CN104755632A - 多重y-str分析 - Google Patents

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Abstract

公开了新颖的Y-STR多重分析设计、引物设计、等位基因分型标准物、使用方法以及试剂盒，包括被设计成用于提供至少11个Y-STR基因座的具有小于约220bp的碱基对大小的扩增子的引物集的用途，以及被设计成用于提供至少22个Y-STR基因座、包括至少5个快速突变基因座的扩增子的引物集的用途。

Description

多重Y-STR分析
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求以下申请的优先权：2012年9月6日提交的名称为“多重Y-STR分析(Multiplex Y-STR Analysis)”的美国临时申请第61/697,742号、2012年10月31日提交的名称为“多重Y-STR分析”的美国临时申请第61/720,949号、2013年2月5日提交的名称为“多重Y-STR分析”的美国临时申请第61/761,152号、以及2013年2月15日提交的名称为“多重Y-STR分析”的美国临时申请第61/765,323号，所述公开内容中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应理解为以任何方式限制本文中所述的主题。
技术领域
一般来说，本发明涉及使用多重分析方法测定人类Y染色体上的短串联重复序列(STR)等位基因的身份。包括数量增加的可以提供增加的辨别和灵敏度的基因座的多重分析可以对更宽范围的个体准确地进行基因分型。
背景技术
法医学、亲子鉴定、细胞系ID以及个体化用药领域常规地使用基于DNA的技术进行身份测定、基因分型、表现型预测以及预测和/或预防疾病。DNA分型涉及分析基因组DNA的选择区域，通常被称为“标志物”。现今所使用的大多数分型方法专门被设计成用于检测并分析已知在人群中以至少两种不同形式出现的DNA标志物的一或多个区域的长度和/或序列方面的差异。所述长度和/或序列变异被称为“多态性”。DNA中存在这种变异的任何区域(即，“基因座”)都被称作“多态基因座”。
近年来，多态短串联重复序列(STR)作为遗传标志物的发现和发展在DNA分型中起到了重要作用。STR已经变成了人类身份和法医DNA测试的主要手段。
具体来说，Y-STR分析在许多应用中是一种有价值的工具。法医学应用包括在性侵案的调查中的用途，其中男性DNA可以存在于还含有过量女性DNA的样品中。Y-STR分析在把个体排除在进一步调查之外的过程中可能是至关重要的。在另一种法医学应用中，样品可以包括来自多个男性贡献者的DNA。Y-STR分析可以用于在法医学分析或其它遗传分析中跟踪男性之间的家庭关系，并且可以用于失踪人员调查中。另外，Y-STR分析可以用于亲子鉴定中，包括假设父亲不可用于直接比较的情况。
用于帮助研究者的一个数据库是美国Y-STR数据库，这是11到23个基因座Y-STR单体型的可搜索清单，并且可见于：(http://www.usystrdatabase.org/newdefault.aspx)。所述数据库由国家司法研究所(National Institute of Justice)资助并且由国家法医科学中心(National Center for Forensic Science；NCFS)以及中佛罗里达大学(University of CentralFlorida)管理。美国Y-STR数据库只是人口数据库并且出于法医案件工作的目的，打算用于评估Y-STR单体型人口频率。
当前可获得的Y-STR分析试剂盒存在若干局限性。虽然使用单体型数据库来确定特定群体中的单体型频率，但是试剂盒的单体型分辨率(HR)可以在群体中变化(韦尔默朗(Vermeulen)等人,(2009)FSIG 3:205-213)。其次，使用当前试剂盒，不可以排除怀疑个体的男性亲属。根据当前分析，相隔多达20代的亲属的Y-STR概况可能彼此不可区别(巴兰坦(Ballantyne)等人(2010):美国人类遗传学杂志(Am J Hum Genet)87:341-353)。第三，随着更多男性概况添加到Y-STR频率数据库，偶然匹配增加。因此，在本领域中存在改善Y-STR多重分析系统、分析、试剂盒以及方法的需要。
发明内容
一方面，本发明提供一种扩增引物集，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过荧光检测技术执行。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过依赖于迁移率的分析技术执行。依赖于迁移率的分析技术可以是毛细管电泳。在一些其它实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过测序技术执行，不使用荧光染料标记。在一些实施例中，扩增引物集可以进一步包括用于扩增至少5个附加Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少5个附加Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以包括25个Y-STR标志物的引物。在一些实施例中，当扩增引物集包括25个Y-STR标志物的引物时，扩增引物集可以包括至少两个双重拷贝标志物的引物。在一些实施例中，扩增引物集可以用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些实施例中，扩增引物集可以被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的用至少5种荧光染料中的一种标记的每个扩增子集。用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。用于扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少一个包括迁移率调节剂的Y-STR标志物的扩增子集。在一些实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集的扩增引物集可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。
在本发明的另一个方面，提供一种用于共扩增至少一个DNA样品的基因座集的试剂盒，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集；以及任选地，大小标准。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于扩增至少5个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少5个Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。所述试剂盒可以包括25个Y-STR标志物的扩增引物集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括用至少5种荧光染料中的一种标记的扩增引物集。用于标记所述试剂盒的引物的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。所述试剂盒可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。在一些实施例中，包括扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集的试剂盒可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，包括扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集的试剂盒可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在一些实施例中，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集的试剂盒可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集的试剂盒可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，当所述试剂盒包括大小标准时，所述试剂盒进一步包括等位基因分型标准物。
在本发明的另一个方面，提供一种用于扩增人类男性的Y-STR标志物的等位基因的方法，包括以下步骤：使疑似含有人类男性的DNA样品的样品与包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触；并且扩增所述样品，由此形成至少11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。所述方法可以进一步包括以下步骤：检测每个扩增子集，借此鉴别至少11个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，检测步骤通过使用依赖于迁移率的分析分离多个扩增子集来执行，其中多个扩增子集经荧光标记。在其它实施例中，检测步骤不检测荧光。在实施例中，当检测步骤不检测荧光时，检测步骤可以包括离子半导体检测、焦磷酸盐释放检测或质谱检测。在所述方法的各种实施例中，扩增引物集可以进一步包括用于扩增至少5个附加Y-STR标志物的引物，其中所述引物可以被配置成用于提供至少5个附加Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在所述方法的各种实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在所述方法的各种实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在所述方法的一些实施例中，扩增引物集可以包括25个Y-STR标志物。在一些实施例中，扩增引物集可以用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些其它实施例中，至少11个Y-STR标志物的每个扩增子集可以用至少5种荧光染料中的一种标记。在所述方法的各种实施例中，用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。用于所述方法中的扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。在所述方法的一些实施例中，至少一个扩增子集可以包括迁移率调节剂。在所述方法的各种实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在所述方法的一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，所述方法包括用于扩增27个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集。
在又另一个方面，本发明提供一种扩增引物集，包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的引物，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在一些实施例中，所述至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在一些实施例中，所述至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYS518。在不同实施例中，被配置成用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以进一步被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在其它实施例中，用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少22个Y-STR标志物的各自具有小于约410个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在其它实施例中，用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少22个Y-STR标志物的各自具有小于约420个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过荧光检测来执行。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过依赖于迁移率的分析技术执行。依赖于迁移率的分析技术可以是毛细管电泳。在一些其它实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过测序技术执行，不使用荧光染料标记的检测。扩增引物集可以包括25个Y-STR标志物。在一些实施例中，扩增引物集用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物的每个扩增子集用至少5种荧光染料中的一种标记。用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供Y-STR标志物的至少一个扩增子集，其中所述至少一个扩增子集包括迁移率调节剂。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS518、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。可以提供一种用于共扩增至少一个DNA样品的基因座集的试剂盒，包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座；以及任选地，大小标准。在一些实施例中，所述大小标准是等位基因分型标准物。
在又另一个方面，提供一种用于扩增人类男性的Y-STR标志物的等位基因的方法，包括以下步骤：使可以含有人类男性的DNA样品的样品与包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座；并且扩增所述样品，由此形成至少22个Y-STR标志物的多个扩增子集。在所述方法的一些实施例中，提供至少23个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在又其它实施例中，提供27个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在一些实施例中，所述27个Y-STR标志物包括2个具有有助于Y-STR标志物的总数的双重拷贝标志物的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在其它实施例中，至少23个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在又其它实施例中，27个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在所述方法的各种实施例中，提供包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少6个是快速突变基因座。在所述方法的各种实施例中，提供包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少7个是快速突变基因座。所述方法可以进一步包括以下步骤：检测每个扩增子集，借此鉴别至少22个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，鉴别至少23个Y-STR标志物的等位基因。在又其它实施例中，鉴别27个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，检测步骤是荧光检测步骤。在一些实施例中，检测步骤通过使用依赖于迁移率的分析分离多个扩增子集来执行，其中多个扩增子集经荧光标记。在其它实施例中，检测步骤不检测荧光。在实施例中，当检测步骤不检测荧光时，检测步骤可以包括离子半导体检测、焦磷酸盐释放检测或质谱检测。在一些实施例中，含有具有小于约220个碱基对的碱基对大小的扩增子的至少11个Y-STR标志物是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物选自由以下组成的群组：DYF387S1ab、DYS449、DYS518、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物是6个快速突变Y-STR标志物。
另一方面，提供一种男性个体鉴别的方法，包括以下步骤：使含有人类男性核酸的样品与包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触；并且扩增所述样品，由此形成至少11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小；并且检测每个扩增子集，借此鉴别男性个体的等位基因。在所述方法的各种实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的步骤可以包括扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在所述方法的一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，所述方法包括用于扩增超过11个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集。在其它实施例中，超过11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中所述多个扩增子集具有小于约410个碱基对的碱基对大小。在一些实施例中，检测步骤是荧光检测步骤。在一些实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：比较针对第一男性个体所鉴别的等位基因与针对第二男性个体所鉴别的等位基因，借此使第一男性个体与第二男性个体可区分。在一些实施例中，第一男性个体具有与第二男性个体类似的父系遗传谱系。
