CN105986022A

CN105986022A - 24个y染色体str基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105986022A
Application number: CN201510076934.8A
Authority: CN
Inventors: 于在亮; 赵洪玉; 付亮剑; 陈初光
Original assignee: SUZHOU MICROREAD GENETICS Co Ltd
Current assignee: SUZHOU MICROREAD GENETICS Co Ltd
Priority date: 2015-02-13
Filing date: 2015-02-13
Publication date: 2016-10-05
Anticipated expiration: 2035-02-13
Also published as: CN105986022B

Abstract

本发明提供一种24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒，属于生物检测技术领域，该试剂盒能同时扩增分析STR基因座DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643，本发明采用四色荧光标记，扩增产物大小在100-400bp之间，操作简单，并提供了很高的累计个体识别力和累积非父排除率。

Description

24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，设计检测人体基因组中的短串联重复序列基因座多态性，具体地，本发明设计24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增试剂盒及其应用。

背景技术

目前DNA检测技术已经广泛应用于法医DNA分析、亲缘关系鉴定、细胞系鉴定、医学遗传学、人类学等领域。而应用最广泛的DNA分析即为遗传标记的分析，多数的DNA分析方法的核心技术在于片段长度多态性和序列多态性的分析。

近年来，随着短串联重复序列的发现与技术发展使其成为目前应用最广泛的DNA分析技术。在大多数的案件中，由于其在人群中的高度遗传多样性，常染色体STR基因座被广泛应用，然后Y染色体由于其特殊的非重组性质，使其可以应用于同一父系关系的亲缘关系研究。

人类Y染色体特异的短串联重复序列即Y-STR(short tandem repeat,STR),为人类男性所特有,按父系单倍型遗传,在法医学亲子鉴定和个体识别、人类种群学、类起源和进化研究中具有独特的应用价值,在无创伤性产前基因诊断的研究工作中也具有重要应用前景。Y染色体在很多案件的应用中具有其特殊的价值，如在性侵案件中，男性DNA样本中常常混有很多女性DNA样本，Y染色体STR的可以特异性地从混合样本中检测出，此外，Y染色体STR可以应用于父系亲缘关系的鉴定。

发明内容

本发明对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，并提供了一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增试剂盒，本发明所提供的试剂盒操作简单、快速，系统多态性高，均衡性好，灵敏度高，可以应用在法医鉴定及亲子鉴定等领域中。

24个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，包括24对特异性引物，能同时扩增24个Y染色体STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643，所述24对特异性引物见下表如述：

所述特异性引物的浓度分别为：

所述扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4为第一组；DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533为第二组；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576为第三组；DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643为第四组。

所述第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5’端。

所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。

所述等位基因标准物采用橙色标记物ORG标记。

一种试剂盒，包括上述任一扩增体系。

上述扩增体系或试剂盒在法医DNA分析、亲子鉴定中的应用，所述应用为采用上述扩增体系或试剂盒用于检测DNA样本。

所述DNA样本来源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、体液、毛发、肌肉以及其他组织器官。

所述DNA样本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法、酚氯仿提取法而得到。

本发明的技术方案的设计思路：

(一)Y染色体STR基因座的确定

本发明共调查了35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性，最后确定了多个具有高度遗传多态性的Y染色体遗传标记，包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643等24个基因座。这些基因座可以与现在市面上使用较为广泛的试剂盒兼容，保证了已有DNA数据的比对和交流，在此基础上增加位点提高了累计个体识别力和累积非父排除率。

(二)五色荧光标记的确定

本发明采用了五色荧光标记技术，将上述24个Y染色体STR基因座分成四组，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4，采用FAM荧光标记；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533，采用HEX荧光标记；DYS456、DYS389I/II、DYS390、 DYS438、DYS576，采用TAMRA荧光标记；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643，采用ROX荧光标记。内标采用橙色标记物ORG标记。

