CN108060233A

CN108060233A - 30个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN108060233A
Application number: CN201711326962.6A
Authority: CN
Inventors: 杨凡; 于在亮; 陈初光; 庞蒙维; 郑玉
Original assignee: SUZHOU MICROREAD GENETICS Co Ltd
Current assignee: SUZHOU MICROREAD GENETICS Co Ltd
Priority date: 2017-12-13
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: CN108060233B

Abstract

本发明属于生物检测技术领域，涉及30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用，可同时扩增Y染色体上的29个STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y‑GATA‑H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS587、DYS645、DYS531、DYS596、DYS593、DYS443。总之，本发明具有如下优点：1.含有30个人类男性Y染色体STR，包含常规位点及低突变位点，独特新颖，信息量大，兼容性好。2.适应范围广，指向性强，精准度高，适用于所有涉及男性的有细胞的物证案件中的法医DNA分析。凡是含有男性细胞的生物检材，如血迹、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨及其它人体组织等均能鉴定，可直接扩增FTA卡，全血，带毛囊的毛发以及口腔拭子等。

Description

30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，设计检测人体基因组中的短串联重复序列基因座多态性，具体是指一种能分析男性个体Y染色体上30个STR位点的五色荧光标记系统，主要用于公安建库，同时可用于亲子鉴定的辅助检测手段。

背景技术

近年来，随着短串联重复序列的发现与技术发展使其成为目前应用最广泛的DNA分析技术。在大多数的案件中，由于其在人群中的高度遗传多样性，常染色体STR基因座被广泛应用，然后Y染色体由于其特殊的非重组性质，使其可以应用于同一父系关系的亲缘关系研究。

人类Y染色体特异的短串联重复序列即Y-STR(short tandem repeat,STR),为人类男性所特有,按父系单倍型遗传,在法医学亲子鉴定和个体识别、人类种群学、类起源和进化研究中具有独特的应用价值,在无创伤性产前基因诊断的研究工作中也具有重要应用前景。Y染色体在很多案件的应用中具有其特殊的价值，如在性侵案件中，男性DNA样本中常常混有很多女性DNA样本，Y染色体STR的可以特异性地从混合样本中检测出，此外，Y染色体 STR可以应用于父系亲缘关系的鉴定。

而在所有的Y-STR中，突变率较低的基因座可有效区分开不同家系或不同地域男性，作为一种辅助检测手段，在进行司法鉴定以及案件侦破时节省排查范围。

目前美国ABI公司的PCR扩增试剂盒和美国Promega公司的21试剂盒，国内的如公安部二所的DNATyper15试剂盒被广为应用在身份鉴定，一般包含15个左右的基因座。

随着技术的发展和客户需求的增长，对试剂盒基因座数目，兼容性，信息量的需求也逐步提高。而目前现有的试剂盒一般包含15个左右的基因座，所提供的信息量有限，不利于进行精确的亲缘鉴定、失踪人口比对。

发明内容

为了克服上述缺陷，本发明提供一种30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用，属于生物检测技术领域，该试剂盒能同时扩增分析STR基因座DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、 DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS587、DYS645、DYS531、DYS596、DYS593、DYS443，本发明采用五色荧光标记，提供了很高的累计个体识别力和累积非父排除率，且具有多个突变率低的位点，在实际使用中可作公安建库，以及家系排查。

为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，可同时扩增Y染色体上的30个STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、 DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、 DYS643、DYS587、DYS645、DYS531、DYS596、DYS593、DYS443；其中DYS385a/b为同一对引物扩增，以下为该29对特异性引物的序列如下表1：

表1：复合扩增体系各基因座引物序列

所述扩增体系中的被扩增位点分别由四种颜色的荧光标记，第五种荧光标记为橙色内标。相同荧光标记视为同一组，四组组合分别为：

第一组：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS587，引物5’标记为FAM；

第二组：DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS645，引物 5’标记为HEX，

第三组DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576、DYS531、DYS596, 引物5’标记为TAMRA，