本传授内容的这些实施例和其它特征将从本文中的描述变得更清楚。
附图说明
图1是所选择的Y-STR标志物的图形表示，其中基因多样性值图示在x轴上并且突变率沿着y轴映射。
图2是Y-STR多重分析组的一个实施例第1组的示意性图示。
图3是Y-STR多重分析组的一个实施例第2组的示意性图示。
图4是Y-STR多重分析组的另一个实施例第3组的示意性图示。
图5是Y-STR多重分析组的再一个实施例第4组的示意性图示。
图6是Y-STR多重分析组的又另一个实施例第5组的示意性图示。
图7是Y-STR多重分析组的又另一个实施例第6组的示意性图示。
图8是关于图7的Y-STR组(第6组)运行的电泳的图形表示，颜色分离。第6个染料标准泳道图中未示。
图9是一张表，比较了来自各种来源的所选择的Y-STR标志物组与第6组并且包括每个组的等位基因的编号。
图10是Y-STR多重分析组的另一个实施例第7组的示意性图示。
图11是关于图10的Y-STR组(第7组)运行的电泳的图形表示，颜色分离。第6个染料标准泳道图中未示。
图12是一张表，比较了来自各种来源的所选择的Y-STR标志物组与第7组并且包括每个组的等位基因的编号。
图13是图形表示，针对DYS438标志物，比较了多重分析的等位基因与第1组到第7组的扩展等位基因。
图14是当扩增所选择的男性/女性DNA混合物时DYS456标志物的引物长度影响的图形表示。
图15A是图10的多重组(第7组)的等位基因分型标准物的一个实施例的图形表示。
图15B是图10的多重组(第7组)的等位基因分型标准物的另一个实施例的图形表示。
图16是图形表示，使用Y-STR第6组和比较当使用递减量的目标DNA时从PCR扩增回收的等位基因的数量。
图17是图形表示，使用Y-STR第7组和比较当使用递减量的目标DNA时从PCR扩增回收的等位基因的数量。
图18是图形表示，比较使用恒定浓度的女性DNA，当男性DNA与女性DNA的比率减小时，使用Y-STR第6组和多重分析鉴别的等位基因的百分比。
图19是图形表示，比较使用恒定浓度的女性DNA，当男性DNA与女性DNA的比率减小时，使用Y-STR第7组和多重分析鉴别的等位基因的百分比。
图20是图形表示，比较使用递增浓度的女性DNA，当男性DNA与女性DNA的比率减小时，使用Y-STR第6组和多重分析鉴别的等位基因的百分比。
图21是图形表示，比较当使用第6组多重分析或多重分析时的颜色内平衡。
图22是图形表示，比较当使用第7组多重分析或多重分析时，在两种不同的男性DNA:女性DNA的比率下的颜色内平衡。
图23是图形表示，比较当在存在递增量的腐殖酸的情况下扩增目标DNA时，使用Y-STR第6组或多重分析鉴别的等位基因的平均百分比。
图24是图形表示，比较当在存在递增量血色素的情况下扩增目标DNA时，使用Y-STR第6组或多重分析鉴别的等位基因的平均百分比。
图25是图形表示，比较当在存在递增量的血色素或腐殖酸的情况下扩增目标DNA时，使用Y-STR第7组或多重分析鉴别的等位基因的平均百分比。
图26是图形表示，比较当在存在两种不同浓度的血色素或腐殖酸的情况下执行分析时第7组或多重分析的颜色内平衡。
图27是电泳图的图形表示，示出了使用Y-STR第6组多重分析得到的男性/男性混合物的分辨率。
图28是使用第7组多重分析，通过生物样品在所选择的底物上直接扩增提供的电泳信号的颜色内平衡的图形表示。
图29是图28的直接扩增样品中的一个的扩增结果的电泳图的图形表示。
具体实施方式
为了解释本说明书，将应用以下定义并且只要合适，以单数形式使用的术语也将包括复数并且反之亦然。除非明确想要相反含义(例如在最初使用所述术语的文档中)，否则为了解释本说明书和其关联的权利要求书，在下文阐述的任何定义与所述词语在任何其它文档、包括以引用的方式并入本文中的任何文档中的用法冲突的情况下，应该总是以下文阐述的定义为准。应注意，除非明确地并且好不含糊地限于一个指示物，否则如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数个指示物。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。为了说明，但不是作为限制，“X和/或Y”可以意指“X”或“Y”或“X和Y”。“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用是可互换的并且并不打算是限制性的。此外，当一或多个实施例的描述使用术语“包含”时，本领域的技术人员应了解，在一些特定情况下，所述实施例可以使用语言“基本上由……组成”和/或“由……组成”可替代地描述。术语“和/或”意指所列要素中的一个或所有或所列元素中的任何两个或两个以上的组合。
本文中所用的章节标题仅用于组织目的并且不应理解为以任何方式限制所述主题。本说明书中引用的所有文献，包括(但不限于)专利、专利申请、文章、书籍以及论文，全都出于任何目的以其全文引用的方式明确地并入本文中。在所并入的文献中的任一个与本文中所定义的任一术语矛盾的情况下，以本说明书为准。虽然结合各个实施例来描述本传授内容，但是并不打算将本传授内容限制为所述实施例。相反地，如本领域的技术人员应了解，本传授内容涵盖各种替代方案、修改和等效物。
据称以引用的方式并入本文中但与本文中明确阐述的现有定义、陈述或其它公开内容材料相冲突的任何材料或其部分所并入的程度仅为在所并入的材料与本发明材料之间不出现冲突。在冲突的情况下，支持本发明作为优选的公开内容来解决所述冲突。
本发明的实践可以采用在本领域的技能内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学以及免疫学的常规技术和描述。所述常规技术包括寡核苷酸合成、杂交、延伸反应以及使用标记检测杂交。合适技术的具体说明可以参看下文中的实例。然而，当然也可以使用其它等效的常规程序。所述常规技术和描述可见于标准实验指南中，例如基因组分析实验指南系列(Genome Analysis:A LaboratoryManual Series)(第I-IV卷)、PCR引物实验指南(PCR Primer:ALaboratory Manual)以及分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(全都来自冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),1989)；盖特(Gait),“寡核苷酸合成的实用方法(Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach)”1984,IRL出版社(IRLPress),伦敦(London),纳尔逊(Nelson)和考克斯(Cox)(2000)；勒宁格尔(Lehninger),生物化学原理(Principles of Biochemistry)第3版,W.H.弗里曼(W.H.Freeman)出版,纽约(New York),纽约州(N.Y.)；以及伯格(Berg)等人(2002)生物化学(Biochemistry),第5版,W.H.弗里曼出版,纽约,纽约州，所有这些都出于所有目的以其全文引用的方式并入本文中。
如本文所用的术语“等位基因”是指与基因或DNA链段相关的遗传变异，即，占据相同基因座的DNA序列的两种或两种以上替代形式中的一种。在一些实施例中，在基因座内的等位基因涵盖具有多态性串联重复碱基对基元的核酸分子。串联重复单元数量的变异区分基因座内的等位基因。
术语“野生型等位基因”或“优势等位基因”在本文中可互换地使用并且如本文所用是指在指定的种、属、科、社会部分、部落、种族或种族人口中发现的最常出现的等位基因。野生型等位基因可以认为是最常见的等位基因。
如本文所用的术语“变异体等位基因”是指从最常出现的等位基因变异。它还可以指在一或多个核酸位置，核酸序列在一或多个位置的改变，当与在指定的种、属、科、社会部分、部落、种族或种族人口的等位基因中所发现的在一或多个核酸位置的最常见等位基因相比时，产生了一或多个差异。
如本文所用的术语“等位基因分型标准物”是指涵盖特定STR标志物的一或多个等位基因的大小标准的核酸大小标准。等位基因分型标准物充当从STR标志物扩增的等位基因的参照标准和核酸大小标志物。
如本文所用，术语“扩增引物”和“寡核苷酸引物”可互换地使用并且是指能够退火到与目标序列相邻的RNA或DNA区域并且充当在本领域中众所周知的合适条件下进行DNA合成的起始引物的寡核苷酸。通常，PCR反应采用“扩增引物对”，也称为“寡核苷酸引物对”，包括“上游”或“正向”引物和“下游”或“反向”引物，它们限定了要扩增的RNA或DNA的区域。第一引物和第二引物可以是正向或反向引物并且在本文中可互换地使用并且不是限制性的。
如本文所用，“扩增”是指以酶促方式增加特定核苷酸序列的量的过程。这种扩增不限于通过PCR实现，但主要是通过PCR实现。如本文所用，“变性”是指从退火状态分离两条互补核苷酸链。变性可以通过多种因素诱导，例如缓冲液的离子强度、温度或破坏碱基配对相互作用的化学品。如本文所用，“退火”是指核苷酸链之间的特定相互相用，其中所述链基本上基于如通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对所测定的链之间的互补性彼此结合。为了发生退火，互补性不必是100％。如本文所用，“延伸”是指在引物寡核苷酸和目标核酸已经彼此退火之后的扩增循环，其中聚合酶催化引物延伸，由此实现扩增，使用目标核酸作为复制模板。
术语“扩增子”、“扩增产物”和“已扩增序列”在本文中可互换地使用并且是指用于以线性方式或以指数方式增加多核苷酸序列的广泛技术并且可以是扩增反应的产物。扩增子可以是双链或单链，并且可以包括通过使双链扩增产物变性获得的分开的组分链。在某些实施例中，一个扩增循环的扩增子可以充当后一扩增循环中的模板。例示性扩增技术包括(但不限于)PCR或采用引物延伸步骤的任何其它方法。扩增的其它非限制性实例包括(但不限于)连接酶检测反应(LDR)和连接酶链式反应(LCR)。扩增方法可以包括热循环或可以等温执行。在不同实施例中，术语“扩增产物”和“已扩增序列”包括来自任何数量的扩增反应循环的产物。
如本文所用，术语“碱基对基元”是指核碱基序列配置，包括(但不限于)重复序列、具有生物学意义的序列、串联重复序列等。
如本文所用，术语“比较”广泛地指两个或两个以上核酸序列之间的差异。类似性或差异可以通过各种方法来测定，包括(但不限于)：核酸测序、测序读数的比对、凝胶电泳、限制酶消化、单链构象多态性等。
术语“检测(detecting)”和“检测(detection)”在本文中在广义上使用并且涵盖可以确定核酸序列的存在或鉴别核酸序列的任何技术。在一些实施例中，检测可以包括对来自核酸的可检测信号进行定量，包括(但不限于)实时检测方法，例如定量PCR(“Q-PCR”)。在一些实施例中，检测可以包括使用扩增产物作为模板测定测序产物或测序产物家族的序列；在一些实施例中，所述检测可以包括获得测序产物家族的序列。在其它实施例中，检测可以通过测量核酸扩增产物的大小来实现。
如本文所用，“DNA”是指如本领域中所了解呈其各种形式的脱氧核糖核酸，例如基因组DNA、cDNA、经分离核酸分子、载体DNA以及染色体DNA。“核酸”是指呈任何形式的DNA或RNA。经分离核酸分子的实例包括(但不限于)载体中所含的重组DNA分子、维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子、部分地或实质上纯化的核酸分子以及合成的DNA分子。通常，“经分离”核酸不含天然地侧接获得核酸的生物体的基因组DNA中的核酸的序列(即，位于核酸的5'和3'端处的序列)。此外，“经分离”核酸分子(例如cDNA分子)当通过重组技术产生时一般基本上不含其它细胞材料或培养基，或当以化学方式合成时不含化学前体或其它化学品。
如本文所用，术语“侧接序列”广泛地指目标核酸序列的核酸序列5’和/或3’，包括(但不限于)短串联重复序列。侧接序列可以在扩增产物内或在扩增产物外，即侧接扩增产物。扩增引物可以经选择以杂交到侧接STR标志物的可变部分的序列，以便产生表现出STR标志物的特定等位基因的大小的扩增子。
如本文所用，术语“短串联重复(STR)基因座”是指基因组中含有长度为2到7个碱基对的短重复序列元件的区域。每个序列元件在STR内重复至少一次并且在本文中被称作“重复单元”。术语STR还涵盖基因组DNA区域，其中超过单一重复单元串联重复或插入碱基重复，其限制条件为所述序列中的至少一个串联重复至少两次。STR的实例包括(但不限于)三联体重复序列，例如atc串联，例如atcatcatcatcaacatcatc(SEQID NO:1)；4-peat(四重复序列)，例如gata串联，例如GATAGATAGATACATAGATA(SEQ ID NO:2)；以及5-peat(五重复序列)，例如attgc串联，例如ATTGCATTGCATTGC(SEQ ID NO:3)等。关于可以用作遗传标志物的特定STR的信息尤其可在www.cstl.nist.gov/strbase见于STRbase。
如本文所用，术语“不完美重复序列”、“不完全重复序列”和“变异体重复序列”是指其中重复单元尽管串联，但是在一或多个重复单元之间具有序列中断(添加或缺失)的串联重复序列，例如atcg atcg aacg atcg atcg(SEQ ID NO:4)，其中第三个重复单元与其它重复单元不一致并且因此是不完美重复序列；不完全重复序列可以视为其中重复单元中的碱基对的数量是不完全重复的串联重复序列，例如TH01基因座的等位基因9含有九个4-peat重复单元([AATG]9表示TH01基因座的完全重复单元“AATG”)，但是9.3等位基因含有九个“AATG”重复单元和一个不完全重复单元，不完全重复单元三个核苷酸“ATG”，即，[AATG]6ATG[AATG]3；而变异体重复序列在重复单元内具有变异，例如atcc atcg atcc atcg atcg atcc atcc(SEQ ID NO:5)，其中4-peat重复单元在重复单元的第四个位置处具有变异体碱基对“c”或“g”核苷酸。
如本文所用，术语“多态短串联重复基因座”是指其中在基因组DNA的特定区域中的重复序列元件的数量(和所述序列的净长度)因等位基因而异并且因个体而异的STR基因座。
“遗传标志物”一般是具有用于分析的相关特征的基因组DNA基因座的等位基因，所述分析例如DNA分型，其中基于个体的DNA的变异区分个体。大多数DNA分型方法被设计成用于检测并分析已知以至少两种不同形式或等位基因出现在群体中的DNA标志物的一或多个区域的长度和/或序列的差异。所述变异被称作“多态性”，并且其中出现这种变异的任何DNA区域都被称作“多态基因座”。执行DNA分型的一种可能方法涉及将PCR扩增技术(K B穆利斯(K B Mullis)，美国专利第4,683,202号)与长度变异多态性的分析相结合。PCR在传统上只可以用来可靠地扩增相对较小的DNA区段；即，只扩增长度低于3,000个碱基的DNA区段(M.庞塞(M.Ponce)和L.米克(L.Micol)(1992),NAR 20(3):623；R.德科尔特(R.Decorte)等人(1990),DNA细胞生物学(DNACELL BIOL.)9(6):461469)。短串联重复序列(STR)、小卫星和数目可变串联重复序列(VNTR)是长度变异多态性的一些实例。含有小卫星或VNTR的DNA区段一般过长以致于不能通过PCR可靠地扩增。相比之下，含有约三到七个核苷酸的重复单元的STR足够短以适用作PCR应用中的遗传标志物，因为扩增方案可以被设计成用于产生比可能来自DNA的其它可变长度区域的产物小的产物。
如本文所用，术语“单体型”是Y染色体上一起遗传的一组所选择的等位基因。
如本文所用的术语“基因座”是指在染色体或核酸分子上的特定实体位置。基因座的等位基因位于同源染色体上的相同位点处。如本文所用的“基因座(locus)”的复数“基因座(Loci)”是指在相同或不同染色体上的特定实体位置以及在核酸分子上的相同或不同特定实体位置。
如本文所用，术语“核酸样品”是指在根据本发明的生物样品中所发现的核酸，包括(但不限于)例如毛发、粪便、血液、组织、尿液、唾液、颊部细胞、阴道细胞、皮肤(例如指纹中所含有的皮肤细胞)、骨骼、牙齿、面颊样品、含有胎盘细胞的羊水和含有胎儿细胞的羊水以及精液。预计可以侵入性或非侵入性地收集样品。样品可以在以下各者之上、之中、之内、来自以下各者或结合以下各者发现：纤维、织物、香烟、口香糖、粘合材料、土壤或无生命的物体。如本文所用的“样品”在其最广泛的意义上使用并且是指疑似含有核酸的样品并且可能伴随着细胞、从细胞中分离的染色体(例如，中期染色体的扩展)、基因组DNA、RNA、cDNA等。样品可以是动物或植物来源的，涵盖含有核酸的任何生物体，包括(但不限于)细菌、病毒、植物、牲畜、家养宠物以及人类样品。
另外在本文中，通过端点对数值范围进行的叙述包括所述范围内所包含的所有数字(例如1到5包括1、1.5、2、2.75、3、3.80、4、5等)。
