CN111454945B - 利用扩增产物进行法医序列多态str分型的方法及引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了利用扩增产物进行法医序列多态STR分型的方法及引物组合。本发明提供了引物组合，由30种引物组成：依次如序列表的序列1至序列30所示。本发明还保护所述引物组合在制备法医鉴定试剂盒中的应用。本发明还保护一种法医鉴定试剂盒，包括所述引物组合。本发明选择了法医常用的STR基因座中具有序列多态性的13个基因座，进一步优化选择了特定引物组合，可以实现有效的多重扩增。从而本发明可以使用以往被废弃的荧光标记STR复合扩增产物作为PCR模板，进行二代测序STR分型解析，实现了“零检材”，实现了新技术(NGS)与旧技术(CE)的衔接，使其能够更好地应用于法庭科学领域。

Description

利用扩增产物进行法医序列多态STR分型的方法及引物组合
技术领域
本发明属于法医鉴定领域，具体涉及利用扩增产物进行法医序列多态STR分型的方法及引物组合。
背景技术
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)分型技术是当前法医DNA领域的主流技术。在国际上，美国、英国、德国、法国、荷兰等全球数十个国家已经先后建立基于STR遗传标记的法庭科学DNA数据库。STR分型技术广泛服务于刑事案件侦查举证、打击拐卖妇女儿童、灾害遇难者及失踪人员身份认定等领域，在个体识别和亲缘关系鉴定中发挥着重要的作用。
传统基于毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)平台的STR分型技术仅关注STR片段的长度多态信息。二代测序(Next Generation Sequencing,NGS)STR分型技术可在获得长度多态信息的同时，进一步解析STR序列多态信息，实现犯罪嫌疑人精准个体识别，是对毛细管电泳技术的提升和有效补充。当前，法医二代测序STR分型策略均以基因组DNA为实验材料，但实际工作中，案件检材DNA可能被用于多次优化毛细管电泳STR分型实验条件、增加Y-STR基因座检验、线粒体DNA测序等等，导致基因组DNA检材消耗殆尽，没有基因组DNA可用来进一步挖掘STR序列多态信息，二代测序STR分型技术无用武之地。
发明内容
本发明的目的是提供利用扩增产物进行法医序列多态STR分型的方法及引物组合。
本发明提供了引物组合，由如下30种引物组成：
引物D18S51-F，序列表的序列1所示的单链DNA分子；
引物D18S51-R，序列表的序列2所示的单链DNA分子；
引物D2S1338-F，序列表的序列3所示的单链DNA分子；
引物D2S1338-R，序列表的序列4所示的单链DNA分子；
引物D2S441-F，序列表的序列5所示的单链DNA分子；
引物D2S441-R，序列表的序列6所示的单链DNA分子；
引物D3S1358-F，序列表的序列7所示的单链DNA分子；
引物D3S1358-R，序列表的序列8所示的单链DNA分子；
引物D8S1179-F，序列表的序列9所示的单链DNA分子；
引物D8S1179-R，序列表的序列10所示的单链DNA分子；
引物D12S391-F，序列表的序列11所示的单链DNA分子；
引物D12S391-R，序列表的序列12所示的单链DNA分子；
引物D19S433-F，序列表的序列13所示的单链DNA分子；
引物D19S433-R，序列表的序列14所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-F，序列表的序列15所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-R1，序列表的序列16所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-R2，序列表的序列17所示的单链DNA分子；
引物D21S11-F，序列表的序列18所示的单链DNA分子；
引物D21S11-R，序列表的序列19所示的单链DNA分子；
引物D6S1043-F，序列表的序列20所示的单链DNA分子；
引物D6S1043-R，序列表的序列21所示的单链DNA分子；
引物D7S820-F，序列表的序列22所示的单链DNA分子；
引物D7S820-R1，序列表的序列23所示的单链DNA分子；
引物D7S820-R2，序列表的序列24所示的单链DNA分子；
引物FGA-F，序列表的序列25所示的单链DNA分子；
引物FGA-R1，序列表的序列26所示的单链DNA分子；
引物FGA-R2，序列表的序列27所示的单链DNA分子；
引物vWA-F1，序列表的序列28所示的单链DNA分子；
引物vWA-F2，序列表的序列29所示的单链DNA分子；
引物vWA-R，序列表的序列30所示的单链DNA分子。
所述引物组合中，按照引物顺序，各个引物的摩尔配比依次如下：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.05：0.05：0.05：0.05：0.1。
本发明还保护以上任一所述引物组合在制备法医鉴定试剂盒中的应用。
本发明还保护一种法医鉴定试剂盒，包括以上任一所述引物组合。所述法医鉴定试剂盒还包括组件甲和组件乙。所述组件甲为基于毛细管电泳的STR分型试剂或试剂盒。所述组件乙为基于二代测序的STR分型试剂或试剂盒。
本发明还保护以上任一所述引物组合在制备用于鉴定13个STR基因座的试剂盒中的应用；所述13个基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。所述鉴定13个STR基因座为鉴定13个人STR基因座。