(三)本发明进一步提供了24个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643。

(四)24个Y染色体STR基因座的等位基因范围、Genbank登记号、参考序列见下表：

基因座	核心重复数目范围	核心重复序列	Genbank登记号	参考序列等位基因
					DYS393	9-17	AGAT	AC006152	12
DYS570	10-25	TTTC	AC01208	16
					DYS19	10-19	TAGA	AC017019	16
DYS392	6-17	TAT	AC011745	13
					DYS549	7-17	GATA	AC010133	13
Y-GATA-H4	8-18	TAGA	AC011751	12
					DYS460	7-12	ATAG	AC009235	9
DYS458	10-24	GAAA	AC010902	18
					DYS481	17-32	CTT	BV208971.1	24
DYS635	15-28	TSTA	AC004772	22
					DYS448	14-24	AGAGAT	AC025227	19
DYS533	7-17	ATCT	AC053516	13
					DYS456	11-23	AGAT	AC010106	15
DYS389I	9-17	(TCTG)(TCTA)	AC004617	13
					DYS389II	24-34	(TCTG)(TCTA)	AC004617	29
DYS390	17-28	(TCTA)(TCTG)	AC011289	25
					DYS438	7-18	TTTTC	AC002531	11
DYS576	11-23	AAAG	AC010104	16
					DYS391	5-16	TCTA	AC011302	10
DYS439	5-19	GATA	AC002992	11
					DYS437	8-18	(TCTA)(TCTG)	AC002992	15
DYS385a/b	7-28	GAAA	AC022486	12
					DYS643	6-17	CTTTT	AC007007	10

扩增相应STR基因座的引物对有一定的序列，这些引物在扩增体系中有一定的浓度，所述各个引物浓度见下表。

本发明的有益效果和优点：

本发明所提供的DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643这24个Y染色体STR基因座包含了市场上使用最广泛的ABI公司的Yfiler的17个位点，在此基础上又增加了7个位点，提高了累积个体识别力和累积非父排除率。

本发明所提供试剂盒与国内外试剂盒比较

本发明采用四色荧光标记，扩增产物大小在100-400bp之间，操作简单，并提供了很高的累计个体识别力和累积非父排除率。本发明所提供的试剂盒操作简单、快速，系统多态性高，均衡性好，灵敏度高，完全能够满足个体识别、亲缘关系鉴定以及DNA数据库建设的需要。

本发明的优势

1、更高的累积个体识别力和累积非父排除率，应用该体系对600个无关男性个体进行检测，共检测出599个单倍型，个体识别力达到99.83％。

通过计算得到如下统计学参数：HD(单倍型多样性)＝0.99999165275

每个基因座的GD值

基因座名称	GD值
		DYS393	0.63773772
DYS570	0.79406271
		DYS19	0.67963499
DYS392	0.72350686
		DYS549	0.61649837
GATA-H4	0.58698308
		DYS460	0.66219516
DYS458	0.81846098
		DYS481	0.80846268
DYS635	0.78764907
		DYS448	0.74326216
DYS533	0.56000416
		DYS456	0.68126544
DYS389I	0.60919076
		DYS390	0.63895109
DYS389II	0.75173301
		DYS438	0.34438729
DYS576	0.77369941
		DYS391	0.42655025
DYS439	0.65342156
		DYS437	0.48007845

DYS385ab	0.86058542
		DYS643	0.65083308

所有基因座的累积非父排除率TGD＝1，累积个体识别率和累积非父排除率相等。

2、物种特异性强

应用该体系扩增了包括鸡、猪、鼠、猫、狗、兔子、马、鹿以及大肠杆菌等物种的DNA样本，均没有检测出特异性扩增峰。

3、混合样本的检测

在男性DNA模板与女性DNA模板的比例达到1:400时，仍能有效检测出24个Y染色体STR基因座，无任何基因座丢失。

附图说明

图1男性个体1的DNA检测图，

图2男性个体2的DNA检测图，

图3牛的DNA检测图，

图4羊的DNA检测图，

图5鸡的DNA检测图，

图6鱼的DNA检测图，

图7男性样本A的DNA检测图，

图8男性样本B的DNA检测图，

图9男性样本A+女性样本C的DNA检测图，

图10男性样本B+女性样本C的DNA检测图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

1、124个Y染色体STR基因座的选择、荧光标记组合以及引物设计

通过对35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性进行统计学分析，确定了包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643在内的24个具有高度遗传多态性的Y染色体STR基因座。这些基因座提高了系统的累积非父排除率和累计个体识别力，能够更好地满足法医DNA检测的技术要求。

将24个基因座分成四组，分别采用FAM、HEX、TAMAR、ROX的荧光染料进行标记，通过反复多次实验验证后，确定最优荧光染料组合方案，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、 Y-GATA-H4，采用FAM荧光标记；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533，采用HEX荧光标记；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576，采用TAMRA荧光标记；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643，采用ROX荧光标记。