如本文所用，“聚合酶链式反应”或PCR是核酸的扩增，由分离双链核酸样品的链的初始变性步骤、接着重复以下各步组成：(i)退火步骤，它允许扩增引物特定地退火到侧接目标序列的位置；(ii)延伸步骤，它沿着5'到3'的方向延伸引物，由此形成与目标序列互补的扩增子多核苷酸；以及(iii)变性步骤，它引起扩增子与目标序列分离(穆利斯等人编,聚合酶链式反应(The Polymerase Chain Reaction),比克霍瑟(BirkHauser),波士顿(Boston),马萨诸塞州(Mass.)(1994))。以上步骤中的每一个都可以在不同温度下进行，优选地使用自动化热循环仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems LLC),生命技术公司(Life Technologies Corporation)的分公司,福斯特市(Foster City),加利福尼亚州(CA.))。必要时，RNA样品可以通过本领域的技术人员已知的方法转化成DNA/RNA异双螺旋或双螺旋cDNA。PCR方法还包括逆转录酶-PCR和遵循PCR原理的其它反应。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本文中可互换地使用并且是指核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括(但不限于)通过核苷酸间磷酸二酯键键联或核苷酸间类似物以及相关抗衡离子连接的2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)，所述抗衡离子例如H+、NH4 +、三烷基铵、Mg2+、Na+等。多核苷酸可以完全由脱氧核糖核苷酸构成、完全由核糖核苷酸构成或由其嵌合混合物构成，并且可以包括核苷酸类似物。核苷酸单体单元可以包括任何核苷酸或核苷酸类似物。多核苷酸的大小通常从几个单体单元到若数千个单体核苷酸单元不等，例如5-40，当它们有时在本领域中被称为寡核苷酸时。除非另外指出，否则每当呈现多核苷酸序列时，都应了解，核苷酸从左到右是按5'到3'的顺序并且除非另外指出，否则“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷，“T”表示胸苷，并且“U”表示脱氧尿苷。
术语“引物”是指如下多核苷酸(寡核苷酸)和其类似物：能够选择性杂交到目标核酸或“模板”、目标区域侧接序列或杂交到扩增产物的对应引物结合位点；并且允许从引物的3’端合成与对应多核苷酸模板、侧接序列或扩增产物互补的序列。引物的长度通常可以介于约10到100个核苷酸之间并且可以提供与模板互补的多核苷酸的模板定向合成的起始点，所述合成可以在存在恰当酶、辅因子、例如核苷酸(dNTP)的底物等的情况下发生。
如本文所用，术语“引物结合位点”是指多核苷酸序列、通常是侧接目标区域和/或扩增子的序列中可以直接或通过其互补序列充当模板的区域，引物可以退火到所述模板进行本领域中已知的任何合适的引物延伸反应，例如(但不限于)PCR。本领域的技术人员应了解，当在双链多核苷酸上存在两个引物结合位点时，这两个引物结合位点的方向一般是不同的。举例来说，引物对的一个引物与第一引物结合位点互补并且可以与它杂交，而引物对的对应引物被设计成用于与第二引物结合位点的互补序列杂交。换句话说，在一些实施例中，第一引物结合位点可以沿有义方向，并且第二引物结合位点可以沿反义方向。扩增子的引物结合位点可以(但不需要)涵盖与目标侧接序列或其互补序列相同的序列或所述序列中的至少一些。
本领域的技术人员了解，当目标区域通过某些扩增手段扩增时，在互补的扩增子或扩增子的互补链中合成了引物结合位点的互补序列。因此，应了解，引物结合位点的互补序列明确地包括在如本文所用的的术语引物结合位点的既定含义内。
如本文所用，术语“串联重复序列”是指依次连续出现的重复序列。
如本文所用，术语“串联重复基因座”是指含有串联重复序列的基因座。
如本文所用，术语“目标多核苷酸”、“核酸目标”和“目标核酸”在本文中可互换地使用并且是指特定相关核酸序列。“目标”可以是力图被扩增并且可以在存在其它核酸分子的情况下存在或存在于更大核酸分子内的多核苷酸序列。目标多核苷酸可以从任何来源获得，并且可以包括任何数量的不同组成性组分。举例来说，目标可以是核酸(例如DNA或RNA)。目标可以经甲基化、非甲基化或两者。此外，应了解“目标多核苷酸”可以指目标多核苷酸本身以及其代替物(例如扩增产物)以及天然序列。在一些实施例中，目标多核苷酸是来源于降解来源的短DNA分子，例如可以发现于例如(但不限于)法医学样品中(参看例如布特勒(Butler),2001,法医学DNA分型：STR标志物背后的生物学和技术(Forensic DNA Typing:Biology and Technology Behind STRMarkers))。本传授内容的目标多核苷酸可以来源于多种来源中的任一种。这些来源可以包括(但不限于)全血、组织活检、淋巴、骨骼、骨髓、牙齿、羊水、毛发、皮肤、精液、肛门分泌物、阴道分泌物、汗液、唾液、口腔拭子、各种环境样品(例如，农业、水和土壤)、一般研究样品、一般经纯化样品以及溶解细胞。应了解，目标多核苷酸可以使用本领域中已知的各种程序中的任一种从样品中分离，例如PrepSEQTM试剂盒(来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)),博姆(Boom)等人和美国专利第5,234,809号等。应了解，目标多核苷酸可以在分析之前进行切割或剪切，包括使用以下程序：例如机械力、声处理、限制性核酸内切酶裂解或本领域中已知的任何方法。
如本文所用的特定STR基因座的命名法是指给这些基因座分配如它们在本领域中已知的名称。基因座例如在各种参考文献中并且通过在之后的清单中的各种登录号进行鉴别，所有这些参考文献以其全文引用的方式并入本文中。之后的参考文献清单仅仅打算示范基因座信息的来源。适当时，当前登录号截止到提出申请时为止，如由(美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information),贝塞斯达(Bethesda),马里兰州(MD))所提供。
在此描述了新的Y-STR多重分析组，其在以下方面提供了出人意料的改善：提供更多样化群体中的单体型分辨率(HR)变异的能力、排除怀疑个体的男性亲属的能力和/或在更高度填充的Y-STR频率数据库中解决偶然匹配的能力。在本领域中存在对所述改善的需要，因为目前，Yfiler多重分析在欧洲人群中的HR是0.989，但全球HR只有0.905(韦尔默朗,国际法医科学：遗传学(Forensic Science InternationalGenetics)3(2009)205-213)。另外，在此所述的Y-STR多重组提供了鉴别混合物中的更强劲次要贡献者等位基因的多重分析的更好整体平衡，由此提供了相比于市售试剂盒，具有高女性背景的男性/女性混合物中更好的男性/男性分辨率和/或男性等位基因的更好鉴别。此外，Y-STR多重组提供：相比于当前可获得的商业试剂盒，针对PCR抑制剂的抗性改善，提供等位基因的更高回收；更高的灵敏度，当扩增少量输入DNA时，提供更高数量的经鉴别等位基因；以及更短的分析时间。
在本文中所述的Y-STR多重分析组中，也已经包括了当前用于多重组中的Y-STR标志物，因为现有Y-STR数据库已经用含有这种信息的概况填充。已经评估了附加Y-STR标志物的用途。已经鉴别了大量Y-STR基因座，但出于多种原因，不是所有Y-STR基因座都必定适用于包含在多重组中。在解释数据时，尤其是在具有若干DNA来源或潜在污染物的样品中，多拷贝标志物可能具有挑战性。举例来说，不认为具有两个以上拷贝(非限制性实例包括DYF399S1abs和DYF403S1 1abc/II)的标志物可以用于包含在本发明的一些实施例中。
已经研究了使用具有更高基因多样性的基因座来降低偶然匹配的发生率。为了排除个体的父系近亲属，具有高突变率的标志物可能是有利的。另一方面，在亲属关系分析中，具有高突变率的标志物会使分析变复杂；包括具有更低突变率的附加标志物可以辅助谱系区分。平衡那些因素可以提供具有最广泛适用性的多重组。
新加入的Y-STR标志物提供的改进超出了当前商业化Y-STR多重分析的能力，包括以下特征：例如(1)使用微型STR，其可以促进降解DNA的分析；(2)包含高度有差别的标志物，其可以更好地区分具有低Y染色体多样性的群体中的父系谱系；以及(3)使用快速突变标志物来提高在近亲属之间加以区分的能力。此外，选择每个标志物最多具有两个拷贝的标志物(例如DYS385ab)可以简化分析。
有助于选择用于改善多重分析的Y-STR基因座的其它因素包括多重分析内的引物相容性、针对相关引物的严格男性特异性以及适用作微型STR的潜在性。包括微型STR的另一个优点是缩短用于鉴别多重分析中所扩增的等位基因的电泳分离的时间的潜在性，因为可以在约410bp的电泳分离中包括更大数量的STR标志物。添加第六染料泳道还允许增加所检查的Y-STR基因座的数量同时维持更短的电泳分离。
基因多样性.从可获得的人口研究搜集平均基因多样性(GD)值，如在表1中关于39个基因座的候选清单所列。进一步评估这39个基因座包含在经改善的Y-STR多重组中的可能性，因为这些基因座提供了更大辨别的可能性，尤其是在非欧洲人口中，如表1的关键词中所示。
表1.
*DYS526I/II是类似于DYS389I/II的多拷贝标志物，并且不包括在潜在新标志物的清单中。
表1a.人口背景关键：
突变率.还考虑了包含经过挑选的一或多种高度突变Y-STR标志物。Y-STR标志物的个体突变率(MR)已经在美国申请公开2011/0263437A1和巴兰坦等人,国际法医科学：遗传学(Forensic Sci Int.Genet.)(2011),doi:10.1016/j.fsigen.2011.04.017)中有所描述。快速突变Y-STR标志物的突变率可以大于约10-2。表1示出了考虑用于包含在多重组中的Y-STR标志物中的每一个的突变率。
图1示出了绘制成x轴上的基因多样性对比y轴上的突变率的Y-STR标志物。菱形代表目前存在于市售多重分析试剂盒中的Y-STR标志物基因座。三角形代表不是试剂盒的一部分的Y-STR标志物。除其它特征之外，针对基因多样性与突变率特性的组合，可以选择考虑用于包含在本文中所述的多重组中的Y-STR标志物。
在设计使用电泳分离并检测的Y-STR多重分析组的过程中，多重设计可以利用多个可区分的荧光染料泳道，并且使片段大小不同以将标志物的每个单独等位基因区域的检测放在所运行的电泳的所选部分，允许检测所有复合基因座的经标记扩增子，并且信号不重叠。当并入所有标志物时，多重分析内可获得的“间隔”会对向所述组中添加附加Y-STR标志物造成严重限制。这种限制可以反映在引物设计考虑因素中。另一方面，引物设计和放置还会需要在不同Y-STR标志物的等位基因之间相隔1或2个碱基对。在一些实施例中，在电泳分析中，不同Y-STR标志物的等位基因由2个碱基对“间隔”隔开，允许更准确的等位基因和标志物鉴别。
产生小于约220bp的扩增子的微型STR的使用还允许增加多重性(plexy)同时还允许扩增，并且由此检测降解DNA。然而，不是每一个STR标志物都可以被调适成用作微型STR。如果重复序列加上所需侧接碱基总计为过多碱基或如果侧接序列不允许特定引物设计，那么STR标志物可能不合适用于微型STR使用。不适合作为微型STR标志物的Y-STR标志物受限于放在分析组内为更大的扩增子片段检测保留的区域中。举例来说，被设计成用于放置约200个碱基对的DYF404S1和DYF387S1的一些引物并没提供令人满意的结果，并且那些标志物可以更成功地放在多重组中更大扩增子大小范围处。
在选择用于包含在本文中所述的多重组内的Y-STR标志物时的额外考虑因素在描述引物设计的部分中进一步加以讨论，并且包括评估特异性(即，仅扩增目标核酸)；灵敏度(即，混合法医样品内的即使少量目标核酸都可以被准确地扩增)，以及多重分析内的潜在不合意的相互作用。
基于初始研究，一些Y-STR标志物不能得到成功并入多重分析组中的最高概率。举例来说，测试了DYS626的3个不同引物对。所述引物对中的两个在含1:500男性/女性DNA的样品中显示出附加峰，而第三个引物对显示出与标志物DYS392和DYS439的相互作用。在另一个实例中，测试了DYF404S1的两个不同引物对。当用于1:500男性/女性DNA样品中时，两者均具有其初始峰高度的仅1/3。这会在个案工作样品中产生脱离(drop out)问题。在第三个实例中，测试DYS547的两个不同引物，但当在1:500男性:女性混合物中测试时，两者均展现出女性DNA的不合意扩增。如果包括男性:女性混合物的法医样品不用于源DNA，那么所有这些标志物都可以成功地用于多重组中。举例来说，如果Y-STR多重组用于在男性亲属之间进行辨别，那么这些标志物中的任一个都可以成功添加到相比于当前市售试剂盒有所改善的Y-STR多重组中。
当评估例如DYS612的标志物时会出现另一种复杂情况，所述标志物由于其三核苷酸重复性质，可以提供包括相当比例的影子带(stutter)的扩增产物。影子带是在扩增短串联重复序列时看到的假影并且可以发生在长度比亲本等位基因短的一个重复单元处。在法医分析中，影子带使来自多个贡献者的DNA图谱的分析变得复杂，因此具有显著的影子带倾向的标志物可能不够理想适用于具有比率可能显著不同的混合来源的样品所用的多重法医组中。然而，它可以成功地用于个体男性身份/亲缘关系的分辨分析中。
在一些情况下，可以更改当前标志物的引物以去除与各个组的新添加的Y-STR标志物的相互作用。
在本文中示出了若干个不同的多重组，其包括当前标志物加上附加Y-STR标志物以使单体型分辨率达到最大。
图2示出了第1组35重Y-STR多重分析组的示意性图示。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。十三个标志物是微型STR并且在约450个碱基对的电泳运行中捕获整组。
图3示出了第2组27重Y-STR多重分析组的示意性图示，所述多重分析组包括所有STR标志物和10个基因多样性值大于0.75的附加Y-STR标志物(包括双重拷贝标志物)，其中所述多重分析包括7个快速突变Y-STR标志物。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。十二个标志物是微型Y-STR标志物并且在约370个碱基对的电泳运行中捕获整组。
图4示出了第3组30重Y-STR多重分析组的示意性图示，所述多重分析组包括所有STR标志物和9个(10个，包括双重标志物)基因多样性值大于0.75的附加Y-STR标志物。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。十二个标志物是微型STR标志物并且在约420个碱基对的电泳运行中捕获整组。
图5示出了第4组27重Y-STR多重分析的示意性图示，所述多重分析含有所有Y-STR标志物、基于平均基因多样性值最佳的三个标志物以及六个附加标志物。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。十二个标志物是微型STR标志物并且在约370个碱基对的电泳运行中捕获整组。
图6示出了第5组27重Y-STR多重分析的示意性图示，所述多重分析含有所有Y-STR标志物和12个其它Y-STR标志物。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。十二个标志物是微型STR标志物并且在约410个碱基对的电泳运行中捕获整组。
关于图3-6的Y-STR多重分析组，可以在染料2泳道中包括具有中等基因多样性值的附加标志物DYS460，从而获得总共13个微型STR标志物。
图7示出了第6组27重Y-STR多重分析的示意性图示，所述多重分析含有所有Y-STR标志物和十个附加标志物。二十七个标志物中的两个是双重拷贝标志物(DYS385ab和DYF387S1ab)，并且十一个标志物是小于约220个碱基对的微型标志物。具有小于约220个碱基对的大小的至少11个Y-STR标志物可以是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。至少五个标志物是快速突变标志物(参看表1)，并且代表所述组中总共六个快速突变标志物，因为DYF387S1ab是双重拷贝标志物。快速突变Y-STR标志物可以是DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。DYS446不包括在这一组中，因为其与DYS393标志物(存在于多重分析中)的接近性会通过两个标志物引起扩增假影。在电泳分离之后在约76-400个碱基对的范围内捕获整组。图9示出了第6组相比于数据库和其它Y-STR组的等位基因范围。
图8示出了使用图7的27重Y-STR标志物组(第6组)进行电泳分离的图形表示，示出了分开的泳道中的每个可区分的染料泳道并且没有示出使用第六染料的大小标准染料泳道。在表2中，条目1-18和20-26描述了第6组Y-STR标志物的单独标志物、重复序列、重复类型以及染色体位置。第6组是用于扩增某个引物集的多重分析，所述引物集用于扩增以下各者：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393和DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。
图10示出了第7组27重Y-STR多重分析的示意性图示，所述多重分析含有所有Y-STR标志物和十个附加标志物。二十七个标志物中的两个是双重拷贝标志物(DYS385ab和DYF387S1ab)，并且十一个标志物是小于约220个碱基对的微型标志物。具有小于约220个碱基对的大小的至少11个Y-STR标志物可以是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。使用了六种染料，包括用第六可区分的荧光染料标记的大小标准/等位基因分型标准物(未图示)。至少五个标志物是快速突变标志物(参看表1)，并且代表所述组中总共七个快速突变标志物，因为DYF387S1ab是双重拷贝标志物。快速突变Y-STR标志物可以是DYF387S1ab、DYS449、DYS518、DYS570、DYS576和DYS627。在电泳分离之后，可以在约68到约406个碱基对的范围内捕获整组。图12示出了第7组相比于数据库和其它Y-STR组的等位基因范围。
图11示出了使用图10的27重Y-STR标志物组(第7组)进行电泳分离的图形表示，示出了分开的泳道中的每个可区分的染料泳道并且没有示出使用第六染料的大小标准染料泳道。在表2中，条目1-24和26描述了第7组Y-STR标志物的单独标志物、重复序列、重复类型以及染色体位置。第7组是用于扩增以下各者的多重分析：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。
表2.Y-STR标志物，包括重复序列、类型和染色体位置.
