JP2021518127A - 高熱安定性を持つ修飾ヌクレオシドホスフェート - Google Patents

Abstract

本発明は、末端ホスフェート、例えばγ−ホスフェートでフッ素化されたヌクレオシドポリホスフェートを含む、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応における試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出するための、フッ素化されたヌクレオシドポリホスフェートを用いる方法も提供する。

Description

本発明は、安定なヌクレオチド試薬、それらの合成方法と、それらの使用方法と、それらを含むキットと、を提供する。ヌクレオチド試薬は、多くの組換えＤＮＡ及びＲＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）による核酸増幅において有用である。

核酸増幅試薬は、典型的には、温度感受性の成分から構成され、したがって、周囲温度より充分に低い温度で貯蔵して輸送しなければならないことが多い。これは特に、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート又はそのリボヌクレオシドトリホスフェート類似体の場合にある。これらの試薬は、末端からの連続したホスフェート基の喪失を介して分解されやすく、核酸ポリメラーゼの基質ではないヌクレオシドジホスフェート及びモノホスフェートの両方を形成する。更に、ジホスフェートの蓄積は酵素活性を阻害し得る。末端ホスフェートをエステル化することによって、ヌクレオシドポリホスフェートの安定性を向上させることができる。例えば、末端ホスフェートにメチルエステルを含有するｄＮＴＰ類似体は、正常なｄＮＴＰを完全に分解するのに充分な熱ストレス条件下において完全に安定であった。しかしながら、末端ホスフェートのエステル化は、ある特定のポリメラーゼ酵素に有効な基質として働くこれらのヌクレオチドの能力に負の影響を及ぼし得る。熱的に安定であり、かつポリメラーゼ酵素の効率的な基質であるｄＮＴＰ類似体を有する必要性が存在する。

本発明は、修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含む、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応における試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出するための、修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを用いる方法も提供する。

したがって、一態様では、本発明は、試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出する方法であって、該標的核酸配列が該試料中に存在する場合、該試料を増幅試薬と接触させて該試料を増幅試薬と接触させて増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実施することと、該増幅産物を検出することと、を包含し、ここで、該増幅試薬は、次の構造を有する修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含み、

式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である。一実施形態では、ｎ＝１である。別の実施形態では、ｎ＝２である。更に別の実施形態では、ｎ＝３〜４である。いくつかの実施形態では、増幅工程は、少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態では、増幅工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも４０回、少なくとも６０回、又は少なくとも１００回繰り返されてもよい。いくつかの実施形態では、増幅産物は、増幅が起こった後に１回検出される。いくつかの実施形態では、増幅産物は、増幅工程の間及び／又は増幅工程の後に検出される。いくつかの実施形態では、増幅産物は、３回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、若しくは５０回の増幅工程の間及び／若しくは後、又は各増幅工程の間及び／若しくは後の所定の時点で検出される。いくつかの実施形態では、増幅試薬は、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は、核酸ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素活性を持つ。

別の態様では、本発明は、増幅試薬を用いて標的核酸配列を増幅する方法を包含し、ここで、該増幅試薬は、次の構造を有する修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含み、

式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である。一実施形態では、ｎ＝１である。別の実施形態では、ｎ＝２である。更に別の実施形態では、ｎ＝３〜４である。いくつかの実施形態では、増幅工程は、少なくとも１回繰り返される。いくつかの実施形態では、増幅工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、少なくとも４０回、少なくとも６０回、又は少なくとも１００回繰り返されてもよい。いくつかの実施形態では、増幅産物は、増幅が起こった後に１回検出される。いくつかの実施形態では、増幅産物は、増幅工程の間及び／又は増幅工程の後に検出される。いくつかの実施形態では、増幅産物は、３回、５回、１０回、２０回、３０回、４０回、若しくは５０回の増幅工程の間及び／若しくは後、又は各増幅工程の間及び／若しくは後の所定の時点で検出される。いくつかの実施形態では、増幅試薬は、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、増幅試薬は、核酸ポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素活性を持つ。

別の態様では、本発明は、次の構造を有する修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含む組成物を包含し、

式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である。一実施形態では、ｎ＝１である。別の実施形態では、ｎ＝２である。更に別の実施形態では、ｎ＝３〜４である。

別の態様では、本発明は、核酸ポリメラーゼと、緩衝液と、下記の構造を有する修飾ヌクレオシドポリホスフェートとを含む、反応混合物又はキットのいずれかを包含し、

式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である。一実施形態では、ｎ＝１である。別の実施形態では、ｎ＝２である。更に別の実施形態では、ｎ＝３〜４である。いくつかの実施形態では、キットの反応混合物は、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、核酸ポリメラーゼは、逆転写酵素活性を持つ。いくつかの実施形態では、キット構成物は、別々のバイアル又は容器中の別々の構成要素としてキットに含まれる。いくつかの実施形態では、キット構成物の１つ以上は、同一のバイアル又は容器中でキットに含まれる。

本発明の実施形態及び利点を、発明を実施するための形態及び図において更に詳細に記載する。

図１は、合成されたフッ素化デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート類似体の化学構造を示す。 図２は、２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（γ−フルオロ−トリホスフェート）（ｄＮＴＰ−γＦ）ナトリウム塩の化学合成の概略図である。 図３は、２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（δ−フルオロ−テトラホスフェート）（ｄＮ４Ｐ−δＦ）ナトリウム塩の化学合成の概略図である。 図４は、６５℃における天然ｄＵＴＰ及びｄＵＴＰ−γＦの熱安定性を示す。 図５は、Ｚ０５ポリメラーゼ及びｒＴｈピロホスファターゼ酵素を用いた、ＤＮＡ標的からの定量的ＰＣＲ増幅反応の増殖曲線を示す。 図６は、Ｚ０５ポリメラーゼ及びＴＩＰピロホスファターゼ酵素を用いた、ＤＮＡ標的からの定量的ＰＣＲ増幅反応の増殖曲線を示す。 図７は、Ｃ２１ポリメラーゼ及びｒＴｈピロホスファターゼ酵素を用いた、ａｒｍｏｒｅｄ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ標的からの逆転写酵素定量的ＰＣＲ増幅反応の増殖曲線を示す。 図８は、Ｃ２１ポリメラーゼ及びＴＩＰピロホスファターゼ酵素を用いた、ａｒｍｏｒｅｄ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ標的からの逆転写酵素定量的ＰＣＲ増幅反応の増殖曲線を示す。

本発明は、フッ素化されたデオキシリボヌクレオシドポリホスフェートを含む、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）による核酸増幅に使用される安定なヌクレオチド試薬を提供する。本発明はまた、増幅反応における試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出するため、及び試料中の標的核酸配列を増幅するためのフッ素化されたデオキシリボヌクレオシドポリホスフェートを用いる方法も提供する。フッ素化デオキシリボヌクレオシドポリホスフェートの安定性増加により、ＰＣＲに基づく診断試験で使用されるマスタミックス試薬などの複雑な水性混合物中における長期保存が可能となる。

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様である本質的に任意の方法及び材料が本発明の実施又は試験で使用され得るが、例示的な方法及び材料のみを記載する。本発明の目的のために、次の用語を以下のように定義する。

用語「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。

用語「周囲温度」とは、周辺の温度を指し、温度制御された屋内の建物の温度を指す場合には「室温」と同義である。通常、周囲温度とは１５℃〜２５℃の温度範囲を指すが、わずかに低い又は高い温度も、依然として周囲温度の範囲内であると考えることができる。

用語「アプタマ」とは、米国特許第５，６９３，５０２号に記載されているように、ＤＮＡポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖ＤＮＡを指す。ＲＴ−ＰＣＲにおけるアプタマ及びｄＵＴＰ／ＵＮＧの使用はまた、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｓ．ら、（「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ：Ｈｉｇｈ−ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ」、「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，Ｃ．Ｗ．及びＤｖｅｋｓｌｅｒ，Ｇ．Ｓ．編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ、第２１１〜２１９頁（２００３年））が論じている。

「組換え」とは、本明細書で使用される場合、組換え法によって意図的に修飾されているアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。本明細書中の用語「組換え核酸」とは、本来、一般にはインビトロで、制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作によって、自然界では通常見られない形態で形成された核酸を意味する。したがって、直鎖状（ｌｉｎｅａｒ ｆｏｒｍ）である単離された突然変異体ＤＮＡ、又は通常は連結されていないＤＮＡ分子を連結することによりインビトロで形成された発現ベクターは、どちらも本発明の目的のための組換え体であると考えられる。一度組換え核酸が作製されて宿主細胞に再導入されると、これは非組換え的に、すなわち、インビトロ操作よりも宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて複製するであろうことが理解される。しかしながら、そのような核酸は、一度組換え的に生成され続いて非組換え的に複製されたが、本発明の目的のためには依然として組換え体であると考えられる。「組換えタンパク質」は、組換え技術、すなわち、上で示すような組換え核酸の発現を用いて作製されるタンパク質である。

