CN108841948A - 用于检测人细胞色素p450相关基因多态性的引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测人细胞色素p450相关基因多态性的引物组、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的引物组，所述引物组包括针对CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18、CYP2C9*3、CYP2D6*10及CYP3A5*3基因位点的特异性引物及探针；本发明还涉及一种用于人细胞色素P450相关基因多态性位点检测的试剂盒，所述试剂盒包括含有上述引物及探针的PCR反应液冻干粉(PCR buffer、dNTPs、MgCl2、UNG酶及Taq酶、海藻糖)。本发明还涉及一种用于人细胞色素P450相关基因多态性位点检测的方法，该方法免去抽提DNA程序，直接采用微量全血扩增，用血量少，减少病人的痛苦；省时省力，并且大大减少经济支出。

Description

用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的引物组、试剂盒 及检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于检测人细胞色素P450 相关的基因多态位点的引物组、试剂盒及其检测方法。
背景技术
药物进入人体后，会经过吸收、分布、代谢、排泄四个过程。肝脏 是人体中代谢药物最重要的脏器，而主要的代谢酶是细胞色素P450超家 族(CYP)，它们催化多种内、外源物质(包括大多数临床药物)的代 谢，参与人体内一半以上的药物代谢过程。由单个核苷酸变异引起的 DNA序列多态性称之为单核苷酸多态性。P450代谢酶的单核苷酸多态 性是导致人类代谢和反应差异的关键因素。P450酶系的基因主要有 CYP1、CYP2、CYP3三个家族，相关的有以下几种重要的P450酶： CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5。
CYP2C19参与氯吡格雷、S-美芬妥英、奥美拉唑、伏立康唑、安定、 去甲安定等药物的代谢。CYP2C19遗传变异可导致酶活性的个体差异， 使人群出现超快代谢者(ultrarapidmetabolizer，UM)、快代谢者(extensive metabolizer，EM)、中间代谢者(intermediatemetabolizer，IM)和慢代 谢者(poor metabolizer，PM)4种表型。CYP2C19*2(rs4244285，c.681G>A) 和CYP2C19*3(rs4986893，c.636G>A)是中国人群中存在的2种导致 CYP2C19酶缺陷的主要等位基因。CYP2C19*2导致剪接缺失， CYP2C19*3为终止密码子突变。EM个体只携带CYP2C19*1等位基因，IM个体携带CYP2C19*2或CYP2C19*3杂合子基因型；PM个体包括CYP2C19*2/*2、CYP2C19*2/*3和CYP2C19*3/*3基因型。东方人群中 75～85％的PM由CYP2C19*2所致，约20～25％的PM由CYP2C19*3 所致。
CYP2D6又称异喹胍4’-羟化酶,CYP第二亚家族中的重要成员。人 群中CYP2D6的活性呈现强代谢者(EM)、中间代谢者(IM)、弱代 谢者(PM)和超强代谢者(UM)四态分布的现象。白种人群中CYP2D6 PM的发生率高达5～10％，而在东方人群中PM的发生率约为1％。目前 已发现了CYP2D6基因的70多种遗传变异。不同突变类型对酶活性和药 物代谢的影响不一。中国人群中CYP2D6常见的导致酶活性降低的等位 基因包括CYP2D6*3(A2637deletion)、CYP2D6*4(G1934A)、CYP2D6*5 (CYP2D6deletion)和CYP2D6*10(C188T)，等位基因频率分别为1 ％、1％、6％和53％。其中，CYP2D6*5为基因缺失多态，导致PM表 型；CYP2D6*10为该酶第34位脯氨酸被丝氨酸所替代所致，导致IM表 型。导致CYP2D6酶活性缺失的多态性可影响安替比林、可待因、β受 体阻滞剂如美托洛尔和卡维地洛、氯丙咪嗪、去甲替林、地昔帕明、多 虑平、丙咪嗪、马普替林、奥匹哌醇、三甲丙咪嗪、昂丹司琼、曲马多和他莫昔芬等的体内代谢，从而影响这些药物的疗效和不良反应的发生， 临床需根据个体的基因型进行剂量的调整。