表格说明：可变重复序列用粗体表示，所列的不同序列用斜体和下划线表示。
a.通过内部测序证实序列重复。巴兰坦等人2011年公开了不同重复结构：AAAG]3[GTAG][GAAG]4N16-[GAAG]9和不同染色体位置：Yq11.2Yq11.23。
b.通过内部测序证实序列重复。
c.通过内部测序证实序列重复。巴兰坦等人2011年公开了不同重复结构：AGAA]3N16[AGAG]3[AAGG]3
d.NCBI RefSeq NC000024中的序列不同于STRbase：
[TAGA]12N12[GAT]2AA[TAGA)4。
等位基因.已经报告了许多新等位基因(YHRD.org、usystrdatabase.com)，并且所述新等位基因可以并入到Y-STR标志物分析中。图9示出了第6组的每个标志物的等位基因与其它组的对比。图12示出了第7组的每个标志物的等位基因。两组均含有针对所选标志物扩展的等位基因范围。第6组和第7组的等位基因分型标准物并入了这些新等位基因。举例来说，标志物DYS438的扩展等位基因范围示出在图13中。上部泳道示出了来自试剂盒的等位基因(8-13，总共6)，而下部泳道示出了第1到7组Y-STR的经扩展的6-16重复范围，它还包括虚拟等位基因5、8.2(在示意图中鉴别为8)和17。
引物设计.鉴别了用于在单一多重反应中共扩增的基因座集之后，可以确定适用于共扩增所述集中的每个基因座的引物。可以向反应混合物添加寡核苷酸引物并且所述引物用以划分所扩增的DNA片段的5'和3'端。一个寡核苷酸引物退火到变性模板DNA的有义(+)链，并且另一个寡核苷酸引物退火到变性模板DNA的反义(-)链。通常，寡核苷酸引物的长度可以是约12-25个核苷酸，但其大小可以取决于例如要扩增的模板序列的碱基组成、扩增反应条件等参数显著变化。寡核苷酸引物可以被设计成用于退火到DNA中侧接相关基因座的特定部分、特异性地扩增介于引物互补位点之间DNA部分。可能需要修改引物长度以便更具特异性并且防止扩增非目标核酸。举例来说，发现延长DYS456标志物的引物解决了以下问题：当扩增男性:女性混合样品时，不希望扩增女性DNA样品子集的女性DNA。在图14的左手边，示出了DYS456标志物的两个部分电泳分离区段证明了当所选女性A和女性B样品存在于0.5ng男性/250ng女性样品中并且使用标准长度(25个核苷酸或更少)引物时，女性DNA不当扩增(在分离区段左边的超标度峰)。相比之下，使用延长的引物(长度是28个核苷酸)来扩增DYS456，当分析这两种有问题的男性/女性混合物时，如图14的右手组中所示，看到关于此Y-STR标志物，男性等位基因恰当地扩增(标度上单个峰，无女性DNA不当扩增的证据)。
寡核苷酸引物可以包括腺苷、胸苷、鸟苷和胞苷，以及尿嘧啶、核苷类似物(例如(但不限于)肌苷、锁核酸(LNA)、非核苷酸连接子、肽核酸(PNA)和亚磷酰胺)以及含有或结合到化学部分的核苷，例如放射性核素(例如，32P和35S)、荧光分子、小沟结合物(MGB)或本领域中已知的任何其它核苷结合物。
一般来说，寡核苷酸引物可以化学合成。应注意选择多重反应中所用的引物序列。引物的不当选择会产生不当效果，例如缺乏扩增、在除了既定目标基因座之外的一个位点或多个位点扩增、形成引物二聚体、不同基因座的引物之间的不当相互作用、从一个基因座的等位基因产生与另一个基因座的等位基因重叠(例如，在大小方面)的扩增子或需要特定适合于不同基因座中的每一个的扩增条件或方案，所述条件/方案在单一多重系统中不相容。可以通过例如采用本领域的普通技术人员非常熟悉的多重优化的再迭代过程开发并选择适用于本传授内容的多重系统的引物：选择引物序列，混合用于共扩增所选择的基因座的引物，共扩增所述基因座，然后分离并检测扩增产物，从而判定引物在扩增中的有效性。
可以通过使用本领域中可获得的并且已知的用于开发扩增和/或多重系统的各种软件程序中的任一个来选择引物。参看例如Primer软件(应用生物系统公司,福斯特市,加利福尼亚州)。在软件程序的使用的实例中，可以将来自相关基因座区域的序列信息引入到软件中。所述软件然后使用各种算法来选择最佳地满足用户规范的引物。
最初，这种引物选择方法会产生上述扩增中的不当效果中的任一种，或扩增产物的不平衡，其中关于一些基因座得到的产物比关于其它基因座得到的产物大，因为一些引物与其各别目标之间的结合强度比其它引物大，例如产生针对一些基因座的优选退火和扩增。或者，引物可以产生不代表目标基因座等位基因本身的扩增产物；即，可以产生非特异性扩增产物。由不良引物设计产生的这些额外产物可能是因为例如引物与样品DNA的非目标区域或甚至与其它引物退火，接着在退火之后扩增。
当在引物选择期间在多重系统中存在不平衡的或非特异性扩增产物时，可以从总的多重集中取出个别引物并用于与来自相同或其它基因座的引物扩增，从而鉴别哪些引物造成了扩增不平衡或假影。在鉴别出产生假影或不平衡中的一或多个的两个引物之后，可以单独成一对或在多重系统(或多重系统的子集)中对一个或两个促成因素进行修改并再测试。可以重复这个过程直到产物评估产生在多重系统中不具有扩增假影或可接受水平的扩增假影的扩增等位基因为止。
引物浓度的优化可以在测定最终引物序列之前或之后执行，但最通常可以在引物选择之后执行。一般来说，增加任何特定基因座的引物的浓度就增加了所述基因座所产生的产物的量。然而，引物浓度优化也是再迭代过程，因为例如增加从一个基因座得到的产物会减少从另一个基因座或其它基因座得到的产物。此外，引物可以彼此相互作用，这会直接影响从各种基因座获得扩增产物的产率。总之，特异性引物集的浓度线性增加可能不一定等同于对应基因座所得到的扩增产物的线性增加。关于基因座特异性引物的更详细描述，参考西蒙斯(Simons)的美国专利第5,192,659号，其传授内容以全文引用的方式并入本文中。
多重反应中基因座与基因座之间的扩增产物平衡还会受到扩增方案的多个参数的影响，例如所输入的模板(样品DNA)的量、所用扩增循环的次数、热循环方案的退火温度以及在循环过程结束时包含或排除额外延伸步骤。针对所有等位基因和基因座得到扩增产物的绝对均匀平衡虽然理论上是理想的，但是实际上一般是无法实现的。
迁移率调节剂.在一些实施例中，可以调整扩增产物(即含有指定基因座的STR的扩增子)的电泳迁移率以避免与另一个不同STR基因座扩增子的电泳迁移率范围重叠。这可以按至少两种可以彼此分离或组合使用的不同方法进行。在一种方法中，调整引物的位置以产生更小或更大的扩增产物，从而避免在电泳期间与另一个基因座的分子量大小重叠。在另一种方法中，迁移率调节剂部分包括(但不限于)例如任选地经磷酸二酯或磷酸三酯子单元间杂的聚氧化乙烯重复子单元，可以按非核苷酸连接基团形式并入引物5'端处的荧光染料与引物序列之间。聚氧化乙烯重复子单元可以是三-氧化乙烯、四-氧化乙烯、五-氧化乙烯、六-氧化乙烯(HEO)、七-氧化乙烯或八-氧化乙烯子单元。聚乙烯重复子单元可以重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、十一次或十二次。迁移率调节剂部分可以通过磷酸二酯部分连接到引物序列的5'端。参看例如美国专利5,470,705；5,514,543；5,580,732；5,624,800；5,703,222；5,777,096；5,807,682；5,989,871；6,395,486；6,734,296；6,756,204；6,743,905；7,074,569；7,115,376；7,129,050和7.897,338，所述专利中的每一个以全文引用的方式并入本文中。类似地，扩增引物可以含有不杂交到基因座，但经添加用于产生所用检测方法(例如电泳或质谱)所要的扩增子迁移率的附加核苷酸(在5'端)。(两个PCR产物中较大那个的)所得PCR扩增产物含有迁移率调节剂分子，增加了PCR产物的分子量并且因此察觉到更大PCR产物的分子量变为甚至更大的大小。分子量范围与扩增子大小相关，因此当扩增子包括迁移率调节剂部分时明显变高。
当Y-STR标志物的扩增子具有小于约220个碱基对的碱基对大小时，它在本文中可以被称作微型Y-STR标志物。在一些实施例中，至少11个Y-STR标志物的扩增子中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在一些实施例中，至少11个Y-STR标志物中的至少一个的具有小于约220个碱基对的有效碱基对大小的扩增子中的每一个还包括迁移率调节剂部分。当阐明微型Y-STR标志物的扩增子中的每一个的大小是小于约220个碱基对时，那么关于微型Y-STR标志物，小于约220个碱基对的大小范围包括80-90％的等位基因。在一些实施例中，至少11个微型Y-STR标志物可以包括DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，至少11个微型Y-STR标志物可以包括DYS19、DYS458、DYS456、DYS505、DYS481、DYS460、DYS437、DYS389I、DYS576、DYS390、DYS570、DYS391和DYS393。在又其它实施例中，至少11个微型Y-STR标志物可以包括DYS19、DYS458、DYS456、DYS439、DYS481、DYS437、DYS389I、DYS576、DYS390、DYS570、DYS391和DYS393。在一些其它实施例中，至少11个微型Y-STR标志物可以包括DYS19、DYS458、DYS456、DYS439、DYS481、DYS437、DYS389I、DYS576、DYS390、DYS570、DYS391和DYS393。在一些实施例中，至少11个微型Y-STR标志物选自DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393、DYS439、DYS505、DYS481和DYS391。在一些实施例中，超过11个微型STR标志物选自DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393、DYS439、DYS505、DYS481和DYS391。在一些实施例中，一个以上Y-STR标志物的扩增引物具有并入其中的迁移率调节剂部分。当一个以上Y-STR标志物的扩增引物具有迁移率调节剂部分时，那么每个不同Y-STR标志物的扩增引物的迁移率调节剂部分的结构可以独立地进行选择。在一些实施例中，超过5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个Y-STR标志物具有迁移率经修改的扩增引物。在一些实施例中，迁移率经修改的扩增引物可以经选择用于扩增选自下组的呈任何组合或次组合形式的Y-STR标志物：包括DYS627、DYS389II、DYS635、DYS389I、DYS391、DYS448、Y-GATA-H4、DYS19、DYS438、DYS390和DYS449。
在一些实施例中，提供了包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物的扩增引物集，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过荧光检测技术执行。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过依赖于迁移率的分析技术执行。依赖于迁移率的分析技术可以是毛细管电泳。在一些其它实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过测序技术执行，不使用荧光染料标记。在一些实施例中，扩增引物集可以进一步包括用于扩增至少5个附加Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少5个附加Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。扩增引物集可以包括25个Y-STR标志物。在一些实施例中，扩增引物集用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些实施例中，扩增引物集可以被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的用至少5种荧光染料中的一种标记的每个扩增子集。用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。用于扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少一个包括迁移率调节剂的Y-STR标志物的扩增子集。在一些实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集的扩增引物集可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。
在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约400个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约405个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约415个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约405个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约415个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，当提供用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物时，那么所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约425个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。
在一些实施例中，提供了用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物，其中至少11个Y-STR标志物的扩增子中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小，并且其中所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约400个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，提供了用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物，其中至少11个Y-STR标志物的扩增子中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小，并且其中所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，提供了用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物，其中至少11个Y-STR标志物的扩增子中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小，并且其中所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约415个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，提供了用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物，其中至少11个Y-STR标志物的扩增子中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小，并且其中所述引物被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。
