CN106701746B - 基于毛细管电泳和ssr标记的高通量麦芽纯度鉴定技术 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种SSR引物组，包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755。本发明还提供了一种利用该SSR引物组进行高通量麦芽纯度鉴定的方法，包括以下几个步骤：提取供试品种样品的DNA、用不同荧光染料标记的SSR引物进行多重PCR扩增、毛细管电泳荧光检测和数据分析。通过3对SSR引物PCR扩增后进行SSR谱带分析，可以构建麦芽品种指纹数据库。本发明建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通量麦芽纯度鉴定方法，结果稳定可靠，检测效率提高，能够在短时间内对大量样品进行快速测定，可作为商业仲裁的判定依据，杜绝麦芽掺假和售假行为的出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。
Description
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，具体涉及一种麦芽纯度鉴定的方法，尤其涉及一种基于毛细管电泳和SSR标记的高通量麦芽纯度鉴定的方法。
背景技术
啤酒是以麦芽、酒花、水为主要原料，经酵母发酵作用酿制而成的饱含二氧化碳的低酒精度酒。麦芽作为啤酒的主要原料，是大麦经浸麦、发芽、干燥和焙焦等工艺制得的，麦芽的质量直接决定啤酒的质量。与其他麦芽指标相比，麦芽纯度鉴定也是评价麦芽质量的重要指标。
中国的啤酒产量多年来稳居世界第一，但国产大麦产量不足，需要大量从海外进口，主要来自加拿大、澳大利亚和法国。进口大麦和国产大麦之间存在较大的价格差，因此个别麦芽生产企业将廉价麦芽掺入进口大麦生产的麦芽中，以次充好，从中牟利。此外，某些麦芽生产企业也通过混合不同品种麦芽来调配麦芽指标，以此满足啤酒企业严格的麦芽采购标准。混合后的麦芽尽管指标靓丽，但麦芽均一性变差，容易引起糖化、过滤、发酵等一系列问题，进而给啤酒企业带来一系列的经济损失。啤酒企业由于缺乏麦芽纯度鉴定的技术手段，即使明知对方掺假也无计可施，只能吃哑巴亏。因此麦芽纯度鉴定不仅是评价麦芽质量的重要指标，也是保证麦芽一致性和啤酒生产一致性的前提，但是目前尚无快速高效的麦芽纯度鉴定方法。
近年来以微卫星(SSR)分子标记为基础的大麦、小麦等主要农作物的DNA指纹库构建已逐步开展，基于聚丙烯酰胺凝胶电泳技术在大麦遗传多样性及纯度鉴定等方面的研究也有相关报道。聚丙烯酰胺凝胶电泳属于SSR分子标记最常用的方法，通过比较目的条带的位置进行样品品种的判断，但该法不能准确读出片段大小，只能粗略估计。且该法操作繁琐，在样品数量和SSR位点较多时检测工作费时费力。麦芽纯度鉴定时要求取100粒麦芽进行分析，根据检测出的杂粒数来计算样品纯度。如果使用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对100粒麦芽进行多SSR位点的纯度鉴定，由于不能准确读出片段大小而影响结果的准确性，而且检测周期较长，无法满足商业采购对结果快速判定的要求。假设使用10对引物进行麦芽品种鉴定，则100粒麦芽需要进行1000次PCR反应，1000次聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，检测周期至少需要4周，根本无法满足商业麦芽采购的要求。因此聚丙烯酰胺凝胶电泳法仅适用于几粒麦芽样品的品种鉴定分析，无法满足麦芽纯度鉴定时100粒麦芽的检测要求。
毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法。与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比，毛细管电泳具有高灵敏度、高分辨率、快速、自动化、样品少、应用范围广等优点。毛细管电泳检测的样品中均含有分子量内标，DNA片段直接与其泳道中的分子量内标相比就可精确获得其大小数值，而聚丙烯酰胺凝胶电泳所得片段大小只能用肉眼与DNA Marker做比较后估测得出，特别是远离Marker的条带在判定时容易产生误差。发明专利申请ZL201410090899.0提供了一种“利用SSR标记与毛细管电泳鉴定甘蔗杂交种子纯度的方法”。该申请是利用SSR标记与毛细管电泳技术相结合，具体方法包括提取甘蔗基因组DNA，选取多态性较高的SSR引物，对甘蔗DNA进行多重PCR扩增，利用毛细管凝胶电泳检测PCR产物，对SSR标记数据进行分析，计算杂交组合F1的杂交率。SSR-毛细管凝胶电泳技术能精确给出片段大小，分离效率高，结果稳定可靠，能够有效的鉴定出杂交种子纯度。但目前还未见基于毛细管电泳技术和SSR分子标记对麦芽纯度进行高通量鉴定的相关报道。
发明内容
针对现有麦芽纯度鉴定所存在的上述问题，本发明提供了SSR引物组以及利用该引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法。
