CN108118088B - 一种基于微流控芯片的人y-str基因位点分型方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于微流控芯片的人Y‑STR基因位点分型方法，涉及DNA分析领域。该方法包括选择缓冲体系、选择电泳芯片、Y染色体STR位点选择、电泳等步骤。本发明基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，在12分钟内分离了5个人Y染色体上的STR基因座(DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y‑GATA‑A10)，并完成真实血液样本的Y‑染色体STR分型测试。芯片电泳对Y‑染色体STR分型所表现出来的高分辨、快速的分离分析能力，使它有希望成为快速、简便、高效分离检测人类染色体STR位点的分析手段之一。

Description

一种基于微流控芯片的人Y-STR基因位点分型方法
技术领域
本发明涉及DNA分析领域，尤其涉及一种基于微流控芯片的人Y-STR基因位点分型方法。
背景技术
Y染色体(Y Chromosomes)是男性所特有,具有6千万个核苷酸片段的染色体,在染色体组中仅大于22号染色体。在减数分裂时,Y染色体结构的拟常染(PseudoautosomalRegions, PAR)常与X染色体的相应区域进行交换重组,而约占Y染色体结构95%区域的Y特异区(Nonrecombining Regions, NRY)则不进行重组交换,呈单倍父系遗传,并保留父系的突变记录, 这也便是利用Y染色体进行法医DNA分析的理论基础(Dupuy B M et al, Hum.Mutat., 2004, 23 (2): 117-124)。同时由于其具有男性特异性,在实际办案中,对性侵犯、伤害等案件中提取到的男女混合检材进行鉴定时,Y染色体遗传标记检验技术更有其特殊的价值,能够获得男性个体Y染色体遗传信息同时不受女性成分影响。鉴于以上特点,Y染色体长期以来都是作为重要的研究检验对象被应用于法医物证检验。
自Cooke于1976年首先报道了人类Y染色体上存在多个串联重复序列,便为人类遗传学和法医学的研究建立了新的里程碑(Cooke H. Nature, 1976, 262 (5565): 182-186)。目前商业化仪器大多采用毛细管电泳技术作为分离系统，采用PMT或CCD作为光电检测系统，用于STR位点检测的时间超过40分钟。然而, 对于某些紧急案件, 快速得到准确的STR 分型结果显得至关重要。此外, 随着案件搜集DNA样本量的增大及国家DNA 数据库建设的快速推进, 待检DNA 样本数量激增, 这不但是对法医DNA 实验室人力和财力的考验,更是对检验技术方法的考验。因此迫切需要开发快速STR分型技术，满足法医DNA工作者的需求。
微流控芯片技术，或称为微全分析系统(micrototal analysis system, μ-TAS)是21世纪非常重要的科学技术，具有重大应用前景。其高度集成，灵活组合的特点可以集成多个分析过程于一体, 使快速STR分析成为可能。1994年起J.Ramsey等开始发表芯片毛细管电泳的文章，1995-1997年Mathies等先后发表了一系列在芯片上实现高速DNA测序和PCR扩增等的论文。Mathies 研究组还较早的涉入Y染色体的芯片STR分型工作。通过设计便携式PCR-CE装置，在1.5小时内实现对釉原蛋白（amelogenin）基因座和3个Y-STR基因座（DYS390, DYS393, DYS439）的复合扩增及电泳分离。并对实际案件中的检材（口腔试子和人骨骼）进行扩增，4个位点全部成功扩出（Liu P et al, Anal. Chem., 2007, 79 (5):1881-1889）。但这些研究进行人STR基因分型仍然需要较长的时间、较高的温度（≥60°）及不同的分离模式才能实现。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，针对人Y染色体基因位点进行快速分离和分析的Y-STR电泳分型方法。
本发明的技术解决方案是：一种基于微流控芯片的人Y-STR分型方法，包括下列步骤：
(1) 选择电泳体系：进样缓冲液体系由50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、50mmol/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸（TAPS）、1mmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)组成1×TTE缓冲液，pH8.3 ；样本分离体系由POP 4 或 POP 7胶组成；
(2) 选择电泳芯片：芯片包括样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池及十字管道，所述十字管道的横臂左右两端分别向垂直于纵臂方向延伸，并分别与缓冲液废液池及缓冲液池相通，十字管道的纵臂上端与样品池相通，十字管道的纵臂下端通过U形延伸段后与样品废液池相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点；
（3）芯片表面修饰：首先将芯片置于真空干燥器中抽真空约10分钟；取出芯片，立即向单个池中加入1M NaOH 65℃保持15min，抽干NaOH，加入1M HCl，室温保持15 min，抽干后加入0.25% pHEA，室温保持 1小时，最后以乙腈抽干微通道置于室温备用。