在又另一个方面，提供了包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的引物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYS518。在不同实施例中，被配置成用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以进一步被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在其它实施例中，用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少22个Y-STR标志物的各自具有小于约410个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在其它实施例中，用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供至少22个Y-STR标志物的各自具有小于约420个碱基对的碱基对大小的扩增子集。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过荧光检测来执行。在一些实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过依赖于迁移率的分析技术执行。依赖于迁移率的分析技术可以是毛细管电泳。在一些其它实施例中，扩增子碱基对大小的检测可以通过测序技术执行，不使用荧光染料标记的检测。扩增引物集可以包括25个Y-STR标志物。在一些实施例中，扩增引物集用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物的每个扩增子集用至少5种荧光染料中的一种标记。用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集可以被配置成用于提供Y-STR标志物的至少一个扩增子集，其中所述至少一个扩增子集包括迁移率调节剂。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS518、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。
荧光团标记.在本发明传授内容的一些实施例中，可以使用荧光团来标记多重扩增的至少一个引物，例如通过共价结合到引物，由此产生经荧光标记的引物。在一些实施例中，多重分析中用于不同目标基因座的引物可以用不同荧光团标记，取决于荧光团的发射波长，每个荧光团产生带不同颜色的产物。这些不同标记的引物可以用于同一多重反应中，并且接着一起分析其各别扩增产物。可以对扩增特异性基因座的引物对的正向或反向引物进行标记，但是更多时候可以对正向引物进行标记。在一些实施例中，可以用荧光团标记正向引物的5′端。当标记引物的5′端时，它可以通过5′磷酸酯的连接基团进行荧光标记。在其它实施例中，当在5'端标记时，可以通过核碱基的连接基团进行荧光标记。
接下来是在本领域中众所周知并且适用于本传授内容中的荧光团的一些实例。清单打算是例示性的并且决不是详尽的。一些可能的荧光团包括：荧光素(FL)，它在492nm下吸收最大并且在520nm下发射最大；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(rhodamine)(TAMRATM)，它在555nm下吸收最大并且在580nm下发射最大；5-羧基荧光素(5-FAMTM)，它在495nm下吸收最大并且在525nm下发射最大；2',7'-二甲氧基-4',5'-二氯-6-羧基荧光素(JOETM)，它在525nm下吸收最大并且在555nm下发射最大；6-羧基-X-若丹明(ROXTM)，它在585nm下吸收最大并且在605nm下发射最大；CY3TM，它在552nm下吸收最大并且在570nm下发射最大；CY5TM，它在643nm下吸收最大并且在667nm下发射最大；四氯-荧光素(TETTM)，它在521nm下吸收最大并且在536nm下发射最大；以及六氯-荧光素(HEXTM)，它在535nm下吸收最大并且在556nm下发射最大；NEDTM，它在546nm下吸收最大并且在575nm下发射最大；6-FAMTM，它在约520nm下发射最大；它在约550nm下发射最大；它在约590nm下发射最大；以及LIZTM，它在约650nm下发射最大。参看SR科蒂科内(SR Coticone)等人,美国专利第6,780,588号；IdentifilerTM PCR扩增试剂盒用户手册,第1-3页,应用生物系统公司(2001)。应注意，以上所列的发射和/或吸收波长是典型的并且只可以用于一般指导目的；实际峰波长可以随不同应用并且在不同条件下变化。可以为了如本领域的技术人员所知的所要吸光度和发射光谱以及颜色选择附加荧光团，并且所述附加荧光团提供在表3中。
表3：市售染料.
多重组的各个实施例可以涵盖包括至少五种不同染料的单一多重染料系统。扩增引物集可以用至少五种不同染料中的一种标记。至少5种不同荧光染料可以是在光谱上截然不同的。这至少五种染料可以包括以上所列染料中的任何五种，或本领域中已知的任何其它五种染料，或6-FAMTM、NEDTM、和LIZTM染料。其它实施例可以包括包含至少六种不同染料的单一多重系统。这至少六种染料可以包括以上所列染料中的任何六种，或本领域中已知的任何其它六种染料6-FAMTM、NEDTM、TAZTM、SIDTM和LIZTM染料，其中TAZ染料在约600nm下发射最大，并且SID染料在约620nm下发射最大(LIZTM染料用于标记大小标准)。染料可以是能量转移染料。能量转移染料具有供体染料，它吸收激发能量并且转移能量以激发受体染料。能量转移染料可以被配置成用于将能量从供体染料有效地转移到受体染料。具有超过1种染料的多重能量转移染料系统可以具有与能量转移染料集成员中的每一个的供体染料相同的染料，同时具有与所述染料集的每个成员在光谱上截然不同的受体染料。
等位基因分型标准物.充当从多重组的一或多个STR标志物扩增的等位基因的参考标准和核酸大小标志物的等位基因分型标准物可以具有多种可能组合中的一种。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以包括所述分析中的STR标志物的所有已知等位基因。在其它实施例中，等位基因分型标准物可以不包括所有已知等位基因；可以通过与现存等位基因分型标准物组分的大小比较鉴别附加等位基因。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以并入不同STR的等位基因的大小标准，包括多重分析中的所有STR标志物的子集。或者，等位基因分型标准物可以包括多重分析中的所有STR标志物的等位基因的大小标准。多重分析的等位基因分型标准物可以是等位基因分型标准物组合。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以是DNA。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以包括非天然存在的核酸类似物，其可以进一步包括核苷酸类似物。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以包括天然存在的核苷酸和核苷酸类似物两者。在一些实施例中，等位基因分型标准物可以包括非核苷酸部分。在一些实施例中，等位基因分型标准物内的不同的单独的大小标准可以用可检测标记进行标记，例如荧光团。在一些实施例中，等位基因分型标准物组分用相同荧光团标记。在一些实施例中，等位基因分型标准物组分用不同荧光团标记。不同荧光团可以是在光谱上截然不同的。大小标准可以经选择以充当特异性寡核苷酸引物对的参照。举例来说，如果具有四核苷酸重复的标志物X的第一引物集产生了对应于等位基因7的150个碱基对扩增子，那么对应的第一等位基因分型标准物组分将充当150个碱基扩增子的大小标准。标志物X的第一引物集还可以产生对应于标志物X的等位基因8的154个碱基对扩增子，并且对应的第二等位基因分型标准物组分将充当154个碱基扩增子的大小标准。因此，涵盖了相同标志物的不同大小扩增子的不同大小标准。来源于指定等位基因的指定扩增子的大小标准可以具有与扩增子或获得扩增子的等位基因的核酸碱基序列相同或不同的核酸碱基序列。在个别基因座的等位基因分型标准物的构造之后，可以与扩增产物同时对所述分型标准物进行电泳。或者，可以在运行预先选择数量的分析进行分析结果比较之后，对所述分型标准物单独进行电泳。关于在电泳系统中的等位基因分析，大小标准可以经选择以具有与相关扩增子相同的电泳迁移率。可以通过在标准物或扩增子中包括非核苷酸部分获得大小标准和扩增子或获得扩增子的等位基因的相等电泳迁移率。或者，在一些实施例中，大小标准可以经选择以具有与相关扩增子不同的电泳迁移率。基于对大小标准与相关扩增子之间的迁移率差异的可推断性质的了解，可以判定扩增子的身份。关于在质谱系统中的等位基因分析，大小标准(重量/电荷比，不是电泳迁移率)可以经选择以便具有与相关扩增子相同的信号。或者，在一些实施例中，大小标准(重量/电荷比，不是电泳迁移率)可以经选择以具有与相关扩增子不同的分离特性。类似地，鉴于对重量/电荷差异的可推断性质的了解，可以判定扩增子的身份。等位基因分型标准物的单独的大小标准组分可以通过表达、合成或半合成产生。
在本文中所述的多重组的等位基因分型标准物的一个实施例中，所述组中的每个STR标志物的等位基因大小标准的范围(从最小等位基因到最大等位基因)可以与多重组中的对应相邻STR标志物的等位基因大小标准的前后范围相隔两个碱基对差异。
每个STR标志物的范围还可以包括在等位基因范围的最小端和最大端的虚拟仓以备将来使用。另外，软件处理电泳分离结果可以被进一步配置成用于将虚拟仓分配给微型变异体等位基因，例如其中在目标核酸中已发生串联重复序列的仅一部分重复。
一个例示性等位基因分型标准物示出在图15A中。图15A中所示的等位基因分型标准物可以用来鉴别多重组7的等位基因。第一染料泳道示出在顶图中，其中第一标志物是DYS576，其中在从约70bp到约135bp的区域中检测到等位基因10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25；第二标志物是DYS389I，其中在从约145bp到约175bp范围内检测到等位基因9、10、11、12、13、14和15；第三标志物是DYS635，其中在从约190bp到约250bp范围内检测到等位基因15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30；第四标志物是DYS389II，其中在从约260bp到约300bp范围内检测到等位基因24、25、26、27、28、29、30、31、32、33和34；并且第五标志物是DYS627，其中在从约320bp到约375bp范围内检测到等位基因12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和25。第二染料泳道示出在图15A顶部的第二组中，其中第一标志物是DYS460，其中在从约75bp到约110bp范围内检测到等位基因7、8、9、10、11、13和14；第二标志物是DYS458，其中在从约115bp到约170bp范围内检测到等位基因11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24；第三标志物是DYS19，其中在从约180bp到约220bp范围内检测到等位基因9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19；第四标志物是GATA-H4，其中在从约220bp到约260bp范围内检测到等位基因8、9、10、11、12、13、14和15；第五标志物是DYS448，其中在从约275bp到约335bp范围内检测到等位基因14、15、16、17、18、19、20、21、22、23和24；并且第六标志物是DYS391，其中在从约345bp到约395bp范围内检测到等位基因5、6、7、8、9、10、11、12、13、14和15。第三染料泳道示出在图15A顶部的第三组中，其中第一标志物是DYS456，其中在从约75bp到约135bp范围内检测到等位基因12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23和24；第二标志物是DYS390，其中在从约140bp到约195bp范围内检测到等位基因17、18、19、21、22、23、24、25、26、27、28和29；第三标志物是DYS438，其中在从约200bp到约255bp范围内检测到等位基因6、7、8、9、10、11、12、13、14、15和16；第四标志物是DYS392，其中在从约265bp到约305bp范围内检测到等位基因4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、19和20；并且第五标志物是DYS518，其中在从约340bp到约380bp范围内检测到等位基因35、36、37、38、39、40、41、42、43和45。第四染料泳道示出在图15A顶部的第四组中，其中第一标志物是DYS570，其中在从约95bp到约165bp范围内检测到等位基因10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25和26；第二标志物是DYS437，其中在从约175bp到约205bp范围内检测到等位基因10、11、12、13、14、15、16、17和18；第三标志物是DYS385ab，其中在从约225bp到约305bp范围内检测到等位基因6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27和28；并且第四标志物是DYS449，其中在从约325bp到约400bp范围内检测到等位基因23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、37、38、40和41。第五染料泳道示出在图15A顶部的第五组中，其中第一标志物是DYS393，其中在从约90bp到约135bp范围内检测到等位基因7、8、9、11、12、13、14、15、16和18；第二标志物是DYS439，其中在从约150bp到约195bp范围内检测到等位基因6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17；第三标志物是DYS481，其中在从约205bp到约255bp范围内检测到等位基因17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31和32；第四标志物是DYF387S1ab，其中在从约265bp到约320bp范围内检测到等位基因30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43和44；并且第五标志物是DYS533，其中在从约340bp到约380bp范围内检测到等位基因7、8、9、10、11、12、13、14、15、16和17。含有大小标准的第六染料泳道未示出在图15A中。在此实施例中，虚拟仓提供在每个标志物的等位基因检测范围的低bp侧和高bp侧。
在另一个实施例中，等位基因分型标准物如上所述，关于DYS456，含有附加等位基因10，从而提供在从约70bp到约135bp范围内检测到等位基因10、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22、23和24的DYS456范围。DYS456的附加范围特别示出在图15B中。
