CN115074423A - 一种pcr缓冲液及其应用 - Google Patents

一种pcr缓冲液及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115074423A
CN115074423A CN202210737335.6A CN202210737335A CN115074423A CN 115074423 A CN115074423 A CN 115074423A CN 202210737335 A CN202210737335 A CN 202210737335A CN 115074423 A CN115074423 A CN 115074423A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
pcr buffer
hcl
comparative example
buffer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210737335.6A
Other languages
English (en)
Inventor
高静贤
闫泉
熊永清
甄博文
王莹
梁宁孝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd
Original Assignee
Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd filed Critical Aike Ruite Biomedical Technology Nanjing Co ltd
Priority to CN202210737335.6A priority Critical patent/CN115074423A/zh
Publication of CN115074423A publication Critical patent/CN115074423A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种PCR缓冲液及其应用，属于生物制品技术领域。本发明提供了一种PCR缓冲液，用本发明所述的缓冲液进行PCR扩增，可大大提高PCR扩增体系的稳定性和灵敏度，对难以扩增的样本模板具有更好的扩增效率。

Description

一种PCR缓冲液及其应用
技术领域
本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种PCR缓冲液及其制备方法和应用。
背景技术
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
PCR的用途：1、核酸的基础研究：基因组克隆2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序3、反向PCR测定未知DNA区域4、反转录PCR(RT-PCR)用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控6、cDNA末端快速扩增技术7、检测基因的表达8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学。
因此，获得准确的检测结果Ct值在临床诊断阶段非常重要。
因此，提供一种可大大提高PCR扩增体系的稳定性和灵敏度，对难以扩增的样本模板具有更好的扩增效率的PCR缓冲液非常重要。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了一种PCR缓冲液，可大大提高PCR扩增体系的稳定性和灵敏度，对难以扩增的样本模板具有更好的扩增效率。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种PCR缓冲液，由以下成分组成：100mM-500mM Tris-Hcl，20mM-50mM Kcl，1mM-10mM Mgcl2，10mM-50mM硫酸铵，100μM-500μM dNTP，1mM-5mM DTT，1％-5％DMSO，0.01％-0.05％吐温20，余量为无核酸酶水。
进一步，由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％vol DMSO，0.02％vol吐温20，余量为无核酸酶水。
进一步，所述PCR缓冲液的pH为7.5-9.0。
一种PCR缓冲液的制备方法，具体步骤如下：
(1)按具体浓度称量或稀释Tris-Hcl、Kcl、Mgcl2、硫酸铵、dNTP、DTT、DMSO、吐温20，溶于无核酸酶水；
(2)将溶解的溶液用pH计调节pH至7.5-9.0，优选地，调节pH至8.5；
(3)将调节pH后的溶液过0.22μM水系滤膜除菌，得PCR缓冲液。
进一步地，所述的一种PCR缓冲液的制备方法，还包括步骤(4)将所配制的PCR缓冲液液无菌无酶分装至冻存管，-20℃存储。
本发明的有益效果为：
本发明具有提高样本在QPCR反应中的扩增效率的优点，能够使同等浓度样本模板提前达到平台期。
能使QPCR具有更高的灵敏度，防止低浓度样本出现假阴性。
DTT是一种还原剂，DTT上的巯基可以保护逆转录所用酶的二硫键，增加稳定性。
DMSO、吐温20都是一种增强剂，能够提高试剂整体扩增效率。
附图说明
图1为实施例1、对比例1-7中所得PCR缓冲液对DNA病毒的QPCR扩增曲线图；
图2为实施例1、对比例1-7中所得PCR缓冲液对RNA病毒的QPCR扩增曲线图；
图3为实施例1-4中所得PCR缓冲液对RNA病毒的QPCR扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值。
以咽拭子样本为例，结合本发明的技术方案详细说明本发明的具体实施方式。
以下实施例中，若非特殊说明，各原料均为普通市售。
实施例1
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
