CN106755418A - 一种外显子组装测序方法 - Google Patents

一种外显子组装测序方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106755418A
CN106755418A CN201611210750.7A CN201611210750A CN106755418A CN 106755418 A CN106755418 A CN 106755418A CN 201611210750 A CN201611210750 A CN 201611210750A CN 106755418 A CN106755418 A CN 106755418A
Authority
CN
China
Prior art keywords
extron
pcr
sequence
overlap
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611210750.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106755418B (zh
Inventor
张明航
吴婉婷
刘志海
陈文娟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Ige Biotechnology Ltd
Original Assignee
Guangzhou Ige Biotechnology Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Ige Biotechnology Ltd filed Critical Guangzhou Ige Biotechnology Ltd
Priority to CN201611210750.7A priority Critical patent/CN106755418B/zh
Publication of CN106755418A publication Critical patent/CN106755418A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106755418B publication Critical patent/CN106755418B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种外显子组装测序方法，它涉及外显子组技术领域；它的方法为：对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，在基因上临近外显子的区域设计多对引物把这些外显子序列通过PCR的方法扩增下来，同时通过多重PCR技术，设计引物时Tm值相似，使得这些引物能够放在同一反应体系中进行同时扩增；然后在多重PCR的基础上，在引物之间加上一段特异的序列‑overlap，使得几个外显子之间能够在扩增的同时通过overlap组装起来，成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，再对该大扩增子进行一次测序便能够得到多个外显子序列信息；本发明使得外显子测序工作能够以更有效的方式、更低的成本进行。