本发明还保护一种用于鉴定13个STR基因座的试剂盒，包括以上任一所述引物组合；所述13个基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。所述鉴定13个STR基因座为鉴定13个人STR基因座。所述用于鉴定13个STR基因座的试剂盒还包括组件甲和组件乙。所述组件甲为基于毛细管电泳的STR分型试剂或试剂盒。所述组件乙为基于二代测序的STR分型试剂或试剂盒。
本发明还保护以上任一所述引物组合在法医鉴定中的应用。
本发明还保护一种法医鉴定方法，包括如下步骤：进行多重PCR扩增，然后进行基于二代测序的STR分型；
所述多重PCR扩增采用以上任一所述引物组合；
所述多重PCR扩增采用的模板为法医样本进行基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物的残余物。由于基于毛细管电泳的STR分型时借助荧光标记，基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物为荧光标记STR复合扩增产物。
本发明还保护以上任一所述引物组合在鉴定13个STR基因座中的应用；所述13个基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。所述鉴定13个STR基因座为鉴定13个人STR基因座。
本发明还保护一种鉴定13个STR基因座的方法，包括如下步骤：进行多重PCR扩增，然后进行基于二代测序的STR分型；
所述多重PCR扩增采用以上任一所述引物组合；
所述多重PCR扩增采用的模板为法医样本进行基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物的残余物。由于基于毛细管电泳的STR分型时借助荧光标记，基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物为荧光标记STR复合扩增产物。
所述鉴定13个STR基因座为鉴定13个人STR基因座。
以上任一所述方法中，所述多重PCR扩增的反应体系中，各个引物的浓度如下：
D18S51-F的浓度为0.1μM，D18S51-R的浓度为0.1μM，D2S1338-F的浓度为0.1μM，D2S1338-R的浓度为0.1μM，D2S441-F的浓度为0.1μM，D2S441-R的浓度为0.1μM，D3S1358-F的浓度为0.1μM，D3S1358-R的浓度为0.1μM，D8S1179-F的浓度为0.1μM，D8S1179-R的浓度为0.1μM，D12S391-F的浓度为0.1μM，D12S391-R的浓度为0.1μM，D19S433-F的浓度为0.1μM，D19S433-R的浓度为0.1μM，D1S1656-F的浓度为0.1μM，D1S1656-R1的浓度为0.05μM，D1S1656-R2的浓度为0.05μM，D21S11-F的浓度为0.1μM，D21S11-R的浓度为0.1μM，D6S1043-F的浓度为0.1μM，D6S1043-R的浓度为0.1μM，D7S820-F的浓度为0.1μM，D7S820-R1的浓度为0.05μM，D7S820-R2的浓度为0.05μM，FGA-F的浓度为0.1μM，FGA-R1的浓度为0.05μM，FGA-R2的浓度为0.05μM，vWA-F1的浓度为0.05μM，vWA-F2的浓度为0.05μM，vWA-R的浓度为0.1μM。
示例性的，以上任一所述基于毛细管电泳的STR分型采用Globalfiler试剂盒、PowerPlex21系统或Identifiler Plus试剂盒。
示例性的，以上任一所述组件甲可为Globalfiler试剂盒、PowerPlex21系统或Identifiler Plus试剂盒。
示例性的，以上任一所述基于二代测序的STR分型采用组件丙和组件丁；所述组件丙为建库试剂或试剂盒；所述组件丁为测序试剂或试剂盒。
示例性的，以上任一所述组件乙包括组件丙和组件丁；所述组件丙为建库试剂或试剂盒；所述组件丁为测序试剂或试剂盒。
示例性的，所述组件丙为TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit。
示例性的，所述组件丁为Miseq Reagent Micro Kit v2。
以上任一所述方法用于非疾病诊断与治疗。
以上任一所述应用用于非疾病诊断与治疗。
目前市场上常用的基于毛细管电泳的STR分型试剂盒较多，各试剂盒中相同基因座覆盖的扩增子范围差异很大。为了尽可能提高利用扩增产物进行STR分型方法的通用性，使其可利用各款毛细管电泳STR分型试剂盒的扩增产物，应将本发明的扩增子设计得尽量小，即引物设计区紧贴STR基因座的核心重复序列或尽可能少覆盖额外的侧翼序列。在此前提下，还须确保所选择的多个基因座可以实现复合扩增。因此，本发明技术难度很大。
本发明的一个创新点在于：基因座的选择、引物设计策略的制定以及复合扩增的实现。本发明以毛细管电泳技术检测的扩增产物为模板，所以选择基于毛细管电泳的各款STR试剂盒中经常出现的基因座(如果引入过多毛细管电泳试剂盒不覆盖的基因座，只会浪费实验成本，无法获得数据)。另外，并不是所有STR基因座都具有显著的序列多态性，如果引入不具有序列多态性的STR基因座，则这部分基因座数据不会提供新信息，只能重复毛细管电泳分型结果，也不具有应用价值，还可能干扰该实验体系中有效基因座的分型效果。最终本发明的发明人选择了法医常用的STR基因座中具有序列多态性的13个基因座。