PCR缓冲由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％vol DMSO，0.02％vol吐温20，余量为无核酸酶水。缓冲液pH 7.5，用1M Hcl和1M NaOH将缓冲液pH调整为8.5。
加入提取完成的DNA病毒核酸模板进行QPCR扩增。
实施例2
PCR缓冲由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％vol DMSO，0.02％vol吐温20，余量为无核酸酶水。缓冲液pH 7.5。
加入提取完成的DNA病毒核酸模板进行QPCR扩增。
实施例3
PCR缓冲由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％vol DMSO，0.02％vol吐温20，余量为无核酸酶水。缓冲液pH 7.5，用1M Hcl和1M NaOH将缓冲液pH调整为9.0。
加入提取完成的DNA病毒核酸模板进行QPCR扩增。
实施例4
PCR缓冲由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，1mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％vol DMSO，0.02％vol吐温20，余量为无核酸酶水。缓冲液pH 8.5。
加入提取完成的DNA病毒核酸模板进行QPCR扩增。
实施例1-实施例4的QPCR扩增图见图3，Ct值见表1
表1
Figure BDA0003716354210000031
由图3可知，实施例1的效果明显优于实施例2、3、4，故实施例1为最优方案。
对比例1
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
PCR缓冲由以下成分组成：150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，余量为无核酸酶水。缓冲液pH 7.5，用1M Hcl和1M NaOH将缓冲液pH调整为8.5。
加入提取完成的DNA病毒/RNA病毒核酸模板进行QPCR扩增。
对比例2
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本对比例和对比例1的区别在于，缓冲液pH调整为8.0，其他同对比例1。
对比例3
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本实施例和实施例1的区别在于，缓冲液pH调整为8.5，其他同对比例1。
对比例4
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本对比例和对比例1的区别在于，缓冲液pH调整为9.0，其他同对比例1。
对比例5
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本对比例和对比例3的区别在于，缓冲液中添加2mM DTT，其他同对比例3。
对比例6
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本对比例和对比例3的区别在于，缓冲液中添加3％vol DMSO，其他同对比例3。
对比例7
病原体核酸实时荧光定量PCR实验
本对比例和对比例3的区别在于，缓冲液中添加0.02％vol吐温20，其他同对比例3。
采用上述实施例1对比例1～7的PCR缓冲液进行qPCR检测，每个样本进行3次重复，Ct值取平均值，Ct值见表2。
表2不同PCR缓冲液获得的检测Ct值
Figure BDA0003716354210000041
扩增曲线见附图1、附图2。
从表2中数据可看出，采用本申请的PCR缓冲液，其中实施例1扩增效果最优。
其他对比例效果均不如实施例1的效果。
需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种PCR缓冲液，其特征在于，由以下组分组成：
100mM-500mM Tris-Hcl，20mM-50mM Kcl，1mM-10mM Mgcl2，10mM-50mM硫酸铵，100μM-500μM dNTP，1mM-5mM DTT，1％-5％vol DMSO，0.01％-0.05％vol吐温20，余量为无核酸酶水。
2.根据权利要求1所述的一种PCR缓冲液，其特征在于，由以下组分组成：
150mM Tris-Hcl，30mM Kcl，10mM Mgcl2，35mM硫酸铵，400μM dNTP，2mM DTT，3％DMSO，0.02％吐温20，余量为无核酸酶水。
3.根据权利要求1或2所述的一种PCR缓冲液，其特征在于，所述PCR缓冲液的pH为7.5-9.0。
4.一种如权利要求1-3任意一项所述的PCR缓冲液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按具体浓度称量或稀释Tris-Hcl、Kcl、Mgcl2、硫酸铵、dNTP、DTT、DMSO、吐温20，溶于无核酸酶水；
(2)将溶解的溶液用pH计调节pH至7.5-9.0；
(3)将调节pH后的溶液过0.22μM水系滤膜除菌，得PCR缓冲液。
5.根据权利要求4所述的一种PCR缓冲液的制备方法，其特征在于，步骤(2)中调节pH的试剂为1M Hcl和/或1M NaOH。
CN202210737335.6A 2022-06-27 2022-06-27 一种pcr缓冲液及其应用 Pending CN115074423A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210737335.6A CN115074423A (zh) 2022-06-27 2022-06-27 一种pcr缓冲液及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210737335.6A CN115074423A (zh) 2022-06-27 2022-06-27 一种pcr缓冲液及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115074423A true CN115074423A (zh) 2022-09-20