Description

一种外显子组装测序方法
技术领域
本发明涉及外显子组技术领域，具体涉及一种外显子组装测序方法。
背景技术
外显子组(exome)是一个物种基因组中全部外显子区域的总和，它是基因行使其功能最直接的体现。通过进行外显子组测序，能够直接发现与蛋白质功能变异相关的遗传突变。由于外显子仅占人类全基因序列的1％，而且是极其关键的1％，相比于全基因组重测序，外显子组测序更加经济、高效。目前，外显子组测序技术已经应用到寻找与各种复杂疾病相关的致病基因和易感基因的研究中。
虽然外显子测序技术目前是基因研究的一个重要手段之一，但是无论是传统的外显子单个捕获测序法，或者近年来兴起的高通量测序，在全外显子测通的成本上还是依然居高不下，使得外显子测序难以得到广泛的应用。
人类基因上外显子数量一般较多，而且大部分外显子的长度在100-300bp之前，如果对这些小的外显子单个捕获后测序不仅工作量大，成本也高。
现有的外显子除了传统的Sanger法还有近几年兴起的高通量测序。传统的Sanger测序主要是利用Uniplex PCR和Mutliplex PCR方法富集目标区域序列，然后再对单独捕获的外显子序列进行测序。而新一代测序技术则是把基因组DNA片段化，然后在其两侧连上接头，用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR单克隆阵列，所有单克隆同时独立地进行引物杂交和酶延伸反应，并对每个延伸所摄入的荧光标记信号进行拍摄从而得到测序数据，但得到的数据量却是十分庞大的，要在如此庞大的数据中分析出有意义的内容也是一个大的挑战。
现有的基因外显子测序方法基本上都是设计多对引物分别扩增出每个外显子再进行测序，但是人类基因上的外显子数量较多，一般多达20-30个，这样对每一个外显子都进行单独扩增测序不仅步骤繁琐、工作量大，而且测序数量大，成本昂贵。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷和不足，提供一种外显子组装测序方法。
为了解决背景技术所存在的问题，本发明的一种外显子组装测序方法，它的方法为：对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，在基因上临近外显子的区域设计多对引物把这些外显子序列通过PCR的方法扩增下来，同时通过多重PCR技术，设计引物时Tm值相似而且尽量避免引物之间错配，使得这些引物能够放在同一反应体系中进行同时扩增；然后在多重PCR的基础上，在引物之间加上一段特异的序列-overlap，使得几个外显子之间能够在扩增的同时通过overlap组装起来，成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，再对该大扩增子进行一次测序便能够得到多个外显子序列信息。
本发明有益效果为：使得外显子测序工作能够以更有效的方式、更低的成本进行；大大减少了测序的反应数从而降低实验成本。
附图说明
图1为本发明的组装图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明作进一步的说明。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1所示，本具体实施方式采用如下技术方案：它的方法为：对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，在基因上临近外显子的区域设计多对引物把这些外显子序列通过PCR的方法扩增下来，同时通过多重PCR技术，设计引物时Tm值相似，使得这些引物能够放在同一反应体系中进行同时扩增；然后在多重PCR的基础上，在引物之间加上一段特异的序列(overlap)，使得几个外显子之间能够在扩增的同时通过overlap组装起来，成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，再对该大扩增子进行一次测序便能够得到多个外显子序列信息。
本具体实施方式的工作原理为：在使用多重PCR技术扩增多个外显子片段的同时，利用基因合成的原理把4-6个小的外显子片段搭建起来，组成一个大的完整的扩增子，这样可以通过一个测序反应便能得到4-6个外显子的序列信息，大大减少了测序的反应数从而降低实验成本。这种外显子组装测序技术可以应用到许多基因的外显子测序工作中，使得外显子测序工作能够以更有效的方式、更低的成本进行。
以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
实施例1：TP53基因的外显子组装测序
1.从人的外周血中提取基因组
利用DNA提取试剂盒(Qiagen)提取人外周血单个核细胞基因组DNA，具体地，包括：
1)将20μl QIAGEN蛋白酶加入200μl血细胞样品中，混匀。
2)将200μl缓冲液AL加入样品中，充分混匀，56℃孵育10分钟。
3)加入200μl无水乙醇，充分混匀，将混合物转移到吸附柱上，8000r/m离心1分钟，弃废液。
4)然后加入500μl缓冲液AW1，8000r/m离心1分钟，弃废液。
5)再加入500μl缓冲液AW2，8000r/m离心1分钟，弃废液。
6)然后全速(14000r/m)空甩1分钟。
7)再加入200μl缓冲液AE，室温静置1分钟，8000r/m离心1分钟，以便提取获得DNA，保存于-20℃，备用。
2.多重PCR扩增
以上一步得到的DNA作为模板，采用基因TP53的外显子引物组进行多重PCR扩增。引物信息如下表：
引物名称 序列
TP53-exon1F ATGTTAGTATCTACGGCACCAGGTCGGCGAGAATCC
TP53-exon1R AAATACACGGAGCCGAGAGCCCGTGACTCAGA
TP53-exon89F GCTCTCGGCTCCGTGTATTTTGGGAGTAGATGGAGCCTGGT
TP53-exon89R AAACGGCATTTTGAGTGTTAGACTGGAAACTTTCCACTTG
TP53-exon10F GTCTAACACTCAAAATGCCGTTTGTACCGTCATAAAGTCAAACAAT
TP53-exon10R AAGGCAGGATGAGAATGGAATCCTATGGCTTTCCAACCTA
TP53-exon234F TCTCAGACACTGGCATGGTGTTGGGGGAGGGGGTTC
TP53-exon234R GGGATACGGCCAGGCATTGAAGTCTCATGGAAGC
TP53-exon56F GGAGGTGCTTACGCATGTTTGTTTCTTTGCTGCCG
TP53-exon56R CCAGTGCGCCTTGAACCACCCTTAACCCCTCCTCC
TP53-exon7F AGGGGTTAAGGGTGGTTCAAGGCGCACTGGCCTCATC
TP53-exon7R GTGGATGGGTAGTAGTATGGAAGAAATCGGTAAGAGGTGGGC
TP53-exon11F1 CCAGCCTTAGGCCCTTCAAAGCATTGGTCAG
TP53-exon11R1 GTCAGACAGGGTTTGGCTGGGCCAGCAGAGAC
TP53-exon11F2 CCCTTGAGGGTGCTTGTTCCCTCTCCCTGT
TP53-exon11R2 CCCCAGCCCACACTCATTGCAGACTCAGGT
具体地，首先，将浓度均为100μM的引物稀释成10μM，并按照将各引物按F、R等浓度混合获得引物组。然后，按下表的配比，配制多重PCR扩增的反应体系：
组分 体积(μl)
基因组模板 10-50ng
引物组1(exon1) 1.5
引物组2(exon89) 1.5
…(exon10) 1.5
10x Multiplex PCR buffer 3.2
dNTPs(2mM) 2
Taq DNA polymerase 1
总体积 20
然后，将配制好的反应体系按一下反应条件进行PCR扩增：
一轮扩增结束后，取一轮产物为模板，按下表的配比，配制第二轮PCR扩增的反应体系：
组分 体积(μl)
一轮产物 1
exon1-F(10p) 1
exon10-R(10p) 1
10x Multiplex PCR buffer 2
dNTPs(2mM) 2
Taq DNA polymerase 0.5
总体积 20
然后，将配制好的反应体系按一下反应条件进行PCR扩增：
3.琼脂糖凝胶电泳纯化回收
扩增完成后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳进行分离，获得目的条带后切胶回收，利用PCR纯化试剂盒纯化回收目的片段，该片段即可用于测序。
4.测序与数据分析
对纯化回收得到的含多个外显子的片段测定浓度后，进行Sanger测序。根据得到的测序结果，与参考序列进行比对，确认外显子是否有缺失、突变等。