针对上述每个基因座设计一对引物，单对引物进行扩增实验，确保不会引起非特异扩增后，24对引物复合扩增，重新设计可能引起非特异的引物，直到体系中无非特异扩增出现，根据引物对效率的高低调整复合扩增体系中引物的浓度。

1、2复合扩增体系中各组分的优化

基于反应体系10ul优化体系中酶的含量和Mg²⁺的浓度进行优化，酶含量梯度为0.5U、1.0U、1.5U、2.0U，镁离子浓度梯度为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，设计正交实验，共16组，最后确定复合扩增体系中成分的最优组合。

1、3热循环参数优化

确定了体系中酶的含量和镁离子的浓度后，对热循环参数进行优化，针对扩增循环数大小进行梯度实验，27个循环、29个循环、31个循环以及33个循环四个梯度进行实验，确定最优扩增循环数为31个循环。退火温度是在确定了循环数后进行优化，在31个扩增循环数下，退火温度分别设置56℃、58℃、60℃、62℃、64℃，确定最优的退火温度为60℃。另外也可以兼容不同PCR仪之间的温度差异。

1、4确定本发明推荐使用的反应体系和热循环参数

反应体系

热循环参数

1、5扩增产物的毛细管电泳检测

在检测前，对产物进行变性处理并与分子量内标混合，1ul产物+0.5ul分子量内标+8.5ul 的HIDI(去离子甲酰胺)，混匀后短暂离心，95℃变性5min后立即冰浴10min，用ABI系列遗传分析仪进行电泳检测。

无关个体的24个Y染色体STR基因座检测结果，男性个体1、男性个体2的检测图见图1、图2。

实验例2物种特异性验证报告

实验目的：

测试Microreader^TM24Y Direct ID System的物种特异性

1.实验仪器与试剂

1.1实验仪器：9700-金(ABI)

1.2实验试剂：配套BufferB和TaqII、引物混合物(自配)

2实验方法

取纯净猪、牛、羊、小鼠、鸡、鸭、鱼及人类模板各一个。

2.1扩增程序

2.2扩增体系

组分	单体系用量(L)
		1.25×BufferB	8
5×引物混合物	2
		TaqII	0.2
模板	1

2.3毛细管电泳：ABI 3500检测(进样电压3.0KV，进样时间4秒)，数据分析采用Genemapper ID-X软件。

3.实验结果，见图3、4、5、6。

本发明的扩增体系作为身份鉴定系统在猪、牛、羊、小鼠、鸡、鸭、鱼等均不能有效扩增，只在人类DNA获得扩增，具有较好的物种特异性。

实施例3混合模板扩增能力验证报告

实验目的：

测试Microreader^TM24Y Direct ID System男女混合模板扩增能力

1.实验仪器与试剂

1.1实验仪器：9700-金(ABI)

1.2实验试剂：配套BufferB和TaqII、引物混合物(自配)

2实验方法

纯净男性模板2个编号A,B；纯净女性模板编号C。A、B与C分别按照1:500的比例进行混合。

2.1扩增程序

2.2扩增体系

4.实验结果：

样本A基因型见图7，样本B基因型见图8，样本A+C混合基因型见图9，样本B+C混合基因型，见图10。

本发明的扩增体系作为身份鉴定系统在男女混合模板中有良好的扩增能力，结果稳定，不影响分型。

Claims

1.24个Y染色体STR基因座的复合扩增体系，包括24对特异性引物，能同时扩增24个Y染色体STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、

DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643，所述24对特异性引物见下表如述：

2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述特异性引物的浓度分别为：

3.根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述扩增体系中的被扩增基因座分别由四种颜色的荧光标记，相同荧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4为第一组；DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533为第二组；DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576为第三组；DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643为第四组。

4.根据权利要求3所述的复合扩增体系，所述第一组采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5’端。

5.根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。

6.根据权利要求1所述的复合扩增体系，所述等位基因标准物采用橙色标记物ORG标记。

7.一种试剂盒，包括权利要求1-6任一复合扩增体系。

8.权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒在法医DNA分析、亲子鉴定中的应用，所述应用为采用权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒用于检测DNA样本。

9.权利要求8所述的应用，所述DNA样本来源于血液、血痕、唾液、精液、精斑、体液、毛发、肌肉以及其他组织器官。

10.权利要求9所述的应用，所述DNA样本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法或酚氯仿提取法而得到。