CN107099596A - 人类y‑str29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒 - Google Patents

人类y‑str29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了人类Y‑STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，包含29对STR基因座的特异性扩增引物，将29对STR基因座的特异性扩増引物分为五组，分别采用不同的荧光色标记，即五组引物依次用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端，扩增上述基因座的引物，本发明通过上述基因座的特异性引物的设计以及独特的基因座组合荧光标记方式，使得本发明复合扩增体系中，仅采用五种标记就可以在同一个复合扩增体系中同时扩增本发明的29个基因座，灵敏度非常高。与现有技术相比，本发明的荧光标记复合扩增试剂盒更针对中国人群，多态性高、性能稳定、操作简单，具有较好的温度耐受性，能同时检测更多基因座的检测体系。

Description

人类Y-STR29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒
技术领域
本发明涉及检测人体基因组中具有多态性的遗传标记，尤其涉及的是人类 Y-STR29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒。
背景技术
人类DNA短串重复序列(short tandem repeat，STR)基因座是一类由2-6个核苷酸为重复单元组成的几十至一百多个的核苷酸重复序列，在人类基因组中分布广泛，多态性好，采用聚合酶链式反应(poly merasechain reaction，PCR)扩增，电泳分型，适合于各种样品检测，因此被广泛地应用于遗传学、I临床医学、生物学以及法科学等领域中，被誉为新一代最重要的DNA指纹。同一STR基因座的基因型分布有群体差异，STR基因座的等位基因片段大小差异小，扩增条件相似，可同时进行多个基因座的同步扩增，既可节约时间、试剂和检材，又可提高工作效率和个人识别机率。
目前市场上主流的商品化试剂盒通常采用的是五色荧光检测技术,有 Yfiler、Yfiler Plus、PowerPlexY23、Goldeneye Y26、STRtyper27Y、AGCU Database Y24等荧光检测试剂盒，基因座数量分别为17个、27个、23个、26个、27个、 24个，会存在包含的基因座少，识别率低，不适合也不能满足科研和办案实际的需要的问题；此外，由于地域、种族、民族之间遗传学特点不同，采用有些 Y-STR商业化试剂盒对中国群体进行分型检验的个体识别率较低。因此，需要开发出更适用于我国群体特征的稳定性好、个体别率更高、检测基因座数更多的Y-STR试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的遗传学特点不同、个体识别率较低、具有等位基因越界的风险的缺陷，提供一种针对中国人群的多态性高、性能稳定、操作简单和能同时检测更多基因座的检测体系：人类29个Y-STR基因座的荧光复合扩增试剂盒来解决上述问题。
本发明是通过以下技术方案实现的：人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为:DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a/b、 DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570、DYS390、DYS437、 DYS460、DYS533、DYS481、DYS576、DYS549、DYS518、DYF387S1a/b、 DYS557、DYS393、GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635，针对上述29个Y-STR基因座，在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。
优选地，复合扩增体系个基因座引物序列如下表：
优选地，所述的29对STR基因座的特异性扩増引物分为五组:
第一组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；
第二组，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570；
第三组，DYS390、DYS437、DYS460、DYS533、DYS481、DYS576；
第四组，DYS549、DYS518、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS557；
第五组，DYS393、GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635。
作为优选，将所述的五组引物依次分别用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端。
优选地，所述的试剂盒内设有内标，内标由一组大小固定且不同的DNA片段组成，内标用SIZ橙色荧光标记物。
优选地，所述的试剂盒包括反应混合液、29对STR基因座的特异性扩増引物、29个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH20和荧光分子量内标。
作为优选，所述的复合扩增试剂盒具体成分为：
优选地，所述扩增反应体系具体成分为：
组分 反应体积
反应混合液 10ul
Y29荧光引物 6ul
热启动Taq酶 1ul
人类DNA样本 0.2-0.3ng
sdH2O 补足至25.0ul
作为优选，所述的扩增反应的条件如下：反应扩增程序为：94℃2min；94℃ 1min，62℃1min，72℃1min，共29个循环；72℃10min。
本发明提供的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，所述的29对STR基因座的特异性扩増引物分为五组，分别采用不同的荧光色标记，即五组引物依次分别用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端，扩增上述基因座的引物，本发明通过上述基因座的特异性引物的设计以及独特的基因座组合荧光标记方式，使得本发明复合扩增体系中，仅采用五种标记就可以在同一个复合扩增体系中同时扩增本发明的29个基因座，灵敏度非常高。与现有技术相比，本发明的荧光标记复合扩增试剂盒更针对中国人群，多态性高、性能稳定、操作简单和能同时检测更多基因座的检测体系。此外，本试剂盒具有较好的温度耐受性，使用不同质量的PCR仪均可获得较好的扩增结果。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1本试剂盒包括：反应混合液、29对STR基因座的特异性扩増引物、 29个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH20和荧光分子量内标。
1、Y-STR 29个基因座的筛选
