CN101921860B - 44个snp位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于个体识别的44个SNPs位点多色荧光复合检测试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括PCR引物，DNA聚合酶，PCR缓冲液，核酸外切酶Ⅰ，虾碱性磷酸酶，延伸引物和SNaPshot反应混合液；PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物，分别针对包含44个SNP位点的DNA片段。采用本发明可以快速、准确地获得44个SNP位点的基因分型，并通过荧光自动分型设备检测分析，对人类生物检材进行个体识别。
Description
技术领域
本发明涉及法医学个体识别，特别涉及SNP位点的基因分型，尤其是一种用于法医学个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒。
背景技术
法医检案工作中，由于高温、潮湿、暴晒、微生物等因素的影响，生物性检材中的DNA分子经常被损坏，发生断裂，分子变小，大片段丢失，无法进行有效的STR分型，使案件侦破限于困境。目前，法医DNA分析中解决高度降解检材DNA样本分型的技术主要集中在两个方面：一种是miniSTR(小片段短串联重复)分析技术。这种技术是通过将STR(短串联重复)遗传标记的扩增引物设计的尽可能接近重复区域而缩短PCR产物片段长度，应用于高度降解检材和微量检材中可以提高DNA分型的成功率。但在分析高度降解检材方面，miniSTR基因座分析的DNA片段范围在80～150bp，对于＜100bp的高度降解DNA，miniSTR基因座分析技术仍然具有局限性。而且，由于扩增片段长度和荧光染料种类的限制，在一个复合扩增体系中只可以同时扩增较少的miniSTR基因座，一般为一种荧光物质标记一个基因座，一个扩增体系最多可同时复合4个miniSTR基因座，要想达到个体识别效能，就必须增加复合扩增系统的数量，至少需要3～4个复合扩增系统，因此，不适合微量检材的应用。另一种是SNPs分析技术，SNPs(单核苷酸多态性)是继限制性片段长度多态性(restrictionfragmeng length polymorphism，RELP)和短串联重复序列(short tandem repeats，STRs)之后被发现的又一种人类遗传性标记，被称为第三代遗传标记，指人类基因组中特定部位的单个碱基序列的变异，其在人类基因组中分布极为广泛，大约每1000个碱基中就存在一个SNP，估计在人类基因组中大约有数百万个SNPs，数量超出STR基因座数目的几个数量级，而且，SNPs具有突变率低，扩增片段短，适合高通量检测和易于分型等特点，因此在法医学个体识别应用中具有广阔前景。选用可靠的多重分型方法，许多SNPs位点可以在短至45～55bp(变异位点两侧引物序列长度)的扩增片段内分型，因此，当DNA样本严重降解或遇到检材微量时，SNPs分析将更有价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的方法及试剂盒，使待测靶DNA的片段范围缩短至69～125bp，提高对高度降解DNA分型的成功率。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：用于个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系：PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂：核酸外切酶Ⅰ(Exo I)及其缓冲溶液(Exo I Buffer)、虾碱性磷酸酶(SAP)及其缓冲溶液(SAP Buffer)，c)延伸反应试剂：延伸引物和SNaPshot反应混合液，d)测试试剂：Hi-Di甲酰胺和GeneScanTM Size Standards-120LIZ，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。
上述SNP基因位点根据以下标准进行选取：(1)具有高的杂合度(≥0.4)；(2)等位基因频率在全球各大人群之间差异小(Fst＜0.06)；(3)系统内SNPs之间要处于连锁平衡状态，位点之间的物理距离至少大于1Mb；(4)系统内的SNP数目要足够多以达到个体识别效能；所有SNP位点的群体遗传学数据已经在公开刊物上发表。其相关信息见表1。
表1SNP基因位点相关信息
所述44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列参见表2。根据NCBI的SNP数据库(dbSNP)提供的DNA序列，设计44个SNP位点的PCR引物，PCR引物长度20～29个碱基，扩增产物长度69～125bp，退火温度：60±5℃，GC含量：40～60％。又设计了延伸引物，延伸引物的3’末端位于多态性位点的上游1个碱基处，延伸引物与模板DNA互补部分的特异性引物长度18～30个碱基，退火温度50±2℃。同一反应管中，被检测突变相同的位点的引物长度相差3～6个碱基，为了改变引物的长度，区分不同的位点，在特异性引物的5’端加poly(dT)或poly(dCT)。
表2 44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列表
利用上述的试剂盒进行个体识别的测试方法，按照下列步骤进行：
a)提取DNA，得DNA提取液；
b)在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、30s，60℃、30s，65℃、30s，进行35个循环；再在65℃保持7min；最终在4℃保存，获得扩增产物；
c)应用核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件：37℃、1h，然后80℃、15min，最终在4℃保存，得纯化后的扩增产物；
