CN113106148A - 一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 - Google Patents
一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其中，所述检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物和CYP2C19*17测序引物。本发明采用样本处理液A快速样本释放出DNA，并通过样本处理液B中氯化钙与十二烷基硫酸锂产生不溶性钙盐沉淀中和表面活性剂，同时不溶性钙盐沉淀和Chelex‑100双重吸附血红素等DNA抑制物，快速得到质量较高的DNA模板，DNA模板通过非对称多重PCR一管扩增三个基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA，生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序流程和时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用，属于药物基因组检测领域。
背景技术
细胞色素P450，2C19(cytochrome P450 2C19，CYP2C19)是人体中重要的药物代谢酶，参与多种药物的代谢，如抗血小板聚集药物氯吡格雷等。氯吡格雷是治疗急性冠状动脉综合征和经皮冠状动脉介入术后抗栓的基础药物，但4％～30％患者在治疗期间出现氯吡格雷疗效下降，甚至出现氯吡格雷抵抗。氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。
CYP2C19有超过20多个位点突变，其中最常见的功能性缺失位点为CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)，以及一个常见的功能性获得位点CYP2C19*17(rs12248560，c.-806C>T)。CYP2C19酶有四种不同的代谢类型：超快代谢型(UM，*17/*17)；快代谢型(EM，*1/*1)；中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。中国人中CYP2C19弱代谢者表型几乎均为CYP2C19*2和CYP2C19*3，常规剂量的氯吡格雷在慢代谢型患者中产生的活性代谢物减少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓风险增加。ELEVATE-TIMI56试验结果表明CYP2C19*2等位基因携带者血小板反应性显著高于非携带者，CYP2C19*2杂合子携带者达到非携带者75mg标准剂量的血小板反应性需要3倍每日维持剂量(225mg)；而CYP2C19*2纯合子患者，即使氯吡格雷剂量达到4倍标准剂量(300mg)，仍达不到最佳血小板抑制程度。
2010年美国FDA修改的氯吡格雷说明书中黑框警示：CYP2C19基因型检测结果应作为医生调整治疗策略的参考。美国心脏病学学院/美国心脏学会(ACC/AHA)根据目前的多项临床试验的结果建议应用氯吡格雷而仍然发生心血管事件的患者，如果没有药物依从性方面的问题，应考虑增加氯吡格雷的剂量或应用其他药物，但需充分平衡缺血与出血风险。
目前，对于CYP2C19基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、芯片法、高分辨率熔解曲线法、等位基因特异性扩增法、taqman荧光探针法等。其中，测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，且扩增产物容易产生污染；芯片法涉及基因特异扩增、杂交、检测等多个步骤，可进行高通量分析，但其成本较高，检测步骤复杂且对样本数量有一定的要求；高分辨率熔解曲线法步骤简单，不需要做扩增后处理，但其不含特异性荧光探针，特异性偏低，且对仪器设备的要求较高；等位基因特异性扩增法采用ARMS引物进行特异扩增，操作方法简单，无需扩增后处理，但其引物设计难以最优化，检测条件要求严格，实际操作中容易出现引物错配而产生假阳。taqman荧光探针法操作方法简单，无需扩增后处理，但其试验成本高，对于多个基因的扩增通量不高。因此，需要建立一种简单、快速有效、价格低廉、特异性高的检测CYP2C19基因多态性的方法。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是以不对称PCR和焦磷酸检测为基础，获得一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用。
为实现上述发明目的之一，本发明采用的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的技术方案如下：
所述氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物、CYP2C19*17测序引物、阳性对照。
优选的，CYP2C19*2测序引物如序列表SEQ ID NO:1～3所示、CYP2C19*3测序引物如序列表SEQ ID NO:4～6所示、CYP2C19*17测序引物如序列表SEQ ID NO:7～9所示。具体的，所述特异性引物序列如下表1所示：
优选的，所述样本处理液A，包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
更优选的，所述样本处理液A，包括0.3％-0.5％十二烷基硫酸锂、0.2-0.4％曲拉通X-100、8-12mM甜菜碱、8-12％海藻糖、4～6mM BSA、50mM Tris-HCl、100mM NaCl，PH＝9。
优选的，所述的样本处理液B，包括1-3％Chelex-100、1-10％氯化钙。
更优选的，所述样本处理液B，包括1.8-2.2％Chelex-100、3-5％氯化钙。
优选的，所述的扩增反应液，包括CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物，还包括PCR Buffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖、无核酸酶水。