在又另一个实施例中，等位基因分型标准物如关于图15B的等位基因分型标准物所述，其中DYS392添加了等位基因12。
一方面，本发明提供一种等位基因分型标准物，其中所述等位基因分型标准物包括用于至少11个Y-STR标志物的至少一个等位基因的至少一个大小标准，其中用于至少11个Y-STR标志物的至少一个等位基因的至少一个大小标准具有小于约220个碱基对的碱基对大小。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准，其中所述大小标准中的每一个具有小于约220个碱基对的碱基对大小。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的一或多个等位基因的大小标准，其中至少11个Y-STR标志物包括DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。等位基因分型标准物可以进一步包括用于至少五个快速突变Y-STR标志物的至少一个等位基因的至少一个大小标准。等位基因分型标准物可以包括用于至少五个快速突变Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准。等位基因分型标准物可以包括用于至少五个快速突变Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准，其中所述至少五个快速突变Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。等位基因分型标准物可以包括用于至少五个快速突变Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准，其中所述至少五个快速突变Y-STR标志物进一步包括DYS518。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准，其中所述至少11个Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的一个以上等位基因中的每一个的大小标准，其中所述至少11个Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393和DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的至少一个等位基因的至少一个大小标准，其中所述至少一个大小标准经荧光标记。等位基因分型标准物可以包括用于至少11个Y-STR标志物的一或多个等位基因中的每一个的大小标准，其中用于至少11个Y-STR标志物中的每一个的一或多个等位基因的多个大小标准用五种在光谱上截然不同的荧光染料中的一种标记。等位基因分型标准物可以进一步包括用第六染料标记的大小标准，其中所述大小标准提供碱基对大小的度量。
样品.在一些实施例中，涵盖有待分析的目标核酸的样品来自以下各者中的一或多个：毛发、粪便、血液、组织、尿液、唾液、颊部细胞、阴道细胞、皮肤、骨骼、牙齿、面颊样品、含有胎盘细胞的羊水和含有胎儿细胞的羊水以及精液。在一些实施例中，所述样品可以源自犯罪现场、与犯罪现场相关的样品、取自嫌疑犯的样品、参考样品或取自在考虑之中的人的样品。在其它实施例中，样品可以是考古学样品、孕妇样品、父系样品、失踪人员样品。
方法.在一些实施例中，本传授内容涉及用于检测并鉴别目标核酸中的短串联重复(STR)序列的等位基因的方法。在一些实施例中，用于检测并鉴别STR序列的等位基因的方法包括通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基因座特异性寡核苷酸引物从目标核酸扩增至少一个短串联重复序列。在扩增之后，将扩增产物的所得经扩增的短串联重复序列与经扩增的等位基因分型标准物进行比较，从而基于样品的扩增产物与等位基因分型标准物内所发现的等位基因标准的匹配来判读等位基因。在一些实施例中，用于检测并鉴别短串联重复序列的等位基因的方法使用目标核酸的PCR扩增并且采用寡核苷酸引物对。所述方法包括适用于所提取的DNA的分析的工作流，其可以用于个案工作样品；以及直接扩增，其可以用于单一来源样品。
用于分析核酸的方法对本领域的技术人员来说是众所周知的，正如通过PCR进行扩增的方法。PCR扩增产物(即，扩增子)的分析包括(但不限于)对扩增产物进行检测、鉴别并且在一些情况下测序、沿用已久并且为本领域的技术人员所知的方法。在一些实施例中，用于检测并鉴别短串联重复序列的等位基因的方法涉及通过电泳比较经扩增的短串联重复扩增序列与对应的等位基因分型标准物。本领域的技术人员已知多种用于分离等位基因的电泳方法，并且所述电泳方法包括(但不限于)变性和非变性凝胶电泳、毛细管电泳等。用于对扩增产物进行测序的方法(例如桑格测序(Sanger sequencing))沿用已久并且为本领域的技术人员所知。
在本传授内容的一些实施例中，提供了以下方法：其中分析一或多个样品以测定样品中所存在的STR等位基因。在一些实施例中，所述方法包括从样品中分离核酸并且PCR扩增所述核酸以产生扩增产物。
然后将扩增产物与每个标志物包括一或多个等位基因的等位基因分型标准物混合物进行比较。本传授内容的各个实施例涉及所选择的Y-STR基因座的等位基因的新扩展组。本发明的实施例包括用于检测所选择的Y-STR基因座的这些新颖等位基因的等位基因分型标准物。
可以使用与DNA的后续扩增相容的样品制备的任何程序制备基因组DNA样品用于本发明传授内容的方法中。本领域的技术人员已知多种所述程序。一些实例是通过酚提取进行的DNA纯化(J.萨姆布鲁克(J.Sambrook)等人(1989),分子克隆实验指南,第二版,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约州,第9.14-9.19页)；和通过盐沉淀部分纯化(S.米勒(S.Miller)等人(1988),核酸研究(Nucl.Acids Res.)16:1215)；或chelex(PS沃尔什(PS Walsh)等人(1991),生物技术(BioTechniques)10:506-513；CT科米(CTComey)等人(1994),法医学杂志(J.Forensic Sci.)39:1254)；以及使用未处理血液释放未纯化物质(J.布尔克哈特(J.Burckhardt)(1994),PCR方法和应用(PCR Methods andApplications)3:239-243；RBE麦凯布(RBE McCabe)(1991),PCR方法和应用1:99-106；BY诺德瓦格(BY Nordvag)(1992),生物技术12:4第490-492页)。
在制备出基因组DNA样品之后，可以在本发明传授内容的多重扩增步骤中共扩增目标基因座。或者，含有基因组DNA的样品可以从在上面收集样品的衬底直接扩增，所述衬底包括(但不限于)纸张、织物或纤维衬底。
可以使用多种不同扩增方法中的任一种来扩增基因座，例如PCR(RK佐伯(RKSaiki)等人(1985),科学(Science)230:1350-1354)、基于转录的扩增(DY库沃(DYKwoh)和TJ库沃(1990),美国生物技术实验室(American Biotechnology Laboratory),1990年10月)以及链置换扩增(SDA)(GT沃克(GT Walker)等人(1992),美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.),89:392-396)。在本发明传授内容的一些实施例中，可以通过PCR实现多重扩增，其中使用对多重扩增中的每个基因座具有特异性的引物对，使DNA样品经历扩增。
标准PCR的化学组分一般包括溶剂、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(“dNTP”)、寡核苷酸引物、二价金属离子以及预计含有PCR扩增目标的DNA样品。一般可以使用水作为PCR溶剂，水通常包括缓冲剂和非缓冲盐，例如KCl。缓冲剂可以是本领域中已知的任何缓冲液，例如(但不限于)Tris-HCl，并且可以随着常规实验变化以优化PCR结果。本领域的普通技术人员能够容易地确定最佳缓冲条件。PCR缓冲液可以取决于用于扩增的特定酶进行优化。
二价金属离子通常可以有利于聚合酶有效地起作用。举例来说，镁离子允许某些DNA聚合酶有效地起作用。通常可以向反应缓冲液中添加MgCl2或MgSO4以供应最佳镁离子浓度。最佳PCR扩增所需的镁离子浓度可以取决于所用的特定引物集和模板。因此，通常凭经验确定用于获得最佳扩增所添加的镁盐的量，并且这是本领域中的例行实践。一般来说，用于最佳PCR的镁离子浓度可以在约1mM与约10mM之间变化。PCR中的镁离子浓度的典型范围可以是介于约1.0mM与约4.0mM之间，围绕中点约2.5mM变化。或者，可以使用二价离子锰，例如呈二氧化锰(MnO2)形式，滴定到适合于最佳聚合酶活性的浓度，容易使用标准实验室程序由本领域的技术人员确定。
dNTP是在扩增核酸分子的过程中所用的构造部分，通常可以按例如约40-200μM以下各者中的每一个的浓度供应于标准PCR中：脱氧腺苷三磷酸(“dATP”)、脱氧鸟苷三磷酸(“dGTP”)、脱氧胞苷三磷酸(“dCTP”)以及脱氧胸苷三磷酸(“dTTP”)。还可以使用其它dNTP，例如脱氧尿苷三磷酸(“dUTP”)、dNTP类似物(例如，肌苷)以及结合dNTP，并且如本文所用的术语“dNTP”涵盖所述dNTP。虽然以各自约40-200μM的浓度使用dNTP可以经受本传授内容的方法，但是各自高于约200μM的dNTP浓度会是有利的。因此，在这些传授内容的方法的一些实施例中，每个dNTP的浓度一般是至少约500μM并且可以是高达约2mM。在一些其它实施例中，每个dNTP的浓度可以介于约0.5mM到约1mM范围内。用于任何多重扩增的特定dNTP浓度可以取决于多重条件而变化，并且可以使用标准实验室程序，由本领域的技术人员凭经验确定。
在PCR中将核苷酸三磷酸聚合成扩增产物的酶可以是任何DNA聚合酶。DNA聚合酶可以是例如本领域中已知的任何抗热聚合酶。可以用于本传授内容中的一些聚合酶的实例是来自以下生物体的DNA聚合酶：例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus litoralis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)以及火球菌属(Pyrococcus sp.)。所述酶可以通过若干可能方法中的任一种获得；例如从来源细菌中分离、通过重组DNA技术产生或从商业来源购买。所述市售DNA聚合酶的一些实例包括AmpliTaqDNA聚合酶；AmpliTaqDNA聚合酶；DNA聚合酶；DNA聚合酶斯托菲尔片段(Stoffel Fragment)；rTth DNA聚合酶；以及rTth DNA聚合酶,XL(全都由应用生物系统公司,福斯特市,加利福尼亚州制造)。合适的聚合酶的其它实例包括Tne、来自嗜热脂肪芽孢杆菌的BstDNA聚合酶大片段、来自海滨嗜热球菌的Vent和Vent Exo-、来自海栖热袍菌的Tma、Deep Vent和Deep VentExo-以及来自火球菌属的Pfu，以及以上各者的突变体、变异体和衍生物。
在本传授内容的范围内，可以使用PCR的其它已知组分。所述组分的一些实例包括山梨糖醇、清洁剂(例如，特立通(Triton)X-100、诺尼迪特(Nonidet)P-40(NP-40)、吐温(Tween)-20)以及破坏核苷酸对的错配的试剂，例如二甲亚砜(DMSO)和氯化四甲铵(TMAC)和尿嘧啶N-糖基化酶，或起作用防止PCR的扩增子污染和/或防止在PCR程序开始之前，在PCR的培育或制备期间产生不希望的产物的其它试剂。
按照常规实验，可以改变PCR循环温度、循环次数和其持续时间以优化特定反应。本领域普通技术人员将认可以下内容作为确定PCR的各种参数的指导，并且还将认识到，一或多个条件的变体在本传授内容的范围内。确定PCR中以下三个阶段的温度和循环时间：变性、退火和延伸。变性、退火和延伸的一个轮回被称作“循环”。变性一般可以在高到足以允许DNA链分开，但不没有高到破坏聚合酶活性的温度下进行。一般来说，可以在反应中使用抗热聚合酶，其在高温下不变性但保持一定水平的活性。然而，如果在PCR的每个变性步骤之后得到补充，那么可以使用热不稳定聚合酶。通常，变性可以在高于约90℃并且低于约100℃下进行。在一些实施例中，变性可以在约94-95℃的温度下进行。DNA的变性一般可以进行至少约1到约30秒。在一些实施例中，变性可以进行约1到约15秒。在其它实施例中，变性可以进行长达约1分钟或更久。除了DNA的变性以外，对于一些聚合酶，例如AmpliTaq在变性温度下培育也可以用以活化所述酶。因此，当使用这些聚合酶时，使PCR的第一变性步骤久于后续变性步骤可以是有利的。
在退火阶段期间，寡核苷酸引物在其互补区域中退火到目标DNA并且在目标DNA已经结合到引物-模板双螺旋体之后，通过DNA聚合酶大大延伸。在常规PCR中，退火温度通常可以是在最不稳定的引物-模板双螺旋体的熔点(Tm)或低于所述熔点，其中Tm可以通过本领域的从业者众所周知的若干理论方法中的任一种估计。举例来说，可以通过以下公式确定Tm：
Tm＝(4℃×G和C碱基的数量)+(2℃×A和T碱基的数量)。
通常，在标准PCR中，退火温度可以是低于最不稳定的引物-模板双螺旋体的估计Tm约5-10℃。退火时间可以是介于约30秒与约2分钟之间。退火阶段通常接着延伸阶段。延伸可以进行足够量的时间以允许聚合酶完成引物延伸成恰当大小的扩增产物。
PCR中的循环次数(一个循环包括变性、退火和延伸)决定了扩增程度和后续扩增产物的量。PCR产生DNA分子的指数扩增。因此，理论上，在PCR的每个循环之后，前一循环中所存在的产物的数量翻倍，直到PCR试剂耗尽并且达到平稳段为止，在平稳段，不再产生扩增产物。通常，可以执行约20-30个PCR循环以到达这个平稳段。更通常，可以执行约25-30个循环，但是循环次数不受特定限制。所用循环次数可以取决于输入样品的性质。在一些情况下，所提取DNA样品可能需要30个循环，而直接扩增的DNA样品可能只需要26个循环。本领域的技术人员可以调整温度与时间间隔的循环次数和具体细节以便优化反应条件。
对于一些实施例，在上一个PCR循环的上一个阶段之后在某种温度下培育所述反应可以是有利的。在一些实施例中，可以选择延长延伸阶段。在其它实施例中，可以选择在低温(例如，约4℃)下培育。
可以使用各种方法来评估从多重反应获得的扩增产物的混合物中的经扩增等位基因产物，包括例如检测荧光标记产物、检测在每个延伸反应期间释放的离子(离子半导体测序)、检测在每个延伸反应期间的焦磷酸盐释放、检测放射性同位素标记产物、扩增产物的银染色或使用DNA嵌入剂染料，例如溴化乙锭(EtBr)和SYBR绿色花青染料使双链扩增产物可视化。适用于连接到适用于本传授内容的引物的荧光标记众多，可商购，并且是本领域中众所周知的。借由荧光分析，至少一种荧光标记引物可以用于扩增每个基因座。荧光检测可以是理想的，优于标记和产物检测的放射性方法，例如因为荧光检测不需要使用放射性材料，并且因此避免了伴随着放射性材料的使用的监管和安全性问题。还可以选择用经标记引物进行荧光检测，所述荧光检测优于其它非放射性检测方法，例如DNA嵌入剂和银染色，因为荧光检测方法一般展现出比银染色和DNA嵌入剂少的扩增假影。这部分由于以下事实：在荧光检测中只检测到上面连接有标记的DNA扩增链，而使用银染色和嵌入剂检测方法对每一个扩增产物的两条链均进行染色和检测，这导致了许多非特异性扩增假影的可视化。另外，存在与EtBr和SYBR的使用相关的潜在健康风险。EtBr是一种已知诱变剂；SYBR虽然是比EtBr弱的诱变剂，但是一般悬浮于DMSO中，DMSO会快速穿过皮肤。