d)对纯化后的扩增产物进行延伸反应
将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；所述的延伸反应的条件：依次在96℃、10s，50℃、5s，60℃、30s进行25个循环，最终保存在4℃，得延伸产物；
e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物
将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应：37℃、1h，65℃、15min，最终保存在4℃，得纯化后的延伸产物；
f)检测、确定产物，
将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混匀；然后95℃变性3min，4℃迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定44个SNP基因位点的基因型。
采用本发明产生的有益效果在于：采用本发明可以快速、准确地获得44个SNP位点的基因分型，并通过荧光自动分型设备检测分析，对人类生物检材进行个体识别。本发明在对高度降解检材DNA的法医学个体识别方面具有很大的优势和潜力。
附图说明
图1和图2分别是本发明的检测结果的附图。
具体实施方式
用于个体识别的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a)扩增体系：PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b)扩增产物纯化试剂：核酸外切酶Ⅰ及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液，c)延伸反应试剂：延伸引物和SNaPshot反应混合液，d)测试试剂：Hi-Di甲酰胺和GeneScanTMSize Standards-120LIZ，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。
所述PCR引物和延伸引物的序列表、浓度分别参见表2和表3。
所述延伸引物由延伸引物混合物I(26个位点)和延伸引物混合物II(18个位点)由不同长度的延伸引物组成，分别针对44个SNP位点的多态性位点。
表3PCR引物和延伸引物的浓度
| No. | dbSNP rs# | PCR引物浓度(1×) | 延伸引物浓度(1×) |
| 1a | rs1109037 | 0.1μM | 0.67μM |
| 2a | rs3780962 | 0.1μM | 0.67μM |
| 3a | rs987640 | 0.07μM | 0.33μM |
| 4a | rs9951171 | 0.1μM | 0.67μM |
| 5a | rs430046 | 0.07μM | 0.33μM |
| 6a | rs338882 | 0.1μM | 0.67μM |
利用上述的试剂盒进行个体识别的测试方法，按照下列步骤进行：
a)提取DNA，得DNA提取液；
b)多重PCR扩增包含44个SNP位点的DNA片段
在扩增体系中加入步骤一所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增。所述PCR扩增体系的总体积为25μL，扩增体系的组分、浓度或含量如下：
10×PCR缓冲溶液 2.5μL
Mg2+(25mM) 5.5μL
dNTPs(10mM) 2μL
PCR引物(浓度参见表3) 1μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL) 0.3μL
模板DNA(1~10ng/μL) 1μL
去离子水 12.7μL
扩增的热循环参数：
得扩增产物；
c)应用核酸外切酶Ⅰ(Exo I)和虾碱性磷酸酶(SAP)纯化步骤b)所得的扩增产物，纯化反应体系和纯化反应条件如下
扩增产物的纯化反应体系，体积10μL：
10×Exo I Buffer 1μL
10×SAP Buffer 1μL
Exo I(5U/μL) 2μL
SAP(1U/μL) 2μL
扩增产物 4μL
扩增产物纯化反应的条件：
37℃ 1h
80℃ 15min
4℃ 保存
得到纯化后的扩增产物；
d)将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；延伸反应试剂和延伸反应条件如下：
延伸反应体系，反应体积10μL：
SNaPshot反应混合液 5μL
纯化后的扩增产物 3μL
延伸引物(3.3~13.3μM，具体参见表3) 1μL
去离子水 1μL
延伸反应的热循环参数
得延伸产物；
e)应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物
延伸产物纯化反应体系，反应体积10μL：
10×SAP Buffer 1μL
SAP(5U/μL) 2μL
去离子水 5μL
延伸产物 2μL
延伸产物纯化反应条件：
37℃ 1h
65℃ 15min
4℃ 保存
得纯化后的延伸产物；
f)检测、确定产物，
将步骤e)中得到的纯化后的延伸产物中加入11.5μL Hi-Di甲酰胺和0.5μL GeneScanTMSize Standards-120 LIZ混匀；然后95℃变性3min，4℃迅速冷却后，用美国AB公司的DNA自动分析仪进行电泳检测，检测条件：1500V电压，36cm毛细管，POP4凝胶，电泳20min；应用Data Collection 3.0软件收集数据，GenemapperV 3.2软件进行结果分析。其中一实施例的结果图见附图1和图2。
Claims (1)
