CN109929936A

CN109929936A - 一种检测人类y染色体快速突变str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用

Info

Publication number: CN109929936A
Application number: CN201910168477.3A
Authority: CN
Inventors: 刘超; 杜蔚安; 郑文彦; 刘宏; 周咏松; 徐曲毅; 王邦超; 刘长晖
Original assignee: GUANGZHOU CITY FORENSIC SCIENCE TECHNOLOGY INSTITUTE; GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: GUANGZHOU CITY FORENSIC SCIENCE TECHNOLOGY INSTITUTE; GUANGDONG HUAMEI ZHONGYUAN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-03-06
Filing date: 2019-03-06
Publication date: 2019-06-25
Anticipated expiration: 2039-03-06
Also published as: CN109929936B

Abstract

本发明提供了一种检测27个人类Y染色体快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，可在单个反应中多重扩增Y染色体上27个高突变率的STR基因座。本发明通过设计独特的基因座排布和特异性引物，将27个Y染色体快速突变STR基因座分为四组并分别标记不同的荧光染料。本发明的复合扩增系统包含的全部为突变率高、多态性高的Y染色体STR基因座，男性个体识别能力高，在家系细分和案件排查中可作为常规Y染色体STR试剂盒的有效补充。所述荧光标记复合扩增系统引物特异性好、检材适应性强，方法操作简便，检测耗时短、效率高。

Description

一种检测人类Y染色体快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，具体涉及一种检测人类Y染色体27个快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，可应用于亲权鉴定、建库排查、DNA家谱构建等方面。

背景技术

近年来，法医DNA分型技术的发展迅猛，目前已经能对多种检材进行DNA分型，达到认定水平，成为刑事技术中科技含量最高、实用性最强的方法之一，技术水平基本同世界同步，检验结果得到了司法机关特别是审判机关的普遍采信，DNA分析技术成为刑事侦查和法庭审判的最重要依据之一。

目前，国内外广泛使用的法医DNA检测试剂盒主要针对的是常染色体STR、X染色体STR以及低突变Y染色体STR。由于Y染色体STR具有男性特有、父系遗传及单倍型遗传等三大特征，将其独特性与STR位点分型检测的优越性相结合，可在高概率水平上进行法医学个体识别、父权鉴定、混合斑男性成分检测及无名男尸身源确认等，解决了常染色体STR面临的困境。

现有的低突变Y染色体STR的男性属性和父系遗传方式使其在法医学性犯罪案件调查、父系亲缘关系鉴定及现场生物检材群体来源推断等方面具有独特应用价值，但也存在同一父系男性个体间无法有效区分的局限性。此外，一些相对封闭或经历了瓶颈效应的群体，因Y染色体基因多态性较差，导致Y染色体STR分型应用价值较低。鉴于此，加入多态性好、突变率高的快速突变Y染色体STR(rapidly mutating Y-STR，简称RM Y-STR)基因座将在一定程度上解决Y染色体STR分型的法医学应用的局限。

发明内容

本发明旨在提供一种检测人类Y染色体27个快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及其应用，该试剂盒具有高分辨率、高突变率的特点，能够满足同一家系男性个体识别的需求。

本发明为实现上述目的，所采取的技术方案如下：

一种检测人类Y染色体快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，试剂盒含有用于特异性扩增27个Y染色体快速突变STR基因座的19组引物对，27个基因座为DYF387S1a/b、DYF399S1a/b/c、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYF404S1a/b、DYS449、DYS508、DYS516、DYS518、DYS526a/b、DYS534、DYS547、DYS565、DYS570、DYS573、DYS576、DYS612、DYS626、DYS627和DYS640。

扩增27个快速突变STR基因座的19组引物对序列如下表1所示：

表1.RM Y27引物序列

DYF387S1a和DYF387S1b的扩增引物相同；DYF399S1a、DYF399S1b和DYF399S1c的扩增引物相同；DYF403S1a1、DYF403S1a2、DYF403S1a3和DYF403S1b的扩增引物相同；DYF404S1a和DYF404S1b的扩增引物相同；DYS526a和DYS526b的扩增引物相同。