本发明的另一个创新点在于：使用以往被废弃的荧光标记STR复合扩增产物作为模板，采用本发明的引物组合进行多重PCR扩增后进行二代测序STR分型解析，实现了“零检材”，实现了新技术(NGS)与旧技术(CE)的衔接，借助CE平台的广泛普及度，将二代测序技术的优势有效推广，使其能够更好地应用于法庭科学领域。
本发明具有如下优点：(1)打破一、二代STR分型技术之间的隔阂，使一、二代STR分型技术形成有效的联系；(2)针对性强，利用一代扩增产物作为模板，而不是传统引物体系所利用的基因组DNA，具有极高的针对性，同时也避免了利用整个基因组进行扩增时可能会带来的干扰；(3)摆脱检材的限制，本复合扩增体系不需要使用样本作为检材，这对于极端条件下，例如毛细管电泳实验已经将检材DNA耗尽，或者检材保存不当而降解严重等情况，这时传统二代复合扩增体系无法利用并对其进行建库及测序，此时本发明的复合扩增体系更能体现其特有的极高的应用价值，更能凸显其重要性。
附图说明
图1为实施例2的步骤四中各STR位点测序深度占比图(采用PowerPlex21系统时)。
图2为对比例1的步骤一中各STR位点测序深度占比图。
图3为实施例2的步骤四中各STR位点测序深度占比图(采用Globalfiler试剂盒时)。
图4为对比例1的步骤二中各STR位点测序深度占比图。
图5为实施例2的步骤四中各STR位点测序深度占比图(采用Identifiler Plus试剂盒时)。
图6为对比例1的步骤三中各STR位点测序深度占比图。
图7为对比例2中各STR位点测序深度占比图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。A-STR基因座即常染色体基因座。
实施例1、引物组合的设计和制备
进行大量位点筛选，过滤掉核心区为单基序位点的同时保证最大限度覆盖尽量多的一代检测试剂盒中的位点，并且兼顾二代测序的特点，针对性找出具有序列多态性的位点，为案件侦破提供线索，过滤掉暂未发现有序列多态性的位点，以减少引物之间不必要的干扰的同时也减小后续对数据处理的难度。最终，筛选出13个含有多种基序的STR位点。
基于13个STR位点设计引物组，通过大量预实验和效果验证，获得了引物组合。引物组合由13个引物组组成(共计30条引物)，用于检测13个A-STR基因座。各个引物组的引物序列信息及其检测的A-STR基因座信息以及等位基因基因型的范围见表1。13个引物组均满足如下条件：扩增子长度特别小，扩增子除核心序列及引物外，几乎不含其它额外序列，与传统的二代扩增体系相比都大为减小，与一代扩增体系相比更是减小很多，极小的扩增子也意味着着其广泛的适用性，能够用于扩增多种一代试剂盒的扩增子。在hg38人类参考基因组(hg38人类基因组的信息见网址http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/bigZips/hg38.2bit)中，各个引物组的扩增子长度以及扩增子序列见表2。
表1
Figure BDA0002448033140000051
Figure BDA0002448033140000061
表2
Figure BDA0002448033140000062
实施例2、方法的建立
供试样本：标准品DNA 2800M，Promega公司的产品，产品目录号为DD7101。
一代STR分型试剂盒分别为：Globalfiler试剂盒、PowerPlex21系统或Identifiler Plus试剂盒。Globalfiler试剂盒，全称为GlobalFilerTM PCR AmplificationKit，Thermo Fisher公司，产品目录号为4476135。PowerPlex21系统，全称为
Figure BDA0002448033140000071
21系统，Promega公司，产品目录号为DC8902。Identifiler Plus试剂盒，全称为
Figure BDA0002448033140000072
Plus PCR Amplification Kit，Thermo Fisher公司，产品目录号为A26364。
一、基于毛细管电泳的STR分型
取1ng供试样本，采用一代STR分型试剂盒进行扩增(按说明书操作，得到一代STR分型的各个基因座的基因型分型结果，采用Globalfiler试剂盒时结果见表3，采用PowerPlex21系统时结果见表4，采用Identifiler Plus试剂盒时结果见表5)，扩增产物用水稀释至十倍体积，得到产物溶液。
二、多重PCR扩增
反应体系为20μL，其中含2μL步骤一得到的产物溶液、1U TaqDNA polymerase和引物混合物。反应体系中的其它组分及其在反应体系中的浓度为：20mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、1.6mM MgCl2、0.8mg/ml牛血清白蛋白、0.2％(体积比)Tween-20、3.2％(体积比)甘油、0.02g/100ml NaN3、200mM dNTP。反应体系中，余量为水。引物混合物提供的有效成分为表1中的30种引物。