CN107287299A - 基于焦磷酸测序技术的用于cyp2c19基因多态性快速检测的方法 - Google Patents

基于焦磷酸测序技术的用于cyp2c19基因多态性快速检测的方法 Download PDF

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CN107287299A CN201710499943.7A CN201710499943A CN107287299A CN 107287299 A CN107287299 A CN 107287299A CN 201710499943 A CN201710499943 A CN 201710499943A CN 107287299 A CN107287299 A CN 107287299A
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Abstract

本发明公开的是基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：S1：基因组DNA的提取；S2：CYP2C19多态性位点的引物设计；S3：PCR扩增反应；S4：焦磷酸测序；S5：基因型分析；S6：Sanger测序验证；上述CYP2C19多态性位点的引物包括CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列及焦磷酸测序引物，本发明所建立的焦磷酸测序检测方法可对CYP2C19基因进行快速、准确的分型，具有快速、准确、成本低的特点。

Description

基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的 方法
技术领域
本发明涉及分子生物学检验技术领域，具体是涉及基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法。
背景技术
检测CYP2C19多态性的方法除了金标准Sanger测序技术外，常用的还有限制性片段长度多态分析、飞行时间质谱[6]、DNA微阵列芯片、高分辨率熔解曲线分析、Taqman探针等技术[10]。这些技术对CYP2C19的基因分型都具有较高的准确性，但均存在一些不足，操作步骤较为繁琐，或是需要依赖昂贵的仪器，检测成本较高，不适合规模的推广应用。为适应临床对CYP2C19基因多态性检测的需要，有必要建立一种高效、快速、准确度高、灵敏度好、经济适用的检测方法。
焦磷酸测序是一种基于DNA序列分析的技术，是检测SNP最为准确的方法之一[7]，该方法适用于对已知短序列的测序分析，其敏感性和精确性能与金标准(Sanger测序法)相提并论，并能够实时、直观、准确、定量的提供待测序列的信息[8]，已广泛用于基因多态性检测、微生物分型、基因甲基化检测等领域[9]。
氯吡格雷是临床上常用的抗血小板聚集的药物之一，冠状动脉介入术(PCI)后患者需长期服用氯吡格雷来进行抗血小板治疗[1]。但临床上部分患者会出现氯吡格雷抵抗[4]，仍然会有心血管血栓事件的发生。氯吡格雷的主要代谢酶为细胞色素P4502C19，其编码基因CYP2C19的多态性是影响氯吡格雷疗效的主要遗传因素[2-3]。CYP2C19的等位基因以CYP2C19*1(野生型)、CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)较常见。基因型为CYP2C19*1/*17、CYP2C19*17*17的患者，其代谢型为超快代谢；基因型为CYP2C19*1/*1的患者，其代谢型为快代谢；基因型为CYP2C19*1/*2、CYP2C19*1/*3的患者，其代谢型为中代谢；基因型为CYP2C19*2/*2、CYP2C19*3/*3和CYP2C19*2/*3的患者，其代谢型为慢代谢。
因此，临床上应根据患者CYP2C19的基因型，指导氯吡格雷的个体化用药。为使临床实验室能快速检测CYP2C19的基因型，本发明拟采用焦磷酸测序技术建立一种CYP2C19基因多态性检测方法，并用Sanger测序法对其准确性进行验证。
发明内容
本发明提供的是基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，具有快速、准确、成本低的特点，适用于临床实验室对CYP2C19基因多态性的分型。
本发明的技术方案是：
基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；
S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：
在NCBI上下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMark Assay DesignSoftware2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物：
PCR引物包括：
PCR引物1(SEQNO1)：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；
PCR引物2(SEQNO2)：
CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；
PCR引物3(SEQNO3)：
CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；
PCR引物4(SEQNO4)：
CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；
PCR引物5(SEQNO5)：
CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；
PCR引物6(SEQNO6)：
CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；
焦磷酸测序引物包括：
测序引物1(SEQNO7)：
CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；
测序引物2(SEQNO8)：
CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；
测序引物3(SEQNO9)：
CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；
所述Bio为生物素标记；
S3：PCR扩增反应；
S4：焦磷酸测序：
1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；
2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；
3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(15℃-25℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；
S5：基因型分析：
焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；
S6：Sanger测序验证：
将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物送上海生工生物有限公司采用Sanger测序法进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。
进一步地，在上述方案中，S2中所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃。
进一步地，在上述方案中，S2中所述CYP2C19*2的产物长度为289bp，CYP2C19*3的产物长度为249bp，CYP2C19*17的产物长度为248bp。
进一步地，在上述方案中，S3中所述PCR扩增反应体系如表1所示：
表1PCR扩增反应体系
进一步地，在上述方案中，S3中所述PCR扩增反应条件如表2所示：
表2PCR扩增反应条件
进一步地，在上述方案中，S3中在所述PCR扩增反应后进行PCR产物凝胶电泳分析：PCR产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的片段。
进一步地，在上述方案中，步骤S1中所述DNA提取试剂盒包括:
试剂A：裂解缓冲液；
试剂B：吸附剂；
试剂C：漂洗缓冲液；
试剂D：洗脱缓冲液；
所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠2-5％、柠檬酸钠0.4-0.7％、变性剂2-4.5％、还原剂0.05-0.25％、乙二胺四乙酸0.15-1.25％、离子型表面活性剂2.3-3.0％、无水乙醇22-38％，余量为超纯水；
所述吸附剂为纳米磁珠；
所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10-20；
所述洗脱缓冲液为：0.5％(wt)氢氧化钠。
优选地，所述变性剂为硫氰酸胍或异硫氰酸胍。
优选地，所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽(GST)或半胱氨酸中任意一种。
优选地，所述离子型表面活性剂为DTAC、CTAB、CPB或OPB中任意一种。
优选地，所述纳米磁珠为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为110-400nm。
更进一步的，所述DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.5-8、7.0-7.5和7.8-8.2之间，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4至-20℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入1.7-2.5mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37-42℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7-10％；
(5)将样品管放入离心机内，以10000-15000r/min转速离心1-2min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000-15000r/min转速离心1-3min,弃掉上清液，重复此步骤1-3次；
(7)在25-30℃温度下干燥3-6min后，加入120-200μl所述洗脱缓冲液，在50-55℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以10000-15000r/min转速离心1-3min,取上清液，得到所述基因组DNA。
本发明的有益效果是：本发明所建立的焦磷酸测序检测方法可对CYP2C19基因进行快速、准确的分型。PCR扩增结束后，可20分钟内对24个标本进行平行检测，检测结果与Sanger测序结果完全一致，并且检测成本低于Sanger测序法。另外，由于人群中等位基因CYP2C19*17的频率较低，其他方法较少对其进行检测。而携带有CYP2C19*17的患者属于超快代谢型，氯吡格雷的用量应相应减少。因此，本研究建立的检测方法可更为全面地指导氯吡格雷的个体化用药。
附图说明
图1是PCR扩增后的电泳结果，其中，A：CYP2C19*2(681G>A)；B：CYP2C19*3(636G>A)；C：CYP2C19*17(-806C>T)；M：50bp DNA Marker；
图2是CYP2C19*2(681G>A)焦磷酸测序与Sanger测序结果对比图；
图3CYP2C19*3(636G>A)焦磷酸测序与Sanger测序结果对比图；
图4CYP2C19*17(-806C>T)焦磷酸测序与Sanger测序结果对比图；
具体实施方式
实施例1：
基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；
S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：
在NCBI上下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMark Assay DesignSoftware2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物：
PCR引物包括：
PCR引物1(SEQNO1)：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；
PCR引物2(SEQNO2)：
CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；
PCR引物3(SEQNO3)：
CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；
PCR引物4(SEQNO4)：
CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；
PCR引物5(SEQNO5)：
CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；
PCR引物6(SEQNO6)：
CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；
焦磷酸测序引物包括：
测序引物1(SEQNO7)：
CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；
测序引物2(SEQNO8)：
CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；
测序引物3(SEQNO9)：
CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；
所述Bio为生物素标记；