CYP3A5参与他克莫司、咪达唑仑、氨苯砜、可的松、尼菲地平等 多种药物的代谢。CYP3A5基因第3内含子内22893位存在6986A>G的 突变(rs776746，CYP3A5*3)，该SNP可导致CYP3A5mRNA异常剪 接，引起终止密码子过早剪切CYP3A5蛋白，从而使其失去酶的活性， 因此CYP3A5*3纯合子个体肝脏和肠道CYP3A5蛋白表达和活性显著下 降。CYP3A5*1等位基因频率存在显著种族差异，白种人群中为10％-15％，中国人群中为28％，而黑种人群则高达60％--80％。
CYP3A4在人类肝脏中表达具有40倍个体差异，CYP3A4在肝脏中 表达最丰富，并且在人群中广泛存在着遗传多态性，是引起个体和种族 间对同一底物代谢能力不同的原因之一。目前，在CYP3A4基因中发现 了近30种单核苷酸多态性(SNPs)，其突变等位基因从CYP3A4*2至 CYP3A4*19。CYP3A4*18 878位的T/C突变使代谢酶活性降低，减弱对 一些药物的代谢能力。
通过以上位点的检测，可以指导常见的解热镇痛类、消化系统类、 内分泌系统类、神经系统类、呼吸类和抗感染类6类药物的用药，为临 床个性化用药提供依据，预防药物不良反应。
目前药物代谢酶和药物作用靶点基因检测过程一般包括核酸提取和 靶标检测两阶段。用于靶标检测的方法包括PCR-直接测序法、PCR-焦 磷酸测序法、荧光定量PCR法、PCR-基因芯片法、PCR-电泳分析、等 位基因特异性PCR法等多种方法。荧光定量PCR扩增时，需预先对血 液或者唾液进行核酸提取纯化处理，从而导致核酸大量损失、增加交叉 污染以及使用有毒试剂等问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种可同时检测 人细胞色素P450相关的CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、 CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3基因多态性的引物组。
用于检测人细胞色素P450相关的基因多态性的引物组，包括针对 CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及 CYP3A5*3基因多态性的特异性引物及探针，所述的基因多态性位点、特 异性引物及探针为：
CYP2D6*10正向引物1：5’-TTGGTAGTGAGGCAGGTA-3’；
CYP2D6*10反向引物2：5’-AAGCAGTATGGTGTGTTC-3’；
CYP2C9*3正向引物3：5’-TGTGATTGGCAGAAACCG-3’；
CYP2C9*3反向引物4：5’-CCTTGGGAATGAGATAGT-3’；
CYP2C19*2正向引物5：5’-TTCCCCATCAAGATATAC-3’；
CYP2C19*2反向引物6：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCC-3’；
CYP2C19*3正向引物7：5’-TCATCCTGGGCTGTGCTC-3’；
CYP2C19*3反向引物8：5’-ATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’；
CYP3A4*18正向引物9：5’-ATCTAAACTGTGATGCCCTA-3’；
CYP3A4*18反向引物10：5’-ACCTCCTCCCTCCTTCTC-3’；
CYP3A5*3正向引物11：5’-GGCATAGGAGATACCCAC-3’；
CYP3A5*3反向引物12：5’-CACCCAGGAAGCCAGACT-3’；
CYP2D6*10探针13：
5’-TACCCACCAGGCCCCCTGCCAATCCGGGTA-3’；
CYP2C9*3探针14：5’-ACATTGACCTTCTCCCCACCAATCCAATGT-3’；
CYP2C19*2探针15：
5’-CCGGGAACCCATAACAAATTAATCCCCCGG-3’；
CYP2C19*3探针16：
5’-TGGATCCAGGTAAGGCCAAGTATCCATCCA-3’；
CYP3A4*18探针17：
5’-TCTGGAGCTCGTGGCCCAATCTTGCCCAGA-3’；
CYP3A5*3探针18：
5’-CAATATCTCTTCCCTGTTTGGCGCCTATTG-3’。