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合、「操作可能に連結」される。例えば、プロモータ又はエンハンサは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合はコード配列に操作可能に連結され、又はリボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合はコード配列に操作可能に連結する。

用語「宿主細胞」とは、細胞培養で増殖する場合、単一細胞の原核生物及び真核生物（例えば、細菌、酵母、放線菌）の両方、並びに高次の植物又は動物由来の単一細胞を指す。

用語「ベクター」とは、外来ＤＮＡの断片をその中に挿入され得る、典型的には二本鎖のＤＮＡの断片を指す。ベクターは、又は例えば、プラスミド起源であってもよい。ベクターは、宿主細胞におけるベクターの自律的複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含有する。外来ＤＮＡは異種ＤＮＡと定義され、これは、宿主細胞中に天然には存在しないＤＮＡであって、例えば、ベクター分子を複製し、選択マーカ若しくはスクリーニング可能マーカをコードし、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを好適な宿主細胞に輸送するために使用される。宿主細胞内に入ると、ベクターは宿主染色体ＤＮＡとは独立して、又は宿主染色体ＤＮＡと同時に複製することができ、ベクター及びその挿入されたＤＮＡのコピーをいくつか生成することができる。加えて、ベクターはまた、挿入されたＤＮＡからｍＲＮＡ分子への転写を可能にするか、又はそうでなければ挿入されたＤＮＡからＲＮＡコピーへの多数の複製を引き起こす、必要な要素を含有することもできる。いくつかの発現ベクターは、挿入されたＤＮＡに隣接する配列要素を更に含有し、これは、発現したｍＲＮＡの半減期を増加させ、及び／又はｍＲＮＡからタンパク質分子への翻訳を可能にする。このようにして、挿入されたＤＮＡによりコードされたｍＲＮＡ及びポリペプチドの多くの分子を、迅速に合成することができる。

「増幅試薬」は、核酸の増幅を可能にする化学的又は生化学的な成分である。このような試薬として、限定されるものではないが、核酸ポリメラーゼ、緩衝液、ヌクレオシドトリホスフェートなどのモノヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドプライマーなどのオリゴヌクレオチド、塩及びそれらの各溶液、検出プローブ、並びに色素などが挙げられる。

当技術分野で公知であるように、「ヌクレオシド」は、塩基−糖の組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。このような複素環塩基の最も一般的な２つのクラスは、プリン及びピリミジンである。

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したホスフェート基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むこれらのヌクレオシドについて、ホスフェート基は、糖の２’−ヒドロキシル部分、３’−ヒドロキシル部分、又は５’−ヒドロキシル部分のいずれかに連結することができる。ヌクレオチドは「オリゴヌクレオチド」のモノマー単位であり、より一般的には「オリゴマー化合物」として、又は「ポリヌクレオチド」、より一般的には「ポリマー化合物」として示すことができる。上記の別の一般的な表現は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。

「オリゴマー化合物」は「モノマー単位」からなる化合物であり、これは、ヌクレオチド単独又は非天然化合物（下記参照）、より具体的には修飾ヌクレオチド（若しくはヌクレオチド類似体）又は非ヌクレオチド化合物の、単独又はそれらの組合せであり得る。

「オリゴヌクレオチド」及び「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）は、オリゴマー化合物のサブグループである。用語「オリゴヌクレオチド」とは、それらのモノマー単位としての複数のヌクレオチドから形成される成分を指す。ホスフェート基は、一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するといわれる。ＲＮＡとＤＮＡとの正常な結合又は骨格は、３’〜５’のホスホジエステル結合である。本発明に有用なオリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチド（下記参照）は、主に当技術分野に記載され、当分野の専門家に公知であるように合成することができる。特定の配列のオリゴマー化合物を調製する方法は当技術分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニング及び制限、並びに直接的な化学合成が挙げられる。化学合成法としては、例えば、Ｎａｒａｎｇ Ｓ．Ａ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第６８巻（１９７９年）、第９０〜９８頁に記載のホスホトリエステル法、Ｂｒｏｗｎ Ｅ．Ｌ．ら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、第６８巻（１９７９年）、第１０９〜１５１頁に開示のホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅら、「Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ」、第２２巻（１９８１年）、第１８５９頁に開示のホスホロアミダイド法、Ｇａｒｅｇｇら、「Ｃｈｅｍ．Ｓｃｒ．」、第２５巻（１９８５年）、第２８０〜２８２頁に開示のＨ−ホスホネート法、及び米国特許第４，４５８，０６６号に開示の固体支持法（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ ｍｅｔｈｏｄ）を挙げることができる。

上に記載の方法では、オリゴヌクレオチドは化学的に修飾されてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。したがって、プローブ又はプライマーは修飾オリゴヌクレオチドである。

「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチド類似体」）は、いくつかの修飾で天然ヌクレオチドと異なるが、依然として、塩基、ペントフラノシル糖、ホスフェート部分、塩基様部分、ペントフラノシル糖様部分、及びホスフェート様部分、又はそれらの組合せからなる。例えば、ヌクレオチドの塩基部分に標識を結合させて、修飾ヌクレオチドを得ることができる。ヌクレオチド中の天然塩基はまた、例えば７−デアザプリンによって置換することで、同様に修飾ヌクレオチドを得ることもできる。

用語「メチル化したｄＮＴＰ」又は「メチル化ｄＮＴＰ」とは、トリホスフェート部分に１つ以上の付加されたメチル基を有する任意のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート又はｄＮＴＰを指す。例としては、メチル化ｄＡＴＰ、メチル化ｄＣＴＰ、メチル化ｄＧＴＰ、メチル化ｄＴＴＰ、及びメチル化ｄＵＴＰが挙げられる。１つ以上のメチル基は、ｄＮＴＰに見られるα−ホスフェート基、β−ホスフェート基、又はγ−ホスフェート基のうちのいずれか１つ以上をエステル化することができる。特定の例では、メチル化ｄＮＴＰとは、各ｄＮＴＰの末端γ−ホスフェート基がメチル基で修飾されるようなものであって、これは、従来の未修飾ｄＮＴＰと比較して、ＰＣＲなどの増幅反応で使用するためのより安定なｄＮＴＰ成分を生じる。

用語「フッ素化デオキシリボヌクレオシドポリホスフェート」とは、ホスフェート基の１つでフッ素化された任意のデオキシリボヌクレオシドポリホスフェートを指す。例として、ｄＡＴＰ−γＦ、ｄＣＴＰ−γＦ、ｄＧＴＰ−γＦ、ｄＴＴＰ−γＦ、及びｄＵＴＰ−γＦが挙げられる。例として、ｄＡ４Ｐ−δＦ、ｄＣ４Ｐ−δＦ、ｄＧ４Ｐ−δＦ、ｄＴ４Ｐ−δＦ、及びｄＵ４Ｐ−δＦが更に挙げられる。フッ素原子は、デオキシリボヌクレオシドポリホスフェートに見られるα−ホスフェート基、β−ホスフェート基、γ−ホスフェート基、δ−ホスフェート基、ε−ホスフェート基、ζ−ホスフェート基のいずれか１つで酸素を１つ置換し得る。特定の例では、フッ素化ポリホスフェートとは、各デオキシリボヌクレオシドポリホスフェートの末端ホスフェート基がフッ素化されるようなものであって、これは、従来の未修飾ｄＮＴＰと比較して、ＰＣＲなどの増幅反応で使用するためのより安定なポリホスフェート成分を生じる。
用語「熱安定性無機ピロホスファターゼ」及び「熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素」とは、本文中で同義的に使用され、無機ピロホスフェートの加水分解を触媒してオルトホスフェートを生成する酵素を指し

（Ｐ₂Ｏ₇ ^-4＋Ｈ₂Ｏ→２ＨＰＯ₄ ^-2）、ＰＣＲ条件（例えば、９０℃以上）で使用される温度において活性を保持することができる。熱安定性無機ピロホスファターゼの一例は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（マサチューセッツ州イプスウィッチ）から市販されている好熱性生物Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓに由来する。