所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃；所述CYP2C19*2的产物长度为289bp，CYP2C19*3的产物长度为249bp，CYP2C19*17的产物长度为248bp；
S3：PCR扩增反应；
所述PCR扩增反应体系如表1所示：
表1PCR扩增反应体系
试剂 体积
PyroMark PCR Master Mix 12.5μL
CoraLoad Concentrate 2.5μL
Q-Solution 5μL
25mM MgCl2 1.5μL
上游PCR引物 0.5μL
下游PCR引物 0.5μL
DNA 1μL
RNase-free water 1.5μL
总体积(μL) 25μL
PCR扩增反应条件如表2所示：
表2PCR扩增反应条件
在所述PCR扩增反应后进行PCR产物凝胶电泳分析：PCR产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的片段。
S4：焦磷酸测序：
1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；
2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；
3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(15℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；
S5：基因型分析：
焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；
S6：Sanger测序验证：
将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物送上海生工生物有限公司采用Sanger测序法进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。
其中，步骤S1中所述DNA提取试剂盒包括:
试剂A：裂解缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠2％、柠檬酸钠0.4％、硫氰酸胍2％、二硫苏糖醇(DTT)0.05％、乙二胺四乙酸0.15％、DTAC2.3％、无水乙醇22％，余量为超纯水；
试剂B：吸附剂，所述吸附剂为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为110nm；
试剂C：漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10；
试剂D：洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为：0.5％(wt)氢氧化钠。
该DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.5、7.0和7.8，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-20℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入1.7mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到37℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的7％；
(5)将样品管放入离心机内，以10000r/min转速离心1min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2ml所述漂洗缓冲液重悬，以10000r/min转速离心1min,弃掉上清液，重复此步骤1次；
(7)在25℃温度下干燥3min后，加入120μl所述洗脱缓冲液，在50℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以10000r/min转速离心1min,取上清液，得到所述基因组DNA。
实施例2：
基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；
S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：
在NCBI上下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMark Assay DesignSoftware2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物：
PCR引物包括：
PCR引物1(SEQNO1)：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；
PCR引物2(SEQNO2)：
CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；
PCR引物3(SEQNO3)：
CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；
PCR引物4(SEQNO4)：
CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；
PCR引物5(SEQNO5)：
CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；
PCR引物6(SEQNO6)：
CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；
焦磷酸测序引物包括：
测序引物1(SEQNO7)：
CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；
测序引物2(SEQNO8)：
CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；
测序引物3(SEQNO9)：
CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；
所述Bio为生物素标记；
所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃；所述CYP2C19*2的产物长度为289bp，CYP2C19*3的产物长度为249bp，CYP2C19*17的产物长度为248bp；
S3：PCR扩增反应；
所述PCR扩增反应体系如表1所示：
表1PCR扩增反应体系
试剂 体积
PyroMark PCR Master Mix 12.5μL
CoraLoad Concentrate 2.5μL
Q-Solution 5μL
25mM MgCl2 1.5μL
上游PCR引物 0.5μL
下游PCR引物 0.5μL
DNA 1μL
RNase-free water 1.5μL
总体积(μL) 25μL