本发明的第二个目的是提供一种可直接使用血液或唾液样本、免提 取DNA一步到位检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3基因多态性的试剂盒，包括含有上述特异性引 物及探针的PCR反应液冻干粉，所述的PCR反应液冻干粉包括反应管A和 反应管B，所述反应管A包含CYP3A4*18正向引物9、CYP3A4*18反向引 物10、CYP3A4*18野生型探针17、CYP3A4*18突变型探针、CYP3A5*3 正向引物11、CYP3A5*3反向引物12、CYP3A5*3野生探针18、CYP3A5*3 突变型探针、CYP2C9*3正向引物3、CYP2C9*3反向引物4、CYP2C9*3 野生型探针14、CYP2C9*3突变型探针的混合物；反应管B包含 CYP2D6*10正向引物1、CYP2D6*10反向引物2、CYP2D6*10野生型探针 13、CYP2D6*10突变型探针、CYP2C19*2正向引物5、CYP2C19*2反向 引物6、CYP2C19*2野生型探针15、CYP2C19*2突变型探针、CYP2C19*3 正向引物7、CYP2C19*3反向引物8、CYP2C19*3野生型探针16、 CYP2C19*3突变型探针的混合物；所述PCR反应液冻干粉还包括PCR缓 冲液、dNTPs、Taq酶、MgCl2、海藻糖。
所述PCR反应液冻干粉的储存条件为2-30℃避光保存。
所述PCR反应液冻干粉在加入DNA溶解液后的终浓度为：
所述检测CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、 CYP3A4*18及CYP3A5*3基因多态性的试剂盒还包括野生型对照、阴性 对照，所述野生型对照为CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、 CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3六个基因位点野生型质粒混合物； 所述阴性对照为TE缓冲液或无核酸酶水作为空白对照。
本发明的第三个目的是提供一种上述引物组或试剂盒来检测 CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及 CYP3A5*3基因多态性的方法，包括如下步骤：
步骤一：直接取待检测的全血或唾液作为PCR模板；
步骤二：取出含有PCR反应液冻干粉的PCR管，加入DNA溶解液后 形成PCR反应液，将所述PCR反应液与适量所述PCR模板混匀；
步骤三：进行PCR扩增反应：50℃孵育2分钟；95℃变性10分钟；10 次循环：95℃15秒，65℃20秒(每个循环下降1℃)，72℃20秒；50次 循环：95℃15秒，55℃20秒，72℃20秒；熔解曲线阶段：95℃1分钟， 35℃3秒，40℃-72℃(升温速率0.04℃/s)；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的野生型对照和空白对照品 符合规定的情况下，通过比较待测样本在检测体系中共六个检测通道(分 别为A-FAM、A-HEX、A-ROX、B-FAM、B-HEX和B-ROX通道)与野 生型对照之间熔点(Tm值)的差异判断样本的人细胞色素P450相关基因 的基因型。
本发明的有益效果：
1、本发明试剂盒选取靶序列适宜的区域并设计了高特异性的引物和 探针。
2、本发明试剂盒直接采用微量全血扩增，因其用血量少，减少病人 的痛苦；免去抽提DNA程序，省时省力，并且大大减少经济支出。
3、本发明试剂盒在反应体系中加入冻干保护剂(海藻糖)，使反应 液冻干后可在2-30℃条件下存储运输。
附图说明
图1为CYP3A4*18多态性检测结果图。
图2为CYP3A5*3多态性检测结果图。
图3为CYP2C9*3多态性检测结果图。
图4为CYP2D6*10多态性检测结果图。
图5为CYP2C19*2多态性检测结果图。
图6为CYP2C19*3多态性检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：
实施例1：试剂盒的制备
一、引物和探针的设计与合成
针对人基因组中CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、 CYP3A4*18及CYP3A5*3基因位点(序列参见NCBI数据库公开的人 类全基因组序列)，使用PrimerPremier 3.0及BeaconDesigner软件，设 计特异性引物及探针。特异性引物及探针序列如表1所示：
表1：
二、对照品选择
野生型对照为CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、 CYP3A4*18及CYP3A5*3六个基因位点野生型质粒混合物；阴性对照为 DNA溶解液(TE缓冲液)。
三、PCR反应液组成
PCR反应液包括含有上述特异性引物及探针，分为反应管A和反应管 B，其中：