本发明的技术方案是：本发明利用SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合对17个品种的麦芽进行纯度鉴定，筛选出适合鉴定麦芽纯度的SSR荧光引物。
SSR引物组，包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：
利用上述三对SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)提取供试品种样品的DNA：
从麦芽样品中随机数取96粒麦芽，采用CTAB法提取供试样品的DNA。取单粒麦芽样品于1.5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用Thmorgan CK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65℃预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加4ulβ-巯基乙醇和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65℃水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，10000rpm离心10分钟，吸取300μl的上清液到新离心管中，加10μl的RNase A放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20℃条件下放置20分钟以上，10000rpm离心3分钟收集沉淀。加650μl的70％乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10000rpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放于洁净场所，使乙醇挥发。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8℃保存DNA。
(2)用3种荧光染料标记的3对SSR引物进行多重PCR扩增：
用3种荧光染料标记的3对SSR引物分别对供试样品模板DNA进行多重PCR扩增，3对SSR引物的5’端分别标记Alexa Fluor 750、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 647的荧光染料。PCR扩增采用20μL的反应体积，含MgCl22.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，正向荧光引物、反向引物各0.03-0.05μmol/L，Taq DNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)毛细管电泳荧光检测：
a、制备SLS/DSS混合液：取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪(BECKMAN公司，美国)中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
毛细管电泳四色荧光检测法是将毛细管电泳与四色荧光检测技术相结合。该方法采用三对引物多重PCR扩增SSR位点，三对引物在5’端标记三种不同颜色的荧光染料，荧光检测器对标记有荧光染料的扩增产物进行信号采集，通过与各泳道的分子量内标进行比对，可自动读取产物片段大小。运用四色荧光检测系统使通过一次毛细管电泳能同时检测3个以上的SSR位点，此法具有简便、可靠、低成本及高通量的优点，尤其适用于大规模材料的检测分析，随着SSR位点数的增加，其降低成本的效果更加显著。
(4)数据分析：用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小。将待测样品每粒麦芽DNA的3对荧光引物扩增的电泳图谱分别与标准麦芽指纹图谱相比较，如果扩增片段大小与标准麦芽的指纹数据一致，判定该样品与标准麦芽为同一品种；如果扩增片段与标准麦芽指纹图谱有差异，判定为非标准麦芽的品种，从而计算麦芽样品的纯度。
一种上述方法的应用，利用3对不同荧光染料标记的3对SSR引物进行多重PCR扩增、毛细管电泳荧光检测后进行SSR数据分析，构建麦芽品种指纹数据库。
本发明的有益效果是：本发明建立了毛细管电泳技术与SSR荧光标记相结合的高通量麦芽纯度鉴定方法，结果稳定可靠，检测效率大幅提高，能够在短时间内对大量样品进行快速测定，可作为商业仲裁的判定依据，杜绝麦芽掺假和售假行为出现，从源头上保障啤酒生产企业的产品质量。
(1)本发明利用毛细管电泳四色荧光技术，实现了SSR分子标记与高效、自动化毛细管电泳技术的有益结合，检测结果由分析软件自动保存，检测速度快，分离效率高，有利于大批量样品的检测分析，为SSR分子标记技术在麦芽纯度鉴定中的推广和应用打下了坚实的基础。