反应体系中，D18S51-F的浓度为0.1μM，D18S51-R的浓度为0.1μM，D2S1338-F的浓度为0.1μM，D2S1338-R的浓度为0.1μM，D2S441-F的浓度为0.1μM，D2S441-R的浓度为0.1μM，D3S1358-F的浓度为0.1μM，D3S1358-R的浓度为0.1μM，D8S1179-F的浓度为0.1μM，D8S1179-R的浓度为0.1μM，D12S391-F的浓度为0.1μM，D12S391-R的浓度为0.1μM，D19S433-F的浓度为0.1μM，D19S433-R的浓度为0.1μM，D1S1656-F的浓度为0.1μM，D1S1656-R1的浓度为0.05μM，D1S1656-R2的浓度为0.05μM，D21S11-F的浓度为0.1μM，D21S11-R的浓度为0.1μM，D6S1043-F的浓度为0.1μM，D6S1043-R的浓度为0.1μM，D7S820-F的浓度为0.1μM，D7S820-R1的浓度为0.05μM，D7S820-R2的浓度为0.05μM，FGA-F的浓度为0.1μM，FGA-R1的浓度为0.05μM，FGA-R2的浓度为0.05μM，vWA-F1的浓度为0.05μM，vWA-F2的浓度为0.05μM，vWA-R的浓度为0.1μM。
反应程序：95℃11min；94℃30s、60℃2min、72℃1min，20个循环；60℃60min；4℃保存。
三、回收多重PCR扩增的产物
取步骤二的产物，采用MinElute PCR Purification Kit并按说明书(QIAGEN公司，产品目录号为28004)操作，得到纯化产物。
取纯化产物，采用Qubit dsDNA HS Assay kit进行定量。
四、基于二代测序的STR分型
1、文库制备
(1)取步骤三的纯化产物，采用TruSeq DNA PCR-Free HT Library Prep Kit并按说明书(illumina公司，产品目录号为20015693&20015949)操作，进行文库制备。文库制备的过程依次包括：末端修复、末端修复产物纯化、连接A-tail、连接Adapter以及连接产物的纯化。
(2)取步骤(1)的产物，采用KAPA Library Quantification Kit(Roche公司，产品目录号为KK4824)进行文库定量，然后进行文库均一化，得到文库溶液。
2、测序
取步骤1得到的文库溶液，进行变性及混合，采用测序试剂Miseq Reagent MicroKit v2(Illumina公司，产品目录号为MS-103-1002)在Illumina公司MiSeq FGx二代测序仪(MiSeq FGx Forensic Genomics System)进行测序。
3、数据处理
对步骤2得到的原始测序结果进行处理分析，具体为：测序得到样本Fastq文件，使用STRait Razor v3分析软件进行数据分析，测序深度阈值设置为50X，对分析结果进行整理，得到各STR位点等位基因的长度及序列信息(即二代STR分型的各个基因座的基因型分型结果)。
采用Globalfiler试剂盒时，结果见表3。采用PowerPlex21系统时，结果见表4。采用Identifiler Plus试剂盒时，结果见表5。二代STR分型与一代STR分型的结果完全一致，并且二代STR分型进一步得到了序列结果。
表3
Figure BDA0002448033140000081
表4
Figure BDA0002448033140000082
Figure BDA0002448033140000091
表5
Figure BDA0002448033140000092
注：“×”代表对应的一代试剂盒内不包含该位点，“——”代表测序结果没有数据。
采用PowerPlex21系统时，进行上述步骤后，各STR位点测序深度占比图见图1。
采用Globalfiler试剂盒时，进行上述步骤后，各STR位点测序深度占比图见图3。
采用Identifiler Plus试剂盒时，进行上述步骤后，各STR位点测序深度占比图见图5。
五、二代测序的结果验证
取1ng供试样本，采用Precision ID GlobalFilerTM NGS STR Panel(ThermoFisher公司，产品目录号为A30939)扩增，然后采用Precision ID Library Kit(ThermoFisher公司，产品目录号为A26435)建库，最终在Ion PGMTM二代测序平台进行测序。结果与表3、表4和表5的二代STR分型结果完全吻合。
对比例1、
虽然目前市场上及各个实验室内存在的基于二代测序平台的复合扩增体系较多，但是没有一种能够实现致力于联系一、二代STR分型技术，利用一代的扩增产物作为模板来完成二代测序。而在实际应用过程中，经常遇到检材量过少而在一代STR分型过程中被耗尽的情形，从而无法使用二代测序平台进行实现对检材的进一步的信息发掘。因此，本发明实现零检材，使用以往废弃的一代扩增产物来实现二代测序来进一步发掘其信息，这是对现有测序手段的重要补充，也体现了本发明的必要性。
一、为了验证不采用本发明的引物组合进行多重扩增能否实现相同的目的，以实施例2的步骤一中采用PowerPlex21系统得到的产物溶液为模板，采用Precision IDGlobalFilerTMNGS STR Panel(Thermo Fisher公司，产品目录号为A30939)扩增，然后采用Precision ID Library Kit(Thermo Fisher公司，产品目录号为A26435)建库，最终在IonPGMTM二代测序平台进行测序。
各STR位点测序深度占比图见图2。
实施例2中采用PowerPlex21系统时的检测结果和对比例1的步骤一检测结果的对比见表6。
表6
实施例2 对比例1 实施例2 对比例1
D2S1338 D2S1338 —— CSF1PO
D12S391 D12S391 —— AMEL
D19S433 D19S433 —— D13S317
D1S1656 D1S1656 —— D5S818