オリゴマー化合物の別の特定のサブグループに属する「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）は、モノマー単位として、１つ以上のヌクレオチド及び１つ以上の修飾ヌクレオチドを持つ。したがって、用語「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチド類似体」）とは、オリゴヌクレオチドと実質的に類似する様式で機能する構造を指し、本発明の文脈において交換可能に使用することができる。合成の観点から、修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は、例えば、ホスフェート骨格、リボース単位、又はヌクレオチド塩基の適切な修飾によるオリゴヌクレオチドの化学修飾によって作製することができる（Ｕｈｌｍａｎｎ及びＰｅｙｍａｎ、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ」、第９０巻（１９９０年）、第５４３頁；Ｖｅｒｍａ Ｓ．及びＥｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、第６７巻（１９９８年）、第９９〜１３４頁）。代表的な修飾として、ホスホジエステルのヌクレオシド間結合の代わりに、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、若しくはホスホラミデートのヌクレオシド間結合；天然のプリン及びピリミジン塩基、５又は６位に置換基を有するピリミジン塩基の代わりに、デアザプリン若しくはアザプリン、及びピリミジン；７−デアザプリンとして、２、６、若しくは８位、若しくは７位に改変した置換基を有するプリン塩基；アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、若しくはアリール部分を担持する塩基、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、等の低級アルキル基、若しくはフェニル、ベンジル、ナフチルのようなアリール基；例えばそれらの２’位に置換基を有する糖；又は、炭素環式若しくは非環式糖類似体が挙げられる。その他の修飾は当業者に公知である。そのような修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチド類似体）は、天然オリゴヌクレオチドと機能的に交換可能であるが構造的に異なるとして、最もよく記載される。より詳細には、例示的な修飾として、Ｖｅｒｍａ Ｓ．及びＥｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、第６７巻（１９９８年）、第９９〜１３４頁、又は国際公開第０２／１２２６３号が開示される。その上、ヌクレオシド単位が、ヌクレオシド間のホスフェート又は糖ホスフェート結合の代わりとなる基を介して連結される修飾を行うことができる。そのような結合として、Ｖｅｒｍａ Ｓ．及びＥｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．」、第６７巻（１９９８年）、第９９〜１３４頁に開示されるものが挙げられる。ホスフェート結合以外の構造がヌクレオシド単位を結合するために利用される場合、そのような構造は、「オリゴヌクレオシド」としても記載されている。

「核酸」及び「標的核酸」は、当業者に公知のヌクレオチドのポリマー化合物である。「標的核酸」は、分析されるべき試料中の核酸、すなわち、試料中のその存在、不在、及び／又は量が決定されるべき核酸を示すために本明細書において使用される。

用語「プライマー」は、本明細書では当業者に公知であるように使用され、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、また、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を開始することができる修飾オリゴヌクレオチドも指す。すなわち、例えばプライマーの３’末端が遊離３’−ＯＨ基を提供し、そこに、３’−〜５’−ホスホジエステル結合を確立する鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼによって更なるヌクレオチドを結合することができ、これによって、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが使用され、それによってピロホスフェートが放出される。

「プローブ」はまた、天然又は修飾オリゴヌクレオチドを示す。当技術分野で公知なように、プローブは、分析物又は増幅物を検出する目的に役立つ。上記の方法の場合、プローブを使用して、標的核酸の増幅物を検出することができる。この目的のために、プローブは通常、標識を担持する。

「レポータ基」と呼ばれることが多い「標識」は、一般に、核酸、特にオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド、及びそれに結合した任意の核酸を、試料の残りの部分（標識が結合した核酸は、標識された核酸結合化合物、標識されたプローブ、又は単にプローブとも称することができる）と区別可能にする基である。例示的な標識は蛍光標識であり、これは例えば、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素などの蛍光色素である。例示的な蛍光色素は、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＡＬ６３５、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３４３、Ｑｕａｓａｒ７０５、Ｃｙａｎ５００、ＣＹ５．５、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５である。

いくつかの実施形態では、標識は、「リンカー」又は「リンカーアーム」を介してプリン若しくはピリミジン塩基又は類似体に結合され得る。リンカーアームの長さは、ヌクレオチド塩基から蛍光部分までのオングストローム（Å）の距離である。一般に、リンカーアームは約１０Å〜約２５Åである。リンカーアームは、国際公開第８４／０３２８５号に記載されている種類のものであってもよい。国際公開第８４／０３２８５号はまた、リンカーアームを特定のヌクレオチド塩基に結合させる方法、及び蛍光部分をリンカーアームに結合させる方法も開示している。例示的には、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０−ＮＨＳ−エステルなどのアクセプタ蛍光部分を、Ｃ６ホスホアミダイト（ＡＢＩ（カリフォルニア州フォスタシティ）又はＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（バージニア州スターリング）から入手可能）と組み合わせて、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０−ホスホロアミダイトを生成することができる。フルオレセインなどのドナー蛍光部分をオリゴヌクレオチドに結合させるためによく使用されるリンカーとしては、チオ尿素リンカー（ＦＩＴＣ由来、例えばＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ又はＣｈｅｍＧｅｎｅ（マサチューセッツ州アッシュランド）製のフルオレセイン−ＣＰＧ）、アミド−リンカー（ＢｉｏＧｅｎｅｘ（カリフォルニア州サンラモン）製のフルオレセイン−ＣＰＧなどの、フルオレセイン−ＮＨＳ−エステル由来）、又はオリゴヌクレオチド合成後にフルオレセイン−ＮＨＳ−エステルの結合を必要とする３’−アミノ−ＣＰＧが挙げられる。更に、他の非ヌクレオシドリンカーは、例えば、脂肪族、芳香族、アリール、環状、キラル、アキラル、ペプチド、炭水化物、脂質、脂肪酸、トリ−、テトラ−、ペンタ−、ヘキサ−ポリエチレングリコール（ＨＥＧ）、若しくはポリ−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、又は複素環部分であってもよい。他の従来の非ヌクレオシドリンカーは、ホモ二官能性及びヘテロ二官能性の架橋試薬を使用している。ホモ二官能性試薬は２つの同一の官能基を担持するのに対し、ヘテロ二官能性試薬は、生物製剤を生体接着剤に連結するために２つの異種官能基を含有する。ヘテロ二官能性架橋剤の大部分は、第一級アミン反応性基及びチオール反応性基を含有する。共有結合架橋剤は、ジスルフィド（Ｓ−−Ｓ）、グリコール（−−ＣＨ（ＯＨ）−−ＣＨ（ＯＨ）−−）、アゾ（−−Ｎ＝Ｎ−−）、スルホン（−−Ｓ（＝Ｏ₂−−）、エステル（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｏ−−）、又はアミド（−−Ｃ（＝Ｏ）−−Ｎ−−）架橋を形成することができる試薬から選択される。

任意のプライマー及び／又はプローブが化学的に修飾されてもよく、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾されたヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。したがって、プローブ又はプライマーは修飾オリゴヌクレオチドである。

核酸増幅の方法は、その他の参考文献、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、及び同第４，９６５，１８８号に開示されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸鋳型（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）に結合する２つ以上のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する。核酸分析に有用なプライマーは、標的核酸の核酸配列内で核酸合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを含む。プライマーは、従来の方法によって制限消化物から精製することができるか、又は合成的に生成することができる。プライマーは増幅における最大効率のために一本鎖であり得るが、プライマーは二本鎖であってもよい。二本鎖プライマーは、最初に変性される、すなわち、鎖を分離するために処理される。二本鎖核酸を変性させる１つの方法は、加熱によるものである。「熱安定性ポリメラーゼ」は、熱安定性であるポリメラーゼ酵素であって、すなわち、鋳型に相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒する酵素であり、二本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間にわたり高温に曝された場合、不可逆的には変性しない。一般に、合成は各プライマーの３’末端で開始され、鋳型鎖に沿って５’から３’方向へ進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓから単離される。それにもかかわらず、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼをＰＣＲアッセイに使用することもできる。

鋳型核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲで鋳型として使用することができるようにする前に、２本の鎖を分離することが必要である。鎖分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含む任意の好適な変性方法によって達成することができる。核酸鎖を分離する１つの方法は、核酸が優位に変性する（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％を超える変性）まで加熱することを含む。鋳型核酸を変性させるのに必要な加熱条件は、例えば、緩衝塩濃度、並びに変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、温度及び核酸長のような反応の特徴に応じて、約９０℃〜約１０５℃の範囲である。変性は、典型的には約５秒から９分間行われる。例えばＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼのような各ポリメラーゼをそのような高温に長く晒さず、したがって機能酵素を損失する危険を冒さないために、短い変性工程を使用することが好ましい場合がある。