进一步，每个基因座上游引物的5’端标记有荧光染料。

根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布及化学荧光染料标记方法，将27个基因座使用四种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料的不同分为四组，分组情况如下：第一组为DYS526a/b、DYS570、DYF387S1a/b、DYS516；第二组为DYS576、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYS640、DYS547；第三组为DYS508、DYS612、DYS573、DYF399S1a/b/c、DYS627、DYS518；第四组为DYS565、DYF404S1a/b、DYS626、DYS449、DYS534。所述四组引物分别标记有6-FAM、HEX、TAMRA、ROX于上游引物的5’端，每组之中的各基因座扩增产物根据长度差异区分，基因座不互相重叠。

优选的，所述试剂盒包括PCR缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、荧光分子量内标和等位基因分型标准物。所述荧光分子量内标由一组大小固定且不同的DNA片段组成，标记有SIZ荧光染料。将四组标记有不同荧光染料的引物混合进行复合扩增，根据产物峰高调整各基因座引物对的浓度，使各基因座峰值整体均衡性达到30％。上述引物混合物可用于27个基因座的复合扩增。

优选的，本发明所述复合扩增采用聚合酶链式反应，扩增程序为：95℃2分钟；94℃30秒、60℃45秒、72℃60秒，共10个循环；94℃30秒、59℃45秒、72℃60秒，共20个循环；72℃10分钟；4℃保温得到扩增产物，扩增产物采用毛细管电泳检测，通过片段分析软件GeneMapper分析获得结果。

优选的，所述样品DNA包括利用Chelex-100法、磁珠法、硅珠法或有机法任意一种方法提取的人基因组DNA；所述样品DNA还包括利用FTA卡、免提取滤纸、棉签或口腔拭子等中的任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。

本发明的有益效果是：

1.本试剂盒采用均为突变率高、多态性高的Y染色体STR基因座，男性个体识别能力高，在家系细分和案件排查中可作为常规Y染色体STR试剂盒的有效补充；

2.采用的不同基因座引物之间相互干扰较少，扩增特异性和扩增灵敏度高；

3.聚合酶链式反应在90分钟内完成，毛细管电泳检测过程不足1个小时，整个检测过程在3小时内完成，具有用时少，快速的优点；

4.利用FTA卡、免提取滤纸、棉签或口腔拭子中的任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞可以直接扩增，从而可以省去DNA抽提步骤，减少操作步骤，简化操作流程；

5.本发明所述试剂盒采用五色荧光系统，将27个Y染色体快速突变STR基因座排布成四色，大大提高了每一色排布的空间利用率，同时也尽可能降低了荧光染料的成本。

附图说明

图1是RM Y27基因座排布示意图；

图2是以2800M为模板的RM Y27分型图；

图3是家系样本1的RM Y27分型图；

图4是家系样本2的RM Y27分型图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1.Y染色体快速突变STR基因座的筛选

通过对Y染色体STR基因座多态性和突变率的研究，最后筛选出DYF387S1a/b、DYF399S1a/b/c、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYF404S1a/b、DYS449、DYS508、DYS516、DYS518、DYS526a/b、DYS534、DYS547、DYS565、DYS570、DYS573、DYS576、DYS612、DYS626、DYS627和DYS640，共27个Y染色体快速突变STR基因座。各基因座信息如下表所示：

表2.Y染色体快速突变STR基因座信息

实施例2.Y染色体快速突变STR基因座排布

根据以上27个基因座，设计了独特的基因座排布和化学荧光染料标记方法，将27个基因座使用四种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料的不同分为四组，分组情况如下：第一组为DYS526a/b、DYS570、DYF387S1a/b、DYS516，荧光染料为6-FAM；第二组为DYS576、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYS640、DYS547，荧光染料为HEX；第三组为DYS508、DYS612、DYS573、DYF399S1a/b/c、DYS627、DYS518，荧光染料为TAMRA；第四组为DYS565、DYF404S1a/b、DYS626、DYS449、DYS534，荧光染料为ROX。基因座排布图如图1所示。

