CN108977548A - Snp位点组合及在制备检测肿瘤易感基因的产品中的应用 - Google Patents

Snp位点组合及在制备检测肿瘤易感基因的产品中的应用 Download PDF

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荣策
吴晓娜
信双晴
吴影杰
曾瀚
何泽铭
宋洁
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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Abstract

本发明提供用于扩增SNP位点组合的引物对以及延伸引物和用于检测肿瘤易感基因的试剂盒，其利用飞行质谱平台，能够检测15个与肿瘤遗传相关的基因，共涉及20个热点变异位点。所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1‑20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21‑40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41‑60所示。采用上述试剂盒，可以取得快速、简单、准确的基因型检测，同时具有其他其它SNP检测方法所没有的优势。

Description

SNP位点组合及在制备检测肿瘤易感基因的产品中的应用
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域。尤其是涉及基于飞行质谱平台的肿瘤易感基因检测技术及用途。
背景技术
肿瘤已成为全世界范围内发病率和死亡率最高的疾病，寻找有效地早期诊断及治疗方法已成为当前医学研究领域中的重大课题。肿瘤的发生发展是机体局部组织细胞异常增生而形成的异常病变，这种发病的过程常常涉及各种基因突变。因此，肿瘤细胞在基因组水平上与正常体细胞存在显著差异，在肿瘤细胞发生发展的过程中存在被稳定复制的一些重要的驱动基因突变，可作为生物标志物，对肿瘤的预防、诊断、治疗以及预后判断提供重要的信息。
恶性肿瘤是多基因参与的复杂性疾病，其发病机制尚不完全清楚。目前研究认为，肿瘤的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果。其中环境因素是大多数肿瘤的病因，但暴露于相同环境的人群只有少数个体发病；而遗传因素为内因，与人体是否携带肿瘤易感基因有关，提示个体的遗传易感因素起重要作用。
SNP分型的方法多种多样，分子量阵列技术是Sequenom公司推出的世界上领先的基因分析工具，通过引物延伸或切割反应与灵敏、可靠的MALDITOF质谱技术相结合，实现基因分型检测。基于分子量阵列平台的iPLEX GOLD技术可以设计最高多达40重PCR反应和基因型检测，实验设计非常灵活，分型结果准确性高。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，具有最佳性价比。特别适合于对全基因组研究发现的结果进行验证，或者是有限数量的研究位点已经确定的情况。
质谱是带电原子、分子或分子碎片按分子量(质荷比)的大小顺序排列的图谱。质谱仪可通过对物质的分子量(质荷比)进行检测，达到区分、鉴别物质的目的。SNP位点两个等位基因之间存在分子量差异，通过分型实验将差异放大，然后以质谱仪进行检测即可达到SNP分型的目的。带电物质无电场的真空管(Drift region)中的飞行速度与分子量负相关，分子量越小，飞行速度越快，到达检测器(Detector)的时间越早，反之亦然。
发明内容
本发明的技术目的首先是提供一种用于飞行质谱检测的SNP位点组合，其利用飞行质谱平台，能够检测15个与肿瘤遗传相关的基因，共涉及20个热点变异位点。所述SNP位点包括：rs121913482、rs1042522、rs28934573、rs1800896、rs1057035、rs121909229、rs17401966、rs2736100、rs121913274、rs1621、rs11554290、rs5030820、rs28934576、rs401681、rs1057519942、rs1131878、rs121434596、rs121913355、rs121913338、rs9841504。这20个变异位点是发明人经过多年研究选择得到的组合形式，可以基本覆盖常见与肿瘤遗传相关的基因，同时可以快速准确的得到位点突变检测结果。本发明的技术基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)，是一种基因SNP位点的分型技术。该技术的主要原理是首先通过多重PCR技术，扩增出所要检测SNP附近的一个片段，然后，通过纯化技术，取出PCR产物中的杂质，再通过单碱基扩增引物，特异性的扩增出SNP所在的位点。再将扩增产物点在芯片上，进行结晶。最后将芯片上的产物，通过飞行时间质谱仪，测定其分子量，来最终判断SNP位点的类型。
进一步地，本发明提供用于扩增所述SNP位点的引物对以及延伸引物。所述引物基于飞行质谱技术的原理和特点，经过多次设计、试验和优化，最终得到优选的扩增引物对，以及延伸引物。所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1-20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21-40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41-60所示。用于后续PCR扩增反应以及单碱基延伸反应。所述引物的设计是此技术开发中的一个难点，因为多重PCR是若干条引物组合，在一个反应孔中进行反应，因此不同引物间会发生串扰，影响检测的准确性。本发明的引物由富有经验的发明人开发设计，利用算法精确的引物设计软件，同时经过了多次试验验证，最终才得到了如上所述的最优选的引物组合，可以达到不串扰、同时可以快速高效地扩增出所述位点的效果。
基于上述优化的引物设计和位点选择，本发明提供一种用于检测肿瘤易感基因的方法，包括步骤：
1、合成引物；2、提取待检样品的核酸；3、多重PCR；4、纯化PCR产物，SAP酶消化反应；5、单碱基延伸反应；6、单碱基延伸反应产物纯化，树脂脱盐反应；7、产物芯片点样，结晶；8、MALDI-TOF-MS(质谱)检测；9、数据分析。
采用上述技术，可以实现快速、简单、准确的基因型检测，对于肿瘤疾病的遗传解读、早期预防、临床治疗等都有着重大意义。
再进一步地，本发明优选提供一种用于检测肿瘤易感基因的试剂盒，包括上述引物对以及延伸引物，所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1-20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21-40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41-60所示。
上述试剂盒，包括引物储备液、PCR反应试剂、SAP酶消化试剂以及单碱基延伸反应试剂。
引物储备液为每种引物用TE缓冲液或ddH2O配置而成：PCR引物储备液，终浓度为100μmol/L；和单碱基引物储备液，终浓度为500μmol/L。
PCR反应试剂包括：1.8μL的dddH2O；0.5μL的10倍缓冲液；0.4μL的Mg2+；0.1μL的dNTP(脱氧核糖核苷酸)；0.2μL的Hotstar(HotStart Taq DNA聚合酶)。
SAP酶消化试剂包括：1.53μL的dddH2O；0.17μL的SAP缓冲液；0.3μL的SAP酶(虾碱酶)。
单碱基延伸反应试剂包括：0.619μL的dddH2O、0.2μL的10倍iplex缓冲液(iPLEXTMGold：agena公司的试剂)、0.2μL的Terminator mix、0.041μL的单碱基延伸酶。
采用上述试剂盒，可以取得快速、简单、准确的基因型检测，同时具有其他其它SNP检测方法所没有的优势：
(1)质谱仪检测的是分子最本质的特征之一分子量，不涉及荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本身出错的概率非常低；
(2)质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都能被检测出来；
(3)通量高：几秒就能检测完一个反应孔；
(4)操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器；
