CN107881245A - 29个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用 - Google Patents
29个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用，属于生物检测技术领域，该试剂盒能同时扩增分析STR基因座DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y‑GATA‑H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1 a/b、DYS627、DYS449、DYS518，本发明采用六色荧光标记，扩增产物大小在80‑450bp之间，操作简单，并提供了很高的累计个体识别力和累积非父排除率。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，用于检测人体基因组中的短串联重复序列基因座多态性，具体地，本发明设计29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用。
背景技术
目前DNA检测技术已经广泛应用于法医DNA分析、亲缘关系鉴定、细胞系鉴定、医学遗传学、人类学等领域。而应用最广泛的DNA分析即为遗传标记的分析，多数的DNA分析方法的核心技术在于片段长度多态性和序列多态性的分析。
近年来，随着短串联重复序列的发现与技术发展使其成为目前应用最广泛的DNA分析技术。在大多数的案件中，由于其在人群中的高度遗传多样性，常染色体STR基因座被广泛应用，然后Y染色体由于其特殊的非重组性质，使其可以应用于同一父系关系的亲缘关系研究。
人类Y染色体特异的短串联重复序列即Y-STR(short tandem repeat,STR)，为人类男性所特有，按父系单倍型遗传，在法医学亲子鉴定和个体识别、人类种群学、类起源和进化研究中具有独特的应用价值，在无创伤性产前基因诊断的研究工作中也具有重要应用前景。Y染色体在很多案件的应用中具有其特殊的价值，如在性侵案件中，男性DNA样本中常常混有很多女性DNA样本，Y染色体STR的可以特异性地从混合样本中检测出，此外，Y染色体STR可以应用于父系亲缘关系的鉴定。
而现有的检测试剂盒，无法同时检测Yfiler、PPY23和Yfiler Plus的所有位点，鉴别能力有待提高。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明对男性人群的Y-STR基因座的遗传多态性进行了深入的研究，目的在于提供一种具有改善鉴别能力的Y染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系、试剂盒及其应用，本发明所提供的试剂盒可以应用在法医鉴定及亲子鉴定等领域中。
为了实现上述发明目的，本发明所采取的技术方案：29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，包括27对特异引物，能同时扩增29个Y染色体STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518，所述27对特异性荧光引物如下表1：
表1特异性荧光引物
其中，每个基因座对应的引物对中，上排为正向引物，下排为反向引物；基因座DYS385a/b和DYF387S1a/b分别具有2个等位基因，两等位基因对应的引物对相同。
所述引物浓度分别如表2。
表2各引物浓度
所述扩增体系中的被扩增基因座分别由五种颜色的荧光标记组成，相同的荧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4为第一组；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533为第二组；DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS518为第三组；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643为第四组；DYS438、DYS576、DYS387S1a/b、DYS627、DYS449为第五组。
所述第一组采用采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，第五组采用PURP标记，所述荧光标记位于特异引物对中其中一条引物的5’端。
由27对引物扩增各STR基因座，复合扩增采用聚合酶链式反应。
所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。
所述等位基因标准物采用橙色标记物ORG标记。
一种试剂盒，包括上述任一扩增体系。
上述扩增体系或试剂盒在法医DNA分析、亲自鉴定中的应用，所述应为采用上述扩增体系或试剂盒用于检测DNA样本。
所述的扩增产物可用ABI系列的遗传分析仪进行检测。
所述DNA样品可来源于人的血液、血痕、精液、精斑、唾液、体液、毛发、肌肉、组织、指甲等。
所述DNA样品可用试剂盒法、酚氯仿抽提法、Chelex-100法、磁珠法进行DNA提取处理。
更具体的技术方案包括：
(一)Y染色体STR基因座的确定
本发明共调查了35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性，最后确定了多个具有高度遗传多态性的Y染色体遗传标记，包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518等29个基因座。这些基因座可以与现在市面上使用较为广泛的试剂盒兼容，保证了已有DNA数据的比对和交流，在此基础上增加位点提高了累计个体识别力和累积非父排除率。
(二)六色荧光标记的确定
本发明采用了六色荧光标记技术，将上述29个Y染色体STR基因座分成五组，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4用FAM标记；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533用HEX标记；DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS518用TAMRA标记；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643用ROX标记；DYS438、DYS576、DYS387S1、DYS627、DYS449用PURP标记。
(三)本发明进一步提供了29个Y染色体STR基因座的特异性寡核苷酸扩增引物对：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518。
(四)29个Y染色体STR基因座的等位基因范围、Genbank登记号、参考序列见下表3：
表3 29个Y染色体STR基因座的等位基因范围、Genbank登记号、参考序列