通过对DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a/b、DYS392、DYS389I、 DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570、DYS390、DYS437、DYS460、DYS533、 DYS481、DYS576、DYS549、DYS518、DYF387S1a/b、DYS557、DYS393、 GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635共29个Y染色体STR基因座的基因多态性和突变率的研究，最后筛选出，共29个Y-STR基因座。每个基因座相应信息表如下：
2、五色荧光系统的建立
法医实验室采用荧光检测技术的具体过程为：激光轰击连接在DNA末端的荧光集团(染料)，荧光集团吸收能力后发出较低能量的光，用滤光片收集特定波长范围的发射光，用光电倍增管或电耦合装置用以收集和放大来自荧光集团的信号，并将其转化为电信号，最终生成毛细管电泳的峰图。
3、29Y-STR个基因座排布
第一组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；
第二组，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570；
第三组,DYS390、DYS437、DYS460、DYS533、DYS481、DYS576；
第四组,DYS549、DYS518、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS557；
第五组,DYS393、GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635。
将五组引物分别用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端。
4、调整PCR反应混合液
在PCR扩增体系中，对Mg2+浓度、dNTPs浓度两个因素设计正交试验进行优化，最终将，Mg2+浓度定位2.5mM，dNTPs浓度为0.25mM，Tris-HCl浓度为 100mM，KCl浓度为100mM，并且利用上述材料制备成PCR反应混合液。最终 PCR体系组成见下表：
5、调整PCR反应程序及PCR扩增
本发明为包装不同检材的适应性及不同退火温度的耐受性，分别对循环数和退火温度进行测试。其中，循环数测试了27、28、29、30、31、32个循环，最佳为29和循环；分别测试了58℃、59℃、60℃、61℃、62℃，最佳温度为 62℃。
最终反应扩增程序为：94℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共 29个循环；72℃10min；4℃forever。
6、PCR扩增反应
取反应混合液、引物混合液按照下表配成混合液，震荡混匀后分装至PCR 反应管中，每管25ul。
综上所述，本发明提供的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，所述的29对STR基因座的特异性扩増引物分为五组，分别采用不同的荧光色标记，即五组引物依次分别用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端，扩增上述基因座的引物，本发明通过上述基因座的特异性引物的设计以及独特的基因座组合荧光标记方式，使得本发明复合扩增体系中，仅采用五种标记就可以在同一个复合扩增体系中同时扩增本发明的29个基因座，灵敏度非常高。与现有技术相比，本发明的荧光标记复合扩增试剂盒更针对中国人群，多态性高、性能稳定、操作简单和能同时检测更多基因座的检测体系。此外，本试剂盒具有较好的温度耐受性，使用不同质量的PCR仪均可获得较好的扩增结果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包含29对STR基因座的特异性扩增引物，其中STR基因座为:DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a/b、DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570、DYS390、DYS437、DYS460、DYS533、DYS481、DYS576、DYS549、DYS518、DYF387S1a/b、DYS557、DYS393、GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635，针对上述29个Y-STR基因座，在其重复序列的侧翼分别设计特异性荧光标记引物。
2.根据权利要求1所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：复合扩增体系个基因座引物序列如下表：
3.根据权利要求1所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的29对STR基因座的特异性扩増引物分为五组:
第一组，DYS391、DYS456、DYS19、DYS448、DYS385a、DYS385b；
第二组，DYS392、DYS389I、DYS449、DYS389II、DYS438、DYS570；
第三组，DYS390、DYS437、DYS460、DYS533、DYS481、DYS576；
第四组，DYS549、DYS518、DYF387S1a、DYF387S1b、DYS557；
第五组，DYS393、GATAH4、DYS439、DYS447、DYS458、DYS635。
4.根据权利要求3所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：将所述的五组引物依次分别用红色PET、黄色NED、蓝色FAM、绿色VIC、和紫色荧光素VIG标记其5'端。
5.根据权利要求1所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒内设有内标，内标由一组大小固定且不同的DNA片段组成，内标用SIZ橙色荧光标记物。
6.根据权利要求1所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括反应混合液、29对STR基因座的特异性扩増引物、29个基因座的等位基因、热启动Taq酶、DNA标准品、sdH2O和荧光分子量内标。
7.根据权利要求6所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的复合扩增试剂盒具体成分为
8.根据权利要求6所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述扩增反应体系具体成分为：
组分 反应体积 反应混合液 10ul Y29荧光引物 6ul 热启动Taq酶 1ul 人类DNA样本 0.2-0.3ng sdH2O 补足至25.0ul
9.根据权利要求8所述的人类Y-STR 29个基因座荧光标记复合扩增试剂盒，其特征在于：所述的扩增反应的条件如下：反应扩增程序为：94℃2min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，共29个循环；72℃10min。
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