(5)灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应；
(6)便宜：引物不带荧光标记，普通长度(3条引物总长80bp左右)，此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应；
(7)一管式操作：即反应体系在实验过程中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概率。
附图说明
图1-6是实施例3样本的质谱峰图举例，其中：图1：rs1621-A；图2：rs401681-TC；图3：rs1042522-CG；图4：rs1057035-CT；图5：rs1800896-CT；图6：rs2736100-CA。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。所用的试剂均为市场上可购得的常规试剂，其中MassArray试剂为：Agena公司iPLEX GoldGenotyping Reagent Set货号10148-2。
实施例1：
一种用于检测肿瘤易感基因的试剂盒，包括如下表所示的引物对以及延伸引物，所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1-20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21-40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41-60所示。引物制备成引物储备液，然后还包括PCR反应试剂、SAP酶消化试剂以及单碱基延伸反应试剂。
实施例2：
一种用于检测肿瘤易感基因的方法，采用实施例1所述的试剂盒来操作，包括步骤：
1、DNA提取：使用商品化试剂盒，提取待测样本中的DNA。使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测，1.25％琼脂糖凝胶电泳检测，DNA质检合格，转移至96孔板，-20度储存备用。
2、合成引物和质检
按照实施例1的引物序列合成引物，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)进行质检，检测实际分子量与理论分子量是否一致，引物纯度是否达到实验要求。
3、引物稀释
3.1PCR引物储备液制备：配置PCR引物储备液，终浓度为100p(μmol/L)；
3.2单碱基延伸引物储备液制备：配置单碱基引物储备液，终浓度为500p(μmol/L)；
4、PCR反应
4.1总反应体系如下：
反应物名称 体积(μl)
dddH2O 1.8
10*buffer 0.5
Mg2+ 0.4
dNTP 0.1
Hotstar 0.2
F Primer/R Primer 1
待检测DNA样品 1(20ng-50ng)
Total 5
4.2PCR扩增反应：按照下述的程序对PCR仪进行设置：
5、SAP酶消化反应
5.1按照下述顺序配制SAP酶Mix：
反应物名称 体积(μl)
dddH2O 1.53*400
SAP Buffer 0.17*400
SAP Enzyme 0.3*400
Total 2*400
5.2按照下述程序，在PCR仪中进行SAP酶消化：
37℃ 40min
85℃ 5min
25℃ ∞
6、单碱基延伸反应
6.1按照下述顺序配制单碱基延伸反应Mix：
反应物名称 体积(μl)
三蒸水 0.619*400
10*iplex buffer 0.2*400
Terminator mix 0.2*400
引物 0.94*400
单碱基延伸酶 0.041*400
Total 2*400
6.2按照下述程序，在PCR仪中进行单碱基延伸反应：
7、树脂纯化
7.1将反应产物的384孔板中加入16μl三蒸水，在离心机中离心2000转离心3min；加入树脂，在反转摇匀仪上做树脂纯化反应35min，脱盐；反应完成后在离心机中离心2000转离心3min；
7.2将脱盐处理后的样品点在样品靶上，自然结晶。
8、质谱检测及数据分析
8.1MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解析电离飞行时间质谱)反应；
8.2Typer 4.0软件检测质谱峰，并根据质谱峰图判读各样本目标位点基因型。最终得到每个样本的20个SNP位点的基因型。
实施例3：样本检测
按照实施例2的操作步骤，随机抽取一份DNA样本进行检测，可以得到所述SNP位点的基因型，选取其中几个SNP位点的检测峰图为例，详见图1-6，可以看出，本发明的方法可以快速准确的检测出所述位点的基因型。检测准确率可达99.9％，准确性高、灵活性强、通量大、检测周期短。然后根据检测结果，进行遗传因素解读，本发明涉及的20个SNP位点的肿瘤疾病解读结果列表如下：
根据上述解读，就可以判断样本来源的肿瘤疾病患病风险，从而提高预防率和早期治疗率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京青航基因科技有限公司
<120> SNP位点组合及在制备检测肿瘤易感基因的产品中的应用
<130> P1810188
<160> 60
<170> PatentIn version 3.5
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tagtgcctct atgagtcc 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
tccgtgttga gtgtttct 18
<210> 49
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
cctctctctg aaatcactg 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ccacatgcac tatacagtag 20
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<212> DNA
<213> 人工序列
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agcctggcac tgtactcttc t 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gggacggctt gactaggctc c 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
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gggagaacag ctttgaggtg c 21
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctcacgctgc ttcacaccat gat 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
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aatgtctcga atatttacat tca 23
<210> 56
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgttttaac tgttgttgag gaa 23
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<213> 人工序列
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agtttcagtg cgcttttccc aaca 24
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ggataattgg atctggatca tttg 24
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ttatgtcact gtagctagac caaaa 25
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<213> 人工序列
<400> 60
tcttcccttt ttccctatat attttta 27