第四组DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS593、DYS443，引物 5’标记为ROX，

第五种荧光标记ORG为内标，内标片段分别为：70、80、100、120、140、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550，共22个内标片段。

所述扩增体系扩增时的反应条件为：

第1步：95℃变性5分钟，第2步：94℃变性20秒，第3步：59℃退火90分钟，重复 2至3步27次，最后60℃延伸10分钟。

所述模板DNA来自于人类的骨骼、唾液、血液、毛发、精斑等DNA提取物以及各类直接扩增的样本，如血卡，FTA卡，口腔拭子等。

本发明采用五色荧光标记系统，将上述的30个基因座按上文分组并进行荧光标记。在各基因座等位基因核心序列的上游、下游各设计一对引物，将扩增产物按照分子量大小差异分开，两个基因座之间不重叠。将所有引物混合进行复合扩增实验，无非特异扩增的现象。同时本发明的检测组分中标准物采用Orange标记，能够很明确的标记区分出检测样本各个基因座位点的大小。

本发明的扩增产物需经过毛细管电泳，可用ABI系列的遗传分析仪进行检测，检测结果可以在Genemapper等数据分析软件上进行分析。

本发明选择人类Y染色体位点，一次性扩增30个基因座，适用于所有涉及有人类男性细胞的物证案件中的法医DNA分析。

本发明的设计策略：

1.基因座的选择

随着技术的发展和客户需求的增长，试剂盒基因座数目，兼容性，信息量也逐步提高。

很多遗传鉴定需要更多的基因座和更多的信息量。比如亲缘鉴定、失踪人口比对等等。本发明是含有30个Y-STR位点的产品，能够提高无关男性间的区分能力，一个试剂盒能够提供足够多的信息量，因而使此试剂盒具备高精准度。

2.引物设计

所述的引物采用Primer Premier 5和NCBI Blast等软件设计而成，设计引物时应尽量确保各引物的Tm值在(59±2)℃的范围内，扩增效率类似并确保各对引物的扩增产物大小相差100bp以上。设计完成后，在线blast分析同源染色体之间的相互作用，如果有相互作用可产生非特异产物或者二聚体的需要重新设计，直至得到符合要求的引物序列。

选用男性人源DNA模板，分别用上述30对引物进行单重扩增，将扩增产物置于1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，根据电泳结果来调整PCR体系及扩增条件以得到30对引物共同的扩增条件。最终期望的效果是：在相同体系及扩增条件下，所有的引物对均能出现明亮且较单一的目的条带。如果有引物满足不了上述条件，则重新设计引物。

3.荧光标记系统的建立

所述选择了FAM、HEX、TAMAR、ROX、ORG建立五色荧光复合扩增体系，将所设计的30对引物，分为四组进行荧光标记，每组采用一种荧光标记，分别是FAM、HEX、TMR和ROX，再加上ORG内标。得到荧光标记引物后，用其相配对的非荧光引物组合，然后分别进行单重扩增，将扩增产物置于3500/3130遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来评估每对引物的扩增效率。其后，将同一荧光标记的引物混合置于同一管中扩增，将扩增产物置于3500遗传分析仪上进行毛细管电泳，根据毛细管电泳检测的结果来确定每对引物的扩增效率，以及判断该组引物混合扩增是否引起非特异性。最后，根据单重扩增及组合扩增的毛细管电泳结果来初步确定各引物对的加入量，将30对引物混合置于同一管中扩增，再根据复合扩增的电泳结果来调整各自的浓度，使各引物对的扩增效率(反应在电泳结果的信号值上)基本一致为准。最终确定的30对引物序列。

4.扩增反应体系的优化

通过多次反复实验来确定30个基因座复合扩增体系的参数，包括：Taq DNA聚合酶的选择与用量、Mg²⁺浓度、缓冲液的离子强度、缓冲液与酶的预混液(Master Mix)负二十防冻实验以及DNA模板用量确定。