二本鎖の鋳型核酸が熱により変性された場合、反応混合物は、標的核酸上のその標的配列に対する各プライマーのアニーリングを促進する温度まで冷却される。

アニーリングの温度は、約３５℃〜約７０℃、又は約４５℃〜約６５℃、又は約５０℃〜約６０℃、又は約５５℃〜約５８℃であり得る。アニーリング時間は、約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒、約３０秒〜約４０秒）であり得る。この文脈では、それぞれのアッセイの包括性を高めるために、異なるアニーリング温度を使用することが有利となり得る。要するにこれは、比較的低いアニーリング温度において、プライマーが単一のミスマッチを有する標的にも結合し得ることを意味し、したがって特定の配列のバリアントもまた増幅され得る。これは、例えば、ある特定の生物が、同様に検出されるべき既知又は未知の遺伝的バリアントを有する場合に望ましくなり得る。一方で、温度が高くなるにつれて、正確には一致しない標的配列にプライマーが結合する確率が連続的に減少するため、比較的高いアニーリング温度はより高い特異性を呈するという利点を持つ。両方の現象から利益を得るために、本発明のいくつかの実施形態では、上述の方法は、異なる温度で、例えば最初に低い温度で、次に高い温度でアニーリングすることを含む。例えば、最初のインキュベーションが５５℃で約５サイクル行われる場合、正確には一致しない標的配列を（事前に）増幅してもよい。これに続いて、例えば、５８℃で約４５サイクル行って、実験の大部分を通してより高い特異性を得ることができる。こうすることで、潜在的に重要な遺伝的バリアントは見逃されず、一方で特異性は比較的高く維持される。

次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長が起こって、分析される核酸に相補的な産物を生成するのに充分な温度に、反応混合物を調節する。温度は、核酸鋳型にアニーリングされた各プライマーから伸長産物を合成するのに充分であるべきだが、その相補的な鋳型から伸長産物を変性させるほど高くすべきではない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０℃〜約８０℃（例えば、約５０℃〜約７０℃、約６５℃）の範囲である）。伸長時間は、約１０秒〜約５分、又は約１５秒〜約２分、又は約２０秒〜約１分、又は約２５秒〜約３５秒とすることができる。新規に合成された鎖は、反応の後続工程で使用できる二本鎖分子を形成する。鎖分離、アニーリング、及び伸長の工程は、標的核酸に対応する所望の量の増幅産物を生成するために、必要に応じて何度でも繰り返すことができる。反応の制限因子は、反応中に存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシドトリホスフェートの量である。サイクル工程（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）は、少なくとも１回繰り返してもよい。検出での使用について、サイクル工程の数は、例えば試料の性質に応じる。試料が核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するために、より多くのサイクル工程が必要となる。概して、サイクル工程は少なくとも約２０回繰り返されるが、４０回、６０回、又は１００回繰り返してもよい。

ＰＣＲは、アニーリング及び伸長の工程が、同じ工程（１ステップＰＣＲ）で行われるものであってもよいし、又は上述のように、別々のステップ（２ステップＰＣＲ）で行われるものであってもよい。アニーリング及び伸長を、例えばＺ０５ ＤＮＡポリメラーゼのように好適な酵素を用いて一緒に、つまり同じ物理的及び化学的条件下で行うことには、各サイクルの追加工程の時間を節約し、また、アニーリングと伸長との間の追加の温度調整の必要をなくすという利点がある。このように、１ステップＰＣＲは、それぞれのアッセイ全体の複雑さを減らす。

一般的に、増幅全体に対する時間短縮は、結果に至るまでの時間が短縮され、可能性のあるより早い診断につながるのため、好ましいことがある。

使用されるその他の核酸増幅方法として、リガーゼ連鎖反応（Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＬＣＲ；Ｗｕ Ｄ．Ｙ．及びＷａｌｌａｃｅ Ｒ．Ｂ．、「Ｇｅｎｏｍｉｃｓ」、第４巻（１９８９年）、第５６０〜６９頁；及びＢａｒａｎｙ Ｆ．、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８８巻（１９９１年）、第１８９〜１９３頁）；ポリメラーゼ／リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．、「ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ．」、第１巻（１９９１年）、第５〜１６頁）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（国際公開第９０／０１０６９号）；修復連鎖反応（欧州特許出願公開第０４３９１８２Ａ２号）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ．ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８６巻（１９８９年）、第１１７３〜１１７７頁；Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．ら、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、第８７巻（１９９０年）、第１８７４〜１８７８頁；国際公開第９２／０８８０８号）、並びにＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号）が挙げられる。更に、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＳＤＡ）、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＴＭＡ）、及びＱｂ増幅（概説は、例えば、Ｗｈｅｌｅｎ Ａ．Ｃ．及びＰｅｒｓｉｎｇ Ｄ．Ｈ．、「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、第５０巻（１９９６年）、第３４９〜３７３頁；Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｒ．Ｄ．及びＭｙｅｒｓ Ｔ．Ｗ．、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ」、第４巻（１９９３年）、第４１〜４７頁を参照のこと）がある。

用語「Ｃｐ値」又は「交点（ｃｒｏｓｓｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）」値は、入力された標的核酸の定量を可能にする値を指す。Ｃｐ値は、二次導関数最大値法（ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｍｅｔｈｏｄ）に従って決定することができる（Ｖａｎ Ｌｕｕ−Ｔｈｅら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｕｓｉｎｇ ｓｅｃｏｎｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ」、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第３８巻、第２号、２００５年２月、第２８７〜２９３頁）。二次導関数法では、Ｃｐは、二次導関数曲線の第１のピークに相当する。このピークは対数線形フェーズ（ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ ｐｈａｓｅ）の始まりに相当する。二次導関数法は、リアルタイム蛍光強度曲線の二次導関数値を算出し、１つの値だけが得られる。元のＣｐ法は、例えば多項式関数による、強度値の局所的に定義された微分可能な近似に基づく。次いで、三次導関数が計算される。Ｃｐ値は、三次導関数の最小根である。Ｃｐは、対数線形領域中の補助線に対する平行線の交点により決定されるフィットポイント法（ｆｉｔ ｐｏｉｎｔ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて決定することもできる（Ｖａｎ Ｌｕｕ−Ｔｈｅら、「ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、第３８巻、第２号、２００５年２月、第２８７〜２９３頁）。Ｃｐ値は、Ｒｏｃｈｅにより提供されたＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ機器により、二次導関数最大値法に従って計算することによって提供される。

用語「ＰＣＲ効率」とは、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。ＰＣＲ効率は、式：％ＰＣＲ効率＝１０^(-傾き)−１）×１００を用いて各条件について算出し、式中、傾きはｙ軸にプロットされたコピー数の対数とｘ軸にプロットされたＣｐとを用いる線形回帰により算出した。ＰＣＲ効率は、完全に一致した又は不一致のプライマー鋳型を用いて測定することができる。

用語「ＦＲＥＴ」又は「蛍光共鳴エネルギー移動」又は「Ｆｏｅｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動」とは、少なくとも２つのクロモフォア、ドナークロモフォアとアクセプタクロモフォア（クエンチャと呼ばれる）との間のエネルギー移動を指す。典型的に、ドナーは好適な波長の光放射によって励起されると、アクセプタにエネルギーを移動させる。典型的に、アクセプタは転移されたエネルギーを異なる波長の光放射の形態で再放射する。アクセプタは、「ダーク」クエンチャである場合、移動されたエネルギーを光以外の形態で散逸させる。特定のフルオロフォアがドナー又はアクセプタとして作用するか否かは、ＦＲＥＴ対の他の要素の性質に依存する。一般的に使用されるドナー−アクセプタ対は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ対を包含する。一般的に使用されるクエンチャは、ＤＡＢＣＹＬ及びＴＡＭＲＡである。一般的に使用されるダーククエンチャは、ＢｌａｃｋＨｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ（商標）（ＢＨＱ）、（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ノヴァト）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ．，Ｉｎｃ．、アイオワ州コーラルビル）、及びＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ（商標）Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０（ＢＢＱ−６５０）（Ｂｅｒｒｙ＆Ａｓｓｏｃ．、ミシガン州デクスタ）を包含する。