Claims (10)

1.一种外显子组装测序方法，其特征在于：结合多重PCR及序列之间的重叠延伸原理，设计引物组合物同时扩增多个外显子并将其组装在一起进行测序。
2.一种外显子组装测序方法，其特征在于，包括以下步骤：
提供核酸样本，所述核酸样本中包含待测基因；以及
利用权利要求1所述的引物组合物，使用多重PCR方法对分散在基因各处的外显子序列进行捕获，并将其通过overlap组装成为一个含有多个外显子片段的大扩增子，即扩增产物。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于，进一步包括：
Overlap组装过程可以在第一步多重PCR扩增时完成，亦可对其进行二次PCR扩增，将多个外显子序列通过PCR的方法组装起来。
4.根据权利要求2所述的方法,其特征在于：所述基因包含但不限于BRCA1、BRCA2、TP53、EGFR等。
5.根据权利要求2所述的方法,其特征在于：所述引物组合物由根据各基因外显子序列设计的特异性的上/下游引物、重叠延伸的overlap序列以串联的方式组成。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于：引物组合物设计时Tm值相似。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于：所述重叠延伸的overlap序列是随机的，以及，同一个反应体系中的任意两个外显子之间的序列是特异的。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于：测序方法包括但不限于Sanger测序法、高通量测序法等。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中设置有权利要求1中所述的引物组合物。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所发明的试剂盒用于检测基因的外显子的序列情况，包括但不限于缺失、突变、重组等。
CN201611210750.7A 2016-12-24 2016-12-24 一种外显子组装测序方法 Active CN106755418B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611210750.7A CN106755418B (zh) 2016-12-24 2016-12-24 一种外显子组装测序方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611210750.7A CN106755418B (zh) 2016-12-24 2016-12-24 一种外显子组装测序方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106755418A true CN106755418A (zh) 2017-05-31
CN106755418B CN106755418B (zh) 2020-08-21

Family

ID=58919350

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611210750.7A Active CN106755418B (zh) 2016-12-24 2016-12-24 一种外显子组装测序方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106755418B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108179189A (zh) * 2018-01-23 2018-06-19 北京旌准医疗科技有限公司 一种检测tp53基因突变的多重pcr特异性引物和方法
CN110117669A (zh) * 2019-06-04 2019-08-13 重庆市公共卫生医疗救治中心 基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法
CN110157781A (zh) * 2018-12-29 2019-08-23 广州凯普医药科技有限公司 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824412A (zh) * 2007-04-29 2010-09-08 北京华大基因研究中心 一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法
CN101899434A (zh) * 2010-06-18 2010-12-01 南方医科大学 一种可连接多片段的重叠延伸pcr方法
WO2013093530A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-27 Kps Orvosi Biotechnológiai És Egészségügyi Szolgáltató Kft. Method for determining the sequence of fragmented nucleic acids