(2)本发明的方法灵敏度较高，本实验将扩增产物稀释后取1μl进行毛细管电泳检测，能准确读出片段大小，精确度达到1bp之内；3对SSR引物的峰形特征良好，而且目的片段之间大小在7-10bp以上，符合多重SSR位点分析的要求，结果准确可靠。
(3)本发明的方法高效、快速，应用毛细管凝胶电泳技术结合四色荧光多重PCR技术，一次麦芽纯度检测只需一块96孔板，每孔可鉴定3个不同的SSR位点，相当于一次完成288个样品的检测，大幅提高了检测效率；在大规模、多批次的样品检测分析中该方法的优势更加明显，不仅检测速度快、分析效率高，而且数据分析结果永久保存，方便在不同批次样品中横向比较，从而保证检测结果的准确可靠。
附图说明
图1为Copeland麦芽的毛细管电泳图谱；
图2为Copeland麦芽中其它品种麦芽的毛细管电泳图谱；
图3为Commander麦芽的毛细管电泳图谱；
图4为Commander麦芽中混入的其它麦芽的毛细管电泳图谱；
图5为Metcalfe麦芽的毛细管电泳图谱；
图6为Metcalfe中混入的甘啤4号麦芽的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
实施例1：麦芽指纹图谱的构建
选择17种不同产地的大麦样品，经发芽、干燥后制成麦芽。
表1. 17种麦芽样品
(1)提取供试样品DNA
从麦芽样品中随机取样，采用CTAB法提取供试样品的DNA：取单粒麦芽样品于1.5ml离心管中，约25-45mg，加入7-8mm钢珠，利用Thmorgan CK1000D高通量组织研磨仪进行粉碎。样品中加入65℃预热的CTAB提取缓冲液600ul，涡旋混匀裂解样品。由于麦芽中富含蛋白质、多糖、多酚等物质，分离难度大，因此添加4ulβ-巯基乙醇和1％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，防止多酚氧化褐变和DNA降解，有效去除多酚和多糖。65℃水浴15min，期间轻轻摇动混匀。加600ul氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋剧烈混匀20s，使成乳状液。室温下，10000rpm离心10分钟，吸取300ul的上清液到新离心管中，加10ul的RNase A放置20min。小心抽取上清液加入预冷的等体积的异丙醇，直至白色线状DNA形成块状沉淀。-20℃条件下放置20分钟以上，10000rpm离心3分钟收集沉淀。加650ul的70％乙醇冲洗液，轻摇几分钟，10000rpm离心2min，弃滤液。打开盖，平放洁净场所挥发乙醇。加适量TE缓冲液溶解DNA，2-8℃保存DNA。
(2)PCR扩增：用3对SSR荧光引物分别对供试样品模板DNA进行多重PCR扩增，采用20μL的反应体积，含MgCl2 2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，正向荧光引物、反向引物各0.03-0.05μmol/L，Taq DNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液(不含Mg2+)，样品DNA10-50ng。反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
(3)毛细管电泳荧光检测：
a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液,在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物,加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪(BECKMAN公司，美国)中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。在毛细管凝胶电泳过程中，PCR产物与DSS-400分子量内标的荧光信号均由基因分析仪自动保存。
(4)数据分析：用GeneMapper-V3.0软件对BECKMAN GeXP遗传分析系统仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与软件统计得出不同麦芽的SSR标记片段。利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小。
(5)利用3对SSR引物构建出17种麦芽样品的SSR标准指纹图谱(表2)。
表2. 17种麦芽样品的SSR标准指纹图谱
实施例2：商业麦芽Copeland样品的纯度鉴定
SSR引物组，包括3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：
利用上述三对SSR引物对采购的商业麦芽Copeland样品进行纯度鉴定的方法，包括以下步骤：
(1)从Copeland麦芽样品中随机数取96粒麦芽，进行麦芽DNA制备，荧光多重PCR扩增，毛细管凝胶电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1的步骤(1)-(4)。