D21S11 D21S11 —— TPOX
D6S1043 D6S1043
D7S820 D7S820
FGA FGA
vWA vWA
D18S51 ——
D3S1358 ——
D8S1179 ——
D2S441 ——
注：“——”表示该位点无数据。
由表6可见，对比例的结果数据中，除位点D2S441因不被PowerPlex21系统所包含外，本发明所含13个位点仅仅得到9个位点的数据，还有D18S51、D3S1358、D8S1179这3个位点没能得到测序数据和结果。另外对比例额外得到的CSF1PO、AMEL、D13S317、D5S818、TPOX五个STR位点，因为暂未发现其在序列上有明显的多态性，无法体现出二代测序技术的优势，在实际应用中无法提供更多的可用信息，只能重复毛细管电泳分型结果，这也是为何本发明在现有的近百个常用STR位点中只筛选了现在的13个位点的原因所在，本发明的发明人在设计初期就以尽量多包含现有一代测序试剂盒常用STR位点并且发挥二代测序技术优势为目的，才有了如今的包含13个STR位点的复合扩增体系。
对比图1和图2可以发现，尽管Precision ID GlobalFilerTM NGS STR Panel是一款很成熟、应用很广的基于二代测序平台的复合扩增体系，但它也无法很好的适用于以一代测序试剂盒的扩增子作为底物来实现得到很好的数据结果。对比例1得到14个STR位点的数据，但其各个位点的测序深度差异极其大，得到的数据量基本都集中在D13S317、D1S1656、D5S818、D7S820和TPOX等5个位点之中，这五个位点的数据量占整个样本数据量的80％以上，基因座间的均衡性差异巨大，无法在实际的案件侦破提供切实可靠的线索和信息。而且，在9个被包含在本发明的位点中，D12S391、D21S11、D6S1043和vWA等近半数的位点的测序深度占整体测序深度的比值在0.8％以下，这些都使得数据无法有足够的可信度去给案件侦破提供信息和方向。而与之相比，本发明的所有位点之间测序深度差异较小，基因座间均衡性大大提升，能够提供稳定、可靠的数据来支撑其数据的可信度。
二、为了验证不采用本发明的引物组合进行多重扩增能否实现相同的目的，以实施例2的步骤一中采用Globalfiler试剂盒得到的产物溶液为模板，采用Precision IDGlobalFilerTM NGS STR Panel(Thermo Fisher公司，产品目录号为A30939)扩增，然后采用Precision ID Library Kit(Thermo Fisher公司，产品目录号为A26435)建库，最终在IonPGMTM二代测序平台进行测序。
各STR位点测序深度占比图见图4。
实施例2中采用Globalfiler试剂盒时的检测结果和对比例1的步骤二的检测结果的对比见表7。
表7
实施例2 对比例1 实施例2 对比例1
D18S51 D18S51 —— DYS391
D1S1656 D1S1656 —— TH01
D21S11 D21S11 —— Y Indel
D7S820 D7S820 —— D13S317
FGA FGA —— D16S539
vWA vWA —— D5S818
D2S1338 —— —— TPOX
D2S441 —— —— Amel
D3S1358 —— —— CSF1PO
D8S1179 ——
D12S391 ——
D19S433 ——
D6S1043 ——
注：“——”表示该位点无数据。
由表7可见，对比例的结果数据中，除位点D6S1043因不被Globalfiler试剂盒所包含外，本发明所含13个位点仅仅得到6个位点(D18S51、D1S1656、D21S11、D7S820、FGA、vWA)的数据，还有D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433这6个位点没能得到测序数据和结果。另外对比例额外得到的Amel、CSF1PO、D13S317、D16S539、D5S818、DYS391、TH01、TPOX、Y Indel九个STR位点，因为暂未发现其在序列上有明显的多态性，无法体现出二代测序技术的优势，在实际应用中无法提供更多的可用信息，只能重复毛细管电泳分型结果。
三、为了验证不采用本发明的引物组合进行多重扩增能否实现相同的目的，以实施例2的步骤一中采用Identifiler Plus试剂盒得到的产物溶液为模板，采用PrecisionID GlobalFilerTM NGS STR Panel(Thermo Fisher公司，产品目录号为A30939)扩增，然后采用Precision ID Library Kit(Thermo Fisher公司，产品目录号为A26435)建库，最终在Ion PGMTM二代测序平台进行测序。
各STR位点测序深度占比图见图6。
实施例2中采用Identifiler Plus试剂盒时的检测结果和对比例1的步骤三的检测结果的对比见表8。
表8
实施例2 对比例1 实施例2 对比例1
D18S51 D18S51 —— D13S317
D21S11 D21S11 —— D16S539
D7S820 D7S820 —— D5S818
FGA FGA —— TH01
vWA vWA —— Amel
D2S1338 —— —— CSF1PO
D3S1358 ——
D8S1179 ——
D19S433 ——
D2S441 ——
D12S391 ——
D1S1656 ——
D6S1043 ——
注：“——”表示该位点无数据。
