JP7084407B2 - 高い熱安定性を有する可逆的に保護されたヌクレオチド試薬 - Google Patents
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Description
別の態様において、本発明は:
別段の定めがない限り、本明細書中で用いられるすべての技術的及び科学的用語は本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと類似した本質的にあらゆる方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、単なる例示的方法及び材料を記載する。本発明に関して、以下の用語を定義する。
本発明のさらなる態様は、逆転写酵素活性を有し、変異を含むポリメラーゼが以下のものからなる群から選択される前述のプロセスである:
a)CS5 DNAポリメラーゼ
b)CS6 DNAポリメラーゼ
c)Thermotoga maritima DNAポリメラーゼ
d)Thermus aquaticus DNAポリメラーゼ
e)Thermus thermophilus DNAポリメラーゼ
f)Thermus flavus DNAポリメラーゼ
g)Thermus filiformis DNAポリメラーゼ
h)Thermus sp.sps17 DNAポリメラーゼ
i)Thermus sp.Z05 DNAポリメラーゼ
j)Thermotoga neapolitana DNAポリメラーゼ
k)Termosipho africanus DNAポリメラーゼ
l)Thermus caldophilus DNAポリメラーゼ
B=プリン又はピリミジン塩基又は類似体、
L=リンカー又は存在しない
Z=標識又は存在しない
R=OH又はO-
R1、R2=H又はOH
n=1~7
X=O、S又はNH
Y=化学的又は酵素的に除去できる有機基
好ましい実施形態
Y=HO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-,CH3C(O)-S-CH2CH2又はCH2CH2C(O)OCH2。
保護基は、初期反応、例えば還元剤との反応によってさらに分解して所望の活性なヌクレオチドをもたらす反応性中間体を生成するように選択される。還元剤は、ジスルフィドを還元することができる任意の試薬であり得る。そのような還元剤の数例は、β-メルカプトエタノール、ジチオトレイトール及びTCEP(トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン)である。
保護基は、初期酵素反応、例えばエステラーゼとの反応によって、さらに分解して所望の活性ヌクレオチドをもたらす反応性中間体を生じるように選択される。本発明の方法において、反応成分は、反応混合物が調製され試料が添加されるまでdNTP類似体が活性化酵素から離れて保持されるように構成されている。修飾ヌクレオシドポリリン酸、アセチル-チオエチル-dNTP(ATE-dNTP)を使用する酵素的活性化反応の一例を図2に示す。
dATP-2-ヒドロキシエチルジスルフィドエステル(HEDS-dATP)の調製を図3に示す。簡単に言うと、500μMのdATPを2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液pH4.5中に懸濁させ、0.82mMの2,2’-ジスルファンジイル-ビス(エタン-1-オール)とインキュベートし、続いて15分間氷中でインキュベーションをおこなった。次いで、増加量のEDC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N’-エチルカルボジイミド塩酸塩)を混合物に徐々に添加し、2.61mMの最終濃度に達した。反応混合物を室温で7日間インキュベートし、生成物を超高性能液体クロマトグラフィー(UPLC)によって分析した。約90%の収率の生成物HEDS-dATPが、このプロトコルを用いて産生された。
還元剤トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を使用して、60℃での熱処理によってHEDS-dATPをdATPに還元した。図4は、60℃での1mM TCEPの処理の0分、10分、20分、30分及び60分後にHEDS-dATPの変換を示すHPLCクロマトグラムを示す。ピーク1は中間生成物を表す。ピーク2は出発物質であるHEDS-dATPを表す。ピーク3は生成物であるdATPを表す。
PCR反応混合物を96ウェルプレート上で、以下の最終濃度で調製した:60mM トリシン(pH8.3)、120mM酢酸カリウム、3%グリセロール、5.4%DMSO、0.015%Tween20、標的HIV-1M鋳型(200コピー/反応)、各々600nMの順及び逆プライマー、100nMのTaqMan(登録商標)プローブ、900単位/mLのZO5D DNAポリメラーゼ(5’ヌクレアーゼ活性を有する)、200単位/mLのUNG、44μM EDTA、及び3.3mM酢酸マンガン。1つの反応セットでは、各々400μMのデオキシアデノシン三リン酸(dATP)、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)、デオキシシチジン三リン酸(dCTP)、及び800μMのデオキシウリジン三リン酸(dUTP)を添加し、別の反応セットでは、各々400μMのHEDS-dATP、HEDS-dGTP(dGTP-2-ヒドロキシエチルジスルフィドエステル)、HEDS-dCTP(dCTP-2-ヒドロキシエチルジスルフィドエステル)、及び800μMのHEDS-dUTP(dUTP-2-ヒドロキシエチルジスルフィドエステル)を添加した。
標準dNTP又はHEDS-dNTPのいずれかの形態のヌクレオシド三リン酸を37℃又は45℃のいずれかで22日間保存した。これらの保存したヌクレオシドトリスホスフェートをその後、HEDS-dNTPの活性化のための還元剤として1mM TCEPを用い、HIV-1M(反応あたり200コピー)、HIV-2(反応あたり100コピー)又は内部制御配列(IC、反応あたり1000コピー)を鋳型として使用して、実施例3で記載するようなアッセイ条件でPCR反応において利用した。これらの保存した試薬を使用するPCR増幅の効率は、平均Ct値(閾値サイクル数)として表され、図7(37℃でインキュベートした試薬について)及び図8(45℃でインキュベートした試薬について)中の棒グラフとして表す。結果は、37℃での保存において、標準dNTPは、HEDS-dNTPよりも高いCt値(1.9~3.9)を示し、おそらくは標準dNTPのある程度の分解のために、あまり効率的でない増幅を示した。45℃での保存について、標準dNTPを使用する3つの反応のうち2つは、HEDS-dNTPを使用する3つの反応はすべて、37℃で保存されたHEDS-dNTPとは有意に異ならないCt値を示した一方で、ほぼ完全な分解のために、成長曲線を生じなかった(図7と図8との間で暗灰色のバーを比較)。
Claims (14)
- 試料における標的核酸配列の存在又は非存在を検出する方法であって:
a)前記試料を増幅試薬と接触させて、前記標的核酸配列が前記試料中に存在する場合は増幅産物を産生することを含む増幅ステップを実施し、
b)前記増幅産物を検出することを含み、
前記増幅試薬は:
- X=Oであり、Yが還元剤によって化学的に除去できる、請求項1に記載の方法。
- 前記還元剤が、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、β-メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなる群より選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記ホスフィン誘導体がトリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)である、請求項3に記載の方法。
- X=Oであり、Yがエステラーゼにより酵素的に除去できる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記エステラーゼがカルボキシルエステラーゼである、請求項5に記載の方法。
- X=Oであり、Yが還元剤によって化学的に除去できる、請求項7に記載の方法。
- 前記還元剤が、ホスフィン誘導体、亜硫酸ナトリウム(Na2SO3)、β-メルカプトエタノール及びジチオトレイトールからなる群より選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記ホスフィン誘導体がトリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)である、請求項9に記載の方法。
- X=Oであり、Yがエステラーゼにより酵素的に除去できる、請求項7に記載の方法。
- 前記エステラーゼがカルボキシルエステラーゼである、請求項11に記載の方法。
- YがHO-CH2-CH2-S-S-CH2-CH2-である、請求項13に記載の修飾ヌクレオシドポリリン酸。
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