上記に記載の方法は、ドナー蛍光部位とアクセプタ蛍光部位との間の蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｅｎｅｒｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：ＦＲＥＴ）に基づいてもよい。代表的なドナー蛍光部位はフルオレセインであり、代表的な対応するアクセプタ蛍光部位は、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、及びＣｙ５．５を含む。典型的には、検出は、ドナー蛍光部位によって吸収された波長で試料を励起することと、対応するアクセプタ蛍光部位によって放出された波長を可視化及び／又は測定することと、を含む。本発明に係る方法では、検出の後に、ＦＲＥＴの定量化を行うことができる。例えば、検出は、各サイクル工程の後に行われる。例えば、検出は、リアルタイムで行われる。市販のリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）又はＴａｑＭａｎ（登録商標））を用いることで、ＰＣＲ増幅と増幅産物の検出とを、サイクル時間を大幅に短縮した単一のクローズドキュベットで組み合わせることができる。増幅と同時に検出が行われるため、リアルタイムＰＣＲ法は増幅産物を操作する必要がなく、増幅産物間の相互汚染のリスクを軽減することができる。リアルタイムＰＣＲは、ターンアラウンド時間を大幅に短縮し、臨床検査室での従来のＰＣＲ技術に代わる魅力的な技術である。

次の特許出願が、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）技術で使用されるリアルタイムＰＣＲについて記載する：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号、及び国際公開第９７／４６７１２号。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）装置は、高品質光学を利用したマイクロボリューム蛍光光度計と組み合わせた、急速サーマルサイクラである。これは薄いガラス製のキュベットを反応容器として使用する急速熱サイクル技術である。反応チャンバの加熱及び冷却は、加熱された空気と周囲の空気とを交互に供給することで制御する。空気の質量が少なく、キュベットの表面積と体積との比率が高いため、サーマルチャンバ内では非常に迅速な温度交換が可能である。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、２つの蛍光部位で標識された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１の蛍光部位が好適な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーはＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部位に移動される。第２の蛍光部位は、一般的には、クエンチャ分子である。この形式で使用される典型的な蛍光色素としては、例えばとりわけ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、シアン、ＣＹ５．５がある。ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階において、Ｔａｑ又は変異型Ｚ０５ポリメラーゼのような当業者に公知の別の好適なポリメラーゼの５’〜３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。その結果、励起された蛍光部位とクエンチャ部位とが、互いに空間的に分離した状態となる。結果として、クエンチャの不在下において第１の蛍光部位を励起すると、第１の蛍光部位からの蛍光発光を検出することができる。

上述したどちらの検出形態においても、放出されるシグナルの強度は、元の標的核酸分子の数と相関し得る。

最近、多重化ＰＣＲアッセイを行うための「タグ付けされた」ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用する方法が、米国特許出願公開第２０１８／００７３０５６号及び米国特許公開第２０１８／００７３０６４号に記載されている。

ＦＲＥＴの代替として、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ Ｉ（登録商標）又はＳＹＢＲＧＯＬＤ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））のような二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いて、増幅産物を検出することができる。二本鎖核酸との相互作用の際、このような蛍光ＤＮＡ結合色素は、適当な波長の光で励起した後、蛍光シグナルを発する。また、核酸インターカレート色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を用いることもできる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、増幅産物の存在を確認するために、通常は融解曲線分析を行う。

また、本発明のリアルタイムＰＣＲ法を用いて増幅産物の存在を検出するために、ＦＲＥＴと組み合わせた分子ビーコンを使用することもできる。分子ビーコン技術は、第１の蛍光部位及び第２の蛍光部位で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部位は一般的にはクエンチャであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各端部に配置される。分子ビーコン技術は、二次構造形成を可能にする配列（例えば、ヘアピン）を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内で二次構造が形成された結果、プローブが溶液中にある場合、両方の蛍光部位が空間的に近接する。増幅産物へのハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造が破壊され、適切な波長の光で励起した後に第１の蛍光部位の発光を検出することができるように、蛍光部位が互いに分離される。

したがって、本発明に係る方法はＦＲＥＴを用いる上記の方法であって、ここで、該プローブは二次構造形成を許容する核酸配列を含み、ここで、該二次構造形成は、該第１の蛍光部位と第２の蛍光部位とを空間的に近接させる。

効率的なＦＲＥＴは、蛍光部位が直接局所的に近接しており、ドナー蛍光部位の発光スペクトルがアクセプタ蛍光部位の吸収スペクトルと重なっている場合にのみ起こり得る。

したがって、一実施形態では、該ドナー及びアクセプタ蛍光部位は、該プローブ上で互いに５ヌクレオチド以下の範囲内にある。更なる実施形態では、該アクセプタ蛍光部位は、クエンチャである。

上述の通り、ＴａｑＭａｎ（登録商標）形式では、ＰＣＲ反応のアニーリング工程の間、標識されたハイブリダイゼーションプローブは、標的核酸（すなわち、増幅産物）に結合し、その後の伸長段階において、Ｔａｑ又は変異型Ｚ０５ポリメラーゼのような当業者に公知の別の好適なポリメラーゼの５’〜３’−エキソヌクレアーゼ活性によって分解される。このように、一実施形態では、上記の方法において、増幅は、５’〜３’−エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を使用する。

上述の方法の結果として得られるアンプリコンの長さを慎重に選択することが、更に有利である。一般に、比較的短いアンプリコンは、増幅反応の効率を高める。したがって、本発明の一態様は、増幅された断片が、最大４５０塩基、最大３００塩基、最大２００塩基、又は最大１５０塩基を含む、上述の方法である。

「配列」とは、核酸の一次構造、すなわち、それぞれの核酸が構成する単一核酸塩基の特定の配列である。用語「配列」は、ＲＮＡ又はＤＮＡのような特定の種類の核酸を示すものではなく、両方に適用されるだけでなく、例えばＰＮＡなどの他のタイプの核酸にも適用されることが理解されなければならない。核酸塩基が互いに対応する場合、特にウラシル（ＲＮＡ中に存在）及びチミン（ＤＮＡ中に存在）の場合では、これらの塩基は、当業者によく知られているように、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列との間で等価であると考えることができる。

臨床的に関連する核酸は、多くの場合、例えばＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ：ＨＢＶ）及びサイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）などの例えばＤＮＡウイルス、又は例えばクラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ：ＣＴ）及び淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ：ＮＧ）などの細菌に由来し得るＤＮＡである。このような場合には、標的核酸の性質を反映させるために、ＤＮＡからなる内部制御核酸の使用することが有利となり得る。用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」とは、同義に使用することができ、全てのかかる表記が子孫を含む。このため、語「形質転換体」又は「形質転換細胞」とは、移行の数にかかわらず初代形質転換細胞及びその細胞由来の培養物を含む。全ての子孫が意図的な、又は想定外の変異に起因してＤＮＡ含量において厳密に同一でない場合がある。元々の形質転換細胞についてスクリーニングされる機能と同じ機能を有する変異体子孫が、形質転換体の定義に含まれる。細胞は原核生物又は真核生物であり得る。

用語「制御配列」とは、特定の宿主生物における操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を指す。例えば、原核生物に好適な制御配列には、プロモータ、任意選択にはオペレータ配列、リボソーム結合部位、陽性逆調節要素（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｔｒｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）（米国特許第４，６６６，８４８号参照）、及び場合によっては他の配列が挙げられる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、及びエンハンサを利用することが知られている。

用語「操作可能に連結された」とは、コード化配列によってコード化されたタンパク質の発現を駆動するために制御配列が機能するような、コード配列の配置を指す。このように、制御配列に「操作可能に連結された」コード配列とは、制御配列の指示の下でコード配列を発現させることができる構成を指す。

用語「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」とは、特定のヌクレオチド配列で又は特定のヌクレオチド配列の近傍で、二本鎖ＤＮＡを切断する酵素、典型的には細菌由来の酵素を指す。

類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリが本明細書で定義される。これらのファミリとして、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、グリシン）、β−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を伴うアミノ酸が挙げられる。

用語「試薬液」とは、ＰＣＲ目的で必要とされるか又は使用される、少なくとも１つの試薬を含有する任意の溶液である。最も典型的な成分は、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、プライマー、イオン、マグネシウム、塩類、ｐＨ緩衝剤、ヌクレオシドトリホスフェート（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ＮＴＰ）又はデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ：ｄＮＴＰ）、１つ以上の核酸プローブ、蛍光色素（プローブに結合してもよい）、核酸結合剤、核酸鋳型である。また、試薬は、ポリメラーゼ反応又はそのモニタリングに影響を与える他のポリメラーゼ反応添加剤であってもよい。

用語「マスタミックス」とは、ＰＣＲが起こるために必要な成分又は因子の全て又は大部分の混合物を指し、場合によっては、試料及びアンプリコンに特異的な鋳型及びプライマーを除く全ての混合物を指す。市販のマスタミックスは、通常、濃縮された溶液である。マスタミックスは、複数の試料に共通する全ての試薬を含有し得るが、１つの試料のみを対象に構成されていてもよい。マスタミックスを用いることで、ピペット操作の誤り、及びピペット操作された体積の違いによる試料間の差異を減らすことができる。