反应管A包含CYP3A4*18正向引物9、CYP3A4*18反向引物10、 CYP3A4*18野生探针17及CYP3A4*18突变型探针；CYP3A5*3正向引物 11、CYP3A5*3反向引物12、CYP3A5*3野生探针18及CYP3A5*3突变型 探针；CYP2C9*3正向引物3、CYP2C9*3反向引物4、CYP2C9*3野生探针14及CYP2C9*3突变型探针的混合物。
反应管B包含CYP2D6*10正向引物1、CYP2D6*10反向引物2、 CYP2D6*10野生探针13及CYP2D6*10突变型探针；CYP2C19*2正向引物 5、CYP2C19*2反向引物6、CYP2C19*2野生探针15及CYP2C19*2突变型 探针；CYP2C19*3正向引物7、CYP2C19*3反向引物8、CYP2C19*3野生 探针16及CYP2C19*3突变型探针的混合物。
PCR反应液A和B都包括10×PCR buffer II、dNTPs(dATP、dTTP、 dCTP、dGTP、dUTP)、Taq酶、UNG酶、MgCl2、海藻糖。上述PCR 反应液经冻干机冻干后密封于PCR管中，再经铝箔袋密封避光封装，获 得PCR反应液冻干粉反应管A和反应管B。
其中，所述dNTPs(dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dUTP)、Taq酶、 UNG酶购买于广州瑞真生物技术有限公司。
PCR反应液在加入DNA溶解液(DNA溶解液的组成：10mM Tris-HCl (PH 8.5)，1mMEDTA)后各成分的终浓度如表2所示：
表2反应体系组分表
四、试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)准备待测的人血液和唾液样品；人血液包含但不限于静脉血， 指尖血，脐带血，血片等人体血液均适用于本发明。
(2)将铝箔袋包装的反应管A、B从试剂盒中取出，剪开包装取出n 人份试剂；
(3)按每管加入20μL DNA溶解液的量，溶解反应管A、B中的冻 干粉；
(4)用微量加液器向每支PCR反应管中加入0.5μL相应的全血样本 或5μL相应的阴性/野生型对照品，并立即盖严管盖；
(5)将已加入模板的PCR反应管于涡旋振荡器中充分振荡混匀20s， 瞬时离心；
(6)将已充分振荡混匀后的PCR反应管转移至PCR扩增仪上；
(7)扩增与熔解曲线分析步骤可设置为一个程序，在实时荧光PCR 仪上连续完成，也可分阶段先在普通PCR仪器上进行扩增，再于实时PCR 仪器上进行熔解曲线分析。反应程序设定如表3所示：
表3：
(8)完成上述PCR反应后，采集所得荧光信号后先进行对照品的判 定；
阴性对照判定
阴性对照在A/B两个反应管中均无熔解曲线检测信号。若对照检测结 果存在熔解曲线检测信号，表明实验过程被污染，可能原因：试剂交叉 污染、存在气溶胶等，实验无效，需重新试验。
野生型对照判定
野生型对照在各体系及各通道中的熔点(Tm)值范围如下：
反应体系A：A-FAM通道56.57℃±1.5℃；A-HEX通道64.19℃±1.5 ℃；A-ROX通道54.71±1.5℃。
反应体系B：B-FAM通道64.80℃±1.5℃；B-HEX通道54.61℃±1.5℃； B-ROX通道59.55℃±1.5℃。
本发明中各Tm值是在特定SLAN-96仪器上所得的常见值作为参考 值。当使用其它仪器时，Tm值可能略有变动，以当次试验野生型对照所 得的Tm值为准。
Tm值以仪器自动判读所得为准，当仪器给出一个以上Tm值时，请 参考野生型对照和阴性对照的峰型选择有效Tm值。当出现仪器无法自 动给出Tm值的情况时，可通过调整基线或直接人工判读的方法获得Tm 值。
在判定阴性对照和野生型对照符合规定值时，样本检测结果再按表 4、表5进行结果判定：
表4检验结果判读标准
注：W代表野生型峰，P代表多态性熔解峰。
表5试剂盒可以检测的多态性类型及各多态性类型在对应通道的ΔTm值 波动范围
注：a、表中“-”指检测样本熔解峰与对应野生型熔解峰Tm差异的在±1℃ 之内。
b、表中黑体字为野生型与对应通道多态性类型ΔTm±3SD，当3SD＜ 1.0时按照ΔTm±1.0，由多次试验得到的统计结果。
按照上述检测方法，选取测序结果为CYP2D6*10位点野生型样品、 CYP2D6*10位点杂合突变型样品、CYP2D6*10位点纯合突变型样品、 CYP2C9*3位点野生型样品、CYP2C9*3位点杂合突变型样品、CYP2C9*3位点纯合突变型样品、CYP2C19*2位点野生型样品、 CYP2C19*2位点杂合突变型样品、CYP2C19*2位点纯合突变型样品、 CYP2C19*3位点野生型样品、CYP2C19*3位点杂合突变型样品、 CYP2C19*3位点纯合突变型样品、CYP3A4*18位点野生型样品、 CYP3A4*18位点杂合突变型样品、CYP3A4*18位点纯合突变型样品、 CYP3A5*3位点野生型样品、CYP3A5*3位点杂合突变型样品、 CYP3A5*3位点纯合突变型样品(全血及唾液)进行检测。检测结果如 图1-图6(样本1～样本18)，对照表4、表5结果判定标准，18例样本 (全血及唾液)的试剂盒检测结果如表6所示：