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101824412A (zh) * 2007-04-29 2010-09-08 北京华大基因研究中心 一种针对一个或多个目标基因组区域进行边扩增边连接的方法
CN101899434A (zh) * 2010-06-18 2010-12-01 南方医科大学 一种可连接多片段的重叠延伸pcr方法
WO2013093530A1 (en) * 2011-12-20 2013-06-27 Kps Orvosi Biotechnológiai És Egészségügyi Szolgáltató Kft. Method for determining the sequence of fragmented nucleic acids

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108179189A (zh) * 2018-01-23 2018-06-19 北京旌准医疗科技有限公司 一种检测tp53基因突变的多重pcr特异性引物和方法
CN110157781A (zh) * 2018-12-29 2019-08-23 广州凯普医药科技有限公司 一种重叠延伸PCR结合Sanger测序检测不连续多DNA位点的方法
CN110117669A (zh) * 2019-06-04 2019-08-13 重庆市公共卫生医疗救治中心 基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法
CN110117669B (zh) * 2019-06-04 2023-03-28 重庆市公共卫生医疗救治中心 基于重叠延伸pcr的抗结核药物耐药性检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106755418B (zh) 2020-08-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104131072B (zh) 一种对未知检材进行个体识别和亲权鉴定的方法和系统
CN105002569A (zh) 转录组文库及其构建方法
CN105463116B (zh) 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法
WO2016049878A1 (zh) 一种基于snp分型的亲子鉴定方法及应用
CN106755496A (zh) 基于高通量测序技术检测遗传性耳聋基因的多重pcr特异性引物、试剂盒及方法
CN106755418A (zh) 一种外显子组装测序方法
CN110343754A (zh) 一种用于造血干细胞移植供体病原微生物快速检测的方法
CN110863056A (zh) 一种人类dna精准分型的方法、试剂和应用
CN108060237B (zh) 基于55个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN107841566A (zh) 快速突变y染色体短串联重复序列的复合扩增体系、试剂盒及应用
CN107557481A (zh) 检测痕量混合人源dna样本13个codis str基因座的试剂、试剂盒与其应用
CN109280696B (zh) Snp检测技术拆分混合样本的方法
CN106086223B (zh) 一种基于zna引物的str分型试剂盒
CN108546762A (zh) 一种用于法医学个体识别的35个插入/缺失位点的试剂盒
CN104031989A (zh) 一种人基因组dna26个基因座的复合扩增的试剂盒
CN108060228A (zh) 一种检测brca1和brca2基因变异的检测引物、试剂盒及方法
CN108517364B (zh) 基于56个y染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN109929936A (zh) 一种检测人类y染色体快速突变str基因座的荧光标记复合扩增试剂盒及应用
CN108642190B (zh) 基于14个常染色体snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒
CN107267600A (zh) 一种富集brca1和brca2基因目标区域的引物、方法、试剂盒及其应用
CN107236808B (zh) 检测dna甲基化鉴别同卵双生子的试剂盒及方法
CN105925693A (zh) 基因身份证及其制备方法
CN202671540U (zh) 鸡产蛋性状相关基因—bmp15基因snp分型试剂盒
CN106319091A (zh) 一种快速区分犬瘟病毒、犬细小病毒和狂犬病毒的多重荧光免疫分析方法及试剂盒
CN108060233B (zh) 30个y染色体str基因座的荧光复合扩增体系、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right

Denomination of invention: An exon assembly sequencing method

Effective date of registration: 20220712

Granted publication date: 20200821

Pledgee: Industrial and Commercial Bank of China Limited Guangzhou Avenue sub branch

Pledgor: GUANGZHOU IGE BIOTECHNOLOGY LTD.

Registration number: Y2022980010303

PE01 Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right