(2)结果分析：将待测样品每粒麦芽DNA的3对荧光引物扩增的电泳图谱分别与Copeland麦芽的指纹图谱相比较。结果表明，96粒麦芽中有94粒的电泳图谱与Copeland麦芽的指纹数据一致，SSR位点大小分别为146bp、224bp和254bp，有2粒麦芽峰值特征有差异，SSR位点大小分别为146bp、165bp和261bp，说明混入了其它品种。因此该批Copeland的麦芽纯度为97.9％，其中Copeland麦芽及混入麦芽的毛细管电泳图谱分别如图1、图2。
实施例3：商业麦芽Commander样品的纯度鉴定
与实施例2不同的是，
(1)从Commander麦芽样品中随机数取96粒麦芽，进行麦芽DNA制备，荧光多重PCR扩增，毛细管凝胶电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1的步骤(1)-(4)。
(2)结果分析：将待测样品每粒麦芽DNA的3对荧光引物扩增的电泳图谱分别与Commander麦芽指纹图谱相比较。结果表明，96粒麦芽中有90粒的电泳图谱与Commander麦芽的指纹数据一致，SSR位点大小分别为141bp、224bp和267bp，其它6粒麦芽的峰值特征一致，SSR位点大小分别为146bp、224bp和257bp，说明为混入了其它品种，因此该批Commander的麦芽纯度为92.8％。其中，Commander麦芽及混入麦芽的毛细管电泳图谱分别如图3、图4所示。
实施例4：Metcalfe麦芽与甘啤4号麦芽混掺后的纯度鉴定：
与实施例2不同的是，
(1)从Metcalfe麦芽样品中随机取样72粒，加入24粒甘啤4号，混合均匀，进行麦芽纯度鉴定。进行麦芽DNA制备，荧光多重PCR扩增，毛细管凝胶电泳检测，数据分析，具体实施步骤如实施例1的步骤(1)-(4)。
(2)结果分析：将待测样品每粒麦芽DNA的3对荧光引物扩增的电泳图谱分别与Metcalfe麦芽指纹图谱相比较。结果表明，96粒麦芽中有71粒的电泳图谱数据与Metcalfe麦芽的指纹数据一致，SSR位点大小分别为146bp、224bp和261bp，其他24粒麦芽电泳图谱数据与甘啤4麦芽的指纹数据一致，SSR位点大小分别为144bp、184bp和255bp，因此该批Metcalfe的麦芽纯度为73.9％。其中，Metcalfe麦芽及甘啤4号麦芽的毛细管电泳图谱分别如图5、图6所示。
Claims (5)
1.利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)提取供试品种样品的DNA；(2)用不同荧光染料标记的SSR引物进行多重PCR扩增；(3)毛细管电泳荧光检测；(4)数据分析；
所述SSR引物组为3对SSR引物，分别为HVM68、Bmag0007和EBmac755；所述3对SSR引物序列如下：
所述供试品种样品麦芽为以下17种麦芽：
所述PCR扩增体系采用20μL的反应体积，包括2.5mmol/L的MgCl2、0.20mmol/L的dNTP以及正向荧光引物、反向引物各0.03-0.05μmol/L，Taq DNA聚合酶0.7单位，2×PCR缓冲液，不含Mg2+，样品DNA 10-50ng。
2.根据权利要求1所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述步骤(2)中PCR扩增的反应程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。
3.根据权利要求1所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述步骤(3)包括以下几个步骤：
a、制备SLS/DSS混合液:取0.5μl的DSS-400分子量内标，加入39.5μl的SLS甲酰胺上样缓冲液，在涡旋震荡器上混合均匀，加入样品板中；
b、样品孔中加入1μl稀释后的PCR产物，加一滴石蜡油覆盖样品；
c、在缓冲液板与样本板对应孔内加入3/4体积的分离缓冲液；
d、将上样板和缓冲板放入BECKMAN GeXP遗传分析系统仪中，进样电压2.0kV，时间30sec；90℃变性120sec；分离电压6.0kV，时间50min。
4.根据权利要求1所述的利用SSR引物组对麦芽纯度进行高通量鉴定的方法，其特征在于：所述步骤(4)数据分析为：对步骤(3)得到的数据进行分析，得出不同麦芽的SSR标记片段；利用软件将SSR标记片段与DSS-400分子量内标比较，得到SSR标记片段长度大小；将待测样品每粒麦芽DNA的3对荧光引物扩增的电泳图谱分别与已知麦芽指纹图谱相比较，电泳图谱与已知麦芽的指纹数据一致，判定二者为同一品种；电泳图谱与已知麦芽指纹图谱数据有差异，判定待测麦芽为其他品种。
5.一种权利要求1所述方法的应用，其特征在于：通过3对SSR引物进行多重PCR扩增、毛细管电泳荧光检测后进行SSR数据分析，构建麦芽品种指纹数据库。
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