表6全血及唾液样本检测结果
上述18例样品(全血及唾液)荧光定量PCR检测结果与测序结果一 致，表明本发明实施例提供的检测试剂盒用于血液直接检测CYP2D6*10、 CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3基因多 态性检测结果可靠，与直接测序一致率达到100％，且本发明检测方法灵 敏度高于传统测序方法，操作简单快速，利于临床检测和推广。
序列表
<110> 厦门为正生物科技股份有限公司
<120> 用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的引物组、试剂盒及检测方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<400> 5
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggcataggag atacccac 18
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacccaggaa gccagact 18
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tacccaccag gccccctgcc aatccgggta 30
<210> 14
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
acattgacct tctccccacc aatccaatgt 30
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ccgggaaccc ataacaaatt aatcccccgg 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggatccagg taaggccaag tatccatcca 30
<210> 17
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tctggagctc gtggcccaat cttgcccaga 30
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
caatatctct tccctgtttg gcgcctattg 30

Claims (6)

1.一种用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的引物组及探针，其特征在于，所述基因多态性位点为CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3，所述引物组及探针序列为：
CYP2D6*10正向引物1：5’-TTGGTAGTGAGGCAGGTA-3’；
CYP2D6*10反向引物2：5’-AAGCAGTATGGTGTGTTC-3’；
CYP2C9*3正向引物3：5’-TGTGATTGGCAGAAACCG-3’；
CYP2C9*3反向引物4：5’-CCTTGGGAATGAGATAGT-3’；
CYP2C19*2正向引物5：5’-TTCCCCATCAAGATATAC-3’；
CYP2C19*2反向引物6：5’-CGAGGGTTGTTGATGTCC-3’；
CYP2C19*3正向引物7：5’-TCATCCTGGGCTGTGCTC-3’；
CYP2C19*3反向引物8：5’-ATTCAAAAATGTACTTCAGG-3’；
CYP3A4*18正向引物9：5’-ATCTAAACTGTGATGCCCTA-3’；
CYP3A4*18反向引物10：5’-ACCTCCTCCCTCCTTCTC-3’；
CYP3A5*3正向引物11：5’-GGCATAGGAGATACCCAC-3’；
CYP3A5*3反向引物12：5’-CACCCAGGAAGCCAGACT-3’；
CYP2D6*10探针13：
5’-TACCCACCAGGCCCCCTGCCAATCCGGGTA-3’；
CYP2C9*3探针14：5’-ACATTGACCTTCTCCCCACCAATCCAATGT-3’；
CYP2C19*2探针15：
5’-CCGGGAACCCATAACAAATTAATCCCCCGG-3’；
CYP2C19*3探针16：