PCR扩增反应条件如表2所示：
表2PCR扩增反应条件
在所述PCR扩增反应后进行PCR产物凝胶电泳分析：PCR产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的片段。
S4：焦磷酸测序：
1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；
2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；
3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(20℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；
S5：基因型分析：
焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；
S6：Sanger测序验证：
将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物送上海生工生物有限公司采用Sanger测序法进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。
其中，步骤S1中所述DNA提取试剂盒包括:
试剂A：裂解缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠3.5％、柠檬酸钠0.55％、异硫氰酸胍3.25％、还原型的谷胱甘肽(GST)0.15％、乙二胺四乙酸0.20％、CPB2.65％、无水乙醇30％，余量为超纯水；
试剂B：吸附剂，所述吸附剂为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为300nm；
试剂C：漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:15；
试剂D：洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为：0.5％(wt)氢氧化钠。
该DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至7.8、7.2和8.0，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于-8℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入2.1mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到40℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的8.5％；
(5)将样品管放入离心机内，以12500r/min转速离心1.5min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2.5ml所述漂洗缓冲液重悬，以12500r/min转速离心2min,弃掉上清液，重复此步骤2次；
(7)在27℃温度下干燥4min后，加入160μl所述洗脱缓冲液，在52℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以12500r/min转速离心2min,取上清液，得到所述基因组DNA。
实施例3：
基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；
S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：
在NCBI上下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，采用PyroMark Assay DesignSoftware2.0(德国凯杰公司)软件设计PCR引物和焦磷酸测序引物：
PCR引物包括：
PCR引物1(SEQNO1)：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；
PCR引物2(SEQNO2)：
CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；
PCR引物3(SEQNO3)：
CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；
PCR引物4(SEQNO4)：
CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；
PCR引物5(SEQNO5)：
CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；
PCR引物6(SEQNO6)：
CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；
焦磷酸测序引物包括：
测序引物1(SEQNO7)：
CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；
测序引物2(SEQNO8)：
CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；
测序引物3(SEQNO9)：
CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；
所述Bio为生物素标记；
所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃；所述CYP2C19*2的产物长度为289bp，CYP2C19*3的产物长度为249bp，CYP2C19*17的产物长度为248bp；
S3：PCR扩增反应；
所述PCR扩增反应体系如表1所示：
表1PCR扩增反应体系
PCR扩增反应条件如表2所示：
表2PCR扩增反应条件
在所述PCR扩增反应后进行PCR产物凝胶电泳分析：PCR产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的片段。
S4：焦磷酸测序：
1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；
2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；
3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(25℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；
S5：基因型分析：
焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；
S6：Sanger测序验证：