扩增相应STR基因座的引物对有一定的序列(见表1)，这些引物在扩增体系中有一定的浓度，所述各个引物浓度见上述的表2。
本发明所提供试剂盒的优越性见表4，其中“+”指的是可以识别该STR基因座，空格为不能识别该STR基因座，本发明的扩增体系可以识别29个Y染色体基因座，而其它试剂盒均只能识别部分基因座。
表4本发明所提供试剂盒与国内外试剂盒比较
本发明所提供的DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518这29个Y染色体STR基因座包含Yfiler、PPY23和Yfiler Plus的所有位点，提高了累积个体识别力和累积非父排除率。
本发明兼容性好，包含22个常规位点DYS393，DYS19，DYS392，DYS549，Y GATA H4，DYS460，DYS458，DYS481，DYS635，DYS448，DYS533，DYS456，DYS389I，DYS390，DYS389II，DYS438，DYS391，DYS439，DYS437，DYS385ab，DYS643，包含Yfiler和PP23的所有位点。包含7个快速突变型位点DYS570，DYS576，DYS627，DYF387S1，DYS449，DYS518。包含10个基因座的扩增片段小于220bp的miniSTR基因座，这10个基因座分别为DYS393、DYS570、DYS460、DYS458、DYS456、DYS389I、DYS391、DYS439、DYS438、DYS576。具有更高的个体识别力，快速突变型位点的加入提高了个体识别力。具有更高的适用性，适用于多种免提取检材，血卡、血纱布、FTA卡、血滤纸、唾液卡、新鲜全血、头发等均可以直接扩增。快速高效，1.5h完成扩增。
总之，本发明具有如下优点：(1)更高的累积个体识别力和累积非父排除率，应用该体系对600个无关男性个体进行检测，共检测出599个单倍型，个体识别力达到99.83％。所有基因座的非父排除率TGD＝1，累积个体识别率和累积非父排除率相等。(2)物种特异性强：应用该体系扩增了包括鸡、猪、鼠、猫、狗、兔子、马、鹿以及大肠杆菌等物种的DNA样本，均没有检测出特异性扩增；(3)混合样本的检测：在男性DAN模板和女性DNA模板的比例达到1:400时，仍能有效检测出24个Y染色体STR基因座，无任何基因座丢失。
附图说明
图1为随机模板扩增效果图；
图2和图3为其他物种的扩增效果图；
图4和图5分别为正常男性模板A和B的扩增效果图；
图6和图7分别为正常男性模板A和B分别以1:500的比例与女性模板混合的扩增图；
图8为等位基因标准物的分型图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1 29个Y染色体STR基因座的选择、荧光标记组合以及引物设计
通过对35个Y染色体STR基因座在男性人群中的遗传多态性进行统计学分析，确定了包括DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518在内的29个具有高度遗传多态性的Y染色体STR基因座。这些基因座提高了系统的累积非父排除率和累计个体识别力，能够更好地满足法医DNA检测的技术要求。
将29个基因座分成五组，分别采用FAM、HEX、TAMAR、ROX、PURP的荧光染料进行标记，通过反复多次实验验证后，确定最优荧光染料组合方案，DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4用FAM标记；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533用HEX标记；DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS518用TAMRA标记；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643用ROX标记；DYS438、DYS576、DYS387S1、DYS627、DYS449用PURP标记。
针对上述每个基因座设计一对引物，单对引物进行扩增实验，确保不会引起非特异扩增后，27对引物复合扩增，重新设计可能引起非特异的引物，直到体系中无非特异扩增出现，根据引物对效率的高低调整复合扩增体系中引物的浓度(表1和表2)。
复合扩增体系中各组分的优化
基于反应体系10ul优化体系中酶的含量和Mg2+的浓度进行优化，酶含量梯度为0.5U、1.0U、1.5U、2.0U，镁离子浓度梯度为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，设计正交实验，共16组，最后确定复合扩增体系中成分的最优组合。
热循环参数优化
确定了体系中酶的含量和镁离子的浓度后，对热循环参数进行优化，针对扩增循环数大小进行梯度实验，27个循环、28个循环、29个循环、30个循环和31个循环进行五个梯度实验，确定最优扩增循环数为28个循环。退火温度是在确定了循环数后进行优化，在28个扩增循环数下，退火温度分别设置57℃、59℃、61℃、63℃、65℃，确定最优的退火温度为59℃。另外也可以兼容不同PCR仪之间的温度差异。
由此确定本发明推荐使用的反应体系和热循环参数，如表5和表6所示。
表5反应体系
表6热循环参数
实施例2
扩增产物的毛细管电泳检测
在检测前，对产物进行变性处理并与分子量内标混合，1ul产物+0.5ul分子量内标+8.5ul的HIDI(去离子甲酰胺)，混匀后短暂离心，95℃变性5min后立即冰浴10min，用ABI系列遗传分析仪进行电泳检测，如图1。从图中可以看出，每个基因座都可以准确分型，特异性较好，未出现非特异条带，各个基因座的峰高均衡性也较好。
实施例3
物种特异性实验
取猪、牛、羊、鸡、鸭、鱼的模板进行扩增，检测6色29Y的物种特异性，结果如图2-3所示。通过对其他物种的扩增，扩增不出条带，说明27对引物的种属特异性较好。
实施例4
混合模板扩增能力验证
纯净男性模板编号A、B；纯净女生编号C。将A、B和C分别按照1:500的比例进行混合扩增。
图4和图5分别为正常男性模板A和B的扩增效果图；图6和图7分别为正常男性模板A和B分别以1:500的比例与女性模板混合的扩增图(即500ng女性DNA模板存在时1ng男性DNA模板的扩增结果图)，由图可以得出：即使在存在大量女性模板的情况下，也能准确对微量的男性模板进行准确分型。
各基因座等位基因标准物
根据各基因座PCR产物片段长度大小设计并制备等位基因分型标准物，如表7。
表7基因座等位基因标准物信息
| 基因座 | 荧光标记物颜色 | 片段长度范围 | 等位基因范围 |
| DYS393 | 蓝 | 103-147 | 7-18 |
| DYS570 | 蓝 | 157-217 | 10-25 |
| DYS19 | 蓝 | 229-269 | 9-19 |
| DYS392 | 蓝 | 282-330 | 4-20 |
| DYS549 | 蓝 | 342-382 | 7-17 |