5.反应程序的优化

经过大量实验摸索了反应程序的变性、退火及延伸的温度和时间范围，认为在以下条件下(见表2)进行的扩增可以得到较好的结果：

表2聚合酶链式反应扩增条件

总之，本发明具有如下优点：

1.含有30个人类男性Y染色体STR，包含常规位点及低突变位点，独特新颖，信息量大，兼容性好。

2.适应范围广，指向性强，精准度高，适用于所有涉及男性的有细胞的物证案件中的法医 DNA分析。凡是含有男性细胞的生物检材，如血迹、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨及其它人体组织等均能鉴定，可直接扩增FTA卡，全血，带毛囊的毛发以及口腔拭子等。

3.系统特异性和稳定性好，经过反复验证多次，无非特异扩增产物产生，信号强度稳定。

4.灵敏度高，低至0.05ng的DNA模板量可以得到准确分型。

5.抗抑制能力强，可有效抵抗血红素，腐殖酸，单宁酸，靛蓝等常见抑制剂的影响。

6.均衡性高于行业标准。

7.扩增时间短，可在90min内得到PCR产物。

附图说明

图1为等位基因分型物示意图；

图2为FTA卡扩增效果图；

图3为全血直接扩增效果图；

图4为0.05ng阳性对照扩增效果图；

图5为加入抑制剂血红素(hematin)的扩增效果图；

图6为男女混合样本的扩增效果图；

图7为哥哥口腔拭子未经提取直接扩增效果图；

图8为提取弟弟头发毛囊扩增效果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例1扩增FTA卡以及未经提取的全血

1.获得DNA

a.FTA卡(用采血针采取的新鲜血液涂卡所制)

b.新鲜血液等(血液样本由志愿者捐赠)

2.反应体系

将各反应试剂(缓冲液、引物混合物、采取1.0mm的FTA卡或0.5ul未经提取的全血)振荡混合后按以下方式配成PCR反应混合液，扩增体系总体积为25μl，包括引物混合物(5*Primer mix)5μl，其中引物浓度见表1，反应缓冲液(5*Master Mix)5μl，基因组DNA 2μl(提取模板DNA，直扩检材，检材即1.0mm的FTA卡或0.5ul未经提取的全血等)，加ddH₂O补齐25ul体系。

3.PCR反应程序

本发明所涉及的复合扩增体系使用的PCR扩增程序(表3)。

表3聚合酶链式反应扩增条件

本发明采用特殊的缓冲液，成分如表4。

表4反应缓冲液(5*Master Mix)配方

成分	单位	缓冲液中的浓度
			KCl	M	0.01
MgCl₂	M	0.002
			Tris-HCl	M	0.055
BSA	mg/ml	0.8
			dNTP	mM	0.2
(NH₄)₂SO₄	mM	0.01
			DMSO	％	5
乙二醇	％	8
			Na₄P₂O₇	mM	1
Taq酶	U	2

4.毛细管电泳检测

将Orange550内标和甲酰胺按比例2.5:100混合，取12.5μl混合物加入到96孔板，再加入扩增产物样品或者是等位基因标准物1μl，混合静置数分钟，95℃变性3min，立即冰浴3min，离心后放入ABI3500测序仪上，准备检测。

5.数据分析

导入原始数据，在主页面的File菜单选择Add sample to project，找到样品文件，选中文件夹，点击add to list，点击add,样品文件即显示在Project窗口；选择分析参数。定义 analysis method、panel、size standard。浏览样本电泳的原始数据，选中某样本的文件名，在“sample”菜单下选择“Raw data”。移动追踪线，使光标停在引物峰右侧(第一个橙色的内标峰前)，以此时窗口左下角X轴上显示的数值作为analysis method分析参数中的起始点；点击绿色分析按钮，出现save project对话框，命名后保存，软件即开始处理数据，分析完成后左下角显示analysis completed。采用GeneMapper^RID-X软件分析得到的数据并生成图谱。如下图2、图3、证明该体系扩增不同类型检材均可得到清晰准确的分型图。

