CN102433374B - Y-str基因座荧光标记复合扩增体系及应用 - Google Patents
Y-str基因座荧光标记复合扩增体系及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及“Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用”，属于检测人体基因组中具有多态性遗传标记领域。该复合扩增体系能同时扩增基因座：DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2和Amelogenin。同时本发明通过的特异性引物的设计，以及独特的基因座组合荧光标记方式，使得仅采用三种标记就可以同时扩增上述基因座，且其扩增产物均控制在100-400bp之间，灵敏度非常高。根据该扩增体系设计的试剂盒操作简单、快速、灵敏度高、高效、节约模板、个体识别能力强，达到国外同类商品化试剂盒的水平。
Description
技术领域
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，特别是涉及Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系及应用。
背景技术
DNA多态性分析技术自1985年被应用于法庭科学生物物证的个体识别和亲子鉴定中以来，极大地推动了法医物证鉴定技术的发展，带动刑事技术产生了划时代的突破。十几年来，新的DNA多态性分析方法不断涌现，开发了许多新的多态性理想的遗传标记，诞生了一系列的现代化DNA检验技术。尤其是1992年开始出现的STR基因座检验技术，因其多态性好、识别能力强、灵敏度高、易于自动化等特点，迅速成为法医DNA鉴定中的主流技术，得到了广泛的应用，取得了令人瞩目的成果。但传统的STR基因座检验主要是以常染色体STR基因座作为检测目标，达到认定罪犯的目的。而目前DNA鉴定已不再仅仅被应用来直接认定犯罪嫌疑人，更依靠它为整个的侦查工作提供方向和指导。现实中很多案件在侦查过程中根据诸多线索可以判断，罪犯就应该是生活在一定范围的村民或常住人员，在案发现场也找到了有价值的生物物证，但由于没有明确的排查线索，只得对本地区大批量的可疑人员应用DNA技术进行排查，经常有案件送检当地嫌疑人动则几百人，排查工作量大、费用高，更主要的是要花费很长的时间，真正的犯罪嫌疑人可能在这样的威慑下很快逃跑，不能充分发挥利用现代化技术手段指导侦查工作的时效性，丧失破获案件、抓捕罪犯的最好时机。
随着分子生物学、遗传学的发展，尤其是伴随着人类基因组计划的完成，国内外法庭科学工作者在人类Y染色体上发现同样具有很多多态性理想的STR基因座，由于Y染色体为男性特有，而且Y染色体上的异染色质区在减数分裂过程中不发生重组，而以单倍型在父系亲属中垂直传递，因而在许多案件中应用具有独特使用价值，成为法医DNA领域新的研究和应用热点。
现有技术存在的问题：1、目前国内针对Y-STR研究报道主要集中于新基因座的开发、群体遗传学调查及部分方法研究，但主要是采用单基因座检验、银染色的检测方法，还没有一种荧光标记的多基因座复合检验的成品试剂盒。2、国外相关研究起步较早，研究相对深入，目前已经推出Y-STR荧光标记复合扩增试剂盒，但是国外试剂盒所采用的Y-STR基因座是根据欧美人群的遗传数据选择的，在实际应用中发现有部分基因座并不适合中国人群，而且价格昂贵。为此自主开发适合中国人群的Y-STR荧光标记复合扩增试剂盒，提高个体识别能力，降低检验鉴定费用，充分发挥Y-STR检验在实际案件生物物证鉴定中作用是当务之急。
发明内容
本发明针对中国人Y-STR基因座的特点，利用聚合酶链反应在一个反应中同时扩增多个短串联重复基因座。本发明还涉及将该扩增体系应用于个人识别和亲子鉴定中，其灵敏感度高，分型结果准确，完全能够满足实际案件检验的需要。
Y-STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系同时扩增Y染色体上的10个基因座：DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439和DYSA7.2。
上述扩增体系中还包括一个性别鉴定基因座Amelogenin，该性别基因座作为该试剂盒进行检测的内对照。
所述基因座分成三组，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：Amelogenin+DYS19+DYS389-1+DYS389-2；DYS390+DYS391+DYS392+DYS393；DYS438+DYS439+DYSA7.2。
所述Amelogenin+DYS19+DYS389-1+DYS389-2组为绿色JOE荧光素标记，所述DYS390+DYS391+DYS392+DYS393组为蓝色FAM荧光素标记；所述DYS438+DYS439+DYSA7.2组为黑色TAMRA荧光素标记。
所述基因座由一对引物扩增，其中一个引物的5’末端带有荧光标记。
所述引物对分别为：
Amelogenin引物：
引物1：AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG，
引物2：ATGGCATGTAGTGAGGACA；
DYS19引物：
引物1：ATGGCATGTAGTGAGGACA，
引物2：CTACTGAGTTTCTGTTATAGT；
DYS389-1/2引物：
引物1：TCTTATCTCCACCCAGA，
引物2：CCAACTCTCATCTGTATTATCTAT；