由表8可见，对比例的结果数据中，除位点D2S441、D12S391、D1S1656、D6S1043这4个位点因不被Identifiler Plus试剂盒所包含外，本发明所含13个位点仅仅得到5个位点的数据，还有D2S1338、D3S1358、D8S1179、D19S433四个位点没能得到测序数据和结果。另外对比例额外得到的Amel、CSF1PO、D13S317、D16S539、D5S818、TH01六个STR位点，因为暂未发现其在序列上有明显的多态性，无法体现出二代测序技术的优势，在实际应用中无法提供更多的可用信息，只能重复毛细管电泳分型结果。
综上步骤一、步骤二和步骤三所述，体现了本发明在对实现对检材的零利用，使用一代测序产物实现二代测序的适用性和必要性，填补了目前国内外在此方面的空白，是对现有测序手段的一个十分重要的补充。
对比例2、
本发明的发明人在位点筛选、引物组合设计以及实验条件的改进方面付出了巨大的努力和精力，特别是在引物组合的设计方面。前期的大量数据调查才使得发明人筛选出本发明中符合要求的包含13个STR位点的复合扩增体系。获得能够满足实验要求的引物组合最能体现本发明的复杂性和创造性。本发明的引物体系是针对利用一代扩增产物这一目的而专门设计的，在实验过程中也经历过多次的失败，才最终确定了本发明这一复合引物体系，被付诸于诸多的努力，具有十足的创造性。示例性的，前期试验中某个失败的引物组合见表9。
表9
Figure BDA0002448033140000131
供试样本：标准品DNA 2800M，Promega公司的产品，产品目录号为DD7101。
一、一代测序
取1ng供试样本，采用PowerPlex21系统进行扩增(按说明书操作)，扩增产物用水稀释至十倍体积，得到产物溶液。
二、多重PCR扩增
反应体系为20μL，其中含2μL步骤一得到的产物溶液、1U TaqDNA polymerase和引物混合物。反应体系中的其它组分及其在反应体系中的浓度为：20mM Tris-HCl pH 8.3、50mM KCl、1.6mM MgCl2、0.8mg/ml牛血清白蛋白、0.2％(体积比)Tween-20、3.2％(体积比)甘油、0.02g/100ml NaN3、200mM dNTP。反应体系中，余量为水。引物混合物提供的有效成分为表9中的26种引物。反应体系中，26种引物的浓度均为0.1μM。
反应程序：同实施例2的步骤二的反应程序。
三、回收扩增产物
同实施例2的步骤三。
四、二代测序
同实施例2的步骤四。
二代测序的分型结果见表10。除D2S441不被一代测序试剂盒(PowerPlex21系统)包含外，在剩余的12个位点中，有D12S391和D1S1656等两个位点没能得到测序数据，还有D21S11和D7S820等两个位点与一代测序数据相比缺失了一个等位基因，这些对于案件应用来说都是无法忍受的重大缺陷。
各STR位点测序深度占比图见图7。由各个位点的测序深度占样本总测序深度的占比图来看，均衡性存在着十分大的问题，这些因素也影响着引物体系的使用价值。
表10
位点 是否得到正确分型
D18S51 得到正确分型
D2S1338 得到正确分型
D2S441 ——
D3S1358 得到正确分型
D8S1179 得到正确分型
D12S391 ——
D19S433 得到正确分型
D1S1656 ——
D21S11 等位基因分型缺失
D6S1043 得到正确分型
D7S820 等位基因分型缺失
FGA 得到正确分型
vWA 得到正确分型
注：“——”表示在该STR位点没有获得到测序数据；“正确分型”是指经一代测序得到的长度分型。
从上述案例来看，并不是所有引物组合都能实现本发明的预期效果，在前期的实验中，类似于这样的复合扩增体系有很多，但都因为各自的缺陷而不能实现本发明引物体系能够达到的目的。在此过程中，本发明的发明人付出了巨大的金钱、精力和时间，最终得到了符合预期要求的结果，它是智慧和汗水的凝结，具有十足的创造性。
SEQUENCE LISTING
<110> 公安部物证鉴定中心
<120> 利用扩增产物进行法医序列多态STR分型的方法及引物组合
<130> GNCYX200704
<160> 30
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ctgagtgaca aattgagacc 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ctttttctct ttctttcctc tct 23
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
gtaagttaaa ggattgcagg ag 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gaaacagaaa tggcttgg 18
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
tgtggctcat ctatgaaaac t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gtggctgtgg tgttatgata 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
gaaatcaaca gaggcttgc 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ggtgacagag caagaccc 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ttgtatttca tgtgtacatt cgta 24