荧光检测还可以适用于合成测序方法，其中每个核苷酸延伸反应释放出与四种天然核苷酸中的每一种可区分的荧光信号。本发明中没有内容会限制技术人员使用所述检测方法与本发明的引物和多重组以及本文中所述的方法。
然而，经扩增的等位基因的检测不限于荧光检测并且可以便利地通过焦磷酸测序或离子半导体测序技术检测。针对基因多样性和/或高突变率所选择的核心基因座以及附加基因座的选择使本文中所述的多重分析同样适用于那些检测方法。
所述组在本发明方法中的能力改善.第6组和第7组多重实验结果证明了如本文中所述设计和执行的多重分析组的灵敏度、稳固性以及辨别能力提高。如实例1和2中所示，第6组和第7组甚至在极低含量的输入DNA下，均提供了较高比例的完全Y-STR概况。实例3、4和5显示，关于在存在递增量的女性DNA的情况下递减量的男性DNA，第6组和第7组的引物集相对于市售组，允许更高比例的完全Y-STR概况。因此，第6组和第7组的引物相比于filer组提供针对男性DNA的更高特异性。实例6和7证明，第6组和第7组的引物集改善了整体颜色内峰平衡并且在输入样品中存在递增量的女性DNA的情况下也是如此。颜色内平衡定义在下文中，但表示引物用相同荧光染料标记的所有等位基因的稳固并且等效扩增的度量。这种度量是引物关于所要目标男性DNA的特异性对比与抑制剂或与女性DNA的杂交或结合的另一种标记。实例8、9和10证明，在存在不同浓度的PCR抑制剂(例如腐殖酸或血色素)的情况下，相比于用filer组所看到的扩增，用于第6组和第7组的引物集和化学物质提供了目标男性DNA的更显著稳固扩增。这些结果对于法医或犯罪现场样品来说特定重要。实例11示出了使用第6组或第7组的更稳固的颜色内平衡特征得到的改善结果可能性，以便鉴别混合男性输入DNA样品的次要男性贡献者。如实例13和15中所示，第7组证明，相比于其它市售多重Y-STR组，在父亲与儿子之间的区分能力增加。这种改善的区分能力(或者，在父亲与儿子之间的辨别能力)所提供的特异性地鉴别男性个体的可能性大于先前的可能性。这种改善的辨别也提供了更肯定地从考虑因素中排除男性个体作为犯罪、法医或其它取证现场中的潜在主导者的能力。实例14证明，使用第7组多重组分辨单体型的能力相对于使用filer有所增加，包括具有更大种族多样性的组，即在更多非欧洲谱系组中。因此，引物的多重组和其使用方法提供了出人意料地稳固、灵敏并且特异性的Y-STR概况结果。在法医学、人体识别和司法领域中急需这些改善。
提供一种用于扩增人类男性的Y-STR标志物的等位基因的方法，包括以下步骤：使疑似含有人类男性的DNA样品的样品与包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触；并且扩增所述样品，由此形成至少11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。所述方法可以进一步包括以下步骤：检测每个扩增子集，借此鉴别至少11个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，检测步骤是荧光检测步骤。在一些实施例中，检测步骤通过使用依赖于迁移率的分析分离多个扩增子集来执行，其中多个扩增子集经荧光标记。在其它实施例中，检测步骤不检测荧光。在实施例中，当检测步骤不检测荧光时，检测步骤可以包括离子半导体检测、焦磷酸盐释放检测或质谱检测。在所述方法的各种实施例中，扩增引物集可以进一步包括用于扩增至少5个Y-STR标志物的引物，其中所述引物可以被配置成用于提供至少5个Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在所述方法的各种实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约400个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在所述方法的各种实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在所述方法的各种实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在所述方法的一些实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么所述引物集可以包括用于扩增25个Y-STR标志物的引物。在一些实施例中，用于扩增25个Y-STR标志物的引物集包括至少两个双重拷贝标志物。在一些实施例中，扩增引物集可以用至少5种荧光染料中的一种标记。在一些其它实施例中，至少11个Y-STR标志物的每个扩增子集可以用至少5种荧光染料中的一种标记。在所述方法的各种实施例中，用于标记引物和/或扩增子的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。用于所述方法中的扩增引物集可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。在所述方法的一些实施例中，至少一个扩增子集可以包括迁移率调节剂。在所述方法的各种实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在所述方法的一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，所述方法包括用于扩增27个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集。
另一方面，提供一种用于扩增人类男性的Y-STR标志物的等位基因的方法，包括以下步骤：使疑似含有人类男性的DNA样品的样品与包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座；并且扩增所述样品，由此形成至少22个Y-STR标志物的多个扩增子集。在所述方法的一些实施例中，提供至少23个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在又其它实施例中，提供27个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座。在一些实施例中，所述27个Y-STR标志物包括2个具有有助于Y-STR标志物的总数的双重拷贝标志物的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在其它实施例中，至少23个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在又其它实施例中，27个Y-STR标志物中的至少11个的每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。在所述方法的各种实施例中，提供包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少6个是快速突变基因座。在所述方法的各种实施例中，提供包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少7个是快速突变基因座。所述方法可以进一步包括以下步骤：检测每个扩增子集，借此鉴别至少22个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，鉴别至少23个Y-STR标志物的等位基因。在又其它实施例中，鉴别27个Y-STR标志物的等位基因。在一些实施例中，检测步骤是荧光检测步骤。在一些实施例中，检测步骤通过使用依赖于迁移率的分析分离多个扩增子集来执行，其中多个扩增子集经荧光标记。在其它实施例中，检测步骤不检测荧光。在实施例中，当检测步骤不检测荧光时，检测步骤可以包括离子半导体检测、焦磷酸盐释放检测或质谱检测。在一些实施例中，含有具有小于约220个碱基对的碱基对大小的扩增子的至少11个Y-STR标志物是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物选自由以下组成的群组：DYF387S1ab、DYS449、DYS518、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物是6个快速突变Y-STR标志物。
一种男性个体鉴别的方法，包括以下步骤：使含有人类男性核酸的样品与包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触；并且扩增所述样品，由此形成至少11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小；并且检测每个扩增子集，借此鉴别男性个体的等位基因。在所述方法的各种实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，扩增至少11个Y-STR标志物的步骤可以包括扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在所述方法的一些实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，所述方法包括用于扩增超过11个Y-STR标志物的等位基因的扩增引物集。在其它实施例中，超过11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中所述多个扩增子集具有小于约410个碱基对的碱基对大小。在一些实施例中，检测步骤是荧光检测步骤。在一些实施例中，所述方法进一步包括以下步骤：比较针对第一男性个体所鉴别的等位基因与针对第二男性个体所鉴别的等位基因，借此使第一男性个体与第二男性个体可区分。在一些实施例中，第一男性个体具有与第二男性个体类似的父系遗传谱系。
试剂盒.在一些实施例中，本传授内容是针对用于分析来自核酸样品的短串联重复序列的试剂盒，其利用以上所述的方法。在一些实施例中，用于分析核酸样品中的短串联重复序列的试剂盒包括至少一个含有被配置成用于杂交到Y-STR标志物的引物集的容器。试剂盒可以包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集；以及任选地，大小标准。在一些实施例中，所述试剂盒可以进一步包括用于扩增至少5个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供至少5个Y-STR标志物的具有大于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。所述试剂盒可以包括25个Y-STR标志物的扩增引物集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在不同实施例中，当扩增引物集扩增超过11个Y-STR标志物时，那么扩增引物集可以被配置成用于提供超过11个Y-STR标志物的具有小于约420个碱基对的碱基对大小的所有扩增子集。在一些实施例中，所述试剂盒可以包括用至少5种荧光染料中的一种标记的扩增引物集。用于标记所述试剂盒的引物的至少5种荧光染料可以被配置成在光谱上截然不同的。所述试剂盒可以进一步包括至少一个包括迁移率调节剂的扩增引物。在一些实施例中，包括扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集的试剂盒可以扩增DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。在其它实施例中，包括扩增至少11个Y-STR标志物的扩增引物集的试剂盒可以扩增至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物，其中所述引物被配置成用于提供至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在其它实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物可以进一步包括DYS518。在一些实施例中，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集的试剂盒可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，包括用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物集的试剂盒可以是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。在一些实施例中，所述试剂盒包括大小标准。在不同实施例中，所述试剂盒进一步包括等位基因分型标准物。
另一方面，可以提供用于共扩增至少一个DNA样品的基因座集的试剂盒，包括用于扩增至少22个Y-STR标志物的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物中的至少5个是快速突变基因座；以及任选地，大小标准。在一些实施例中，所述大小标准是等位基因分型标准物。在一些实施例中，试剂盒的至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。在一些实施例中，至少5个快速突变Y-STR标志物包括DYS518。在一些实施例中，扩增引物集用至少5种荧光染料中的一种标记。用于扩增至少22个Y-STR标志物的试剂盒的扩增引物集可以被配置成用于提供Y-STR标志物的至少一个扩增子集，其中所述至少一个扩增子集包括迁移率调节剂。在一些实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。在其它实施例中，至少22个Y-STR标志物可以包括DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS518、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。
在一些实施例中，可以在本发明的试剂盒中以任何组合或选择包括以下各者：足够数量的用于扩增的酶、用于促进扩增的扩增缓冲液、用于促进酶活性的二价阳离子溶液、用于扩增期间的链延伸的dNTP、用于制备电泳用扩增材料的加载溶液、作为模板对照的基因组DNA、用于确保材料如预期般在分离介质中迁移的大小标志物以及用于培训用户并且限制使用错误的方案和手册。试剂盒中的各种试剂的量也可以取决于多种因素改变，例如最佳方法灵敏度。提供适用于手册应用的试验试剂盒或适用于自动化样品制备、反应装置、检测器或分析仪的试验试剂盒在这些传授内容的范围内。本领域的技术人员了解，所采用的检测技术一般不是限制性的。实际上，各种检测手段都在所公开的方法和试剂盒的范围内，其限制条件为它们允许有待测定的扩增子的存在或不存在。
虽然已经结合特定实施例描述了本发明的原理，但是应明确了解，这些描述仅仅是为了举例并且并不打算限制本发明的范围。已经出于说明和描述的目的提供了本文中已经公开的内容。这并不打算是穷尽性的或将所公开的内容限制为所述的精确形式。许多修改以及变化对于本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。选择并描述所公开的内容以便最佳地解释所述领域所公开的实施例的原理和实际应用，由此使得本领域的其它技术人员能够了解适合于所涵盖的特定用途的各个实施例和各种修改。公开内容的范围打算由以下权利要求书和其等效物限定。
可以根据以下实例来进一步理解本发明传授内容的方面，所述实例不应该理解为以任何方式限制本传授内容的范围。
实例
本领域的普通技术人员将了解，多种修改、替代方案和等效物是可能的。所有所述修改、替代方案和等效物都打算涵盖在本文中。
以下程序代表可以用于分离和扩增样品中的目标核酸并且检测、鉴别并分析Y染色体上的短串联重复序列的试剂和程序。
PCR分析装置和反应条件.