DYS390引物：
引物1：TGACAGTAAAATGAACACATTGC，
引物2：TATATTTTACACATTTTTGGGCC；
DYS391引物：
引物1：GATTCTTTGTGGTGGGTCTG，
引物2：CTATTCATTCAATCATACACCCA；
DYS392引物：
引物1：AGACCCAGTTGATGCAATGT，
引物2：TCATTAATCTAGCTTTTAAAAACAA；
DYS393引物：
引物1：AACTCAAGTCCAAAAAATGAGG，
引物2：GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC；
DYS438引物：
引物1：GTGGCAGACGCCTATAATCC，
引物2：TGGGGAATAGTTGAACGGTAA；
DYS439引物：
引物1：GCCTGGCTTGGAATTCTTTT，
引物2：ACATAGGTGGAGACAGATAGATGAT
DYSA7.2引物：
引物1：TTCAGGTAAATCTGTCCAGTAGTGA，
引物2：AGGCAGAGGATAGATGATATGGAT。
一种试剂盒，包括上述引物对混合物，所述引物对中一个引物的5’端进行荧光素标记。
还包括上述基因座等位基因标准物。
上述试剂盒在检测分析人体DNA样品中的应用。
所述DNA样品来源于血液、唾液或毛发、精斑。
根据对中国男性人群具有高度遗传多态性和良好的等位基因频率分布分析，选择DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2共10个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin作为本发明扩增体的的Y-STR基因座。通过分析，特别是DYSA7.2基因座在中国人群中遗传多态性远高于其他Y-STR试剂盒所选择的基因座，提高了整个试剂盒的个体识别能力，非常适合在中国人群的个体识别鉴定中应用。
在实际的检测中上述基因座同时还加上鉴别人性别的Amelogenin基因座作为检测的内对照，一起构成同时检测的11个基因座的复合扩增系统。不仅可以对男性样品进行Y-STR基因型检测，而且由于性别基因座的存在，还能够对Y-STR检验失败原因给出初步的分析结论。
本发明将11个基因座分为三组，分别采用不同的荧光素标记，即Amelogenin+DYS19+DYS389-1+DYS389-2组为绿色JOE荧光素标记，DYS390+DYS391+DYS392+DYS393组为蓝色FAM荧光素标记；DYS438+DYS439+DYSA7.2组为黑色TAMRA荧光素标记，扩增上述基因座的引物、浓度和上述荧光标记颜色、位置，见表1、2所示。本发明通过上述基因座的特异性引物的设计及其浓度选用，以及独特的基因座组合荧光标记方式，使得本发明复合扩增体系中，仅采用三种标记就可以在同一个复合扩增体系中同时扩增本发明的11个基因座，且其扩增产物均控制在100-400bp之间，灵敏度非常高。
发明创造的效果和优点：
1、与国内相关技术比较
本试剂盒选择DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2共10个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin作为检测的目的基因，根据各基因基因座扩增片段的长度的范围，将上述引物分为三组，每组中不同基因座的扩增片段长度彼此不交叉，三组引物分别采用三种不同颜色的荧光标记。扩增产物通过毛细管电泳分离后，可以清楚地将各基因基因座的等位基因扩增片段分离，达到通过一次扩增和电泳检测即可以对十个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin进行检测的目的。本试剂盒操作简单、快速、灵敏度高、高效、节约模板、个体识别能力强。在检测时，其DNA样品的模板量仅需50pg就可以检出全部11个基因座。目前国内还没有成型的荧光标记Y-STR复合扩增技术。本试剂盒属于国内首创。
2、与国外试剂盒比较
本试剂盒选择DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2共10个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin作为检测的目的基因，与目前已经成型的技术方法相同比较，本试剂盒有两个基因座不同。对上述基因座在中国人群中的分布频率进行调查分析，特别是DYSA7.2基因座在中国人群中遗传多态性远高于其他Y-STR试剂盒所选择的基因座，其个体识别能力高于国外试剂盒相同数目基因座的个体识别能力，更适合中国人群个体识别检验鉴定。另外，本试剂盒包含有性别鉴定基因座，而目前国外相关技术中还没有将性别位点纳入Y-STR复合扩增试剂盒中的报道。当Y-STR复合扩增试剂盒检测失败时，无法确定失败的原因，而由于本试剂盒采用性别鉴定基因座Amelogenin作为内对照，可以直接鉴别失败的原因是由于检材中不含有男性DNA还是检材质量问题，及时纠正检验鉴定方向，节省时间。本试剂盒在PCR扩增操作、检验灵敏度、结果的自动化分析和标准化判读等其他方面都达到国外同类商品化试剂盒的水平。
附图说明
图1对无关个体DNA样品的检测结果，
图2本发明中基因座等位基因分型标准物，
图3刑事案件鉴定的结果
实施例1
本试剂盒包括：10个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin的引物混合液、PCR反应缓冲液、Taq Gold DNA聚合酶及各基因座等位基因标准物。