5’-TGGATCCAGGTAAGGCCAAGTATCCATCCA-3’；
CYP3A4*18探针17：
5’-TCTGGAGCTCGTGGCCCAATCTTGCCCAGA-3’；
CYP3A5*3探针18：
5’-CAATATCTCTTCCCTGTTTGGCGCCTATTG-3’。
2.一种用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液冻干粉，所述的PCR反应液冻干粉包括反应管A和反应管B，所述反应管A包含CYP3A4*18正向引物9、CYP3A4*18反向引物10、CYP3A4*18野生型探针17、CYP3A4*18突变型探针、CYP3A5*3正向引物11、CYP3A5*3反向引物12、CYP3A5*3野生探针18、CYP3A5*3突变型探针、CYP2C9*3正向引物3、CYP2C9*3反向引物4、CYP2C9*3野生型探针14、CYP2C9*3突变型探针的混合物；反应管B包含CYP2D6*10正向引物1、CYP2D6*10反向引物2、CYP2D6*10野生型探针13、CYP2D6*10突变型探针、CYP2C19*2正向引物5、CYP2C19*2反向引物6、CYP2C19*2野生型探针15、CYP2C19*2突变型探针、CYP2C19*3正向引物7、CYP2C19*3反向引物8、CYP2C19*3野生型探针16、CYP2C19*3突变型探针的混合物；所述PCR反应液冻干粉还包括PCR缓冲液、dNTPs、Taq酶、MgCl2、海藻糖。
3.如权利要求2所述的用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应管A冻干粉在加入DNA溶解液后的成分终浓度为：0.125μM的引物3、1.25μM的引物4、0.125μM的引物9、1.25μM的引物10、0.125μM的引物11、1.25μM的引物12、0.05mM的dATP、0.05mM的dTTP、0.05mM的dCTP、0.05mM的dGTP、0.05mM的dUTP、、4.375mM的MgCl2、0.005U/μL的UNG酶、0.225U/uL的Taq酶；所述PCR反应管B冻干粉在加入DNA溶解液后的成分终浓度为：0.125μM的引物1、1.25μM的引物2、0.125μM的引物5、1.25μM的引物6、0.125μM的引物7、1.25μM的引物8、0.05mM的dATP、0.05mM的dTTP、0.05mM的dCTP、0.05mM的dGTP、0.05mM的dUTP、4.375mM的MgCl2、0.005U/μL的UNG酶、0.225U/uL的Taq酶。
4.如权利要求2所述的用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，还包括野生型对照、阴性对照，所述野生型对照为CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3六个基因位点野生型质粒混合物；所述阴性对照为TE缓冲液或无核酸酶水作为空白对照。
5.如权利要求2所述的用于检测人细胞色素P450相关基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述反应液冻干粉的储存条件为2-30℃避光保存。
6.一种如权利要求4所述的试剂盒用于人细胞色素P450相关基因多态性的检测方法，其特征在于，从血液、唾液直接通过PCR方法扩增人细胞色素P450相关基因CYP2D6*10、CYP2C9*3、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP3A4*18及CYP3A5*3多态性位点，包括如下步骤：
步骤一：直接取待检测的全血、唾液作为PCR模板；
步骤二：从试剂盒中取出含有PCR反应液冻干粉的PCR管，加入DNA溶解液后形成PCR反应液，将所述PCR反应液与适量的全血或唾液混匀；
步骤三：进行PCR扩增反应：50℃孵育2分钟；95℃变性10分钟；10个循环：95℃15秒，65℃20秒(每个循环下降1℃)，72℃20秒，50次循环：95℃15秒，55℃20秒，72℃20秒，熔解曲线阶段：95℃1分钟，35℃3分钟，40℃-72℃(升温速率0.04℃/s)；
步骤四：PCR结果判定：在所述试剂盒的野生型对照和空白对照品符合规定的情况下，通过比较待测样本在检测体系中共六个检测通道(分别为A-FAM、A-HEX、A-ROX、B-FAM、B-HEX和B-ROX通道)与野生型对照之间熔点(Tm值)的差异判断样本的人细胞色素P450相关基因多态性的基因型。
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