实施例3.试剂盒组分及扩增体系组成

本发明所述试剂盒组分及扩增体系组成具体为如表3和表4所示：

表3.试剂盒的组分

表4.扩增体系的组成

实施例4.聚合酶链式反应程序

本发明所述PCR反应的扩增程序如下：

实施例5.遗传分析仪荧光电泳检测

12μL去离子甲酰胺与0.5μL分子量内标(Marker SIZ-500)混合。再加入1μL PCR反应产物或Allelic Ladder，涡旋混匀3500r/min离心2min，95℃变性3min，冰浴3min，用遗传分析仪ABI3130XL进行检测，用片段分析软件GeneMapper进行分析。以2800M为例，分型结果见图2。

实施例6.本发明所述试剂盒的实际应用

1.收集家系血液样本：样本由某检测中心提供。

2.样本DNA提取：采用Chelex-100法进行提取。

3.按照实施例3中的体系组分配置PCR反应体系。

4.按照实施例4中的扩增程序进行PCR反应。

5.按照实施例5中的电泳检测流程进行检测，获得分型图如图3和图4所示，分型结果比对见表5：

表5.RM Y-STR分型结果比对

对同一家系两个样本鉴定，常规Y-filer试剂盒检测获得的Y染色体STR基因座分型完全一致，因此选用突变率更高、多态性更好的Y染色体快速突变STR基因座的复合扩增体系进行扩增，可对两个样本进行区分。

以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东华美众源生物科技有限公司

广州市刑事科学技术研究所

<120> 一种检测人类Y染色体快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用

<130>

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

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Claims

1.一种检测人类Y染色体快速突变STR基因座的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述试剂盒含有用于特异性扩增27个Y染色体快速突变STR基因座的19组引物对，27个基因座为DYF387S1a/b、DYF399S1a/b/c、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYF404S1a/b、DYS449、DYS508、DYS516、DYS518、DYS526a/b、DYS534、DYS547、DYS565、DYS570、DYS573、DYS576、DYS612、DYS626、DYS627和DYS640。

2.根据权利要求1所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：扩增27个快速突变STR基因座的19组引物对的序列如下表1所示：

表1.RMY27引物序列

3.根据权利要求1所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：每个基因座上游引物的5’端标记有荧光染料。

4.根据权利要求3所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：将27个基因座使用四种不同的荧光染料标记，根据标记的荧光染料的不同分为四组，分组情况如下：

第一组：DYS526a/b、DYS570、DYF387S1a/b、DYS516；

第二组：DYS576、DYF403S1a1/a2/a3/b、DYS640、DYS547；

第三组：DYS508、DYS612、DYS573、DYF399S1a/b/c、DYS627、DYS518；

第四组：DYS565、DYF404S1a/b、DYS626、DYS449、DYS534。

5.根据权利要求4所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：第一组引物对标记的荧光染料为6-FAM；第二组引物对标记的荧光染料为HEX；第三组引物对标记的荧光染料为TAMRA；第四组引物对标记的荧光染料为ROX。

6.根据权利要求1所述的荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：包括PCR缓冲液、热启动Taq酶、超纯水、荧光分子量内标和等位基因分型标准物。

7.权利要求1～6中任意一项所述的荧光标记复合扩增试剂盒在法医鉴定、亲子鉴定或DNA家谱构建中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：将试剂盒内试剂与样品DNA加入到PCR扩展管中，置于热循环仪上，进行聚合酶链式反应，扩增程序为：95℃2分钟；94℃30秒、60℃45秒、72℃60秒，共10个循环；94℃30秒、59℃45秒、72℃60秒，共20个循环；72℃10分钟；4℃保温得到扩增产物，将扩增产物在遗传分析仪上进行荧光检测，再用片段分析软件GeneMapper分析遗传分析仪上检测到的数据。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品DNA包括利用Chelex-100法、磁珠法、硅珠法或有机法中的任意一种方法提取的人基因组DNA。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述样品DNA还包括利用FTA卡、免提取滤纸、棉签或口腔拭子中的任意一种载体收集的人类血液或口腔细胞。