| DYSH4 | 蓝 | 392-432 | 8-18 |
| DYS460 | 绿 | 93-117 | 7-13 |
| DYS458 | 绿 | 127-183 | 10-24 |
| DYS481 | 绿 | 190-238 | 16-32 |
| DYS635 | 绿 | 249-301 | 15-28 |
| DYS448 | 绿 | 317-377 | 14-24 |
| DYS533 | 绿 | 388-428 | 7-17 |
| DYS456 | 黄 | 85-133 | 11-23 |
| DYS389Ⅰ | 黄 | 149-181 | 9-17 |
| DYS390 | 黄 | 189-245 | 15-29 |
| DYS389Ⅱ | 黄 | 255-299 | 24-35 |
| DYS438 | 紫 | 307-357 | 6-16 |
| DYS576 | 紫 | 365-413 | 11-23 |
| DYS391 | 红 | 84-128 | 5-16 |
| DYS439 | 红 | 137-181 | 6-17 |
| DYS437 | 红 | 193-225 | 11-19 |
| DYS385a/b | 红 | 239-323 | 7-28 |
| DYS643 | 红 | 343-398 | 6-17 |
| DYS387S1a/b | 紫 | 226-284 | 30-45 |
| DYS627 | 紫 | 292-356 | 11-27 |
| DYS449 | 紫 | 296-348 | 24-37 |
| DYS518 | 黄 | 246-320 | 31-50 |
等位基因标准物的分型图见图8。等位基因标准物为分型的标准，将目前基因频率比较高的分型集合到一起，用于对个人进行分型鉴定。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州阅微基因技术有限公司
<120> 29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及其应用
<130> xhx2017111401
<141> 2017-11-14
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
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gcaagccatt aaggaaattg tc 22
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gcacaggtgc agtcatagct gtctgc 26
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ctgaccaaca cagtgaaact ccact 25
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ctatgaatat tttcccttaa cttgt 25
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gctactcagg aggctgaggc cggat 25
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ctgggcaaca caagtgaaac tgctt 25
Claims (10)
1.29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，该复合扩增体系包括27对引物，可同时扩增29个STR基因座：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4、DYS391、DYS439、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533、DYS456、DYS389I/II、DYS390、DYS438、DYS576、DYS460、DYS458、DYS437、DYS385a/b、DYS643、DYF387S1a/b、DYS627、DYS449、DYS518；
29个STR基因座对应的27对特异性引物如下所述：
2.根据权利要求1所述的29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，所述27对特异性引物的浓度分别为：
3.根据权利要求1所述的29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，扩增体系中的被扩增基因座分别由五种颜色的荧光标记组成，相同的荧光标记视为同一组，五组组合分别为：DYS393、DYS570、DYS19、DYS392、DYS549、Y-GATA-H4为第一组；DYS460、DYS458、DYS481、DYS635、DYS448、DYS533为第二组；DYS456、DYS389I、DYS390、DYS389II、DYS518为第三组；DYS391、DYS439、DYS437、DYS385a/b、DYS643为第四组，DYS385a/b包括等位基因DYS385a和DYS385b；DYS438、DYS576、DYS387S1a/b、DYS627、DYS449为第五组，DYS387S1a/b包括等位基因DYS387S1a和DYS387S1b。
4.根据权利要求3所述的29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，所述的第一组采用采用FAM标记，第二组采用HEX标记，第三组采用TAMRA标记，第四组采用ROX标记，第五组采用PURP标记，所述荧光标记位于特异性引物对中其中一条引物的5’端。
5.根据权利要求1所述的29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，所述扩增体系中还含有基因座的等位基因标准物。
6.根据权利要求5所述的29个Y染色体STR基因座的荧光复合扩增体系，其特征在于，所述等位基因标准物采用橙色标记物ORG标记。
7.一种试剂盒，包括权利要求1-6任一项所述的复合扩增体系。
8.权利要求1-6任一项所述的复合扩增体系或权利要求7的试剂盒在法医DNA分析，亲子鉴定中的应用，所述应用为采用权利要求1-6任一复合扩增体系或权利要求7的试剂盒用于DNA样本。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述DNA样本来源于血液、血斑、精斑、唾液、毛发、指甲、软骨、羊水及其它人体组织。
10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述DNA样本采用Chelex-100提取法、磁珠提取法、试剂盒提取法或酚氯仿提取法而得到。
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