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
gattattttc actgtgggga 20
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
atcaatggat gcataggt 18
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
cctctaataa atcccctctc 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
gaataaaaat cttctctctt tctt 24
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
cctgggcaac agaataa 17
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
atacatacaa ttaaacacac acac 24
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
aagggtcaac tgtgtgatg 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
aagggtcaac tgtatgatg 19
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
ttccccaagt gaattgc 17
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
atagactgga tagatagacg a 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
ccacttccca taataaatcc t 21
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
gcaaggatgg gtggat 16
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
attaaaaaaa actatcaatc tgtc 24
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
cttgtcatag tttagaacga a 21
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
cttgtcatag tttagaatga a 21
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
gcaaaaaaga aaggaagaaa 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
aattaggcat atttacaagc tag 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 27
aattaagcat atttacaagc tag 23
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
ggatggatgg atagatgg 18
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 29
ggatggatgg atggatgg 18
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 30
tcagtatgtg acttggattg a 21

Claims (10)

1.引物组合，由如下30种引物组成：
引物D18S51-F，序列表的序列1所示的单链DNA分子；
引物D18S51-R，序列表的序列2所示的单链DNA分子；
引物D2S1338-F，序列表的序列3所示的单链DNA分子；
引物D2S1338-R，序列表的序列4所示的单链DNA分子；
引物D2S441-F，序列表的序列5所示的单链DNA分子；
引物D2S441-R，序列表的序列6所示的单链DNA分子；
引物D3S1358-F，序列表的序列7所示的单链DNA分子；
引物D3S1358-R，序列表的序列8所示的单链DNA分子；
引物D8S1179-F，序列表的序列9所示的单链DNA分子；
引物D8S1179-R，序列表的序列10所示的单链DNA分子；
引物D12S391-F，序列表的序列11所示的单链DNA分子；
引物D12S391-R，序列表的序列12所示的单链DNA分子；
引物D19S433-F，序列表的序列13所示的单链DNA分子；
引物D19S433-R，序列表的序列14所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-F，序列表的序列15所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-R1，序列表的序列16所示的单链DNA分子；
引物D1S1656-R2，序列表的序列17所示的单链DNA分子；
引物D21S11-F，序列表的序列18所示的单链DNA分子；
引物D21S11-R，序列表的序列19所示的单链DNA分子；
引物D6S1043-F，序列表的序列20所示的单链DNA分子；
