpCpGpAp

Die Reaktionsmischung, bestehend aus 75 ul 1.2 mM ACCU (her-

gestellt nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren), 90 ul 1.0 mM pCCGAp (Beispiel 1), 30 ul 1.0 M MOPS, pH 7.9, 120 ul 100 mM MgCl₂, 70 ul 100 mM DTT, 60 ul DMSO (100 %), 60 ul 20 mM ATP, 15 ul BSA (10 mg/ml), 60 ul RNA-Ligase (1500 U/ml) und 100 ul H₇O,wird 16 Stunden bei Raumtemperatur (ca. 24° C) inkubiert. Die Mischung wird dann über eine DEAE-Sephadex-A-24 Säule mit linearem Gradienten (TEAB, pH 7.5, 0.1 bis 2.0 M) fraktioniert. Das Polynukleotid ApCpCpUpCpCpGpAp wird als sechster Peak eluiert und UV-spektroskopisch identifiziert .

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Synthese von RNA mit definierter Basensequenz unter Verwendung des Enzyms T4-RNA-Ligase, dadurch gekennzeichnet, daß ein Donor spezifisch an das hydroxylierte 3'-Ende eines aus mindestens zwei Basen bestehenden Akzeptors addiert wird, wobei dann, wenn der Donor aus zwei oder mehr Nukleotid-Basen besteht, für die Addition Adenosin-Triphosphat als Energiequelle zur Verfügung gestellt wird.

2. Verfahren zur Addition eines definierten einzelnen Ribonukleotids auf ein aus mindestens zwei Basend bestehendes Akzeptor-Ribonukleotid, dadurch gekennzeichnet, daß das Akzeptor-Ribonukleqtid in Gegenwart von TA-RNA-Ligase mit einer Verbindung des Typs AppNp unter Bedingungen gemischt wird, die die Übertragung des pNp-Restes von AppNp auf das 3>Ende des phosphorylierten Ribonukleotids begünstigen, wobei das N von AppNp ein Ribonukleotid aus der Gruppe Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil und Inosin ist.

3. Verfahren zur Addition eines definierten, aus mindestens zwei Basen bestehenden Ribonukleotids an ein aus mindestens zwei Basen bestehendes Akzeptor-Ribonukleotid, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahrensschritte:

spezifische Phosphorylierung des 3'-Endes des Donor-Ribonukleotids;

Phosphorylierung des. 5'-Endes des Donor-Ribonukleotids;

Inkubation des Akzeptor-Ribonukleotids mit dem phosphorylierten Donor-Ribonukleotid in Gegenwart von T4-RNA-Ligase unter Bedingungen, die die Ausbildung einer kovalenten Bindung zwischen Akzeptor- und Donor-Ribonukleotid erlauben.

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4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Akzeptor-Ribonukleotid aus der folgenden Gruppe von Verbindungen ausgewählt wird: Diribonukleotide, phosphoryliert am 5'-Ende und hydroxyliert am 3'-Ende; Oligonucleotide, phosphoryliert am 5'-Ende und hyrdoxyliert am 3'-Ende; Oligonukleotide, hydroxyliert am 5'- und 3'-Ende.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Akzeptor-Ribonukleotid aus der folgenden Gruppe von Verbindungen ausgewählt wird: Diribonukleotide, phosphoryliert am 5'-Ende und hydroxyliert am 3'-Ende; Oligonukleotide, phosphoryliert am 5'-Ende und hydroxyliert am 3'-Ende; Oligonukleotide, hydroxyliert am 5'- und 3^V-Ende.

6. Verfahren nach Anspruch A, zusätzlich gekennzeichnet durch einen Verfahrensschritt zur Synthese eines am 5'-Ende phosphorylierten und am 3'-Ende hydroxylierten Ribonukleotids dadurch, daß ein an den freien 3'- und 5'-Enden hydroxyliertes Ribonukleotid in Gegenwart von Polynukleotid Kinase mit Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Reaktion gebracht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, zusätzlich gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

Reaktion eines am freien 3'- und 5'-Ende hydroxylierten Ribonukleotides mit ATP in Gegenwart von Polynukleotid Kinase zur Herstellung eines phosphoryllerten Ribonukleotids;

- .Fraktionierung der Reaktionsmischung durch Austausch-

Säulenchromatographie;

- Behandlung des das phosphorylierte Ribonukleotid enthaltenden Teils der fraktionierten Rektionsmischung mit ATPase;

- Fraktionierung der mit ATPase behandelten Reaktionsmischung zur Isolierung des phosphorylierten Ribonukleotids .

8. Verfahren nach Anspruch 5, zusätzlich enthaltend einen Verfahrensschritt zur spezifischen Phosphorylierung des 5'-Endes eines Akzeptor-Ribonukleotids durch Reaktion des Ribonukleotids mit ATP in Gegenwart von Polynukleotid Kinase.

9. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Phosphorylierung des 5'-Endes des Donor-Ribonukleotids das Ribonukleotid mit ATP in Gegenwart von Polynukleotid Kinase zur Reaktion gebracht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Phosphorylierung des 3'-Endes des Donor-Ribonukleotids ein aus mindestens zwei Basen bestehendes Ribonukleotid in Gegenwart von T4-RNA-Ligase mit der Verbindung Appnbzl unter Bedingungen zur Reaktion gebracht wird, die eine Bindung des pnbzl-Gruppe an das 3'-Ende des Ribonukleotids begünstigen.

11. Verfahren zur Synthese von RNA mit definierter Basensequenz, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte:

a) Phosphorylierung eines aus mindestens zwei Basen bestehen den Ribonukleotids mit bekannter Basensequenz am 5'-Ende;

b) Reaktion des RNA mit AppNp in Gegenwart von T4-RNA-Ligase, um den pNp-Rest von AppNp an das 3'-Ende des erwähnten Ribonukleotids zu binden;

c) Behandlung der entstehenden, verlängerten RNA mit einem Enzym, welches terminale Phosphatgruppen abspaltet;

d) Wiederholung der Verfahrensschritte b) und c), bis eine Ribonukleinsäure mit einer vorher festgelegten Basensequenz hergestellt ist;

wobei N ein Ribonukleotid aus der aus Adenin, Guanin, Cytosin, Uracil und Inosin bestehenden Gruppe ist.

12. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbedingungen, unter denen eine Übertragung des

pNp-Restes begünstigt wird, darin bestehen, daß das Akzeptor-Ribonukleotid in Gegenwart von RNA-Ligase in einem kleinen Volumen HEPES-Puffer 1 Stunde bei 37° C mit der AppNp-Verbindung inkubiert wird.