更优选的，反应液各组分浓度分别为：CYP2C19*2前引物(1.2uM)，CYP2C19*2后引物(0.03uM)，CYP2C19*3前引物(1.5uM)，CYP2C19*3后引物(0.04uM)，CYP2C19*17前引物(1.2uM)，CYP2C19*17后引物(0.03uM)，PCRBuffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL)。
优选的，所述的阳性对照，包括浓度均为105copies的CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型、CYP2C19*17野生型、CYP2C19*2突变型、CYP2C19*3突变型和CYP2C19*17突变型6种质粒等比混合而成的混合物。
本发明还公开了一种采用上述试剂盒的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
a.样本处理液A和EDTA抗凝全血或口腔拭子样本等比混合，室温静置5min，加入样本处理液B短暂离心后上清液作为DNA模板；
b.将扩增反应液与5ul待测模板混合，采用非对称多重PCR扩增进行扩增；
c.将反应产物进行焦磷酸测序；
d.确定CYP2C19*2位点、CYP2C19*3位点和CYP2C19*17位点的基因型。
优选的，所述的反应体积为25ul，扩增条件为：酶处理37℃3min；预变性95℃，5min；40个循环，95℃15s，60℃25s，72℃25s；最后延伸72℃4min。
本发明还公开了一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的应用，所述检测试剂盒对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17进行检测，以从基因层面反应氯吡格雷的代谢类型，进一步为指导氯吡格雷的剂量给出基因层面的建议。
与现有技术相比，本发明采用样本处理液A快速样本释放出DNA，并通过样本处理液B中氯化钙与十二烷基硫酸锂产生不溶性钙盐沉淀中和表面活性剂，同时不溶性钙盐沉淀和Chelex-100双重吸附血红素等DNA抑制物，快速得到质量较高的DNA模板。DNA模板通过非对称多重PCR一管扩增CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因位点，产生大量的生物素标记的单链DNA。生物素标记单链DNA与链霉亲和素结合，洗涤后加入测序引物和测序原料，进行焦磷酸测序，减少了强碱性试剂对扩增片段的损伤，简化了测序流程和时间。本发明以快速DNA制备、非对称多重PCR扩增和优化焦磷酸测序技术为组合对氯吡格雷剂量相关的基因多态性进行检测，试剂盒可同时检测3个核心位点，通过对核心位点CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17的基因型检测，为临床个性化用药给出基因角度的建议。
附图说明
图1是本发明提供的CYP2C19*2焦磷酸检测结果示例图；
图2是本发明提供的CYP2C19*3焦磷酸检测结果示例图；
图3是本发明提供的CYP2C19*17焦磷酸检测结果示例图；
图4是本发明提供的全血样本扩增电泳图；
图5是本发明提供的口腔拭子样本扩增电泳图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用作进一步详细、完整地说明。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为市场购买得到。
不对称PCR(asymmetric PCR)是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(SSDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50～100∶1。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。
一、特异性引物设计
本发明的试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计了特异性扩增引物和测序引物，用于焦磷酸PCR检测。基因多态性序列以Genebank内的公开序列为准，引物序列如下表1所示。
表1引物明细表
| 引物名称 | SEQ ID | 序列 | 标记 |
| CYP2C19*2-F1 | 1 | CAACCAGAGCTTGGCATATTGT | 生物素标记 |
| CYP2C19*2-R1 | 2 | CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC | |
| CYP2C19*2-S1 | 3 | TTAAGTAATTTGTTATGGGT | |
| CYP2C19*3-F1 | 4 | GCAATGTGATCTGCTCCATTATTT | |
| CYP2C19*3-R1 | 5 | GCAAAAAACTTGGCCTTACCTG | 生物素标记 |
| CYP2C19*3-S1 | 6 | ATTGTAAGCACCCCC | |
| CYP2C19*17-F1 | 7 | TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA | |
| CYP2C19*17-R1 | 8 | TGGCGCATTATCTCTTACATCA | 生物素标记 |
| CYP2C19*17-S1 | 9 | TGTGTCTTCTGTTCTCAAA |
二、试剂盒组成
检测试剂盒包括如下标2所示的组分：
表2试剂盒组分表
| 序号 | 组份 | 标示装量 |
| 1 | 样本处理液A | 2000μL×1管 |
| 2 | 样本处理液B | 300μL×1管 |
| 3 | 扩增反应液 | 430μL×1管 |
| 4 | CYP2C19*2测序引物 | 干粉 |
| 5 | CYP2C19*3测序引物 | 干粉 |
| 6 | CYP2C19*17测序引物 | 干粉 |
| 7 | 阳性对照 | 50μL×1管 |