如上所述制备第1到7组的引物集并且在PCR反应中按以下扩增缓冲液(低EDTA缓冲液，含有10mM Tris-HCl，pH 8.0；和0.1mM EDTA，pH 8.0)中的经染料标记和未标记的引物：
通常使用1ng输入DNA。
添加10μL主混合物，其包括聚合酶。
添加5μL引物集。
通过以中速涡旋10秒充分混合。简单离心以从管的顶盖去除任何液体。
向每个反应孔或管中添加15μL PCR反应混合物。
使板或管以3000rpm离心约30秒以去除任何气泡，然后扩增。
使用以下顺序，在PCR系统9700热循环仪或96孔热循环仪中扩增26-30个循环：在95℃下保持1分钟；在94℃下变性4秒；在61℃下退火/延伸1分钟；在60℃下最后延伸10分钟；以及保持在4℃下进行储存或直到分析为止。使用引物集运行，根据PCR扩增试剂盒用户指南(零件编号4359513)制备并且扩增样品。
毛细管电泳样品制备和检测.通过本领域的技术人员应该已知的分辨扩增产物大小和/或序列差异的方法分析经扩增样品。举例来说，可以遵循仪器制造商的指导使用毛细管电泳。简单来说，针对有待分析的每个样品，混合0.5μL GeneScanTM-600LIZTM大小标准和9.5μL Hi-DiTM甲酰胺。将10.0μL甲酰胺/GeneScan-600LIZ溶液分配到光学96孔反应板的每个孔中，向所述板中添加PCR扩增样品或等位基因分型标准物的1.0μL等分试样并且遮盖所述板。对所述板进行简单离心以混合内容物并且在板的底部收集所述内容物。在95℃下加热所述板3分钟以使样品热变性并且然后通过放在冰上持续3分钟立刻骤冷。
毛细管电泳方法和分析.使用如在仪器的用户指南中所述的指定J6可变装仓模块，在当前应用生物系统公司仪器应用生物系统公司3500xl遗传分析仪上执行毛细管电泳(CE)。3500xl遗传分析仪的参数是：在1.2kV下样品注射24秒和在15kV下在性能优化聚合物(POP-4TM聚合物)中电泳1550秒，其中运行温度为60℃，如在HID36_POP4xl_G5_NT3200方案中所指出。仪器参数(例如注射条件)的变化在其它CE仪器(例如3500、3130xl或3130遗传分析仪)上是不同的。使用对不同仪器具有特异性的各个版本的应用生物系统公司数据收集软件收集数据，例如v.3.0用于3130xl和3500数据收集软件v.1.0，使用GeneMapper ID-X v1.2分析。
在仪器组装之后，根据制造商的指导，注射每种样品并且通过恰当软件分析，例如ID-X v1.2软件与标准分析设置。使用175RFU(相对荧光单位)的峰值振幅作为峰值检测阈。
实例1：灵敏度研究.使用第6组多重分析或多重分析比较递减目标男性DNA的影响，如图16中所示。DNA输入从1ng变到500pg、250pg、63pg和31pg，其中N＝6。Y filer多重分析在63pg开始遭受等位基因脱扣。虽然使用第6组多重分析存在一些损失，但是整体鉴别稳固性较高，因为第6组具有27个等位基因，对比的17个。使用第6组多重分析，在更低浓度的目标男性DNA下，更可靠的鉴别是可能的。
实例2：灵敏度研究.使用第7组多重分析或多重分析比较递减目标男性DNA的影响，如图17中所示。所示数据是从四个不同试验位点收集的，每个执行N-4个复制。DNA输入从1ng变到500pg、250pg、62.5pg和32.25pg。在每个多重分析的每个浓度下鉴别的等位基因的平均数用带交叉的圆圈符号指出。Y filer多重分析在63pg开始遭受等位基因脱扣。虽然使用第7组多重分析存在一些损失，但是整体鉴别稳固性较高，因为第7组具有27个等位基因，对比的17个。使用第7组多重分析，在更低浓度的目标男性DNA下，更可靠的鉴别是可能的。
实例3：使用第6组多重分析或多重分析比较使用男性/女性DNA混合物作为输入DNA的影响，如图18中所示。男性DNA输入减少(1ng、500pg、250pg、125pg、63pg到31pg)，存在500ng的恒定女性DNA输入，其中N＝6。第6组多重分析所回收的等位基因的百分比高于多重分析所回收的。甚至在31pg男性目标DNA下，仍然鉴别出第6组多重分析的超过70％的等位基因。
实例4：使用第7组多重分析或多重分析比较使用男性/女性DNA混合物作为输入DNA的影响，如图19中所示。数据显示了总共四个试验位点的结果，其中男性DNA输入从1ng减少到0.5ng(M007)，存在1μg的恒定女性DNA输入(F9947)，其中N＝3。关于第7组和多重分析两者，左图显示1ngM007/1μg F9947的结果并且右图显示0.5ng/1μg F9947的结果，其中每个多重分析的平均值用带交叉的圆圈显示。第7组多重分析所回收的等位基因的百分比高于多重分析所回收的。甚至在1:2000的男性:女性比下，仍然鉴别出第7组多重分析的所有等位基因。
实例5：使用第6组多重分析或多重分析比较使用男性/女性DNA混合物作为输入DNA的影响，如图20中所示。男性目标DNA输入保持恒定在500pg，女性DNA从500ng增加到1μg、增加到2μg，其中N＝6。在最高浓度的女性DNA，在第6组多重分析中鉴别出超过90％的等位基因，然而在多重分析中鉴别出小于60％的等位基因。
实例6：使用第6组多重分析或多重分析比较男性/女性混合物中的颜色内平衡，如图21中所示。男性目标DNA输入保持恒定(500pg)并且女性DNA浓度从0.0ng变到500ng，五个染料泳道中的每一个含有多重分析的等位基因，其中N＝6。通过用颜色内的最低峰值高度除以最高峰值高度来计算颜色内峰值平衡(ICB)，即用相同荧光团标记并且可在相同波长区域中检测的所有标志物。ICB值1应该意指用相同荧光团标记的所有等位基因具有完全均匀的峰值高度，并且ICB比朝向值1的任何改善都可以在鉴别特定等位基因的存在方面提供更高准确性。如图21中所示，第6组多重分析受女性DNA的存在的影响显著小于多重分析，ICB值始终大于约0.50。另外，所有五个染料泳道的彼此表现相似性大于多重分析。
实例7：使用第7组多重分析或多重分析比较男性/女性混合物中的颜色内平衡，如图22中所示。关于第7组多重分析的含有来自总共4个试验位点的等位基因的五个染料泳道(●、■、◇、▲和)中的每一个，每个N＝3，两个组的图的左侧表示：在第一栏中，1ng男性目标DNA M007和1μg女性DNA F9947(1:1000M:F)；并且在第二栏中，500pg男性目标DNA M007和1μg女性DNA F9947(1:2000M:F)。关于多重分析的含有来自总共4个试验位点的等位基因的四个染料泳道(●、■、◇和▲)中的每一个，每个N＝3，两个组的图的右侧表示：在第一栏中，1ng男性目标DNA M007和1μg女性DNA F9947(1:1000M:F)；并且在第2栏中，500pg男性目标DNA M007和1μg女性DNA F9947(1:2000M:F)。颜色内峰值平衡(ICB)如实例6中所述进行计算和定义。如图22中所示，第6组多重分析受女性DNA的存在的影响显著小于多重分析。
实例8：使用第6组多重分析或多重分析比较在存在PCR抑制剂腐殖酸的情况下等位基因的回收，如图23中所示。男性目标DNA输入保持恒定在500pg，并且腐殖酸的浓度从0.0ng/μl增加到12.5ng/μl、25ng/μl和100ng/μl，使用N＝6。随着腐殖酸的浓度升高到12.5ng/μl或更高，使用多重分析进行的等位基因的回收受到严重抑制。第6组多重分析的使用允许甚至在最高浓度的腐殖酸下，在扩增反应中回收几乎80％的等位基因。
实例9：使用第6组多重分析或多重分析比较在存在PCR抑制剂血色素的情况下等位基因的回收，如图24中所示。男性目标DNA输入保持恒定在500pg，并且血色素的浓度从0.0μM增加到15μM、30μM和120μM，使用N＝6。随着血色素的浓度升高到30μM或更高，使用多重分析进行的等位基因的回收被完全阻断。第6组多重分析的使用允许甚至在最高浓度的血色素下，在扩增反应中回收所有等位基因。
实例10：使用第7组多重分析或多重分析比较在存在PCR抑制剂血色素的情况下或在存在腐殖酸的情况下等位基因的回收，如图25中所示。男性目标DNA输入保持恒定在1ng，并且存在20μM血色素(第1栏)；存在180μM血色素(第2栏)；存在10ng/μl腐殖酸(第3栏)；或存在80ng/μl腐殖酸(第4栏)，数据来自总共四个试验位点，每个使用N＝4。随着血色素的浓度升高到180μM或更高，使用多重分析进行的等位基因的回收被完全阻断。第7组多重分析的使用允许甚至在最高浓度的血色素下，在扩增反应中回收所有等位基因。在80ng/ul的腐殖酸浓度下，使用多重分析进行的等位基因的回收被完全阻断，然而使用第7组多重分析则允许完全回收。图26显示这份数据的五个染料泳道(圆圈、正方形、菱形、▲和)中的每一个的颜色内平衡。如关于两种不同浓度的血色素和腐殖酸中的每一个分别可以看出，第7组多重分析的使用提供所有染料泳道中更一致的结果。
实例11：鉴别2个男性贡献者目标DNA样品的混合物中的次要男性贡献者的能力示出在图27中。437pg:63pg主要:次要贡献者的8:1比示出在所示电泳图的区段中。上部轨迹显示混合物，其中箭头指向属于次要男性贡献者的等位基因。将它与图27的下图中所示的次要男性贡献者概况进行比较，所述下图是在不存在任何其它男性DNA样品的情况下获得的。由第6组或第7组中所用的引物提供的改善的颜色内平衡得到了等位基因范围内峰值高度的改善的均匀性，由此允许改善次要贡献者等位基因的鉴别。
实例12：直接扩增.针对多重组7的引物用于直接扩增未经处理的生物样品。样品类型是在FTA纸上收集的血液(n＝3)；在FTA纸上的面颊样品(n＝3)；以及抹拭溶解产物(3种不同抹拭材料，全都在收集之后老化约6个月到约1年)。用于第7组中且同时也存在于第6组中的基因座的引物具有相同序列，并且因此具有等效性能。用于扩增的主混合物被调适成用于普遍应用。图28示出了三个不同样品/衬底类型的复制品中的每一个的颜色内平衡的比较。结果显示，在用于直接扩增的所有三个样品/衬底类型中获得了大于0.40的最低限度地需要的信号阈值。图29示出了FTA样品上的一种血液的所得Y-STR概况的电泳图。关于每个颜色组，满刻度是10,000Rfu。示出了用直接扩增方法获得了完整并且明确的概况。
实例13.父子研究.使用第7组、和另一种市售试剂盒(试剂盒B)的多重分析研究五十三对父子。在表4中，呈现了结果。鉴别多种突变，其中总和示出在第2栏中，并且突变的位置示出在第1栏中。表中的空单元格表示因为标志物不是所述组的一部分，所以没有鉴别到突变。突变/试剂盒的总数表示每个试剂盒整体所鉴别到的突变数量。可以看出，总的来说，多重分析可以鉴别4个突变；试剂盒B可以鉴别5个突变，并且第7组鉴别10个突变。这种较大分辨率允许对具有相同遗传谱系的男性的更精细辨别，尽管缺乏重组，但这仍然可以提供随机突变。
表4.关于每个多重组在53对父子中发现的突变.
e.这个标志物是快速突变Y-STR标志物。
实例14.不同遗传背景的男性样品的辨别.使用和第7组多重分析评估来自各种遗传背景的超过700份男性样品。结果示出在表5a中。虽然鉴别了广泛范围的种族背景内大比例的个体；但是第7组可以鉴别更大百分比，尤其是在非高加索人组中。
表5a.不同遗传背景的男性样品的辨别.
*已去除的可能有亲缘关系的个体
用对男性样品的其它筛选鉴别出15个相同单体型的集合。这些相同单体型包括来自表5a的可能有亲缘关系的个体，用第7组多重分析再评估并且结果示出在表5b中。可以分辨15个相同单体型中的七个。15个相同单体型中的四个可能有亲缘关系；更难以分辨所述单体型。相同单体型中的三个不能使用第7组分辨，尽管所述个体可能没有亲缘关系。然而，第7组多重分析可以提高成功分辨个体单体型的比率，包括种族多样性大于先前在市售多重组中所见的那些。
表5b.相同单体型的辨别.
实例15.父子研究.使用第7组多重分析和多重分析两者研究了九十五对父子。在这九十五对中，相比于可以使用多重分析区分的6对(6.3％)，可以用第7组多重分析分离九对(9.5％)。表6示出了具有可检测突变的特定标志物。
表6.
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Claims (25)

1.一种扩增引物集，包含用于扩增至少11个Y-STR标志物的引物，其中所述引物集被配置成用于提供所述至少11个Y-STR标志物的具有小于约220个碱基对的碱基对大小的每个扩增子集。
2.根据权利要求1所述的扩增引物集，其中扩增子碱基对大小的检测通过依赖于迁移率的分析技术来执行。
3.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，其中所述依赖于迁移率的分析技术是毛细管电泳。
4.根据权利要求1所述的扩增引物集，其中所述扩增子碱基对大小的检测通过测序技术来执行，不使用荧光染料标记的检测。
5.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，进一步包含用于扩增超过11个Y-STR标志物的引物，其中所述引物被配置成用于提供所述超过11个Y-STR标志物的具有小于约410个碱基对的碱基对大小的扩增子集。
6.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，包含25个Y-STR标志物。
7.根据权利要求1到3和5到6中任一项所述的扩增引物集，其中所述至少11个Y-STR标志物的每个扩增子集用至少5种染料中的一种标记。
8.根据权利要求7所述的扩增引物集，其中所述至少5种染料是被配置成在光谱上截然不同的荧光染料。
9.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，其中所述Y-STR标志物的至少一个扩增子集包含迁移率调节剂。
10.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，其中所述至少11个Y-STR标志物是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。
11.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，进一步包含至少5个作为快速突变基因座的Y-STR标志物。
12.根据权利要求11所述的扩增引物集，其中所述至少5个快速突变Y-STR标志物包含DYF387S1ab、DYS449、DYS570、DYS576和DYS627。
13.根据权利要求12所述的扩增引物集，其中所述至少5个快速突变Y-STR标志物进一步包含DYS518。
14.根据前述权利要求中任一项所述的扩增引物集，其中用于扩增至少11个Y-STR标志物的所述引物集是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。
15.根据权利要求1到13中任一项所述的扩增引物集，其中用于扩增至少11个Y-STR标志物的所述引物集是用于扩增以下各者的引物集：DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。
16.一种用于共扩增至少一个DNA样品的基因座集的试剂盒，包含：
a)根据前述权利要求中任一项所述的引物；以及
b)任选地，大小标准。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述大小标准包含等位基因分型标准物。
18.一种扩增人类男性的Y-STR标志物的等位基因的方法，包含以下步骤：
使疑似含有人类男性的DNA样品的样品与包含用于扩增至少11个Y-STR标志物的等位基因的引物的扩增引物集接触；并且
扩增所述样品，由此形成所述至少11个Y-STR标志物的多个扩增子集，其中每个扩增子集具有小于约220个碱基对的碱基对大小。
19.根据权利要求18所述的方法，进一步包含以下步骤：检测每个扩增子集，借此鉴别所述至少11个Y-STR标志物的所述等位基因。
20.根据权利要求18和19中任一项所述的方法，其中所述检测通过使用依赖于迁移率的分析分离所述多个扩增子集来执行，其中所述多个扩增子集经荧光标记。
21.根据权利要求18到20中任一项所述的方法，其中所述至少11个Y-STR标志物是DYS576、DYS389I、DYS460、DYS458、DYS19、DYS456、DYS390、DYS570、DYS437、DYS393和DYS439。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述扩增引物集包含用于扩增27个Y-STR标志物的等位基因的引物。
23.根据权利要求18到21中任一项所述的方法，其中所述引物是根据权利要求1到3和5到15中任一项所述的引物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述27个Y-STR标志物是DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS518、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635和Y-GATA-H4。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述27个Y-STR标志物是DYF387S1ab、DYS19、DYS385ab、DYS389I、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS392、DYS393、DYS460、DYS437、DYS438、DYS439、DYS448、DYS449、DYS456、DYS458、DYS481、DYS533、DYS570、DYS576、DYS627、DYS635、DYS643和Y-GATA-H4。
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