用語「熱安定性ポリメラーゼ」とは、熱に対して安定であり、耐熱性であり、かつ二本鎖核酸を変性するのに必要な時間にわたり高温に曝された後に、続いてプライマー伸長反応を行うのに充分な活性を保持する酵素を指す。核酸変性に必要な加熱条件は当技術分野で公知であり、米国特許第４，９６５，１８８号及び同第４，８８９，８１８号に例示されている。本明細書で使用される場合、熱安定性ポリメラーゼは、ＰＣＲのような温度サイクル反応で使用するのに適している。熱安定性核酸ポリメラーゼの例としては、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａポリメラーゼ、例えばＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、ＴＭＡ−３０ポリメラーゼ、及びＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼなどが挙げられる。

「逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ」とは、ＲＮＡ鋳型を基にＤＮＡを合成することができる核酸ポリメラーゼのことである。また、ＲＮＡが一本鎖ｃＤＮＡに逆転写されると、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを複製することができる。本発明の一実施形態では、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定性である。

ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅では、最初の伸長反応はＲＮＡ鋳型を用いた逆転写であり、ＤＮＡ鎖が生成される。ＤＮＡ鋳型を用いた第２の伸長反応は、二本鎖ＤＮＡ分子を生成する。このように、ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ鋳型からの相補的ＤＮＡ鎖の合成は、増幅のための出発物質を提供する。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、結合した一酵素逆転写／増幅反応（ｏｎｅ−ｅｎｚｙｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）に使用することができる。この文脈では、用語「均質型（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）」とは、ＲＮＡ標的の逆転写及び増幅のための２段階の単一付加反応を指す。均質型とは、逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ＲＴ）工程に続いて、増幅工程の前に反応容器を開けるか、又は反応成分を調整する必要がないことを意味する。非均質型ＲＴ−ＰＣＲ反応では、逆転写に続いて、増幅の前に、増幅試薬などの反応成分の１つ以上を、例えば、調整、添加、又は希釈し、反応容器を開けるか、又は少なくともその内容物を操作しなくてはならない。均質型の実施形態及び非均質型の実施形態の両方が、本発明の範囲によって構成される。

逆転写はＲＴ−ＰＣＲの重要な工程である。例えば、ＲＮＡ鋳型が、プライマー結合及び／又はそれぞれの逆転写酵素によるｃＤＮＡ鎖の伸長を妨げ得る二次構造の形成に向かう傾向を示すことは、当技術分野で知られている。したがって、ＲＴ反応のための比較的高い温度が、転写効率の点で有利である。一方で、高いインキュベーション温度はまた、より高い特異性、すなわち、予想される配列又は配列（複数）とのミスマッチを示す配列に対してＲＴプライマーがアニーリングしないことを示す。特に、複数の異なる標的ＲＮＡの場合では、単一のミスマッチを伴う配列を転写し、続いて増幅して検出することもまた、例えば、流体試料中に生物の未知又は稀な亜系又は亜種が存在する可能性がある場合には、望ましいことがある。

上述した両方の利点、すなわち二次構造の減少及びミスマッチ伴う鋳型の逆転写による利点を得るために、ＲＴインキュベーションは、２つ以上の異なる温度で実施することができる。

したがって、本発明の一態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼの該インキュベーションが、３０℃〜７５℃、又は４５℃〜７０℃まで、又は５５℃〜６５℃の異なる温度で行われる、上述の方法である。

逆転写の更なる重要な態様として、長いＲＴ工程は、流体試料中に存在し得るＤＮＡ鋳型を損傷する場合がある。流体試料がＲＮＡ及びＤＮＡの両方の種を含有する場合、したがってＲＴ工程の持続時間を可能な限り短く保つことが好ましいが、同時に、その後の増幅及び任意の増幅物の検出のために充分な量のｃＤＮＡの合成を確実にすることが好ましい。

したがって、本発明の一態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼをインキュベートする期間が、最大３０分、２０分、１５分、１２．５分、１０分、５分、又は１分である、上述の方法である。

本発明の更なる態様は、逆転写酵素活性を有し、かつ変異からなるポリメラーゼが、以下からなる群から選択される、上述の方法である。
（ａ）ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｂ）ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＮＡポリメラーゼ
（ｄ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼ
（ｅ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ
（ｆ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓＤＮＡポリメラーゼ
（ｇ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓＤＮＡポリメラーゼ
（ｈ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ｓｐｓ１７ＤＮＡポリメラーゼ
（ｉ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ
（ｊ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａＤＮＡポリメラーゼ
（ｋ）Ｔｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓＤＮＡポリメラーゼ
（ｌ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ

特に、ポリメラーゼドメインに変異を担持する酵素がこれらの要件に適しており、その逆転写効率をより速い伸長率の点で向上させる。

したがって、上記の方法では、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、それぞれの野生型ポリメラーゼと比較して改善された核酸伸長率及び／又は改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含む、ポリメラーゼである。

一実施形態では、上記の方法において、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、それぞれの野生型ポリメラーゼと比較して改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含む、ポリメラーゼである。
それらを特に有用にする点変異を担持するポリメラーゼは、国際公開第２００８／０４６６１２号に開示されている。特に、使用するポリメラーゼは、ポリメラーゼドメインに少なくとも以下：

Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘｂ７−Ｘｂ８−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎのモチーフを有する変異型ＤＮＡポリメラーゼであってもよく；ここで、Ｘｂ７は、Ｓ又はＴから選択されるアミノ酸であり、Ｘｂ８は、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、又はＬから選択されるアミノ酸であり、ポリメラーゼは、３’〜５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して核酸伸長率及び／又は逆転写効率が改善されており、該野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｘｂ８は、Ｄ、Ｅ、又はＮから選択されるアミノ酸である。

一例として、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐｅｃｉｅｓ Ｚ０５（例えば、米国特許第５，４５５，１７０号に記載）に由来する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異体が挙げられ、該変異体は、それぞれの野生型酵素Ｚ０５と比較して、ポリメラーゼドメインに変異を含む。本発明に係る方法に対する実施形態は、５８０位のアミノ酸が、Ｇ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、及びＬからなる群から選択される、変異体Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼである。

熱安定性ポリメラーゼを用いた逆転写について、Ｍｎ²⁺又はＭｇ²⁺などの二価カチオンは、例えば、塩化マンガン（ＭｎＣｌ₂）、又は酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）₂）、又は硫酸マンガン（ＭｎＳＯ₄）、又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ₂）、酢酸マグネシウム（Ｍｇ（ＯＡｃ）₂）、又は硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ₄）などの塩として、典型的に含まれる。ＭｎＣｌ₂が５０ｍＭのトリシン緩衝液を含有する反応に含まれる場合、例えば、ＭｎＣｌ₂は概して０．５〜７．０ｍＭの濃度で存在し、２００μＭの各ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、及びｄＣＴＰ、を利用する場合、概して２．５〜３．５ｍＭが存在する。

「修飾された」熱安定性ポリメラーゼとは、少なくとも１つのモノマーが参照配列と異なるポリメラーゼ、例えば、ポリメラーゼの天然型若しくは野生型の形態、又はポリメラーゼの別の修飾された形態を指す。例示的な修飾として、モノマーの挿入、欠失、及び置換が挙げられる。修飾ポリメラーゼはまた、２つ以上の親に由来する識別可能な成分配列（例えば、構造ドメイン又は機能ドメインなど）を有する、キメラポリメラーゼを含む。また、修飾ポリメラーゼの定義には、参照配列の化学修飾からなる定義も含まれる。修飾された熱安定性ポリメラーゼの例としては、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｌ３２９Ａ Ｄ６４０Ｇ Ｓ６７１Ｆ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ５ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｇ４６Ｅ Ｅ６７８Ｇ ＣＳ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼ、ΔＺ０５ポリメラーゼ、ΔＺ０５−Ｇｏｌｄポリメラーゼ、ΔＺ０５Ｒポリメラーゼ、Ｅ６１５Ｇ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅ６７８Ｇ ＴＭＡ−２５ポリメラーゼ、及びＥ６７８Ｇ ＴＭＡ−３０ポリメラーゼなどが挙げられる。

用語「熱活性ポリメラーゼ」とは、特異的なプライミング及びプライマー伸長を確実に行うために必要な高温（例えば、５５〜８０℃）で活性化される酵素を指す。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、交換可能に使用する。用語「核酸」及び「ポリヌクレオチド」は、交換可能に使用する。アミノ酸配列は、特に明記されない限り、アミノ末端からカルボキシ末端まで記載する。一本鎖核酸配列は、特に明記されない限り、５’〜３’と記載する。特に明記されない限り、二本鎖核酸配列の上鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）は５’〜３’と記載し、下鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）は特に示さない限り３’〜５’と記載する。