将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物送上海生工生物有限公司采用Sanger测序法进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。
其中，步骤S1中所述DNA提取试剂盒包括:
试剂A：裂解缓冲液，所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠5％、柠檬酸钠0.7％、硫氰酸胍4.5％、半胱氨酸0.25％、乙二胺四乙酸1.25％、OPB 3.0％、无水乙醇38％，余量为超纯水；
试剂B：吸附剂，所述吸附剂为超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，直径为400nm；
试剂C：漂洗缓冲液，所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:20；
试剂D：洗脱缓冲液，所述洗脱缓冲液为：0.5％(wt)氢氧化钠。
该DNA提取试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)将所述裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液分别调节PH至8、7.5和8.2，并分别通过0.45μm滤膜除菌，得到除菌后的裂解缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液，置于4℃备用；
(2)提取全血200μL放入样品管内；
(3)在所述样品管内加入2.5mL所述除菌后的裂解缓冲液，放入到42℃水浴中充分反应；
(4)加入所述超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠，并充分混合，超顺磁性四氧化三铁石墨烯纳米微珠的加入量为步骤(3)中所述除菌后的裂解缓冲液质量的10％；
(5)将样品管放入离心机内，以15000r/min转速离心2min,离心结束后弃掉上清液；
(6)使用2-3ml所述漂洗缓冲液重悬，以15000r/min转速离心3min,弃掉上清液，重复此步骤3次；
(7)在30℃温度下干燥6min后，加入200μl所述洗脱缓冲液，在50-55℃水浴温度下溶解；
(8)再使用离心机，以15000r/min转速离心3min,取上清液，得到所述基因组DNA。
实验验证：
一、一般材料
1.1研究对象
来自贵州省人民医院健康体检的成人50例，其中男21例，女29例，平均年龄(35.7±9.7)岁。
1.2主要试剂和仪器
NP968核酸自动提取仪(西安天隆科技有限公司)；美国ABI Veriti96 PCR仪(美国ABI生物系统公司)；Qiagen PyroMark Q24焦磷酸测序仪(德国凯杰公司)；核酸分析仪(德国Eppendorf公司)；PCR扩增引物和焦磷酸测序引物(上海生工生物有限公司)。
采用上述实施例1的方法进行检测，结果如下：
1.PCR结果
电泳结果显示3个SNP位点的PCR产物均在相应位置呈单一条带(如图1所示)。
2. 3个位点的基因型检测结果
CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点均可通过出峰的碱基和峰高清楚判断出不同的基因型，信噪比较高，非特异峰的比例均在10％以内。50个样本中3个位点的基因型与Sanger测序结果完全一致(见图2-图4)。
3. 50例样本CYP2C19基因型检测结果
根据3个SNP位点的检测结果，可以得出每个样本的CYP2C19基因型，并判断出其代谢类型。50例健康体检者中检出超快代谢型1例，快代谢型22例，中代谢性22例，慢代谢型5例(表3)。CYP2C19的4种等位基因频率见表4，野生型CYP2C19*1所占比例为67.0％，其次是CYP2C19*2占29.0％。
表3 50例健康体检者的CYP2C19代谢性与基因型分布情况
表4 50例健康体检者CYP2C19等位基因型频率
结果显示，所建立的焦磷酸测序检测方法可对CYP2C19基因进行快速、准确的分型。PCR扩增结束后，可20分钟内对24个标本进行平行检测，检测结果与Sanger测序结果完全一致，并且检测成本低于Sanger测序法。另外，由于人群中等位基因CYP2C19*17的频率较低，其他方法较少对其进行检测。而携带有CYP2C19*17的患者属于超快代谢型，氯吡格雷的用量应相应减少。因此，本研究建立的检测方法可更为全面地指导氯吡格雷的个体化用药。
序列表
<110> 贵州省人民医院
<120> 基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法
<130> 无
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*2（rs4244285）上游引物
<400> 1
ccagagcttg gcatattgta tcta 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*2（rs4244285）下游引物
<313> (1)..(23)
<400> 2
cgcaagcagt cacataacta agc 23
<210> 3
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*3（rs4986893）上游引物
<313> (1)..(10)
<400> 3
tccctgcaat gtgatctgct 10
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(24)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*3（rs4986893）下游引物
<400> 4
TGGCTGTCTA GGCAAGACTG TAGT
tggctgtcta ggcaagactg tagt 24
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(23)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*17（rs12248560）上游引物
<400> 5
tcatggagaa gggagaactc tta 23
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(22)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*17（rs12248560）下游引物
<400> 6
tggcgcatta tctcttacat ca 22
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*2测序引物
<400> 7
aagtaatttg ttatgggttc 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(26)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*3测序引物
<400> 8