本发明对所述质粒没有特殊限定，选取常规质粒进行上述基因重组质粒的构建方法即可，本发明对所述质粒的构建方法和表达方法均没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的重组质粒构建和表达方法即可。如质粒选择T载体，所述T载体与上述三种基因的野生型、突变型基因片段分别连接后，优选转化到complement大肠杆菌JM109中。三种阳性对照对应所检测基因位点的三种型别，对未知样本的型别判定提供参考，同时对反应液的有效性进行质控。
本实施例的检测试剂盒扩增反应液单人份配置体系如下：
CYP2C19*2前引物(1.2uM)，CYP2C19*2后引物(0.02uM)CYP2C19*3前引物(1.5uM)，CYP2C19*3后引物(0.03uM)，CYP2C19*17前引物(1.2uM)，CYP2C19*17后引物(0.03uM)，PCRBuffer(1.5×)，dNTPS(0.3mM)、HS-Taq酶(1U)，BSA(0.05mg/ml)，海藻糖(0.2％)，dUTP(0.5mM)、UDG酶(1U)和无核酸酶水(将体系补充至20μL)；PCR体系如表3所示：
表3PCR体系表
| 成分 | 体积(ul) |
| 水(自制) | 5.5 |
| 10×PCR buffer | 3.25 |
| dNTP(25mM) | 0.3 |
| CYP2C19*2-F(10μM) | 3 |
| CYP2C19*2-R(10μM) | 0.05 |
| CYP2C19*3-F(10μM) | 3.75 |
| CYP2C19*3-R(10μM) | 0.075 |
| CYP2C19*17-F(10μM) | 3 |
| CYP2C19*17-R(10μM) | 0.075 |
| BSA(5mg/ml) | 0.25 |
| 海藻糖(20％) | 0.25 |
| HS Taq(5U/μL) | 0.25 |
| UNG酶(5U/μL) | 0.25 |
以上引物探针购自生工、dNTP(25mM)购自诺唯赞、10×PCRbuffer、HS Taq(5U/μL)购自TAKARA、UNG酶(5U/μL)Thermo Fisher。
三、样本及处理方法
(1)EDTA抗凝全血处理方法
1)取50μL EDTA抗凝全血样品于EP管中；
2)并加入90μL样本处理液A，静置5min；
3)然后取10μL样本处理液B,于7000rpm/min离心2min；
4)取10μL上清加入20μL PCR反应液混合进行扩增，电泳结果如图4所示。
(2)口腔拭子样本处理方法
1)取口腔拭子样品于EP管中，12000rpm/min离心2min，弃去上清；
2)并加入90μL样本处理液A，静置5min；
3)然后取10μL样本处理液B,于7000rpm/min离心2min；
4)取10μL上清加入20μL PCR反应液混合进行扩增，电泳结果如图5所示。
四、焦磷酸测序
本发明中采用的仪器如下：PCR扩增仪：ABI 2720PCR仪；
焦磷酸测序仪：武汉菲思特生物科技有限公司。
(1)试剂准备(试剂准备室)
提前将试剂取出，室温融化，并将各组分涡旋振荡15秒，将试剂盒各组分低速离心15秒待用。
确定反应数N，N＝待检样本数(n)+质控品数(1)+空白对照。建议每次PCR实验同时进行阳性对照、空白对照分析。然后将反应液按20μL/管分装至PCR反应管中。
(2)加样检测(样本制备间)
将样本DNA、阳性对照和空白对照按5μL加样量加入到PCR反应管中，盖紧管盖，低速离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。
(3)PCR扩增(扩增间)
采用PCR仪进行PCR扩增，PCR反应体系为25μL，扩增条件：
(4)焦磷酸测序
1)在PCR反应管中加入结合液(含微珠)40μL，再向其中加入PCR产物20μL，置于台式振荡器上，1100rpm振荡10min，使微珠和生物素充分结合；
2)7,000×g离心1min，弃上清；
3)向EP管中加入150uL洗涤缓冲液，7000g离心1min，弃上清；
4)向EP管中加入退火缓冲液20μL混匀，分装到3个新的测序管；
5)测序管中分别加入1ul 3个待测位点的测序引物、3uL测序酶和3uL测序底物；
6)取一个dNTP排管，自圆滑一端向平端依次加入20μldATPαS、20μl dTTP、20μldGTP、20μl dCTP。将排管底部轻轻磕碰桌面，使得碱基平铺在排管底部；
7)根据仪器使用说明进行测序，仪器分配指令如下。
(5)结果判读
1)有效性判定：
本试剂盒空白对照品的不通过，阳性对照品的检出结果为杂合突变型。
2)结果判定标准
三个基因位点不同基因型的焦磷酸测序结果如图1～3所示。
a.CYP2C19*2的DNA测序峰值图中，
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即认为CYP2C19*2野生型；
40％≦C的频率≦60％，40％≦T的频率≦60％，即认为CYP2C19*2突变杂合型；
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即认为CYP2C19*2突变纯合型；
b.CYP2C19*3的DNA测序峰值图中，
G的频率≧90％，A的频率≦10％，即认为CYP2C19*3野生型；
40％≦G的频率≦60％，40％≦A的频率≦60％，即认为CYP2C19*3突变杂合型；
A的频率≧90％，G的频率≦10％，即认为CYP2C19*3突变纯合型。
c.CYP2C19*17的DNA测序峰值图中，
C的频率≧90％，T的频率≦10％，即认为CYP2C19*17野生型；
40％≦C的频率≦60％，40％≦T的频率≦60％，即认为CYP2C19*17突变杂合型；
T的频率≧90％，C的频率≦10％，即认为CYP2C19*17突变纯合型。
五、试剂盒的性能测试结果
5.1.特异性
对16份特异性样本(包括非人类DNA模板和人类同一基因不同位点或同源性位点扩增产物稀释物)进行检测，结果为阴性。
5.2.准确性
对试剂盒范围内的不同基因型的12份参考品(包括CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因)进行检测，应均能检出相应基因型。
5.3.最低检出限
最低检出限应不高于10ng/ul。
5.4.重复性
检测试剂盒范围内的不同基因型的重复性参考品，每个参考品进行10次检测，结果应均为相应突变类型，且相应检测通道的Ct值的变异系数(CV)应≤5.0％。
5.5.基因检测结果与代谢活性的相关性表