实施例2灵敏度，抗抑制能力验证

1.用1ng阳性对照进行梯度稀释并使用该发明试剂盒扩增，以下挑选0.05ng模板扩增效果图(如图4)。实验证明，采用0.05ngDNA模板，扩增效果良好，因此，本发明的扩增体系灵敏度高。

2.用1ng的阳性对照进行扩增，并向体系中加入不同浓度的血红素(hematin)，扩增效果图(如图5)。实验证明，在体系中含有高浓度抑制剂的情况下，该复合体系仍然能够完全扩增，除部分片段受到抑制外，大部分片段未受影响。因此，本发明的扩增体系的抗抑制能力高，适用于常见的案件检材。

实施例3男女混合样本验证

虽然Y染色体为男性特有的，但在实际应用中我们发现，由于Y染色体和X染色体具有高度同源性，某些Y-STR同样有可能扩增出女性样本，而在奸杀案中，警方经常能够采集到男女混合样本。这就要求Y-STR的引物设计必须具有很好的特异性，才能避免在女性样本含量过高的混合斑中检出非目的条带，对犯罪嫌疑人的DNA鉴定造成困扰。

用1ng的男性样本与不同浓度的女性样本混合，扩增效果图(如图6)。实验证明，在超高浓度的女性模板影响下，仍能扩增出完整的男性样本条带，且无非特异扩增。

实施例4同父异母样本检测

对同父异母的两兄弟分别取样并扩增，图7为哥哥口腔拭子直接扩增效果图，图8为弟弟头发毛囊提取DNA后扩增效果图，结果分析见表5。

表5：兄弟分型统计表

虽然根据孟德尔遗传定律显示，同父异母的两个兄弟的Y染色体均来自于父亲，但由于某些Y-STR(如DYS449，DYS399等)具体高突变率，一代遗传或二代遗传的过程中就会发生突变，突变率大于1％。

本发明显示的复合扩增体系经过大量家系样本(大于1000个家系)验证，在检测数据正确的情况下，未出现突变，本实验选出其中一个家系的数据作为示例。

上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州阅微基因技术有限公司

<120> 30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用

<130> xhx2017121303

<141> 2017-12-13

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 51

tggctaacac acttcagccc ttc 23

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 52

gtttcttaag agttctccct catgatgtg 29

<210> 53

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 53

ttatttgtct gttccaagtg gttca 25

<210> 54

<211> 29

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 54

ttttatttac acatatacaa aacattgat 29

<210> 55

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 55

attgatagaa gatctcacca gtgga 25

<210> 56

<211> 25

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 56

ttatcctttt tctaggtggg aactt 25

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 57

ttcagttgaa gccagaacct ac 22

<210> 58

<211> 26

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 58

gcacctattt ctgtgaacta ctccta 26

Claims

1.30个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，可同时扩增Y染色体上的30个STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS587、DYS645、DYS531、DYS596、DYS593、DYS443；其中DYS385a/b为同一对引物扩增两个片段，29对特异性引物的序列如下：

2.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，各引物浓度如下：

3.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系中的被扩增基因座分别由五种颜色的荧光标记组成，相同的荧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS587为第一组；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS645为第二组；DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS438、DYS576、DYS531、DYS596为第三组；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYS593、DYS443为第四组；分子量内标为第五组。

4.根据权利要求3所述的复合扩增体系，其特征在于，所述的第一组采用采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，所述荧光标记位于特异引物对中其中一条引物的5’端。

5.根据权利要求1所述的复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。

6.根据权利要求5所述的复合扩增体系，其特征在于，所述等位基因标准物采用橙色标记物ORG标记，片段大小分别为：70、80、100、120、140、180、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550。

7.一种试剂盒，包括权利要求1-6任一复合扩增体系。

8.权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒在法医DNA分析，亲子鉴定中的应用，所述应用为采用权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒用于DNA样本。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述DNA样本来源于血液、血斑、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨、羊水及其他人体组织。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述DNA样本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法或酚氯仿提取法而得到。