核酸増幅試薬は、典型的には、温度感受性の成分から構成され、したがって、周囲より充分に低い温度で貯蔵して輸送しなければならないことが多い。これは特に、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート又はそのリボヌクレオシド類似体の場合にある。これらの試薬は、末端からの連続したホスフェート基の喪失を介して分解されやすいことで、結果として、どちらもポリメラーゼ基質として活性ではないヌクレオシドジホスフェート及びモノホスフェートの両方を形成する。

末端ホスフェートをエステル化することによって、ヌクレオシドポリホスフェートの安定性を向上させることができる。例えば、末端ホスフェートにメチルエステルを含有するｄＮＴＰ類似体は、正常なｄＮＴＰを完全に分解するのに充分な熱ストレス条件下において完全に安定であった。しかしながら、末端ホスフェートのエステル化は、ある特定のポリメラーゼ酵素に有効な基質として働くヌクレオチドの能力に負の影響を及ぼし得る。

本発明は、この問題に対処するための単純かつ端麗な解決策を提示する。標準的なデキソヌクレオシドトリホスフェート（ｄｅｘｏｙｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）は、以下に示すように末端ホスフェートがフッ素部分を含有する類似体で置き換えられ、

式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である。

以下の実施例は、現在実施することが好ましい本発明の実施形態を例示するために示される。実施例は例示的なものであって、本発明は、添付の特許請求の範囲に示される場合を除いて、限定されたものとはみなされないことが理解されよう。

実施例１：２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）及び２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）の化学合成
２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）（ｄＮＴＰ−γＦ）及び２’−デオキシリボヌクレオシド５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）（ｄＮ４Ｐ−δＦ）の化学構造を図１に示し、ナトリウム塩としてのそれらの合成の概略図を、それぞれ図２及び図３に示す。

略記：ＤＥＰＣ＝ジエチルピロカーボネート、ｄＡＴＰ＝２’−デオキシアデノシン５’−トリホスフェート、ｄＣＴＰ＝２’−デオキシシチジン５’−トリホスフェート、ｄＧＴＰ＝２’−デオキシグアノシン５’−トリホスフェート、ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド、ｄＵＴＰ＝２’−デオキシウリジン５’−トリホスフェート、ＭｅＣＮ＝アセトニトリル、ｑＰＣＲ＝リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応、ＲＴ＝室温、ＲＴ−ｑＰＣＲ＝逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、ＴＢＡＦ＝テトラブチルアンモニウムフルオリド、ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン、ＵＰＬＣ−ＭＳ＝質量分析計に連結された超高性能液体クロマトグラフィ。

Ａ．２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）、ｄＡＴＰ−γＦの合成
ｄＡＴＰのナトリウム塩（１．５ｍｍｏｌ）をトリエチルアンモニウム塩に変換し、凍結乾燥した。化合物を乾燥ＭｅＣＮ中に溶解し、反応フラスコに移した。続いて、溶媒を蒸発させ、残渣を高真空下で乾燥させた。アルゴン下において、トリエチルアンモニウムトリホスフェートを、ＤＭＦ（７．７ｍＬ）とトリブチルアミン（９６８μＬ）との無水混合物中に溶解し、続いて、１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（５６２μＬ）を滴下した。即座に反応混合物の黄色への着色が観察され、数分以内に濃いオレンジ色になった。反応液を更に室温で３０分間撹拌し、続いて無水ＴＢＡＦ（４．４８ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）を加えた。室温で一晩撹拌した後に、ＵＰＬＣ−ＭＳ分析は、出発物質の完全な消費を示した。反応物の逆クエンチを、乾燥アセトン（２０ｍＬ、０．５Ｍ）中のヨウ化ナトリウムの撹拌溶液に反応液を滴下することにより実施した。沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで４分間）で単離し、上清を廃棄した。ペレットは、再懸濁と遠心分離とを繰り返すことによって、乾燥アセトンで洗浄した。原産物を乾燥し、逆相液体クロマトグラフィで精製した。合わせた生成物画分を、固相抽出（Ｃ₁₈）によって濃縮し、乾燥アセトン（０．５Ｍ）中においてヨウ化ナトリウムで沈殿させてナトリウム塩に変換した。最後に無色の生成物を、最終収率７３％で得た（純度９９％超）。

Ｂ．２’−デオキシシトシン５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）、ｄＣＴＰ−γＦの合成
合成を、ｄＣＴＰ（１．１１ｍｍｏｌ）、トリブチルアミン（７２０μＬ）、ＤＭＦ（５．８ｍＬ）、ＴＢＡＦ（３．３３ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）、及び１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（４１８μＬ）を用いて、実施例１Ａと同様に行った。１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥ＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）を添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率５５％で単離した（純度９９％超）。

Ｃ．２’−デオキシグアノシン５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）、ｄＧＴＰ−γＦの合成
合成を、ｄＧＴＰ（１．０９ｍｍｏｌ）、トリブチルアミン（７０６μＬ）、ＤＭＦ（５．６ｍＬ）、ＴＢＡＦ（３．３ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）、及び１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（４１０μＬ）を用いて、実施例１Ａと同様に行った。１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥ＤＭＳＯ（３．０ｍＬ）を添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率２７％で単離した（純度９９％超）。

Ｄ．２’−デオキシウリジン５’−Ｏ−（γ−フルオロトリホスフェート）、ｄＵＴＰ−γＦの合成
合成を、ｄＵＴＰ（１．０ｍｍｏｌ）、トリブチルアミン（６４９μＬ）、ＤＭＦ（５．２ｍＬ）、ＴＢＡＦ（３．０ｍＬ、ＴＨＦ中１．０Ｍ）、及び１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼン（３７７μＬ）を用いて、実施例１Ａと同様に行った。１−フルオロ−２，４−ジニトロベンゼンを導入する前に、乾燥ＤＭＳＯ（３．０ｍＬ）を反応混合物に添加して、出発物質の透明な溶液を得た。精製物のナトリウム塩を、最終収率４２％で単離した（純度９９％超）。

Ｅ．２’−デオキシアデノシン５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）、ｄＡ４Ｐ−δＦの合成
フルオロリン酸ナトリウム塩（３．９０９ｍｍｏｌ）を、陽イオン交換によってトリエチルアンモニウム塩に変換した。溶媒を蒸発させると無色の化合物が得られ、これを高真空下で乾燥させた。アルゴン下において、フルオロホスフェートを、ＤＭＳＯ（８．２ｍＬ）とＭｅＣＮ（５．０ｍＬ）との無水混合物中に溶解した。イミダゾール（１．３３ｇ）を加え、溶液を１０分間撹拌し、続いてトリフェニルホスフィン（２．５６３ｇ）及び２−アミノフェニルジスルフィド（１．４５６ｇ）を加えた。反応混合物を、全成分が完全に溶解するまで４０℃に加熱し、室温で一晩撹拌し続けた。反応の進行を、追加の生成物が形成されなくなるまでＵＰＬＣ−ＭＳによって追跡した。反応を、乾燥アセトン（３０ｍＬ、０．５Ｍ）中の冷たいヨウ化ナトリウムの撹拌溶液に滴下することで停止した。形成された沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで４分間）によって単離した。ペレットを乾燥アセトンで繰り返し洗浄した。合わせた上清を４℃で一晩冷却し、無色の生成物を更に沈殿させた。合わせたフルオロリン酸ナトリウムイミダゾリド塩の沈殿物を高真空下において乾燥させ、更に精製することなく使用した。