(4) Y染色体STR位点选择: 基于中国人群中基因多态性(GD>0.6)和等位基因跨度的考虑，我们选择了其中的五个中国人群多态性大，等位基因跨度较小的五个Y染色体基因座作为研究对象。这五个Y染色体基因座位点分别是DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y-GATA-A10。5个基因座分成两组，分别用HEX和TAMRA分组标记，分子量内标用第三色荧光染料标记，组成5个Y染色体STR基因座复合扩增体系,作为电泳待测样品。
(5) 电泳：用1×TTE缓冲液浸洗2 分钟；样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池加入缓冲液后，样品池中注入待测样本；进样阶段，样品池0V，样品废液池+500-800V，缓冲液池+0-200V，缓冲液废液池+300-800V，进样5-60 秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池+3000-4000V，缓冲液池0V，样品池和样品废液池均施加+500-1100V,，运行温度为25℃；得到血清样本中5个Y-STR基因位点的出峰时间、相对含量数据。
芯片大小为63mm×30mm，芯片管道宽90μm，深10-30μm，芯片样品池到十字交叉点长5mm，有效分离长度为160mm，样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池的直径均为2mm。
本发明基于芯片电泳技术结合激光诱导荧光检测系统，在12分钟内分离了5个人Y染色体上的STR基因座（DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y-GATA-A10），并完成真实血液样本的Y-染色体STR分型测试。芯片电泳对Y-染色体STR分型所表现出来的高分辨、快速的分离分析能力，使它有希望成为快速、简便、高效分离检测人类染色体STR基因位点的分析手段之一。
附图说明
图1 是电泳芯片的结构示意图，其中：1样品池；2样品废液池;3缓冲液池;4缓冲液废液池；5检测点，6十字管道。
图2 是Y-STR 等位基因分型标准物电泳图谱。
图3 是实施例1 的1号人血液样本Y-STR 等位基因位点电泳结果。
图4 是实施例1 的2号人血液样本Y-STR 等位基因位点电泳结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
Y-STR等位基因分型标准物的电泳分析
1) 电泳缓冲体系的选择：
进样缓冲液体系由50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、50mmol/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸（TAPS）、1mmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)组成1×TTE缓冲液，pH8.3 ；样本分离体系由POP 4 或 POP 7胶组成；
2) Y-STR等位基因分型标准物的准备
基于中国人群中基因多态性(GD>0.6)和等位基因跨度的考虑，我们选择了其中的五个中国人群多态性大，等位基因跨度较小的五个Y染色体基因座作为研究对象。在与无锡中德美联有限责任公司合作的条件下，共同制作了一个Y染色体试剂盒，基因座位点包括DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y-GATA-A10。5个基因座分成两组，分别用HEX和TAMRA分组标记，分子量内标用第三色荧光染料标记，组成5个常染色体STR基因座复合扩增体系,作为电泳待测样品。
3) 芯片电泳
芯片结构如图1 所示。芯片包括样品池1、样品废液池2、缓冲液池3、缓冲液废液池4及十字管道6；
所述十字管道6的横臂左右两端分别向垂直方向延伸，并分别与缓冲液废液池4及缓冲液池3 相通，十字管道6的纵臂上端与样品池1 相通，十字管道6的纵臂下端与通过U形延伸段后与样品废液池2 相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点5；
芯片采用石英玻璃为制作材料，经光刻、湿法腐蚀、低温键合而成，芯片大小为63mm×30mm，芯片管道宽90μm，深30μm，芯片样品池到十字交叉点长5mm，有效分离长度为160mm，样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池的直径均为2mm。样品池和样品废液池为进样通道，缓冲液池和缓冲液废液池为分离通道。
分析前，进行芯片表面修饰，即1M NaOH引入芯片通道，65℃保持15min，抽干NaOH，加入1M HCl，室温保持15 min，抽干后加入0.25% pHEA，室温保持 1小时，最后以乙腈抽干微通道置于室温备用。样品废液池2、缓冲液池3 和缓冲液废液池4 加入分离缓冲液后，样品池1中注入待测样本。
进样阶段，样品池0V，样品废液池+800V，缓冲液池+200V，缓冲液废液池+700V，进样10 秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池+3600V，缓冲液池0V，样品池和样品废液池均施加+900V，运行温度为25℃。
4) 结果判读
图谱和数据采用Microsoft excel，Origin8.0 和SPASS11.5 软件包处理。先由Y-STR等位基因分型标准物做出标准电泳图谱，再选择受试血液标本进行比对分析，得到血液样本的Y-STR基因位点出峰时间、相对含量等参数。每个峰所代表的等位基因位点已有报道。