1、Y-STR基因座的选择及引物的设计与合成
根据中国人群遗传数据的报道，选择DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2共10个Y-STR基因座及性别鉴定基因座Amelogenin，设计合成PCR扩增引物，在每对引物中的一条引物的5’端标记荧光，各基因基因座的引物序列及标记荧光见表1：
表1：各基因座引物及荧光染料标记
2、试剂盒PCR扩增反应体系中各成分的组成及反应参数
PCR反应体系为10ul，含引物对混合物1.0ul，2mM dNTP1.0ul，10×buffer1.0ul，25mmol/LMgCl21.0ul，1.0UTaq Gold DNA聚合酶。扩增热循环条件为：95℃变性11min，随后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，60℃延伸45min。
3、PCR产物电泳分离及结果分析
PCR产物在电泳分析前，首先要进行予处理。取产物1ul+去离子甲酰胺9ul+ABI GeneScanLiz500或ROX500分子量内标准0.5ul，混匀后，95℃变性5分钟，立即放入冰水浴中5分钟以上，使用ABI-3100型DNA片段分析仪进行电泳分离，选择其36cm毛细管，电泳参数为Project：3100Project1；Set：G5（LIZ500）或Set F（ROX500）；Run Module：GS36-POP4；Analysis Parameter：GS500Analysis parameter。使用GeneScan分析软件，打开一个新的分析窗口，将所有样品加入后，首先设定分子量内标准各片段长度，再执行分析命令，即可获得各样品PCR产物分析结果。
4、对无关个体样品的DNA检测结果如图1所示。
5、各基因座等位基因标准物
根据各基因座PCR产物片段长度设计合成等位基因标准物。
表2：各基因座等位基因判型标准
等位基因分型标准物如图2所示。
6、在刑事侦察中的应用
案例：某市发生一起轮奸案件，采用该试剂盒对被害人的阴道擦拭物进行检验，检验结果显示：被害人的阴道擦拭物中精子的Y-STR基因型为两个男性个体的混合基因型，且与送检的两名犯罪嫌疑人Y-STR基因型的组合完全一致，认定了罪犯。（见图3）
Claims (3)
1.Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系，该复合扩增体系同时扩增Y染色体上的10个基因座和性别位点基因座：DYS19、DYS389-1、DYS389-2、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS438、DYS439、DYSA7.2和Amelogenin，其中扩增引物对分别为：
Amelogenin引物对：
引物1：AGAGCTTAAACTGGGAAGCTG，
引物2：ATGGCATGTAGTGAGGACA；
DYS19引物对：
引物1：ATGGCATGTAGTGAGGACA，
引物2：CTACTGAGTTTCTGTTATAGT；
DYS389-1/2引物对：
引物1：TCTTATCTCCACCCAGA，
引物2：CCAACTCTCATCTGTATTATCTAT；
DYS390引物对：
引物1：TGACAGTAAAATGAACACATTGC，
引物2：TATATTTTACACATTTTTGGGCC；
DYS391引物对：
引物1：GATTCTTTGTGGTGGGTCTG，
引物2：CTATTCATTCAATCATACACCCA；
DYS392引物对：
引物1：AGACCCAGTTGATGCAATGT，
引物2：TCATTAATCTAGCTTTTAAAAACAA；
DYS393引物：
引物1：AACTCAAGTCCAAAAAATGAGG，
引物2：AGGCAGAGGATAGATGATATGGAT。
DYS438引物对：
引物1：GTGGCAGACGCCTATAATCC，
引物2：TGGGGAATAGTTGAACGGTAA；
DYS439引物对：
引物1：GCCTGGCTTGGAATTCTTTT，
引物2：ACATAGGTGGAGACAGATAGATGAT；
DYSA7.2引物对：
引物1：TTCAGGTAAATCTGTCCAGTAGTGA，
引物2：GTGGTCTTCTACTTGTGTCAATAC，
所述Y染色体上的10个基因座和性别位点基因座分成三组，分别由三种不同颜色的荧光素标记，三组组合分别为：Amelogenin+DYS19+DYS389-1+DYS389-2；DYS390+DYS391+DYS392+DYS393；DYS438+DYS439+DYSA7.2，
所述Amelogenin+DYS19+DYS389-1+DYS389-2组为绿色JOE荧光素标记，所述DYS390+DYS391+DYS392+DYS393组为蓝色FAM荧光素标记；所述DYS438+DYS439+DYSA7.2组为黑色TAMRA荧光素标记。
2.根据权利要求1所述的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系，所述扩增引物对的其中一条的5’末端带有荧光素标记。
3.一种试剂盒，包括权利要求1或2所述的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系中的扩增引物对的混合物。
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