最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南菲思特精准医疗科技有限公司
<120> 一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒及其检测方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(22)
<400> 1
caaccagagc ttggcatatt gt 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(23)
<400> 2
cgcaagcagt cacataacta agc 23
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(20)
<400> 3
ttaagtaatt tgttatgggt 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(24)
<400> 4
gcaatgtgat ctgctccatt attt 24
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(22)
<400> 5
gcaaaaaact tggccttacc tg 22
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(15)
<400> 6
attgtaagca ccccc 15
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(23)
<400> 7
tgatggagaa gggagaactc tta 23
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(22)
<400> 8
tggcgcatta tctcttacat ca 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> unsure
<222> (1)..(19)
<400> 9
tgtgtcttct gttctcaaa 19
Claims (10)
1.一种氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17三个基因的多态性设计特异性扩增引物和测序引物，所述试剂盒包括如下组分：样本处理液A、样本处理液B、扩增反应液、CYP2C19*2测序引物、CYP2C19*3测序引物和CYP2C19*17测序引物。
2.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述CYP2C19*2测序引物如序列表SEQ ID NO:1～3所示、CYP2C19*3测序引物如序列表SEQ IDNO:4～6所示、CYP2C19*17测序引物如序列表SEQ ID NO:7～9所示。
3.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照，阳性对照包括浓度均为105copies的CYP2C19*2野生型、CYP2C19*3野生型、CYP2C19*17野生型、CYP2C19*2突变型、CYP2C19*3突变型和CYP2C19*17突变型6种质粒等比混合而成的混合物。
4.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液A，包括0.1％-0.6％十二烷基硫酸锂、0.1-0.5％曲拉通X-100、5-15％海藻糖、3～7mmol/L BSA、20-80mM Tris-HCl和100mM NaCl，PH＝8.5-9.5。
5.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述样本处理液B包括1-3％Chelex-100和1-10％氯化钙。
6.根据权利要求1所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒，其特征在于，所述扩增反应液包括PCRBuffer、dNTPS、HS-Taq、BSA、dUTP、UDG酶、海藻糖和无核酸酶水。
7.一种采用根据权利要求1～6任一项所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：
a)样本处理：样本处理液A和EDTA抗凝全血或口腔拭子样本等比混合，室温静置5min，加入样本处理液B短暂离心后上清液作为DNA模板；
b)扩增：将扩增反应液与5ul待测模板混合，采用非对称多重PCR扩增进行扩增；
c)焦磷酸测序：将反应产物进行焦磷酸测序，确定CYP2C19*2位点、CYP2C19*3位点和CYP2C19*17位点的基因型。
8.根据权利要求7所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述非对称多重PCR扩增体系为20μL体系，体系中各组分浓度如下：CYP2C19*2前引物1.2uM，CYP2C19*2后引物0.03uM，CYP2C19*3前引物1.5uM，CYP2C19*3后引物0.04uM，CYP2C19*17前引物1.2uM，CYP2C19*17后引物0.03uM，PCR Buffer 1.5×，dNTPS 0.3mM、HS-Taq酶1U，BSA0.05mg/ml，海藻糖0.2％，dUTP0.5mM、UDG酶1U和无核酸酶水将体系补充至20μL。
9.根据权利要求7所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述非对称多重PCR扩增条件为：酶处理37℃3min；预变性95℃，5min；40个循环，95℃15s，60℃25s，72℃25s；最后延伸72℃4min。
10.一种根据权利要求1～6任一所述的氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒的应用，其特征在于，所述氯吡格雷剂量相关的基因多态性检测试剂盒用于检测样本的CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的基因型，以判断氯吡格雷的代谢类型。
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