Claims (10)

1.用于扩增SNP位点的引物对以及延伸引物，其特征在于，所述SNP位点包括：rs121913482、rs1042522、rs28934573、rs1800896、rs1057035、rs121909229、rs17401966、rs2736100、rs121913274、rs1621、rs11554290、rs5030820、rs28934576、rs401681、rs1057519942、rs1131878、rs121434596、rs121913355、rs121913338、rs9841504。
2.根据权利要求1所述的引物对以及延伸引物，其特征在于，所述引物对的上游引物的序列如SEQ ID No.1-20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21-40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41-60所示。
3.权利要求1或2所述的引物对以及延伸引物在制备检测肿瘤易感基因的产品中的应用。
4.一种用于检测肿瘤易感基因的试剂盒，其特征在于，包括用于扩增SNP位点的引物对以及延伸引物，所述SNP位点包括：rs121913482、rs1042522、rs28934573、rs1800896、rs1057035、rs121909229、rs17401966、rs2736100、rs121913274、rs1621、rs11554290、rs5030820、rs28934576、rs401681、rs1057519942、rs1131878、rs121434596、rs121913355、rs121913338、rs9841504。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对的上游引物的序列如SEQ IDNo.1-20所示，所述引物对的下游引物的序列如SEQ ID No.21-40所示，所述延伸引物的序列如SEQ ID No.41-60所示。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，包括引物储备液、PCR反应试剂、SAP酶消化试剂以及单碱基延伸反应试剂；所述引物储备液为每种引物用TE缓冲液或ddH2O配置而成。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物储备液包括PCR引物储备液，终浓度为100μmol/L；和单碱基引物储备液，终浓度为500μmol/L。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括：1.8μL的dddH2O；0.5μL的10倍缓冲液；0.4μL的Mg2+；0.1μL的dNTP；0.2μL的Hotstar。
9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述SAP酶消化试剂包括：1.53μL的dddH2O；0.17μL的SAP缓冲液；0.3μL的SAP酶。
10.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述单碱基延伸反应试剂包括：0.619μL的dddH2O、0.2μL的10倍iplex缓冲液、0.2μL的Terminator mix、0.041μL的单碱基延伸酶。
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