1.44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其包括a）扩增体系：PCR缓冲溶液、MgCl2、dNTPs、PCR引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA，b）扩增产物纯化试剂：核酸外切酶Ⅰ及其缓冲溶液、虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液，c）延伸反应试剂：延伸引物和SNaPshot反应混合液，d）测试试剂：Hi-Di甲酰胺和GeneScanTM Size Standards-120 LIZ，其特征在于，所述PCR引物和延伸引物由44个SNP基因位点的引物组成，所述44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839；所述44个SNP基因位点的PCR引物和延伸引物的序列为：
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PCR引物:上游5’-ctggtggtgagggtggagatt-3’，下游5’-gtgccagtgcgagatgaaagt-3’
延伸引物: 5’-cctcccacaccagtttctcc-3’
rs3780962
PCR引物: 上游5’-ctggtggtgtgtattctgcggta-3’，下游5’-aacatgggatgaacaaggtcaag-3’
延伸引物：5’-cctcccacaccagtttctcc-3’
rs987640
PCR引物: 上游5’-acaggtacattcacttaacaggctc-3’，下游5’-gttactaagcccatgccatcg-3’
延伸引物: 5’-32t-aacaggctctctttccaccc-3’
rs9951171
PCR引物: 上游5’-agtcctcgttgttcctctggg-3’，下游5’-ctgctttcatgctgggacctg-3’
延伸引物: 5’-gagagcagcacactgaggctttatgg-3’
rs430046
PCR引物: 上游5’-gaacaaggtcatacaatgaatggtg-3’，下游5’-cacctatgggctcttcttatttctc-3’
延伸引物: 5’-17t-taaacccagcacctaccctca-3’
rs338882
PCR引物: 上游5’-ccttctgtctcaccttctttcg-3’，下游5’-caaagggaccaagtcaagagc-3’
延伸引物: 5’-ctcaccttctttcgtgtgcctgtgca-3’
rs2342747
PCR引物: 上游5’-gtcagcatgggaggaagaaaa-3’，下游5’-ggcagcagtaaccagcaacac-3’
延伸引物: 5’-42t-gctcattctttgttgtcccctc-3’
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PCR引物: 上游5’-agtggcattagaaattccagatag-3’，下游5’-ccccgcaaactaactaggataa-3’
延伸引物: 5’-10t-ccagatagagctaaaactgaag-3’
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PCR引物: 上游5’-cacaatggagccactgaactgc-3’，下游5’-ttccttgtcccttctgacctta-3’
延伸引物: 5’-29t-cattctccttcttctatctgtat-3’
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PCR引物: 上游5’-cctacacacaggcttcaggttac-3’，下游5’-atgtgcgtttctccacactttatac-3’
延伸引物: 5’-18t-tccttttgtgattccacttc-3’
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PCR引物: 上游5’-taagtgggacagttaagagaaggct-3’，下游5’-cactcaacacacagaaacatcaagc-3’
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延伸引物: 5’-T+18ct-ggctctgatctgacggcaa-3’。
2、根据权利要求1所述的44个SNP位点多色荧光复合检测的试剂盒，其特征在于同时复合扩增包含44个SNPs位点的DNA片段。
3、利用权利要求1所述的试剂盒进行个体识别的测试方法，其特征在于按照下列步骤进行：
a）提取DNA，得DNA提取液；
b）在扩增体系中加入步骤a）所得的DNA提取液，然后在扩增仪中进行扩增，扩增条件为：95℃、5min预变性；然后依次在95℃、30s, 60℃、30s，65℃、30s，进行35个循环；再在65℃保持7min；最终在4℃保存，获得扩增产物；
c）应用核酸外切酶Ⅰ和虾碱性磷酸酶纯化扩增产物，纯化反应条件：37℃、1h，然后80℃、15min，最终在4℃保存，得纯化后的扩增产物；
d）对纯化后的扩增产物进行延伸反应
将纯化后的扩增产物加入至所述的延伸反应试剂中进行延伸反应；所述的延伸反应的条件：依次在96℃、10s，50℃、5s，60℃、30s进行25个循环，最终保存在4℃，得延伸产物；
e）应用虾碱性磷酸酶纯化延伸产物
将延伸产物加入至虾碱性磷酸酶及其缓冲溶液的混合液中，在下列条件下进行纯化反应：37℃、1h，65℃、15min，最终保存在4℃，得纯化后的延伸产物；
f）检测、确定产物，
将步骤e）中得到的纯化后的延伸产物中加入至所述的测试试剂中，混匀；然后95℃变性3min，4℃迅速冷却后进行电泳检测；最后根据延伸产物峰的位置和颜色确定44个SNP基因位点的基因型。
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