ｄＡＴＰのナトリウム塩（０．２５ｍｍｏｌ）をトリエチルアンモニウム塩に変換し、凍結乾燥した。残渣を乾燥ＭｅＣＮ中に溶解し、反応フラスコに移し、回転蒸発装置で溶媒を留去し、高真空下において乾燥させた。アルゴン下において、トリホスフェートを無水ＤＭＦ（１．６８ｍＬ）中に溶解した。第２のフラスコ中で、フルオロリン酸イミダゾリド塩（１．１２５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．６８ｍＬ）に溶解した。続いて、１．０ｍＬのイミダゾリド溶液をｄＡＴＰ溶液に滴下した。ＺｎＣｌ₂（２７３ｍｇ）を加え、混合物を室温で２．０時間撹拌した。その後、残りのイミダゾリド溶液を反応混合物に移し、反応の進行を、追加の生成物が生成されなくなるまでＵＰＬＣ−ＭＳによって追跡した。反応を、４．０ｍＬのＥＤＴＡ水溶液（０．５Ｍ、ｐＨ８．０）を加えて停止した。激しい撹拌を１５分間続け、その後、反応混合物を、乾燥アセトン（０．５Ｍ）中のヨウ化ナトリウムの攪拌溶液に滴下した。無色の沈殿物を遠心分離（４０００ｒｐｍで４分間）で単離し、上清を廃棄した。原産物を乾燥し、逆相液体クロマトグラフィで精製した。合わせた生成物画分を、固相抽出（Ｃ₁₈）によって濃縮し、乾燥アセトン（０．５Ｍ）中においてヨウ化ナトリウムで沈殿させてナトリウム塩に変換した。最後に無色の生成物を、反応収率６３％で得た（純度９８％超）。

Ｆ．２’−デオキシシトシン５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）、ｄＣ４Ｐ−δＦの合成
合成は、出発物質としてｄＣＴＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例１Ｅと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率２１％で単離した（純度９８％超）。

Ｇ．２’−デオキシグアノシン５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）、ｄＧ４Ｐ−δＦの合成
合成は、ＺｎＣｌ₂の添加前に１−メチル−２−ピロリドン（１．５ｍＬ）を反応混合物へ加えたことを除いて、出発物質としてｄＧＴＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を用いて、実施例１Ｅと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率２５％で単離した（純度９８％超）。

Ｈ．２’−デオキシウリジン５’−Ｏ−（δ−フルオロテトラホスフェート）、ｄＵ４Ｐ−δＦの合成
合成は、出発物質としてｄＵＴＰ（０．２５ｍｍｏｌ）を用いて実施例１Ｅと同様に実施した。精製物のナトリウム塩を、反応収率６８％で単離した（純度９９％超）。

実施例２：ｄＮＴＰ−γＦによる安定性試験
３００μＭのフルオロポリホスフェート、４０％のＤＭＳＯ、及び１．０Ｍの酢酸カリウムを含有する水性混合物を調製した。参照として、フルオロポリホスフェートの代わりに３００μＭのｄＮＴＰを用いた別の混合物を調製した。両溶液（３００μＬ）を、サーモシェーカ中で６５℃にてインキュベートした。いくつかの時点で、各溶液の試料（２０μＬ）を採取し、ＵＰＬＣ−ＭＳで分析した。２６０ｎｍでの吸収トレースのピーク面積を判定し、出発物質と分解生成物との相対的な割合を算出した。

結果：使用した条件下では、通常のｄＮＴＰは、ＵＰＬＣ−ＭＳによって確認されるように、モノホスフェート及びジホスフェートに迅速に分解した。対照的に、フルオロポリホスフェートは安定であり、分解生成物は６５℃で１４０時間にわたって観察されなかった（図４）。

実施例３：ＤＮＡ標的による増幅反応
定量的ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ：ｑＰＣＲ）の全成分を、ＤＥＰＣ処理水で調製した。ｑＰＣＲマスタ混合物（２０μＬ）、緩衝混合物（２０μＬ）、及びｄＮＴＰ混合物（１０μＬ）と称される３つの成分を組み合わせて、総量５０μＬのｑＰＣＲ混合物を調製した。ｑＰＣＲマスタ混合物は、トリシン緩衝液（ｐＨ８．２）、酢酸カリウム、グリセロール、ＤＭＳＯ、洗浄剤、標的ＤＮＡ（４００ｃｐ／反応）、ポリメラーゼアプタマ、Ｃｙ５．５標識プローブＤＮＡ、順方向及び逆方向プライマーＤＮＡ、ＳＹＢＲ^(商標)緑色素、並びにポリメラーゼ酵素を含有した。緩衝混合物は、酢酸マンガン（８．３ｍＭ）単独、又は酢酸マグネシウム（２．４９ｍＭ）とのブレンドのいずれかを含有した。ｄＮＴＰ混合物は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ（各２．０ｍＭ）、ｄＵＴＰ（４．０ｍＭ）を含有した。天然ｄＮＴＰの代わりにフルオロポリホスフェートを含有する別の溶液を、等濃度で調製した。ｑＰＣＲ混合物を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ製のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｐｙｒｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＴＩＰ）又はＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．製のＴｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ｒＴｈ）のいずれかである、熱安定性無機ピロホスファターゼの不在及び存在下において調製した。各ｑＰＣＲ混合物は、９６ウェルプレートのウェルで三重に調製した。プレートを密封し、ｑＰＣＲ増幅サイクルに供し、続いてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ^(商標)４８０システムでのＤＮＡ融解に供した。ｑＰＣＲ増殖曲線の分析は、Ｃｙ５．５チャネルで収集した蛍光データから行った。

結果：ｄＮ４Ｐ−δＦによる標的ＤＮＡのｑＰＣＲアッセイは、通常のｄＮＴＰと比較して同等又はより速いＣｔ（ΔＣｔ＝−１．５）を示し、ポリメラーゼ酵素が、同等又はそれ以上の効率で基質として、フッ素化ポリホスフェート類似体を受容することを実証した（図５及び図６）。その上、フルオロポリホスフェート切断生成物は、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素の効率的な基質である。このことは、ｄＮ４Ｐ−δＦ基質によるｑＰＣＲアッセイが、未修飾及びベンジル化プライマーと互換性があることを実証している。

実施例４：ａｒｍｏｒｅｄ ＲＮＡ標的による増幅反応
ｑＰＣＲ実験は、以下の変更を加えて実施例３と同様に実施した。標的ＤＮＡを同等の配列のＲＮＡで置換した。通常のサーモサイクリングの前に、逆転写（ＲＴ）工程を追加した。

結果：ｄＮ４Ｐ−δＦによるａｒｍｏｒｅｄ標的ＲＮＡのｑＰＣＲ−ＲＴは、通常のｄＮＴＰと比較して同等又はより速いＣｔ（ΔＣｔ＝−１．２）を示し、ポリメラーゼ酵素が、同等又はそれ以上の効率で逆転写反応における基質として、フッ素化ポリホスフェート類似体を受容することを実証した（図７及び図８）。その上、フルオロポリホスフェート切断生成物は、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素の効率的な基質である。このことは、ｄＮ４Ｐ−δＦ基質による逆転写ｑＰＣＲアッセイが、未修飾及びベンジル化プライマーと互換性があることを実証している。

Claims (22)

1. 試料中の標的核酸配列の存在又は不在を検出する方法であって、
   （ａ）前記標的核酸配列が前記試料中に存在する場合、前記試料を増幅試薬と接触させて増幅産物を生成することを含む、増幅工程を実施することと、
   （ｂ）前記増幅産物を検出することと、を含み、
   ここで、前記増幅試薬は、次の構造を有する修飾されたヌクレオシドポリホスフェートを含み、
   

   

   式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である、方法。
2. ｎ＝１である、請求項１に記載の方法。
3. ｎ＝２である、請求項１に記載の方法。
4. 前記増幅試薬が、熱安定性無機ピロホスファターゼを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記増幅試薬が、核酸ポリメラーゼを更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項５に記載の方法。
7. 増幅試薬を用いて標的核酸配列を増幅する方法であって、前記増幅試薬が、次の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートを含み、
   

   

   式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である、方法。
8. ｎ＝１である、請求項７に記載の方法。
9. ｎ＝２である、請求項７に記載の方法。
10. 前記増幅試薬が、熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を更に含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記増幅試薬が、核酸ポリメラーゼを更に含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項１１に記載の方法。
13. 核酸ポリメラーゼと、緩衝液と、下記の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートとを含む、標的核酸配列を増幅するための反応混合物であって、
    

    

    式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である、反応混合物。
14. ｎ＝１である、請求項１３に記載の反応混合物。
15. ｎ＝２である、請求項１３に記載の反応混合物。
16. 熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を更に含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の反応混合物。
17. 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の反応混合物。
18. 核酸ポリメラーゼと、緩衝液と、下記の構造を有するヌクレオシドポリホスフェートとを含む、標的核酸配列を増幅するためのキットであって、
    

    

    式中、Ｒ＝プリン若しくはピリミジン塩基又は類似体であり、ｎ＝１〜４である、キット。
19. ｎ＝１である、請求項１８に記載のキット。
20. ｎ＝２である、請求項１８に記載のキット。
21. 熱安定性無機ピロホスファターゼ酵素を更に含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載のキット。
22. 前記核酸ポリメラーゼが、逆転写酵素活性を持つ、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載のキット。

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