AACTTGGCCT TACCTG
aacttggcct tacctg 16
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 根据实验要求而设计，作为CYP2C19*17测序引物
<400> 9
ttgtgtcttc tgttctcaa 19

Claims (10)

1.基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：基因组DNA的提取：取全血200μL，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，对DNA样本进行浓度和纯度检测，置于-20℃保存备用；
S2：CYP2C19多态性位点的引物设计：
下载CYP2C19*2(rs4244285)、CYP2C19*3(rs4986893)、CYP2C19*17(rs12248560)位点上下游各1kb范围的基因序列，设计PCR引物和焦磷酸测序引物：
PCR引物包括：
PCR引物1(SEQNO1)：
CYP2C19*2(rs4244285)上游引物5’Biotin-CCAGAGCTTGGCATATTGTATCTA；
PCR引物2(SEQNO2)：
CYP2C19*2(rs4244285)下游引物CGCAAGCAGTCACATAACTAAGC；
PCR引物3(SEQNO3)：
CYP2C19*3(rs4986893)上游引物5’Biotin-TCCCTGCAATGTGATCTGCT；
PCR引物4(SEQNO4)：
CYP2C19*3(rs4986893)下游引物TGGCTGTCTAGGCAAGACTGTAGT；
PCR引物5(SEQNO5)：
CYP2C19*17(rs12248560)上游引物TGATGGAGAAGGGAGAACTCTTA；
PCR引物6(SEQNO6)：
CYP2C19*17(rs12248560)下游引物5’Biotin-TGGCGCATTATCTCTTACATCA；
焦磷酸测序引物包括：
测序引物1(SEQNO7)：
CYP2C19*2测序引物AAGTAATTTGTTATGGGTTC；
测序引物2(SEQNO8)：
CYP2C19*3测序引物AACTTGGCCTTACCTG；
测序引物3(SEQNO9)：
CYP2C19*17测序引物TTGTGTCTTCTGTTCTCAA；
所述Bio为生物素标记；
S3：PCR扩增反应；
S4：焦磷酸测序：
1)制备预混液以固定PCR产物：80μl的反应体系包括Beads2μl，Bindingbuffer40μl，PCR产物10μl，高纯水28μl；
2)单链的分离：将测序引物稀释到0.3uM，并分配25μl到q24反应板的每个孔中，确保PCR管与q24反应板在上样时的方向相同。打开开关，将真空工具放到PCR管的孔中，持续15S，以捕获带有PCR产物的sepharose珠；用70％以纯冲洗真空工具5S；用变性溶液冲洗真空工具5S；用洗涤液冲洗真空工具10S；将真空工具提升到超过90度垂直，持续5S；关闭真空开关。将真空工具放到孔中，左右轻柔晃动，以释放含有磁珠的产物；
3)测序引物与DNA链退火：将q24反应板至于预热的q24板架上，在80℃加热块上加热焦磷酸测序样本2分钟，样本冷却至室温(15℃-25℃)后即可放入焦磷酸测序仪内测序；
S5：基因型分析：
焦磷酸测序结束后，通过Qiagen PyroMark Q24(德国凯杰公司)软件对结果进行分析，根据出峰的碱基和峰高分别判断各位点的基因型；其中，CYP2C19*2和CYP2C19*3为反向测序，CYP2C19*17为正向测序；每个样本结合CYP2C19*2、CYP2C19*3和CYP2C19*17的检测结果得出该样本CYP2C19的基因型；
S6：Sanger测序验证：
将CYP2C19*2(681G>A)、CYP2C19*3(636G>A)和CYP2C19*17(-806C>T)3个SNP位点的PCR扩增产物进行检测，并与焦磷酸测序结果进行比对。
2.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S2中所述CYP2C19*2的Tm值为50℃，CYP2C19*3的Tm值为53℃，CYP2C19*17的Tm值为49℃。
3.如权利要求2所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S3中所述CYP2C19*2的产物长度为289bp，CYP2C19*3的产物长度为249bp，CYP2C19*17的产物长度为248bp。
4.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S3中所述PCR扩增反应体系如表1所示：
表1 PCR扩增反应体系
试剂 体积 PyroMark PCR Master Mix 12.5μL CoraLoad Concentrate 2.5μL Q-Solution 5μL 25mM MgCl2 1.5μL 上游PCR引物 0.5μL 下游PCR引物 0.5μL DNA 1μL RNase-free water 1.5μL 总体积(μL) 25μL
5.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S3中所述PCR扩增反应条件如表2所示：
表2 PCR扩增反应条件
6.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，S3中在所述PCR扩增反应后进行PCR产物凝胶电泳分析：PCR产物经过2％的琼脂糖凝胶电泳检测是否为所需的目的片段。
7.如权利要求1所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，步骤S1中所述DNA提取试剂盒包括:
试剂A：裂解缓冲液；
试剂B：吸附剂；
试剂C：漂洗缓冲液；
试剂D：洗脱缓冲液；
所述裂解缓冲液的组成成分按重量百分比计包括：氯化钠2-5％、柠檬酸钠0.4-0.7％、变性剂2-4.5％、还原剂0.05-0.25％、乙二胺四乙酸0.15-1.25％、离子型表面活性剂2.3-3.0％、无水乙醇22-38％，余量为超纯水；
所述吸附剂为纳米磁珠；
所述漂洗缓冲液的组成成分为乙二胺四乙酸和His-tag，所述乙二胺四乙酸和His-tag的摩尔百分比为1:10-20；
所述洗脱缓冲液为：0.5％(wt)氢氧化钠。
8.如权利要求7所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，所述变性剂为硫氰酸胍或异硫氰酸胍。
9.如权利要求7所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、还原型的谷胱甘肽或半胱氨酸(GST)中任意一种。
10.如权利要求7所述的基于焦磷酸测序技术的用于CYP2C19基因多态性快速检测的方法，其特征在于，所述离子型表面活性剂为DTAC、CTAB、CPB或OPB中任意一种。
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