实施例2
血液样本Y-STR等位基因的电泳分析
1）电泳缓冲体系
进样缓冲液体系由50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）、50mmol/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸（TAPS）、1mmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)组成1×TTE缓冲液，pH8.3 ；样本分离体系由POP 4 或 POP 7胶组成。
2) Y-STR等位基因分型标准物的准备
基于中国人群中基因多态性(GD>0.6)和等位基因跨度的考虑，我们选择了其中的五个中国人群多态性大，等位基因跨度较小的五个Y染色体基因座作为研究对象。在与无锡中德美联有限责任公司合作的条件下，共同制作了一个Y染色体试剂盒，基因座位点包括DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y-GATA-A10。5个基因座分成两组，分别用HEX和TAMRA分组标记，分子量内标用第三色荧光染料标记，组成5个Y染色体STR基因座复合扩增体系,作为电泳待测标本。
芯片电泳：同步骤3)。
结果判读：图2 为Y-STR等位基因分型标准物的电泳图谱。芯片电泳主要以电渗流作为Y-STR区带的驱动力，电泳时具有不同荷质比的基因位点在的电渗流的作用下实现分离。微流控芯片电泳用于五个等位基因分型标准物分离的最高分辨率≤4 bp。总长度 <250bp的五个基因位点单链DNA片段在芯片电泳上获得基线分离，分离时间小于12 min。
其中1号血液样本Y-STR等位基因分型电泳分离分析
电泳缓冲体系、血液Y-STR等位基因分型的准备、芯片电泳同Y-STR等位基因分型标准物分析方法；
结果判读：图3 为Y-STR等位基因分型标准物的电泳图谱。芯片电泳主要以电渗流作为Y-STR的驱动力，电泳时具有不同荷质比的基因位点在的电渗流的作用下实现分离。微流控芯片电泳用于五个等位基因分型标准物分离的最高分辨率≤4 bp。总长度 <250 bp的五个基因位点单链DNA片段在芯片电泳上获得基线分离，分离时间小于12 min。
其中2号血液样本Y-STR等位基因分型电泳分离分析
电泳缓冲体系、血液Y-STR等位基因分型的准备、芯片电泳同Y-STR等位基因分型标准物分析方法；
结果判读：图4 为Y-STR等位基因分型标准物的电泳图谱。芯片电泳主要以电渗流作为Y-STR的驱动力，电泳时具有不同荷质比的基因位点在的电渗流的作用下实现分离。微流控芯片电泳用于五个等位基因分型标准物分离的最高分辨率≤4 bp。总长度 <250 bp的五个基因位点单链DNA片段在芯片电泳上获得基线分离，分离时间小于12 min。

Claims (2)

1.一种基于微流控芯片的Y染色体STR位点分型方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1) 选择电泳体系：进样缓冲液体系由50mmol/L三羟甲基氨基甲烷、50mmol/L N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙烷磺酸、1mmmol/L乙二胺四乙酸组成1×TTE缓冲液，pH8.3 ；样本分离体系由POP 4 或 POP 7胶组成；
(2) 选择电泳芯片：芯片包括样品池、样品废液池、缓冲液池、缓冲液废液池及十字管道；所述十字管道的横臂左右两端分别向垂直于纵臂方向延伸，并分别与缓冲液废液池及缓冲液池相通，十字管道的纵臂上端与样品池相通，十字管道的纵臂下端与通过U形延伸段后与样品废液池相通；在十字管道的交叉处与缓冲液废液池之间的横臂上设置检测点；
（3）芯片表面修饰：首先将芯片置于真空干燥器中抽真空10分钟；取出芯片，立即向芯片通道中加入1M NaOH 65℃保持15min，抽干NaOH，加入1M HCl，室温保持15 min，抽干后加入0.25% 聚N-羟乙基丙烯酰胺（pHEA），室温保持 1小时，最后以乙腈抽干微通道置于室温备用；
(4) Y染色体STR位点选择:选择五个Y染色体基因座位点分别是DYS459、DYS446、DYS443、DYS460和Y-GATA-A10；5个基因座分成两组，用HEX标记DYS459、DYS446和DYS443，用TAMRA标记DYS460和Y-GATA-A10，分子量内标用第三色荧光染料ROX标记，组成5个Y染色体STR基因座复合扩增体系；
(5) 电泳：用1×TTE缓冲液浸洗2 分钟；样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池加入缓冲液后，样品池中注入待测样本；样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池加入缓冲液后，样品池中注入待测样本；进样阶段，样品池0V，样品废液池+800V，缓冲液池+200V，缓冲液废液池+700V，进样10 秒后切换电压进入分离阶段；分离时，缓冲液废液池+3600V，缓冲液池0V，样品池和样品废液池均施加+900V，运行温度为25℃；得到五个Y染色体基因座位点的出峰时间。
2. 根据权利要求1 所述的一种基于微流控芯片的Y染色体STR位点分型方法，其特征在于：所述芯片大小为63mm×30mm，芯片管道宽90μm，深30μm，芯片样品池到十字交叉点长5mm，有效分离长度为160mm，样品池、样品废液池、缓冲液池和缓冲液废液池的直径均为2mm。
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