引物D6S1043-R，序列表的序列21所示的单链DNA分子；
引物D7S820-F，序列表的序列22所示的单链DNA分子；
引物D7S820-R1，序列表的序列23所示的单链DNA分子；
引物D7S820-R2，序列表的序列24所示的单链DNA分子；
引物FGA-F，序列表的序列25所示的单链DNA分子；
引物FGA-R1，序列表的序列26所示的单链DNA分子；
引物FGA-R2，序列表的序列27所示的单链DNA分子；
引物vWA-F1，序列表的序列28所示的单链DNA分子；
引物vWA-F2，序列表的序列29所示的单链DNA分子；
引物vWA-R，序列表的序列30所示的单链DNA分子。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于：
按照引物顺序，所述各个引物的摩尔配比依次如下：0.1 ：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.1：0.1：0.1：0.1：0.05：0.05：0.1：0.05：0.05：0.05：0.05：0.1。
3.权利要求1或2所述引物组合在制备法医鉴定试剂盒中的应用。
4.一种法医鉴定试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组合。
5.权利要求1或2所述引物组合在制备用于鉴定13个人STR基因座的试剂盒中的应用；所述13个人基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。
6.一种用于鉴定13个人STR基因座的试剂盒，包括权利要求1或2所述引物组合；所述13个人基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。
7.权利要求1或2所述引物组合在法医鉴定中的应用；所述应用为非疾病诊断与治疗目的的。
8.一种法医鉴定方法，包括如下步骤：进行多重PCR扩增，然后进行基于二代测序的STR分型；
所述多重PCR扩增采用权利要求1或2所述引物组合；
所述多重PCR扩增采用的模板为法医样本进行基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物；
所述方法为非疾病诊断与治疗目的的。
9.权利要求1或2所述引物组合在鉴定13个人STR基因座中的应用；所述13个人STR基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA；所述应用为非疾病诊断与治疗目的的。
10.一种鉴定13个人STR基因座的方法，包括如下步骤：进行多重PCR扩增，然后进行基于二代测序的STR分型；
所述多重PCR扩增采用权利要求1或2所述引物组合；
所述多重PCR扩增采用的模板为法医样本进行基于毛细管电泳的STR分型时的扩增产物；
所述方法为非疾病诊断与治疗目的的；
所述13个人STR基因座为：D18S51、D2S1338、D2S441、D3S1358、D8S1179、D12S391、D19S433、D1S1656、D21S11、D6S1043、D7S820、FGA和vWA。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160053311A1 (en) * 2012-09-06 2016-02-25 Life Technologies Corporation Multiplex y-str analysis
CN107012225A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的str基因座的检测试剂盒及检测方法
CN110066792A (zh) * 2018-01-24 2019-07-30 深圳华大法医科技有限公司 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160053311A1 (en) * 2012-09-06 2016-02-25 Life Technologies Corporation Multiplex y-str analysis
CN107012225A (zh) * 2017-04-20 2017-08-04 司法部司法鉴定科学技术研究所 一种基于高通量测序的str基因座的检测试剂盒及检测方法
CN110066792A (zh) * 2018-01-24 2019-07-30 深圳华大法医科技有限公司 一种同步检测23个基因位点的五色荧光str分型方法及其专用试剂盒

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Characterization of genetic sequence variation of 58 STR loci in four major population groups;Novroski等;《Forensic Science International:Genetics》;20161130;第25卷;第214-226页 *
二代测序技术在疑难生物检材法医DNA检验的研究进展;程凤等;《生命科学研究》;20181231;第22卷(第6期);第511-516页 *
十二个X染色体STR基因座荧光标记复合扩增体系的法医学应用;任峥等;《中山大学学报（医学科学版）》;20110131;第32卷(第1期);第109-115页 *

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