Family

ID=83255530

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210737335.6A Pending CN115074423A (zh) 2022-06-27 2022-06-27 一种pcr缓冲液及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115074423A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180741A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-25 Holly Hogrefe High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
CN102242188A (zh) * 2010-05-13 2011-11-16 上海星汉生物科技有限公司 可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂
CN107532210A (zh) * 2015-02-17 2018-01-02 塔驰莱特Ip有限公司 Dna合成的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030180741A1 (en) * 2001-12-21 2003-09-25 Holly Hogrefe High fidelity DNA polymerase compositions and uses therefor
CN102242188A (zh) * 2010-05-13 2011-11-16 上海星汉生物科技有限公司 可常温运输的高灵敏高特异性的基因诊断检测核心试剂
CN107532210A (zh) * 2015-02-17 2018-01-02 塔驰莱特Ip有限公司 Dna合成的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ZHENGNAN JIA等: "An Efficient Method for DNA Purification-Free PCR from Plant Tissue", CURR. PROTOC., vol. 1, no. 11, pages 289 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107299155B (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
CN107058623B (zh) 一种高度灵敏和特异的血液HBV pgRNA荧光定量PCR检测体系和检测方法
CN111534576B (zh) 用于荧光定量pcr的方法、组合物、试剂盒及其用途
CN108060269B (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
CN111334614A (zh) 一种采用RT-qPCR技术检测新型冠状病毒的方法
CN107988427A (zh) 对虾肝胰腺细小病毒（hpv）的raa恒温荧光检测方法及试剂
CN106636454B (zh) 一种同时检测人冠状病毒229e，oc43，nl63和hku1的实时荧光多重rt-pcr方法
EP2808387B1 (en) Oligonucleotide for hiv detection, hiv detection kit, and hiv detection method
CN116676428A (zh) 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒a型和b型的荧光定量pcr引物及方法
CN108070636A (zh) 一种荧光pcr扩增样本的处理方法和试剂盒
CN112575118A (zh) 一种利用熔解曲线同时检测多种腹泻病毒的方法
JP2018078806A (ja) ノロウイルスｒｎａの検出方法
CN115074423A (zh) 一种pcr缓冲液及其应用
KR101236197B1 (ko) 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단
US20050244813A1 (en) Detection of human papillomavirus e6 mrna
CN110607394A (zh) 莫洛尼鼠白血病病毒滴度检测试剂盒及滴度检测方法
CN108130385A (zh) 一种人巨细胞病毒核酸检测试剂盒
US20130122484A1 (en) Diagnostic method for determining animals persistently infected (pi) with bovine viral diarrhea virus (bvdv)
CN111378724B (zh) 一种rna放大检测方法及检测试剂盒
Callison et al. Rapid differentiation of avian infectious bronchitis virus isolates by sample to residual ratio quantitation using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction
JP2011135822A (ja) ＴＴＦ−１ｍＲＮＡの測定方法
JP6853523B2 (ja) ヘリカーゼを用いたｐｃｒ
CN113801966B (zh) 一种检测新型冠状病毒亚基因的荧光定量pcr方法及试剂盒
US20210214809A1 (en) One-step detection kit for molecular diagnostics of sars-cov-2 virus
CN113444842B (zh) 一种用于狐狸逆转录病毒检测的特异引物组及pcr检测试剂盒的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination